All images in this document is removed due to copyright restriction

TRANSGENIC MICEDARI KONSEP MENJADI SALAH SATU METODA

UNTUK MEMPELAJARI FUNGSI GEN **

dr. Ahmad Aulia Jusuf, PhDBagian Histologi

Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia2009

PENDAHULUAN

Berbagai penelitian untuk menyingkap fungsi suatu gen telah banyak dilakukan.

Walaupun para ahli telah dapat menginsersikan fragmen DNA atau gen yang ingin

dipelajari dengan metode transfeksi pada sel-sel tertentu yang dikultur di media kultur

tertentu, tetapi mereka belum puas karena sering hasil yang diperoleh secara invitro

berbeda dengan hasil yang diperoleh secara invivo. Para ahli ingin mempelajarinya

langsung pada mahluk hidup yang utuh (invivo).

Ada 2 cara untuk mempelajari fungsi gen tertentu secara langsung pada mahluk

hidup yaitu dengan cara transgenik dan penginaktifan gen (gene disruption / gene knock

out)1. Pada organisma transgenik, gen atau fragmen DNA yang dimasukkan bisa

merupakan gen atau fragmen DNA yang memang terdapat didalam organisme tersebut

(endogen) dengan tujuan untuk mendapatkan ekspresi yang lebih kuat (overekspresi gen)

dan bisa pula gen atau fragmen DNA yang tidak terdapat pada organisma tersebut

(eksogen). Pada tehnik gene disruption atau knock out gene, gen tertentu yang akan

dipelajari yang terdapat di dalam organisma tersebut dibuat menjadi tidak aktif.

Tikus transgenik telah banyak digunakan secara luas di dalam penelitian

biomedik. Riwayat tikus transgenik dimulai ketika Palmitter pada tahun 1981

memasukan gen thymidine kinase dari virus herpes ke dalam sel telur tikus yang telah

dibuahi (zygot).2,3 Beberapa makalah tentang tikus transgenik telah dipublikasikan oleh

Palmitter (1986)4, Jaenisch (1988)5 dan Hanahan (1989)6. Gordon dkk pada tahun 1983

1

** Disampaikan pada kuliah Magister Biomedik, Kamis 05 Nopember 2009

telah mengembangkan tehnik yang lebih baik dan fleksibel yaitu dengan menyuntikkan

gen yang akan diamati secara langsung ke dalam pronucleus telur tikus yang telah

dibuahi/ fertilized eggs (zigot)7. Metode untuk membuat tikus transgenik makin

disempurnakan oleh Hogan dkk pada tahun 1994.8

Makalah ini akan membicarakan metoda yang terakhir dikembangkan oleh Hogan

dkk untuk memasukkan fragmen DNA atau gene secara langsung ke dalam pronukleus

zigot tikus dan cara untuk memproduksi tikus transgenik.

DEFINISI

Tikus transgenik adalah tikus yang mempunyai genom (susunan gen) yang telah

dimodifikasi secara artifisial melalui rekayasa genetik (genetic engineering) dan dapat

diteruskan kepada turunannya.1,2

Fragmen DNA atau gen yang dimasukkan kedalam suatu sel akan diligasikan

secara ujung ke ujung (end to end) kesuatu tempat tertentu di dalam suatu kromosom

secara acak oleh ensim ligasi intraselular sehingga gen atau fragmen DNA itu akan

tersusun secara tandem2,9 (Gb-1). Telur tikus yang telah dibuahi (fertilized eggs) atau

zigot yang pronukleusnya disuntikkan fragmen DNA akan berkembang menjadi tikus

dengan banyak sel-sel tubuhnya mengandung fragmen DNA atau gen yang dimasukkan

tersebut. Fragmen DNA atau gen yang dimasukkan ini akan menempel dan tersusun

secara tandem pada tempat tertentu di dalam suatu kromosom individu transgenik (host)

tersebut secara random.2,3 Bila kromosom yang telah dimodifikasi ini hadir pada sel-sel

kelamin (sel telur dan sperma) maka tikus tersebut akan meneruskan kromosom yang

telah dimodifikasi ini ke tikus turunannya. Tikus yang susunan gennya telah berubah

secara permanen ini dikenal sebagai tikus transgenik (transgenic mice), sedangkan gen

yang dimasukkan tersebut disebut sebagai transgen.3

gen gen gen gen

Gen yang tersusun secara tandem

Gambar 1- Susunan tandem dari gen yang diinsersikan secara acak pada

2

suatu kromosom tertentu pada setiap sel tubuh tikus

KEGUNAAN TIKUS TRANSGENIK

Tikus transgenik digunakan sebagai model hewan coba untuk mempelajari

regulasi gen-gen yang terkait dengan perkembangan jaringan tubuh dan gen-gen yang

spesifik yang berperan dalam pertumbuhan jaringan tubuh tertentu serta mempelajari

fenotif gen pada jaringan tubuh. Disamping itu tikus transgenik juga dapat digunakan

untuk mempelajari regulasi gen-gen yang berperan dalam proses terjadinya kanker

(oncogenesis) dan mempelajari efek zat atau senyawa tertentu dalam terapi penyakit.2,3,10

