Terpenoid adalah kelas beragam produk alami yang memiliki banyak fungsi dalam

kerajaan tumbuhan dan kesehatan manusia dan gizi. keragaman kimia mereka telah

menyebabkan lebih dari 40.000 penemuan struktur yang berbeda, dengan beberapa kelas

yang berfungsi sebagai agen farmasi penting, termasuk antikanker paclitaxel agen (Taxol)

dan terpenoid indole alkaloid yang diturunkan. Banyak senyawa terpenoid ditemukan

dalam hasil yang rendah dari sumber-sumber alam, budaya tanaman sehingga sel telah

diselidiki sebagai strategi produksi alternatif. rekayasa metabolik tanaman utuh dan kultur

sel tanaman merupakan alat yang efektif untuk meningkatkan baik menghasilkan

terpenoid dan mengubah distribusi terpenoid untuk properti yang diinginkan seperti yang

disempurnakan, aroma rasa atau warna. kemajuan terbaru dalam mendefinisikan jalur

metabolik terpenoid, terutama dalam metabolisme sekunder, pengetahuan tentang

peraturan peningkatan akumulasi terpenoid, dan penerapan pendekatan sistem biologi

tanaman muncul, telah memungkinkan rekayasa metabolik produksi terpenoid. Tulisan

ini membahas tentang keadaan saat ini pengetahuan tentang metabolisme terpenoid,

dengan fokus khusus pada produksi yang penting terpenoid farmasi aktif metabolik

sekunder dalam kultur sel tanaman. Strategi untuk mendefinisikan jalur dan langkah-

langkah mengungkap tingkat-mempengaruhi dalam metabolisme global, dan menerapkan

informasi ini untuk rekayasa metabolik sukses terpenoid, ditekankan.

Terpenoid, juga dikenal sebagai isoprenoidnya, mungkin adalah keluarga yang

paling beragam produk alami disintesis dari tanaman, melayani berbagai fungsi fisiologis

dan sosial penting. Lebih dari 40.000 terpenoid yang berbeda telah diisolasi dari tanaman,

hewan dan mikroba species1, 2. terpenoid tanaman diklasifikasikan sebagai metabolit

primer yang diperlukan untuk fungsi selular dan pemeliharaan, atau metabolit sekunder

yang tidak terlibat dalam pertumbuhan dan perkembangan. terpenoid metabolik primer

meliputi giberelin, karotenoid dan sterol, yang melayani fungsi dasar seperti modulasi

pertumbuhan sel dan perpanjangan tanaman, harvestation ringan dan photoprotection, dan

permeabilitas membran dan kontrol fluiditas. terpenoid metabolik sekunder yang sering

komersial menarik karena menggunakan mereka sebagai peningkat rasa dan warna, bahan

kimia pertanian, dan medicinals. Berbagai macam terpenoid (Gbr. 1) telah menunjukkan

aktivitas farmasi terhadap penyakit manusia seperti cancer3, 4, 5 (misalnya, taxanes,

termasuk paclitaxel dari spp Taxus., Dan terpenoid indol alkaloid (TIA), termasuk

vincristine dan vinblastine dari Catharanthus roseus), malaria (misalnya, artemisinin dari

Artemisia annua), dan HIV3 (misalnya, kumarin, termasuk calanolide A dari lanigerum

Calophyllum). Karena pentingnya komersial terpenoid, penerapan strategi rekayasa

metabolisme untuk kedua meningkatkan pasokan (misalnya, produksi terpenoid

medicinally dinilai baik dari tumbuhan alami atau melalui kultur sel tanaman; lihat di

bawah) penyakit dan meningkatkan sifat produk (misalnya, dan ketahanan terhadap hama

dalam tanaman, wangi ditingkatkan pada tanaman berbunga, rasa ditingkatkan dalam

buah-buahan dan sayuran) adalah penting sosial besar. Kajian ini akan menyoroti baik

kemajuan yang menarik dan tantangan masih harus dipenuhi dalam produksi dan

rekayasa terpenoid dalam tanaman dan kultur sel tanaman, dengan fokus pada terpenoida

farmasi aktif.

Terpenoid biosynthesis

Terpenoid adalah sebuah kelas senyawa turunan dari prekursor isopentenil difosfat

universal (IPP) dan allylic isomer nya dimethylallyldiphosphate (DMAPP), juga disebut

unit isoprena (Skema 1). Terpenoid blok bangunan kemudian dibentuk melalui

kondensasi gugus IPP tambahan melalui prenyltransferases. Monoterpenoid berasal dari

geranyl pirofosfat (GPP, C10), seskuiterpenoid berasal dari farnesyl pirofosfat (FPP,

C15), dan diterpenoids berasal dari pirofosfat geranylgeranyl (GGPP, C20). terpenoid

rangka Bahkan lebih tinggi mungkin melalui larutan intermediet ini untuk gugus

prekursor yang lebih besar. Sebagai contoh, sterol berasal dari triterpenoid squalene

(C30), yang berisi enam unit isoprena melalui kondensasi dua molekul FPP, dan

karotenoid (C40) sebagian besar dibentuk melalui kondensasi dua molekul GGPP untuk

menghasilkan senyawa-isoprena delapan unit . Setelah pembentukan terpenoid blok

bangunan asiklik struktural (misalnya, GPP, FPP, GGPP), synthases terpene bertindak

untuk menghasilkan kerangka terpena karbon utama. Tambahan transformasi sering

melibatkan oksidasi, reduksi, isomerisasi, dan enzim konjugasi menghias atau mengubah

kerangka utama dengan kelompok fungsional yang bervariasi untuk menghasilkan

keluarga terpenoid sangat beragam senyawa.

isopentenil difosfat (IPP) dan difosfat dimethylallyl (DMAPP) mengembun untuk

membentuk prekursor orde tinggi terpenoid, termasuk difosfat geranyl prekursor

monoterpenoid (GPP), yang farnesyl difosfat prekursor sesquiterpenoid (FPP) dan

geranylgeranyl difosfat prekursor diterpenoid (GGPP). Dua molekul mengembun FPP

untuk membentuk prekursor squalene triterpenoid, dan dua molekul mengembun GGPP

untuk membentuk tetraterpenoids orde tinggi.

