Slide 1

TEKNIK PCRRIA EKAYATINURRAHMA FITRIANIFITRIA ATTAMIMIAINUTAJRIANIWAHYUNI IYAJUMARDI KAMARUDDIN

Q-PCR

A real-time polymerase chain reaction adalah teknik laboratorium biologi molekuler berdasarkan polymerase chain reaction (PCR ) , yang digunakan untuk memperkuat dan sekaligus mendeteksi atau mengukur molekul DNA yang ditargetkan .

Q-PCR memungkinkan identifikasi tertentu, fragmen DNA diamplifikasi menggunakan analisis suhu leleh mereka (juga disebut nilai Tm, dari suhu leleh). Metode yang digunakan biasanya PCR dengan pewarna DNA-binding untai ganda sebagai wartawan dan pewarna yang digunakan biasanya SYBR Green. Suhu leleh DNA khusus untuk fragmen diperkuat. Hasil dari teknik ini diperoleh dengan membandingkan kurva disosiasi sampel DNA dianalisis. Kegunaan Q-PCR

Kuantitatif PCR dapat digunakan untuk mengukur asam nukleat oleh dua metode umum:. Relatif kuantifikasi dan kuantifikasi mutlak Absolute kuantifikasi memberikan jumlah yang tepat dari molekul DNA target dibandingkan dengan standar DNA menggunakan kurva kalibrasi. Oleh karena itu penting bahwa PCR dari sampel dan standar memiliki efisiensi amplifikasi yang sama.

Reverse Transcription PCR (RT-PCR)

Reverse Transcription PCR (RT-PCR) adalah salah satu dari banyak varian teknik PCR. Teknik ini biasanya digunakan dalam bidang biologi molekuler untuk mendeteksi tingkat ekspresi RNA. Sering terjadi kesalah pahaman di antara pelajar dan peneliti dengan definisi RT-PCR ini yang menganggap bahwa RT-PCR adalah Real-Time PCR (qPCR). Padahal kedua jenis teknik PCR ini sangatlah berbeda. Sementara RT-PCR digunakan untuk mendeteksi secara kualitatif ekspresi gen melalui penciptaan komplementer transkrip DNA (cDNA) dari RNA, qPCR digunakan untuk mengukur secara kuantitatif amplifikasi DNA menggunakan probe ber-fluoresense. RT-PCR pun berbeda dengan teknik PCR biasa walaupun keduanya sama-sama menghasilkan jutaan salinan DNA melalui amplifikasi. RT-PCR digunakan untuk mengkloning gen yang diekspresikan oleh transkripsi RNA target menuju DNA komplemen (cDNA) menggunakanreverse transcriptase. Kemudian, cDNA baru diamplifikasi menggunakan PCR biasa.

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) adalah metode untuk mendeteksi dengan cepat genomic polymorphisms. Teknik ini menggunakan oligonukleotida primer tunggal dan pendekyang akan menempel secara acak dalam proses PCR, menghasilkan serangkaian produk untukdianalisis dengan gel elektroforesis.

RAPD merupakan modifikasi dari teknik PCR (Polymerase Chain Reaction), yaitu suatu teknikmolekuler yang dapat memperbanyak satu atau lebih bagian DNA hingga jutaan kali secara cepat dan tepat. Pola pita DNA dapat dilihat setelah melalui elektroforesis dan disinari dibawah UV. Pola pita tersebut berpeluang berbeda satu sama lainnya,yang menunjukkan adanya variasi genetik.

Prinsip kerja RAPD

Prinsip kerja dari RAPD yaitu semua pita DNA yang berukuran sama hasil dari amplifikasi dapat dikelompokkan menjadi satu tanpa perlu mengetahui urutan DNAnya. Analisis dalam upaya pemuliaan tanaman, genetika populasi, maupun biodiversitas yang menggunakan sampel dalam jumlah besar sangat cocok menggunakan metode ini. RAPD telah banyak digunakan dalam berbagai analisis, namun tidak menutup kemungkinan adanya kelemahan dari metode iniKelemahan utama RAPD adalah sifatnya yang dominan, sehingga hasilnya kurang akurat. Penggunaan RAPD juga dapat memberikan hasil yang berbeda apabila diulang. Namun, hal ini tidak menjadi masalah apabila proses isolasi DNA telah dioptimalkan dengan baik, serta adanya konsistensi kondisi PCR. RAPD mempunyai keterbatasan, salah satunya adalah tidakdapat membedakan individu homozigot dan heterozigot karena bersifat sebagai penanda dominan. Adanya perubahan sekecil apapun dalam reaksi dapat mengubah jumlah dan intensitasproduk amplifikasi sehingga keterulangan sulit untuk dipertahankan.