PROSES PEMBUATAN TIKUS TRANSGENIK

Gambar-2. Ada 2 metoda pembuatan tikus transgenik: (1) metoda insersi transgen kedalam ES cells (kiri) dan (2) metoda pronuclear microinjection.

Pembuatan tikus transgenik merupakan proses yang sulit dan membutuhkan

waktu yang lama. Ada 2 metoda untuk membuat tikus transgenik yaitu19,20: (1)

Pronuclear microinjection yaitu transgen dimasukkan secara langsung kedalam

pronukleus telur tikus yang sudah difertilisasi (fertilized egg/zygote), (2) Embryonic

Stem (ES) cell electroporation and subsequent blastocyst injection yaitu insersi transgen

3

kedalam sel induk embrionik (embryonic stem cells/ES cells) yang dilanjutkan dengan

pemasukkan ES cells kedalam blastokista. Makalah ini akan menguraikan cara membuat

tikus transgenik dengan metoda pronuclear microinjection.

PERSIAPAN PEMBUATAN TIKUS TRANSGENIK

Pembuatan tikus transgenik merupakan proses yang sulit dan membutuhkan

waktu yang lama. Sebelum membuat tikus transgenik serangkaian perisapan yang harus

dilakukan adalah (1) persiapan gen (transgen) yang akan dimasukkan ke dalam

pronukleus telur tikus yang telah dibuahi (zigot), (2) persiapan tikus yang akan

digunakan, (3) persiapan alat dan bahan, (4) persiapan sistem deteksi ada tidaknya

transgen dalam susunan genom ”calon” tikus transgenik (tikus yang berkembang dari

zigot yang disuntikkan transgen).

1. Persiapan Transgen

Fragmen DNA atau gen yang akan dimasukkan ke dalam pronukleus zigot harus

mengandung promoter, complete protein coding region, sedikitnya satu intron dan

polyadenylation site.11

Transgen ini didapatkan dan di amplifikasi dari suatu genom organisme tertentu

dengan menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Produk PCR kemudian

ditanam pada daerah kloning (cloning site) vector plasmid dengan menggunakan ensim

ligase. Vector yang mengandung transgen ini kemudian ditransfeksikan kedalam bakteri

tertentu dengan tehnik heat shock. Bakteri kemudian ditanam dan ditumbuhkan pada

media agar (agar plate). Setelah tumbuh, bakteri kemudian diperbanyak (dibiakkan) pada

media agar yang cair. Plasmid yang mengandung transgen kemudian diisolasi dari bakteri

yang telah dilisiskan dengan tehnik tertentu. Fragmen transgen ini kemudian diisolasi dari

plasmid dengan menggunakan ensim restriksi (restriction enzyme) dikuti dengan

pemisahan dan pemurnian pada gel agarosa dan dilanjutkan dengan isolasi fragmen DNA

dari gel agarosa (Gb-2).

Walaupun sekuens (fragmen DNA) dari vector prokariotik tampaknya tidak

mengganggu integrasi transgen pada hostnya tetapi sekuens tersebut dapat menghambat

ekspresi dari transgen tersebut.10,12 Karenanya konstruksi gen yang akan ditransfer

4

Gambar-2 Tahapan pembuatan transgen

(transgen) tersebut harus dipurifikasi dahulu sebelum diinsersikan ke dalam pronukleus

zigot untuk menghindari hal tersebut. Tak diketahui apakah hambatan ekspresi transgen

ini akibat adanya susunan nukleotida tertentu dalam sekuens vector prokariotik tersebut

atau merupakan sifat umum dari sekuens DNA vektor prokariotik tersebut.10,12

Panjang DNA pada transgen tidak dibatasi, bisa dari beberapa kilo base pair

(Kbp) hingga 1000 kb (Lamb et 1999)13. Hal yang harus dipertimbangkan adalah vector

yang digunakan dan cara konstruksinya.