Dua jalur yang berbeda menghasilkan C5 universal prekursor IPP dan DMAPP

(Skema 2). The mevalonate klasik (MVA) jalur ditemukan pada 1950-an dan dianggap

satu-satunya sumber prekursor IPP terpenoid dan DMAPP. Jalur MVA aktif pada bakteri,

tanaman, hewan dan jamur dan fungsinya dalam sitosol untuk umum memasok prekursor

untuk produksi seskuiterpen dan triterpen. Baru-baru ini, percobaan label pada bakteri

dan tanaman menunjukkan adanya jalur alternatif untuk menyediakan IPP dan DMAPP

(untuk review pada tumbuhan lihat ref 6,. 7, 8). Jalur ini, yang dinamakan setelah

prekursor berkomitmen pertama, 2-C-metil-D-erythritol-4-fosfat (MEP, jalur ini juga

kadang-kadang disebut sebagai jalur DXP), adalah plastidial di alam dan yang umumnya

digunakan untuk prekursor pasokan untuk produksi monoterpenoid, diterpenoids dan

tetraterpenoids. Meskipun interaksi antara jalur-jalur adalah sebagian besar masih belum

ditemukan, bukti terbaru telah mengungkapkan pertukaran intermediet antara sitosol dan

plastid9, 10, 11. Sebaliknya, studi isotop pelabelan dalam tembakau mendeteksi sedikit

pertukaran metabolit antara kompartemen di biosynthesis12 seskuiterpena. rekayasa

metabolik jalur tersebut akan mendapat manfaat secara signifikan dari pemahaman yang

lebih lengkap tentang ini kompartementalisasi dan transportasi.

(Waktu) Melalui mevalonate sitosol (MVA) jalur. HMGR, koenzim 3-hydroxy-3-

methylglutaryl reduktase A; IDI, isomerase difosfat isopentenil. (Kanan) Melalui jalur

plastidic MEP. DXS, sintase 1-deoksi-D-xylulose-5-fosfat; DXR, 1 reductoisomerase-

deoksi-D-xylulose-5-fosfat, HDS, sintasa difosfat 4-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenil;

IDS, isopentenil difosfat: sintase difosfat dimethylallyl, IDI, isomerase difosfat

isopentenil. panah putus-putus menunjukkan lebih dari satu langkah.

Terpenoid supply and study via plant cell culture

Meskipun beberapa terpenoid dihasilkan relatif jumlah besar dari sumber alam

(misalnya, minyak atsiri, resin dan malam), sering kali bernilai tinggi produk terpenoid

ditemukan dalam kelimpahan yang rendah di alam, dengan terpenoid sekunder biasanya

kurang dari 2-3% dari total berat kering. Sebagai contoh, sekitar 10.000 kg kulit kering

harus menyediakan 1 kg paclitaxel13, yang diterjemahkan menjadi harvestation dari kulit

2-4 pohon dewasa untuk memasok paclitaxel cukup untuk mengobati patient14 tunggal.

Ekstraksi dari sumber alami juga sangat bervariasi tergantung pada lokasi sumber

tanaman, dan musim panen, dan dapat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan yang tidak

terduga. Karena tingginya nilai produk ini terpenoid yang diturunkan dan tidak dapat

diandalkan saat panen dari sumber-sumber alam di pertemuan kedua perawatan pasien

dan kebutuhan evaluasi klinis, upaya signifikan telah diarahkan terhadap pengembangan

proses produksi terbarukan dan ramah lingkungan. rute alternatif untuk memasok

terpenoid mencakup total sintesis kimia, semisynthesis dari prekursor terisolasi, rekayasa

genetika jalur tanaman di host mikroba, dan budaya tanaman sel (misalnya lihat ref. 15).

Setiap metode menawarkan keuntungan yang berbeda dan kekurangan tergantung pada

sistem tertentu yang menarik. Total sintesis tidak bergantung pada bahan lapangan-

dewasa, tapi sering kompleks melibatkan kimia menggunakan pelarut yang kasar dan

biasanya menghasilkan hasil produk rendah, seperti halnya untuk paclitaxel (ditinjau

dalam ref. 16) dan artemisinin17 pasokan.

Pengalihan jalur biosintesis terpenoid ke host mikroba menawarkan keuntungan

seperti kimia ramah lingkungan, penggunaan sumber karbon murah, dan kemampuan

manipulasi genetika untuk meningkatkan yields18 (lihat Tabel 1 untuk perbandingan sel

bakteri dan tanaman). Selain itu, sel mikroba lebih bisa dikembangkan untuk digunakan

dalam proses skala besar. sel kecil relatif tidak sensitif terhadap tegangan induksi melalui

impeller pencampuran dalam bioreaktor. Menggandakan kali secara signifikan lebih

pendek dan karena itu kali budaya dapat diminimalkan, meningkatkan throughput dan

mengurangi kesempatan untuk kontaminasi. Tahap produksi biasanya uncoupled dari fase

pertumbuhan untuk produk mikroba, sehingga sistem dua fasa dengan formulasi media

yang optimal untuk pertumbuhan dan produksi dapat digunakan. metabolit tanaman

kadang-kadang bersamaan dengan fase pertumbuhan eksponensial budaya, seperti halnya

dengan paclitaxel19, dan karena itu dua-tahap budaya tidak selalu memungkinkan.