Teknik RAPD

Teknik RAPD didasarkan atas kemampuan primer menempel pada cetakan DNA. Sensitivitas dan spesifitas yang tinggi dapat dicapai dengan penggunaan primer yang tepat, karena desain primer sangat mempengaruhi keberhasilan amplifikasi. Primer yang mengandung GC 30-70% sangat optimal dalam proses amplifikasi, adapun proporsi primer yang cocok untuk eukariot khususnya fungi yaitu 60%.RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).

Teknik berbasis DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi spesies ikan. Keuntungan dari teknik tersebut tidak hanya karena kemampuannya untuk mengidentifikasi spesies ikan terkait, tetapi juga kemampuannya yang dapat dengan mudah mengidentifikasi beberapa spesies dalam suatu produk Penggunaan RFLP dalam DNA TypingBerikut ini adalah langkah-langkah penggunaan RFLP dalam DNA Typing :

. Ekstraksi: Langkah pertama dalam DNA typing adalah ekstraksi DNA dari sampel. Sampel bisa didapatkan dari darah, air liur, sperma atau beberapa zat biologis lainnya.

2. Produksi Restriksi Fragmen: DNA yang dimurnikan kemudian dipotong menjadi fragmen-fragmen oleh enzim restriksi.

3. Elektroforesis: Fragmen restriksi memiliki muatan negatif dan dapat dipisahkan dengan teknik yang disebut gel elektroforesis, yang akan memisahkan potongan DNA berdasarkan ukurannya. Sampel DNA yang telah diberi perlakuan enzim restriksi, ditempatkan di jalur terpisah pada lempengan gel elektroforesis yang ditempatkan pada medan listrik. Fragmen akan berpindah ke arah elektroda positif, fragmen yang lebih kecil bergerak lebih cepat daripada fragmen yang lebih besar, sehingga dapat memisahkan sampel DNA ke dalam band atau pita yang berbeda.

4. Deteksi: Band-band tersebut dapat divisualisasikan menggunakan pewarna luminescent. Pendekatan untuk DNA Typing diperlukan sampel dalam jumlah cukup besar dari bahan biologisnya, hal ini bertujuan untuk mendapatkan hasil lebih baik dan data yang lebih masuk akal.

Teknik Analisis RFLP RFLP merupakan perbedaan pada homolog urutan DNA yang dapat dideteksi dengan menggunakan adanya perbedaan fragmen DNA yang telah dipotong dengan menggunakan enzim endonuklease tertentu. RFLP digunakan sebagai marker molekular karena spesifik untuk setiap tunggal atau kombinasi dari enzim restriksi

Nested PCR

Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen Pasangan primer yang pertama akan mengamplifikasi fragmen yang cara kerjanya mirip dengan PCR pada umumnya

Mekanisme kerja

Secara umum, PCR adalah suatu proses perbanyakan DNA secara in vitro melalui beberapa tahap, yaitu denaturasi, penempelan primer, dan pemanjangan. Prinsip kerja nested PCR tidak jauh berbeda dengan PCR biasa, namun nested PCR akan bekerja menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen DNA spesifik melalui dua proses PCR secara terpisah. Pertama-tama DNA mengalami denaturasi lalu memasuki fase penempelan, di mana sepasang primer pertama melekat di kedua utas tunggal DNA dan mengamplifikasi DNA di antara kedua primer tersebut dan terbentuklah produk PCR pertama.Perbedaan Nested PCR dengan PCR biasa

Nested PCR merupakan variasi dari reaksi polymerase chain reaction biasa (PCR).Nested PCR dan PCR biasa keduanya berguna untuk memperbanyak fragmen DNA tertentu dalam jumlah banyak. Pada nested PCR digunakan 2 pasang primer sedangkan pada PCR biasa hanya menggunakan 1 pasang primer. Oleh karena itu, hasil fragmen DNA dari nested PCR lebih spesifik (lebih pendek) dibandingkan dengan PCR biasa.SSR (Simple Sequence Repeat)

Metode Simple Sequence Repeat (SSR) mempunyai nama lain metode microsatellite atau Simple Tandem Repeat (STR). Metode SSR didasarkan atas pengulangan pasangan sekuen mono-, di-, tri-, tetra-, penta-, dan hexa-nukleotida seperti (TG)n atau (AAT)n. Pasangan sekuen ini tersebar melewati genom sehingga menghasilkan polimorphisme yang tinggi.

THANK YOU