Transgen yang dimasukkan kedalam host dapat satu macam atau lebih dari satu

macam yang dicampur dalam satu pelarut dan disuntikkan secara bersamaan. Bila lebih

dari satu transgen yang diinsersikan konsentrasi dari masing-masing transgen harus sama.

Bila gen yang diinsersikan merupakan gen yang memang sudah ada pada tikus

(endogenous transgene), untuk membedakan produk dari transgen tersebut dengan RNA

atau protein dari gen endogennya dapat dilakukan penyisipan oligonucleotida pada

daerah yang tidak ditranslasikan (untranslated region)14,15 atau menginsersikan gen kecil

yang mengkode RNA yang pendek pada transgen tersebut16. Akan tetapi harus diingat

adanya protein kecil yang ”mendompleng” pada protein yang dikode oleh transgen

tersebut mungkin berpengaruh terhadap fungsi protein yang dikode oleh transgen. Fusi

dari sebuah epitope/peptida yang pendek dengan protein dari transgen dapat

mempermudah pengenalan adanya protein yang dikode oleh transgen pada tikus host

tersebut dengan menggunakan epitope-specific antibodi, atau fusi antara protein yang

dikode oleh transgen dengan protein ”green fluorescent Protein (GFP)” yang dikode oleh

gen reporter alkaline phosphatase akan mempermudah pendeteksian adanya ekspresi

transgen pada tikus host tersebut17.

Efisiensi dari trangen yang ditransfer dipengaruhi oleh beberapa faktor8 yaitu

1. bentuk DNA

Bentuk linier dari DNA transgen akan meningkatkan efisiensi integrasi transgen

tersebut pada genom tikus hostnya

2. konsentrasi DNA

5

Konsentrasi DNA yang rendah akan menurunkan efisiensi pengintegrasian

transgen. Sebaliknya konsentrasi yang terlalu tinggi bersifat toksik bagi zigot.

Konsentrasi DNA yang dianjurkan adalah 1.5-2 nanogram/mikroliter

3. kemurnia DNA

DNA yang diinseriskan harus bebas dari semua kontaminasi termasuk sisa

phenol, etanol atau ensim)

4. buffer DNA

Buffer yang dipakai untuk melartkan DNA juga berperan dalam meningkatkan

efisiensi pengintegrasian transgen pada hostnya. Pelarut yang sering dipakai

adalah TE buffer yang mengandung 1mM EDTA.

2. Persiapan tikus yang akan dipakai

Tikus yang akan dipakai untuk membuat tikus transgenik dikelompokkan menjadi

4 kelompok yaitu

1. Kelompok tikus betina yang dibuat superovulasi (superovulated female mice)

Tikus betina yang termasuk kelompok ini dibuat menjadi superovulasi untuk

mendapatkan telur yang dibuahi (zigot) dalam jumlah banyak. Untuk membuat

superovulated female mice, tikus betina disuntik dengan Pregnant Mare’s Serum

Gonadotrophin (PMSG) yang mempunyai efek yang serupa dengan hormone FSH

untuk menstimulasi perkembangan dan pematangan telur tikus dalam jumlah

banyak. Dua hari setelah penyuntikan PMSG tikus ini disuntik dengan Human

Chorionic Gonadotrophin (HCG) untuk menstimulasi ovulasi. Baik hormon

PMSG maupun HCG disuntikan secara intraperitoneal. Tikus yang dipakai adalah

yang sudah dewasa dengan umur 4-8 minggu tergantung pada strain yang dipakai.

Tikus ini kemudian dikawinkan dengan tikus jantan kelompok fertile stud male

mice dan diperiksa ada tidaknya plug kopulasi (copulation plug) besok paginya.

2. Kelompok tikus jantan pengawin (fertile stud male mice)

Tikus ini dipakai untuk mengawini tikus betina untuk mendapatkan zigot. Tikus

yang dipakai berumur 6-8 minggu dan mempunyai penampilan reproduksi yang

baik. Setelah dipakai mengawini superovulated female mice tikus jantan ini

diistirahatkan beberapa hari.

6

3. Kelompok tikus betina yang dibuat hamil palsu (pseudopregnant female mice)

Kelompok ini adalah tikus betina yang akan menerima zigot yang telah

diinsersikan transgen kedalam pronukleusnya. Tikus ini dikawinkan dengan tikus

dari kelompok sterile male mice dan dicek ada tidaknya plug kopulasi (copulation

plug) besok paginya. Tikus yang dipakai berumur 6-8 minggu dengan berat badan

antara 25-35 gram. Untuk mempermudah transfer zigot disarankan untuk

menggunakan tikus yang mempunyai infundibulum yang besar agar

mempermudah proses transfer, misalnya strain ICR.