Meskipun keuntungan yang jelas untuk sel rekayasa mikroba untuk suplai terpenoid,

beberapa tanaman terpenoid jalur metabolisme yang terlalu kompleks untuk mentransfer

efisien atau sebagian undefined, dan karena itu jalur yang lengkap tidak dapat dibentuk

kembali dalam sistem mikroba. Selain itu, sitokrom P450 (CYP450) hydroxylases sering

terlibat dalam dekorasi kerangka karbon metabolit terpenoid kompleks (misalnya,

paclitaxel dan taxanes terkait), dan ekspresi mitra redoks untuk enzim P450 tantangan

untuk sintesis terpenoid yang maju di systems20 mikroba. Dengan demikian, produksi

pada spesies asli kadang-kadang diperlukan, dan dalam kultur sel keadaan adalah pilihan

yang layak.

kultur sel tanaman memberikan alternatif, ramah lingkungan terbarukan untuk

penyediaan metabolit sekunder. Berbeda dengan panen alam, kondisi budaya dapat secara

ketat dikontrol untuk memenuhi ketat AS Administrasi Makanan dan Obat persyaratan.

Manipulasi proses dan kondisi lingkungan dan / atau rekayasa metabolisme dari jalur

kunci dapat secara signifikan meningkatkan selektivitas dan hasil baik. Selain itu,

senyawa baru dapat disintesis melalui salah satu peraturan yang dikendalikan dari jalur

biosintesis yang melekat atau direkayasa jalur metabolik. Kultur sel tanaman telah

dieksplorasi dalam produksi senyawa terpenoid dan terpenoid yang diturunkan banyak,

terutama bernilai tinggi produk farmasi seperti TIA dari Catharanthus roseus21, taxanes

dari Taxus sp.15, 22, 23, dan artemisinin dari Artemisia annua24. Cell budaya juga telah

diteliti untuk produksi agen farmasi aktif lainnya seperti shikonin dari Lithospermum

erythrorhizon25, berberin dari Coptis japonica26,, 27 camptothecin dari kedua

Camptotheca acuminata27, 28 dan Nothapodytes foetida29, dan hypericins dari

Hypericum perforatum30. Banyak proses telah dikembangkan dengan menggunakan

tanaman kultur suspensi sebagai akibat dari kemudahan dalam skala-up dan penerapan

strategi optimasi tradisional dikembangkan untuk sistem sel mikroba dan mamalia.

Namun, produksi metabolit sekunder seringkali lebih tinggi pada jaringan dibedakan;

sehingga budaya akar rambut yang telah berubah secara genetik dengan Agrobacterium

spp. juga telah secara luas used31, 32. Taxus spp. Kultur suspensi sel merupakan

keberhasilan teknologi kultur sel di Amerika Serikat dengan kelayakan terbukti dengan

Bristol-Myers Squibb dan Phyton Biotech, Inc (sebuah perusahaan DFP Farmasi) dalam

memasok paclitaxel untuk perumusan Taxol Bristol-Myers Squibb's. Selain itu, Samyang

Genex telah dikomersialisasikan proses untuk produksi paclitaxel melalui sel tanaman

culture33. kultur sel tanaman tidak hanya berguna dalam penyediaan terpenoid yang

berharga, tapi juga bisa sangat berharga dalam mengisolasi gen yang sebelumnya tak

dikenal metabolisme terpenoid. Contoh terbaik adalah penjelasan dari jalur biosintesis

paclitaxel (lihat di bawah untuk informasi lebih lanjut).

Sebuah tantangan utama untuk penggunaan komersial biasa teknologi kultur sel

tanaman variabilitas dalam akumulasi produk. Tidak seperti sistem mikroba, di mana

produktivitas diprediksi, sistem budidaya tanaman menunjukkan variasi yang signifikan

dalam pembentukan produk. Bahkan, keragaman telah dikutip sebagai isu yang paling

penting yang dihadapi penggunaan spp Taxus. sel budaya untuk penyediaan komersial

paclitaxel34. Tingkat tertinggi dari akumulasi paclitaxel telah diamati untuk berbeda

dengan sepuluh kali lipat antara garis sel dan di dalam baris sel sampel atas time35.

Karena sifat tanaman divisi seluler dan ketahanan lamella tengah yang kaya pektin yang

semen sel bersama-sama, agregat mengandung mana saja dari approx2-50 sel yang khas

dalam kultur sel tanaman. Karena ukuran dari agregat sel tanaman, yang dapat mencapai

2 mm, microenvironments heterogen berkaitan dengan oksigen dan ketersediaan hara

diciptakan dalam suatu agregat. Sel menuju pusat suatu agregat secara metabolisme dan

morfologi yang berbeda dari sel-sel di dekat pinggiran sebuah aggregate36. Kehadiran

microenvironments tersebut (di mana Taxus spp metabolisme sel. Diubah) dalam budaya

yang sama dapat berkontribusi terhadap variabilitas diamati dalam hasil paclitaxel.

Sebagian besar penelitian saat diarahkan pemahaman variabilitas dengan menganalisis

budaya rata-rata total (yaitu, sampling sebuah batch seluruh sel dan rata-rata lebih dari

mereplikasi batch). Laboratorium kami baru-baru ini mengembangkan metode analisis

aliran populasi cytometric untuk karakteristik heterogenitas dalam Taxus spp. sel

cultures36, 37, 38, 39, 40. Sebagai informasi lebih banyak ditemukan pada tingkat sel

tunggal untuk kultur jaringan tanaman, populasi bisa lebih baik direkayasa untuk

meningkatkan produktivitas dan stabilitas terpenoid.