4. Kelompok tikus jantan yang disteril (sterile male mice)

Kelompok ini adalah kelompok tikus jantan yang telah disterilkan dengan cara

vasektomi (Gb-3). Tikus ini akan dikawinkan dengan tikus betina pseudopregnant

female mice. Tikus yang dipakai berumur sediktinya 2 bulan. Sebelum dipakai

sebaiknya tikus ini dicek ke ”steril” annya.

Gambar-3 Vasektomi pada tikus kelompok sterile stud male mice

3. Persiapan alat dan bahan

Peralatan dan bahan yang harus dipersiapkan untuk membuat tikus transgenik

meliputi

A. Alat dan bahan untuk mengumpulkan telur tikus yang dibuahi (zigot)

1. Spuit disposible

2. Hormon Pregnant Mare’s Serum Gonadotrophin (PMSG)

3. Hormon Human Chorionic Gonadotrophin (HCG)

4. Larutan kultur yaitu larutan D-PBS atau larutan lainnya yang ditambahkan

bovine serum albumin (BSA), asam piruvat dan antibiotik (penisilin dan

streptomisin)

5. Larutan kultur yang mengandung ensim hyaluronidase

6. Inkubator (temperatur 37C, dengan kelembaban 95% dan mengandung

5% CO2)

7

7. Surgical set termasuk watchmaker’s forceps

8. Alkohol 70%

9. Stereomikroskop

10. Mouth controlled pipette (Gb-4)

11. 35 mm petri dish

Gambar-4 Mouth controlled pipette

B. Alat dan bahan yang dipakai untuk menginsersikan transgen ke pronukleus zigot

1. Holding pipette (Gb-5) yaitu pipet yang dipakai untuk “memegang” zigot

selama proses penyuntikan transgen ke dalam pronukleus zigot. Untuk ini

diperlukan Borosilicate glass capilary dan mechanical pipette puller

2. Injection pipette (Gb-5) yaitu pipet yang dipakai untuk memasukkan

transgen kedalam pronukleus zigot. Untuk ini diperlukan glass capillary

tubing dengan internal glass filament dan mechanical pipette puller.

Gambar-5 Holding dan injection pipette

3. Mikroskop yang mempunyai mikromanipulator.

4. Paraffin oil

5. Petri dish injection chamber

6. Transgen yang dilarutkan dalam buffer TAE

C. Alat dan bahan untuk identifikasi ada tidaknya transgen pada tikus host

Analisa ada tidaknya transgen di dalam ”calon” tikus transgenik (tikus yang

berkembang dari zigot yang diinsersikan transgen) dapat dilakukan menggunakan

Southern blot, Northern blot dan Western Blot.

TAHAPAN (PROSEDUR) PEMBUATAN TIKUS TRANSGENIK

8

Pembuatan tikus transgenik memerlukan banyak tahapan dan proses yang

panjang. Adapun tahap-tahap kegiatan terdiri atas

1. Penyuntikan hormone PMSG intraperitoneal pada tikus superovulated female

mice, dilanjutkan dengan penyuntikan hormon HCG 48 jam kemudian. Setelah

disuntik HCG superovulated female mice dikawinkan dengan fertile stud male

mice dan diperiksa ada tidaknya plug kopulasi keesokan harinya. Pada saat yang

bersamaan tikus pseudopregnant mice dikawinkan dengan sterile stud male mice

dan diperiksa ada tidaknya pulg kopulasi keesokan harinya. Tikus dengan plug

positif dipisahkan dari tikus dengan plug negatif.

Gambar-6. Cara memegang tikus (kiri) dan cara penyuntikan hormon intraperitoneal (kanan)

2. Isolasi dan pengumpulan telur tikus yang dibuahi (zigot) dari superovulated

female mice dengan plug kopulasi positif.

Superovulated female mice dengan plug positif dimatikan dengan cara cervical

dislocation (Gb-7). Setelah disemprot dengan alkohol 70% rongga perut dibuka

dan saluran telur (oviduct) diangkat (Gb-8) dan diletakkan dalam medium kultur.

Gambar-7 Cervical dislocation

Telur tikus yang telah dibuahi (zigot) diisolasi dari saluran telur (oviduct) dengan

cara merobek saluran telur tersebut di bawah mikroskop. Saluran telur yang

Gambar-8 Isolasi saluran telur (oviduct) pada superovulated female mice

banyak mengandung zigot akan tampak menggelembung (Gb-9). Zigot yang telah

dibebaskan dari saluran telur kemudian diletakkan dalam medium kultur yang

mengandung ensim hyaluronidase di dalam 35mm petri dish selama beberapa

9

Gambar-9 Pembebasan zigot dari saluran telur (oviduct)

menit (1-2 menit). Ensim hyaluronidase ini berfungsi untuk menghilangkan sel-

sel kumulus yang menempel pada permukaan zigot. Setelah dicuci dalam media

kultur yang tidak mengandung hyaluronidase telur-telur tikus yang telah dibuahi

(zigot) (Gb-10) dikumpulkan dalam 35mm petri dish yang mengandung media

kultur dan diinkubasi dalam inkubator 37C dengan kelembaban 95% dan

mengandung 5% CO2.

Gambar-10 Telur tikus di dalam media kultur pada 35mm petri dish

3. Penyuntikan transgen kedalam pronukleus telur tikus yang dibuahi (zigot)

Sebelum dilakukan penyuntikan transgen kedalam zigot, holding pipette diisi

terlebih dahulu dengan mineral oil dan dipasang pada tempatnya pada

micromanipulator. Injection pipette diisi dengan larutan yang mengandung

transgen dengan menggunakan daya isap kapiler. Injection pipette dipasang pada

tempatnya pada micromanipulator (Gb-11).

Gambar-11 Holding dan injection pipette serta micromanipulator

Petri dish injection chamber diisi dengan sedikit media kultur dan ditutup dengan

paraffin oil (Gb-12).

Gambar-12 Petri dish injection chamber yang mengandung media kultur dan

ditutup dengan paraffin oil

10

Telur tikus yang dibuahi (zigot) ditransfer dari 35mm petri dish ke petri dish

injection chamber dengan menggunakan mouth controlled pipette. Zigot yang

ditransfer haruslah normal yang ditandai oleh adanya 2 pronukleus dan 2 polar

bodi (Gb-13).

Gambar-13 Zigot yang normal mengandung 2 pronukleus (kiri) dan zigot dalam ”genggaman”

holding pipette, sementara injection pipette tampak dibawah zigot (kanan)

Zigot tanpa pronukleus atau pronukelus lebih dari 2 adalah tidak normal dan tidak

dapat digunakan. Pada saat hendak disuntik zigot di ”pegang” oleh holding

pipette. Setelah injection pipette ditusukan ke dalam pronukleus zigot, transgen

kemudian dipompakan ke dalam pronukleus (Gb-14).

Gambar-14 Proses Penginsersian transgen kedalam pronukleus zigot

Masuknya transgen kedalam pronukleus zigot ditandai oleh adanya gelembung

kecil (small bubble) dan pembesaran pronukleus. Setelah penyuntikan injection

11

pipette segera ditarik dari zigot dan zigot dilepaskan dari genggaman holding

pipette. Satu demi satu zigot kemudian akan disuntikkan dengan transgen. Zigot

yang telah disuntik kemudian dikumpulkan didalam 35mm petri dish selama

beberapa saat sebelum ditransfer ke dalam saluran telur (oviduct) pseudopregnant

mice.

4. Transfer zigot yang telah disuntikkan transgen ke saluran telur (oviduct)

pseudopregnant female mice (Gb-15)

12

Gambar-15 transfer zigot kedalam infundibulum pseudopregnant mice

Organ reproduksi pseudopregnant female mouse dikeluarkan dari tubuh dengan

membuat sayatan pada daerah punggung. Fimbrie dan infundibulum saluran telur

tikus dikenali. Setelah itu zigot yang telah disuntik dengan transgen ditransfer

kedalam infundibulum pseudopregnant mice dengan menggunakan mouth

controlled pipette.

5. Zigot yang ditransfer kedalam pseudopregnant mice kemudian akan tumbuh dan

berkembang selama 21 hari. Setelah 21 hari ”calon” tikus transgenik ini akan

lahir. Anak tikus ini keudian ditunggu hingga besar dan mencapai umur 3minggu.

Setelah itu dilakukan pemeriksaan ada tidaknya transgen yang terintegrasi di

dalam genom anak tikus tersebut dengan menggunakan metoda Southern blot.