Bioengineering of terpenoids in plant cell culture

Produksi terpenoid produk bernilai tinggi melalui kultur sel adalah proposisi yang menarik, namun hasil yang rendah dan tingkat tinggi variabilitas dalam akumulasi metabolit menyulitkan biasa menggunakan teknologi kultur sel tanaman untuk suplai terpenoid pada skala besar. Meskipun telah ada kemajuan baru-baru ini kunci dalam mendefinisikan jalur biosintesis terpenoid dan dalam memahami peraturan mereka (lihat di bawah), masih ada berbagai tantangan yang terkait dengan sel-sel tumbuhan rekayasa untuk meningkatkan akumulasi senyawa terpenoid: undefined terpenoid jalur biosintesis metabolit sekunder, kebutuhan akan peraturan terkoordinasi langkah-langkah yang mempengaruhi tingkat-ganda, kurangnya analisis sistem-lebar pada tanaman dan kultur sel tanaman karena fakta bahwa genom tanaman begitu sedikit yang telah diurutkan, ketidakmampuan untuk mentransfer informasi yang diperoleh dari studi keseluruhan-tanaman dengan lingkungan kultur sel, variabilitas dalam terpenoid akumulasi produk dari waktu ke waktu dan antar budaya sampel pada saat yang sama, kurangnya promotor diinduksi tanaman, kesulitan dalam menerapkan metode tradisional transformasi genetik untuk sistem kultur sel kunci, dan kompartemensi metabolisme terpenoid. Meskipun

tantangan ini, kemajuan signifikan telah dibuat dalam beberapa tahun terakhir untuk mewujudkan tujuan metabolisme rekayasa terpenoid pada kultur sel tanaman. Bagian berikut ini akan menyoroti kemajuan penting dan menyarankan strategi yang potensial untuk metabolisme rekayasa terpenoid, dengan fokus khusus pada metabolit sekunder obat yang sebagian besar kemajuan yang signifikan dalam teknologi kultur sel tanaman telah dibuat.

Untuk insinyur jalur terpenoid, yang mempengaruhi tingkat-langkah harus diidentifikasi. Paling sering keterbatasan tingkat terjadi di dalam jalur biosintetik. Karena banyak jalur biosintesis terpenoid tetap sebagian undefined, berbagai metode telah digunakan untuk mengidentifikasi gen terpenoid jalur biosintetik dan menjelaskan peraturan jalur: seleksi mutan, membungkam gen, overekspresi gen melalui rekayasa genetik, makan prekursor, penerapan inhibitor metabolik, dan enzim induksi dengan elisitasi (penggunaan senyawa eksogen untuk menginduksi ekspresi gen). Salah satu yang paling umum diterapkan Elisitor metabolisme terpenoid adalah asam jasmonic, atau metil ester yang jasmonat metil. Sejak pertama kali diterbitkan penggunaan asam jasmonic sebagai penginduksi biosintesis metabolit sekunder dalam kultur jaringan tanaman di 199241, telah terjadi peningkatan yang stabil dalam jumlah publikasi yang mengandung 'tanaman' syarat dan 'asam jasmonic' baik atau ' metil jasmonat '(1.024 tahun 2002-2006 versus 1997-2000 versus 526 di 199 pada tahun 1992-1996; courtesy Web of Science, Thomson Scientific). elisitasi Enzim adalah alat yang ampuh untuk mengidentifikasi langkah-langkah regulasi dalam biosintesis terpenoid.

Terpenoid biosynthesis for precursor supply

Sebuah strategi umum untuk sintesis rekayasa terpenoid adalah fokus pada

peningkatan fluks untuk meningkatkan kolam prekursor IPP dan DMAPP, dengan

kloning gen yang diperlukan dan pemahaman peraturan baik MVA dan jalur pasokan

MEP. Semua gen jalur telah diidentifikasi (ditinjau dalam ref 7,42.), Namun kontribusi

relatif dari enzim tertentu untuk mengendalikan fluks global melalui jalur dan antara

kompartemen untuk memasok terpenoid sebagian besar tidak diketahui. Banyak bukti

telah muncul tentang pengaruh enzim terisolasi pada akumulasi terpenoid (disajikan di

bawah), tetapi gambaran yang lengkap kontrol fluks yang dibutuhkan untuk rekayasa

metabolik yang optimal memerlukan penelitian atas sistem yang lebih luas, yang sejauh

ini masih kurang.

MVA jalur untuk pasokan dari IPP dan DMAPP. Meskipun banyak terpenoid

penting dan senyawa terpenoid yang diturunkan disintesis melalui kultur sel berasal dari

IPP dan DMAPP dihasilkan melalui jalur MEP, studi terbaru menunjukkan cross-talk

antara MVA dan jalur MEP menunjukkan bahwa rekayasa dari jalur MVA untuk

pembentukan IPP dapat berguna dalam pengendalian biosintesis terpenoid plastidial.

Jalur MVA klasik didefinisikan dengan baik, dan banyak penelitian telah menunjukkan

pentingnya koenzim 3-hydroxy-3-methylglutaryl A reduktase (HMGR). HMGR secara

ketat diatur dalam sistem tanaman, dan elisitor-induced HMGR gen telah diklon dan

dikarakterisasi dalam sistem berbagai tanaman termasuk tembakau, tomat, kentang, beras

dan terakhir pepper43, dengan induksi sering dikaitkan dengan biosintesis terpenoid

meningkat. Sebagai contoh, overekspresi HMGR menyebabkan peningkatan akumulasi

sterol tobacco44 dan tomato45. Kloning dan analisis ekspresi gen HMGR baru saja

dimulai di penting sistem kultur sel komersial. Sebuah gen HMGR dari media Taxus

milik keluarga kecil gen kloning yang menunjukkan homologi tinggi untuk HMGRs46

tanaman lainnya. Analisis ekspresi HMGR dalam budaya akar rambut A. annua L.

menunjukkan kontrol temporal, tetapi tidak berkorelasi dengan akumulasi artemisinin47.

Sebuah gen HMGR hamster itu overexpressed dalam C. roseus akar berambut, sehingga

pola diferensial akumulasi alkaloid, yang menunjukkan peran potensial dalam mengatur

biosynthesis48 HMGR alkaloid.

MEP jalur untuk pasokan dari IPP dan DMAPP. Penelitian yang ekstensif telah

dilakukan untuk menjelaskan MEP peraturan jalur (untuk ringkasan jalur dan hubungan

untuk sintesis terpenoid melihat ref 6,49,50 dan Skema 2.). Awal enzim jalur telah

terbukti mempengaruhi tingkat-di akumulasi terpenoid dalam berbagai sistem. Sebagai

contoh, berlebih dari 1-deoksi-D-xylulose-5-fosfat (DXP) sintase (DXS) berkorelasi

dengan meningkatnya akumulasi minyak atsiri di lavender51 transgenik, akumulasi

ginkgolide di Ginkgo biloba52, akumulasi karotenoid dalam Arabidopsis thaliana53 dan

beta-karoten akumulasi dalam Jacq54 kelapa sawit Elaeis guineensis. Ekspresi dari DXP

reductoisomerase (DXR) dalam peningkatan produksi minyak peppermint monoterpene

penting oleh 40-60% 55. tanaman transgenik A. thaliana dengan DXS diubah dan tingkat

enzim DXR dikumpulkan melalui penyaringan untuk ketahanan diubah menjadi inhibitor

metabolik dari jalur MEP. Downregulation dari DXR mengakibatkan fenotipe mewakili

terpenoid produksi menurun, sedangkan upregulation DXR mengakibatkan peningkatan

positif dalam terpenoid plastid-turunan seperti klorofil dan carotenoids56.

Pengaruh langkah-langkah terakhir dalam jalur MEP, yang dikatalisis oleh sintase

4-difosfat enzim 1-hidroksi-2-methyl-2-(E)-butenil (HDS) dan isopentenil difosfat:

sintase difosfat dimethylallyl (IDS), serta reaksi interkonversi antara IPP dan DMAPP,

yang dikatalisis oleh isomerase difosfat isopentenil (IDI), baru-baru ini diselidiki oleh

membungkam pasca-transkripsi menggunakan tembakau berdetak virus (TRV) 57.

Silencing dari HDS dan IDS menghasilkan tanaman dengan daun yang mengandung <4%

dari klorofil dan karotenoid tanaman kontrol. Selain itu, membungkam langkah

isomerisasi menghasilkan tanaman dengan pengurangan 80% pada pigmen dibandingkan

dengan kontrol. Hasil ini menunjukkan kegunaan membungkam gen dalam memahami

peraturan jalur terpenoid dan menyarankan bahwa IDI diperlukan untuk jalur MEP

berfungsi penuh.

Kloning dan analisis ekspresi gen jalur MEP baru-baru ini dimulai dalam sistem

kultur sel tanaman komersial penting. Enzim kelima di jalur MEP, sintasa 2,4-

cyclodiphosphate 2-C-metil-D-erythritol (MCS), baru-baru ini kloning dan ditandai dari

Taxus media58. Jalur MEP baru-baru ini terbukti fungsional dalam akar A. annua

cultures59. Klon untuk DXS dan DXR diisolasi dari perpustakaan DNA komplementer,

dan fungsi dikonfirmasi melalui analisis komplementasi di Escherichia coli. Baik umur

kultur dan tingkat cahaya dipengaruhi tingkat transkrip, dengan cahaya kontinyu yang

paling menguntungkan. Karena kultur sel banyak proses untuk penyediaan terpenoid

metabolik sekunder beroperasi dalam gelap untuk memaksimalkan produktivitas, plastida

selain kloroplas yang fungsional. Penelitian lebih lanjut tentang pengoperasian dan

pengaturan jalur MEP dalam plastida nongreen seperti amyloplasts, chromoplasts atau

proteinoplasts akan memberikan wawasan baru untuk rekayasa sistem kultur sel tanaman.

Inhibitor studi dengan fosmidomycin (menghambat jalur MEP oleh DXR

menghambat), mevinolin (menghambat jalur MVA oleh HMGR menghambat),

mevastatin (menghambat jalur MVA oleh HMGR menghambat), D, L-gliseraldehida

(DLG; inhibitor transportasi IPP ke dalam plastida) dan natrium pirofosfat (NAPP;

substrat analog IPP yang mengganggu dengan serapan plastid IPP) dilakukan pada Taxus

spp. kultur suspensi untuk menentukan kontribusi relatif dari jalur MVA dan MEP di

akumulasi taxane. Dalam penelitian dengan baccata Taxus, produksi taxane secara

signifikan lebih negatif dipengaruhi oleh penambahan fosmidomycin dibandingkan

dengan mevinolin, yang menunjukkan kontribusi yang lebih besar pasokan dari IPP, MEP

pathway60 61. Penurunan produksi taxane dengan penambahan mevastatin menunjukkan

bahwa jalur MVA dapat berkontribusi untuk IPP supply62. Penghambatan IPP

transportasi ke plastida mengakibatkan penurunan produksi taxane, khususnya dalam

budaya, stadium akhir period62 63 (yaitu, 14 hari), lagi-lagi menunjukkan beberapa

pasokan IPP dari jalur MVA. Inhibitor studi perlu dianalisis dengan hati-hati karena isu-

isu potensial dengan spesifisitas, kelarutan, penyerapan, dan transportasi untuk

memperbaiki kompartemen. Kontribusi persentase dari setiap jalur untuk pasokan IPP

untuk produksi taxane hanya dapat definitif ditentukan dari studi pelabelan, yang belum

dilakukan.

Terpenoid secondary metabolite biosynthesis and regulation

Banyak tanaman jalur metabolit sekunder yang sebagian undefined, dan karena itu

penjelasan dari jalur dan regulasi yang diperlukan untuk biosintesis langsung lebih baik

dalam kultur sel tanaman. Bagian ini akan berfokus pada kemajuan dalam Taxus spp.

untuk produksi paclitaxel agen antikanker, meskipun strategi yang disajikan di sini

umumnya berlaku untuk sistem penting lainnya tanaman terpenoid metabolisme

sekunder.