Gambar-16 Pendeteksian Transgen dan ekspresinya dengan menggunakan motoda

Southern blot dan Northern blot

Ekspresi transgen diperiksa dengan metoda Northern blot. Tikus transgenik yang

berkembang dari zigot tersebut dikenal sebagai ”Founders” dan bersifat

hemizygote. Untuk perbanyakan tikus transgenik, founders mice ini kemudian

13

dikawinkan dengan tikus non transgenik. Untuk mendapatkan tikus transgenik

yang homozygote, tikus transgenik hemizygote dikawinkan antar sesamanya.

Tikus transgenik yang homozygote ini kemudian dipelajari fenotifnya dengan

mengamati ada tidaknya kelainan pada organ atau jaringan tertentu selama proses

tumbuh kembangnya.

PENUTUP

Telah diuraikan tentang pengertian tikus transgenik, penggunaan dan tahap

kegiatan yang harus dilakukan untuk membuat tikus transgenik. Pembuatan tikus

transgenik memerlukan proses yang panjang dan waktu, biaya serta tenaga yang cukup

banyak. Sebagai suatu metoda penelitian invivo tehnik ini sekarang telah banyak

digunakan dibanyak tempat di dunia.

RUJUKAN

1. Aguzzi A, Brandner S, Isenmann S, Steinbach JP, and Sure U : Transgenic and gene disruption techniques in the study of neurocarcinogenesis. Glia 1995: 15: 348-364

2. Jusuf, A.A : Transgenic and gene disruption techniques from a concept to a tool in studying the basic pathogenesis of various human disease. Medical Journal Of Indonesia. 1998: 7; 2 : 55-64

3. Brinster R, Chen H, Trumbauer M et al : Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell 1981: 27: 223-231

4. Palmitter R.D and Brinster R.L: Germ-line transformation of mice. Annu. Rev. Genet 1986: 20; 465-499

5. Jaenisch R : Transgenic animals. Science 1988: 240; 146814746. Hanahan D. : Transgenic mice as probes into complex system. Science 1989: 246;

1265-12757. Gordon J, Ruddle F : Gene transfer into mouse embryos: production of transgenic

mice by pronuclear injection. Methods Enzymol. 1983: 102: 411-4338. Hogan B, ConstantiniF, Lacy E. : Manipulating the mouse embryos: A laboratory

manual.2nd Ed .New York : Cold Spring Harbor: 19949. Albert, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D. (1994),

Cellular Mechaninsm of development in Molecular Biology of The Cell., 3rd Ed., Garland Publishing, New York and London, pp.

10. Nagy A, Gertsenstein M, Vintersen K, Behringer R, Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. 3rd Ed New York: Cold Spring Harbor: 2003

11. Brinster R, Allen J, BehringerR, Gelimas R et al.: Intron s increase transcriptional efficiency in transgenic mice. Proc Natl. Acad.Sci.USA. 1988: 85; 836-40

14

12. Chada K, Magram J, Raphael K, Radice G, Lacy E and Constantini F. Spesific expression of a foreign beta globin gene in eryrthroid cells of transgenic mice. Nature.1985: 314: 377-380

13. Lamb B.T, Bardel K.A, Kulnane L.S. Anderson J.J, Holtz G, Wagner S.L, Sisodia S.S, and Hoeger E.J. Amyloid production and deposition in mutant amyloid precursor protein and presenilin-1 yeast artificial chromosome transgenic mice. Natl. Neurosci. 1999: 2; 695-697

14. Peschon J.J, Behringer R.R, Brinster R.L, and Palmiter R.D. Spermatide-specific expression of protamine 1 in transgenic mice. Proc Natl.Acad.Sci.USA. 1987:84; 5316-5319

15. Shi Y, Son H.J, Shahan K, Rodriguez M, Constantini F and Derman E. Silent genes in the mouse major urinary protein gene family. Proc Natl.Acad.Sci.USA. 1989:86; 4584-4588

16. Krumlauf R, Hammer R.E, Tilghman S.M, and Brinster R.L Developmental regulation of alpha-fetoprotein genes in transgenic mice. Mol. Cell. Biol. 1985:5; 1639-1648.

17. van Roessel P and Brand A.H. Imaging into the future: visualizing gene expression and protein interactions with fluorescent proteins.Nat.Cell.Biol. 2002:4; 15-20

18. Hanahan, D., Wagner, E.F., Palmiter, R.D. The origins of oncomice: a history of the first transgenic mice genetically engineered to develop cancer. Genes & Dev. 2007:21:2258-2270

19. Transgenic mice, diunduh dari htpp://cancer ucsd.edu/tgm/pronuclear.asp

15