Paclitaxel adalah diterpenoid siklik dan polyoxygenated mengandung substitusi

beberapa kelompok fungsional, cincin oxetane, dan suatu rantai samping phenylisoserine-

berasal. biosintesis Paclitaxel diawali dengan pembentukan GGPP dan putatively

melibatkan 19 steps64 tambahan. Jalur biosintetik taxane seperti yang saat ini dikenal

secara organisasi dapat dibagi menjadi langkah-langkah berikut (Skema 3): (1)

pembentukan prekursor taxane pertama berkomitmen, taxadiene; (2) penambahan

oksigen tujuh kelompok fungsional dan dekorasi inti karbon dengan reaksi asilasi, (3)

oksidasi fungsi keton dan pembentukan cincin oxetane; (4) perakitan dari rantai samping;

(5) konjugasi rantai sisi ke intermediate taxane (baccatin III kemungkinan) dan reaksi

modifikasi terakhir untuk menghasilkan sisi rantai yang mengandung taxanes seperti

paclitaxel. Awal bekerja di jalur langkah cerdas dilakukan pada jaringan tanaman secara

keseluruhan, tapi tantangan logistik spp Taxus. koleksi tanaman dan sifat lambat tumbuh

anakan mendorong peneliti untuk menggunakan Taxus spp. sel budaya sebagai sumber

terbarukan material65. Menggunakan pendekatan molekuler langsung, laboratorium

Croteau mengembangkan strategi yang sangat sukses untuk mengungkap langkah jalur

taxane biosintetik, yang melibatkan menggunakan sistem sel-bebas untuk menunjukkan

aktivitas enzim melalui penambahan substrat putatif dan penerapan prekursor makan

studi dengan baik tanaman atau kultur sel , diikuti oleh isolasi product65 metabolit.

Untuk mendapatkan cDNA pengkodean masing-masing enzim jalur, pencarian homologi

berbasis digunakan dalam hubungannya dengan perpustakaan tampilan diferensial

dihasilkan melalui perbandingan budaya unelicited dengan yang ditimbulkan dengan

metil jasmonate65.

DMAPP dan IPP dihasilkan dari jalur MEP plastidic dan pekat oleh GGPP sintase (GGPPS) untuk membentuk GGPP. (1) komitmen pertama prekursor biosintesis taxane, taksa-4 (5), 11 (12)-diena dihasilkan oleh sintase taxadiene (TS). (2) Serangkaian hydroxylations P450 dan asilasi menghasilkan taxane putatif menengah. (3) Non-side-rantai taxanes (termasuk baccatin III) yang dihasilkan baik melalui reaksi oksidasi dan pembentukan cincin oxetane. (4) bagian rantai samping berasal dari alfa-fenilalanin. (5) rantai samping ditambahkan ke prekursor taxane non-side-rantai putatif (III baccatin mungkin), dan taxanes sisi paclitaxel dan lain rantai terbentuk. Ac, asetil; Bz, benzoil. panah putus-putus menunjukkan lebih dari satu langkah.

Selain kesenjangan dalam pemahaman kita tentang jalur biosintesis paclitaxel,

aspek-aspek lain dari metabolisme paclitaxel tetap misterius. Dalam jalur ini, peraturan

dapat diselidiki dengan membandingkan program ekspresi gen waktu untuk taxane

akumulasi dalam kultur sel. Baru-baru ini, ekspresi gen sepuluh jalur dibandingkan dari

waktu ke waktu di kedua sel jasmonat-menimbulkan unelicited dan metil cultures66.

langkah Hilir dalam jalur telah diidentifikasi sebagai kandidat yang sangat baik untuk

menilai keterbatasan, karena transkrip tidak hadir dalam budaya unelicited sebagaimana

ditentukan baik melalui utara blotting dan RT-PCR. Data ini tambahan menetapkan

preferensi untuk satu cabang di pathway66 biosintesis taxane, sehingga memberikan

petunjuk lebih lanjut tentang cara terbaik untuk mengendalikan fluks metabolisme.

Namun, pertanyaan besar tetap. Sebagai contoh, beberapa gen yang bertanggung

jawab untuk oksigenasi dalam struktur cincin inti taxane belum teridentifikasi, dan

reductases CYP450 bertanggung jawab untuk elektron yang berganti ke hydroxylases

monooxygenases CYP450 atau belum ditandai. Selain itu, tidak ada unsur-unsur

peraturan yang berkaitan dengan metil jasmonat isyarat atau biosintesis paclitaxel, seperti

aktivator transkripsi, telah diklon dari spp Taxus. Di luar jalur biosintesis langsung,

langkah-langkah regulasi dalam metabolisme sekunder mungkin ada dalam transportasi

dan produk intermediet baik ke kompartemen intraselular atau ke ruang ekstraseluler

dalam kultur jaringan tanaman, atau produk degradasi baik dalam ruang intraseluler atau

ekstraseluler (Gbr. 2) . Transportasi dan degradasi paclitaxel in planta dan dalam budaya

tanaman sel juga tetap tidak diketahui. Sebuah membran plasma mengikat ATP-kaset-tipe

transporter ditemukan terlibat dalam sekresi terpenoid pertahanan dari sel

plumbaginifolia Nicotiana cultures67, dan analog protein transpor yang spesifik juga

dapat terlibat dalam sekresi taxane.

intermediet metabolisme primer sebagian besar diproduksi dalam sitosol dan diangkut ke plastid untuk konversi melalui jalur metabolik sekunder. metabolit sekunder yang diangkut dari plastid baik untuk penyimpanan atau sekresi pada media ekstraseluler. metabolit sekunder Hidrofilik disimpan dalam kompartemen berair seperti vakuola, sedangkan metabolit sekunder hidrofobik disimpan dalam dinding sel. Produk bisa diturunkan baik intrasel maupun ekstrasel, dan metabolit degradatif dapat diangkut masuk dan keluar dari sel dan digunakan kembali di kedua metabolisme primer dan sekunder.

Nondirect pendekatan telah digunakan untuk menentukan gen biosintesis putatif

dan unsur-unsur peraturan di daerah lain metabolisme paclitaxel. Sebagai contoh, sebuah

strategi sekuensing acak dengan menggunakan sebuah perpustakaan cDNA paclitaxel-

terakumulasi telah mengidentifikasi sepuluh CYP450s baru di paclitaxel-mengumpulkan

cuspidata Taxus cells64. CYP450 klon ini memiliki kesamaan yang tinggi (> 75%) untuk

dikenal oxygenases CYP450 paclitaxel-terkait dan kesamaan rendah untuk hydroxylases

sitokrom tanaman lainnya, yang sangat berarti hubungan dengan paclitaxel biosintesis.

Untuk mengidentifikasi gen pengatur nonbiosynthesis-terkait, pendekatan yang lebih

global diperlukan. Analisis gen diferensial disajikan antara dua negara fisiologis

(misalnya, paclitaxel vs paclitaxel nonaccumulating mengumpulkan) dapat memberikan

banyak informasi tentang gen yang terlibat dengan mengatur keadaan tertentu. Sebagai

contoh, metode tampilan diferensial telah diterapkan untuk mengidentifikasi gen yang

berhubungan dengan paclitaxel biosynthesis68. populasi mRNA dibandingkan dari sel

chinensis Taxus sebelum dan setelah melakukan sintesis paclitaxel, dan satu klon

bertekad untuk secara khusus dinyatakan dalam fase paclitaxel-produksi budaya.

Meskipun gen diduga tidak lagi ditandai, studi ini menunjukkan potensi untuk

pendekatan skala besar untuk mengidentifikasi gen baru. metode tampilan Diferensial

juga telah digunakan untuk menjelaskan ekspresi gen alkaloid dalam sampel daun dan

akar dari C. roseus69, untuk menyelidiki interaksi simbiosis antara truncatula Medicago

dan Sinorhizobium meliloti70 dan untuk mengidentifikasi gen baru yang terlibat dalam

xylogenesis dari Eucalyptus71.

Progress in metabolic engineering of terpenoids in plants

Beberapa hasil yang paling menjanjikan telah diamati dengan ketersediaan rekayasa

prekursor melalui penargetan jalur MVA dan MEP (ditinjau dalam ref 72,73.). Terpenoid

rekayasa metabolik hilir langkah jalur metabolit sekunder telah lebih terbatas, sebagian

karena kurangnya jalur baik definisi dan pemahaman peraturan, tetapi beberapa

keberhasilan telah dilaporkan untuk taxanes, alkaloid dan artemisinin. Dalam salah satu

contoh diterbitkan pertama, sintesis skopolamin diinduksi di belladonna Atropa

memperkenalkan pada pengkodean gen hiosiamin-6beta-hydroxylase74. sintase Farnesyl

difosfat (FPPS) menghasilkan prekursor sesquiterpene FPP, dan berlebih dari gen kapas

FPPS dalam annua A. transgenik menghasilkan tiga-untuk menghasilkan empat kali lipat

lebih tinggi dari artemisinin di roots75 berbulu. Baru-baru ini, sebuah makalah yang

menarik menunjukkan bahwa penargetan amorpha sintase-4 coexpressed ,11-diena

(ADS) dan FPPS ke plastida dalam tembakau secara dramatis meningkatkan akumulasi

dari prekursor amorpha artemisinin-4 ,11-diene12. Salah satu sistem yang paling baik

dipelajari dan sukses dalam hal rekayasa metabolis TIA biosintesis di C. roseus, di mana

meningkatkan hasil alkaloid dan profil telah dicapai dengan berbagai kondisi

transformasi (untuk review terbaru lihat ref. 21).

Rekayasa genetika spp Taxus. suspensi sel dengan gen yang mempengaruhi tingkat-

putatif tidak mungkin karena kurangnya metode yang dapat diandalkan untuk transfer

gen. Namun, protokol transformasi Agrobacterium baru spp.-dimediasi baru-baru ini

telah didirikan untuk spp Taxus. suspensi budaya dengan transformasi yang stabil sampai

dengan 20 months76, yang sekarang memungkinkan rekayasa metabolik spp Taxus. sel

dengan gen peraturan yang berlaku. Selain dari laporan ini baru-baru ini, gen taxane jalur

fungsional biosintetik telah disajikan dalam kedua E. coli77 dan Saccharomyces

cerevisiae78, dan lima gen sekuensial telah diubah menjadi ragi tunggal host78.

Meskipun taxadiene antara jalur diamati, produk-produk berikut yang hidroksilasi

CYP450 pertama tidak detected78. Masalah ini dapat dikurangi dengan peningkatan

aktivitas redoks diperlukan. Coexpression dalam ragi dari reduktase CYP450 bersama

dengan hidroksilase CYP450 taxane biosintetik (10beta-hidroksilase) menghasilkan

peningkatan signifikan dalam aktivitas hidroksilase dibandingkan dengan ragi tidak

memiliki reductase79 cotransformed. Baru-baru ini, langkah pertama untuk sintesis

teknik paclitaxel dalam tanaman inang alternatif telah accomplished80, 81. Sebuah

sintase taxadiene terisolasi dari baccata T. konstitutif disajikan dalam thaliana A. untuk

menghasilkan taxadiene80. Pertumbuhan keterbelakangan dan penurunan pigmen

fotosintesis disarankan pengalihan total fluks dari jalur terpenoid lainnya. Sintase

taxadiene adalah tambahan konstitutif disajikan dalam buah tomat transgenik, mencapai

hasil yang lebih besar dari 600 kali lebih tinggi dari hasil maksimal yang dilaporkan

dalam A. thaliana81. Ekspresi enzim kunci jalur taxane biosintetik dalam sistem host

alternatif akan memungkinkan tidak hanya memasok intermediet jalur, tetapi juga sistem

untuk karakterisasi gen jalur baru ditemukan. Ekspresi dari jalur biosintesis lengkap

taxane di host alternatif sangat tidak mungkin diberikan kompleksitas jalur, jadi rekayasa

langsung di Taxus spp. adalah pendekatan yang paling menjanjikan untuk meningkatkan

pasokan paclitaxel.

Future directions in metabolic engineering of terpenoids

Meskipun kemajuan terbaru dan hasil yang menjanjikan di bidang teknik

metabolik terpenoid, masih ada berbagai daerah di mana kemajuan yang signifikan dapat

dibuat. upaya rekayasa metabolik akan ditingkatkan melalui analisis sistem-macam

tanaman dan kultur sel. jaringan reaksi tanaman secara signifikan lebih kompleks

daripada sistem mikroba. Jalur redundansi dan keterlibatan beberapa kompartemen

intraselular menyulitkan upaya fluks analisis. Manipulasi langkah enzimatik tunggal telah

menghasilkan kesuksesan yang tak terduga. Dalam rekayasa sintesis karotenoid, enzim

berkomitmen pertama, sintase phytoene (Psy), telah ditargetkan untuk rekayasa

metabolik. Namun, overekspresi Psy menyebabkan cacat pertumbuhan tomat akibat

pengalihan fluks dari giberelin synthesis82. Contoh ini menunjukkan pentingnya

memahami dampak keseluruhan dari manipulasi gen tunggal pada produk hilir tambahan.

Karena jalur metabolik sekunder seringkali undefined, pendekatan yang menjanjikan

untuk rekayasa metabolik efektif adalah penggunaan transkripsi, spesifik factors83 84.

Karena banyak metabolit sekunder yang berhubungan dengan pertahanan, peraturan

mereka erat terkoordinasi baik temporal dan spasial pada tumbuhan tingkat tinggi dan

mungkin kultur sel, dan faktor-faktor transkripsi dapat digunakan untuk mengendalikan

baik seluruh jalur atau cabang khusus untuk menghasilkan hasil yang diinginkan

terpenoid dan distribusi.

Saat ini, hanya dua genom tanaman telah benar-benar diurutkan-beras dan A.

thaliana-dan karena itu tradisional "omics" analisis pada tanaman dan kultur sel telah

sebagian besar terbatas pada sistem ini. Beberapa tantangan termasuk anotasi gen

tanaman yang hanya didasarkan pada urutan homologi gen yang diketahui atau fungsi

diprediksi systems85 lain. Misalnya, hanya 15% dari tanaman CYP450s putatif telah

ditandai biochemically85 fungsional. Oleh karena itu, penjelasan yang didasarkan pada

pengetahuan mutlak fungsi sangat terbatas. Karena terpenoid begitu beragam dan banyak

itu menantang untuk mengidentifikasi semua senyawa terpenoid dan terpenoid yang

diturunkan melalui analisis metabolomik dalam pabrik atau sistem sel kultur. Sebagai

contoh, lebih dari 350 taxanes telah isolated86, 87, dengan lebih dari 30 taxanes berbeda

secara bersamaan terakumulasi dalam sel culture88. Oleh karena itu, sebagian besar

metabolit analisis dengan spp Taxus. fokus pada identifikasi dan kuantifikasi taxane

metabolit kunci seperti paclitaxel dan baccatin III. Namun, identifikasi dan kuantifikasi

dari kolam metabolit lengkap taxane serta senyawa terpenoid yang diturunkan lain yang

hadir dalam kondisi tertentu dalam suatu budaya sel lebih lanjut akan memungkinkan

desain strategi untuk meningkatkan hasil taxanes yang diinginkan, yang menunjukkan

jalur harus dicegah dan yang jalur harus diinduksi. Integrasi genomik tanaman,

transcriptomik, proteomik dan dataset metabolomik adalah dalam masa pertumbuhan,

namun hasil awal yang promising85 dan kemajuan sedang dibuat dalam pemodelan

matematik plant metabolisme pathways89. Genome analisis fungsional genomik terutama

yang telah terbatas pada sistem tanaman model, tetapi baru-baru ini sebuah analisa yang

komprehensif profiling kedua transkrip (417) dan metabolit (178) dilakukan dalam sel C.

roseus cultures90. Gene-ke-gen dan jaringan gen-ke-metabolit yang dihasilkan, dan

mereka membantu mengungkap perbedaan regulasi di jalur utama metabolisme alkaloid.

Data ini dapat diterapkan untuk lebih memahami metabolisme sekunder dan regulasi

dalam sistem ini penting tanaman obat.

Secara keseluruhan, uang muka menarik dan penting telah dilakukan di kedua

karakterisasi dan pengalihan jalur metabolisme yang terlibat dalam sintesis terpenoid.

Manipulasi metabolisme tanaman melalui rekayasa metabolisme secara signifikan lebih

rumit daripada manipulasi sistem lebih mikroba dipelajari dengan baik, tetapi hal ini

menjadi semakin mungkin karena kemajuan dalam sistem analisis tanaman dan kultur sel.

Sel tanaman teknologi budidaya adalah platform yang sangat baik baik untuk penyediaan

senyawa terpenoid dan untuk identifikasi dan isolasi gen biosintesis baru dan peraturan

terpenoid. Saat ini, pasokan paclitaxel tergantung pada teknologi sel tumbuhan budaya

dan merupakan kisah sukses besar untuk teknologi ini muncul di Amerika Serikat.