i

Kode/Nama

Rumpun Ilmu

: 362 / Bidang Kesehatan Umum

Lain yang belum tercantum

Tema : Kesehatan, penyakit tropis, gizi

dan obat-obatan

LAPORAN PENELITIAN STRATEGIS NASIONAL

LAMA WAKTU KOLONISASI LACTOBACILLUS SP F213 PADA

SALURAN PENCERNAAN DIANALISIS MENGGUNAKAN

SIDIK DNA MIKROBIOMIK FESES DALAM PENGEMBANGAN

PROBIOTIK UNTUK MENURUNKAN KOLESTEROL

Ketua/Anggota Tim

Ir. I Nengah Sujaya, M.Agr.Sc., Ph.D. NIDN: 00312 6651 (Ketua) Drs. Yan Ramona, M.App.Sc, Ph.D. NIDN: 0022106401 (Anggota) Ir. K. Ayu Nocianitri, M.Agr.Sc. NIDN: 0008036801 (Anggota)

UNIVERSITAS UDAYANA

Nopember 2015

ii

HALAMAN PENGESAHAN

Judul Penelitian : Lama waktu kolonisasi Lactobacillus sp F213 pada saluran

pencernaan dianalisis menggunakan sidik DNA mikrobiomik

feses dalam pengembangan probiotik untuk menurunkan

kolesterol

Tema Isu Stragtegis Nasional : Kesehatan, Penyakit Tropis, Gizi dan Obta-obatan (Health,

Tropocal Diseases, Nutrition and Medicine)

Kode/Nama Rumpun Ilmu : 363/Bidang Kesehatan Umum Lain yang Belum Tercantum

Peneliti / Pelaksana

Nama Lengkap : Ir. I Nengah Sujaya, M.Agr.Sc.P.hD.

NIDN : 0031126651

Jabatan Fungsional : Lektor Kepala

Program Studi : Ilmu Kesehatan Masyarakat

Nomor HP : 081338661516

Surel (e-mail) : sakabali@hotmail.com

Anggota Peneliti (1)

Nama Lengkap : Dr. Drs Yan Ramona, M.App.Sc

NIDN : 0022106401

Perguruan Tinggi : Universitas Udayana

Anggota Peneliti (2)

Nama Lengkap : Ir. Komang Ayu Nocianitri, M.Agr.Sc

NIDN : 0008036801

Perguruan Tinggi : Universitas Udayana

Institusi Mitra (jika ada)

Nama Institusi Mitra : --

Alamat : --

Penanggung Jawab : --

Tahun Pelaksanaan : Tahun ke 1 dari rencana 2 tahun

Biaya Tahun Berjalan : Rp. 81.250.000

Biaya Keseluruhan : Rp. 200.000.000

Denpasar, 8 Nopember 2015

Mengetahui,

Ketua LPPM

Prof. Dr. Ir. I Nyoman Gede Antara, M.Eng.

NIP/NIK : 196408071992031002

Ketua Peneliti

Ir. I Nengah Sujaya, M.Agr.Sc.Ph.D.

NIP/NIK196612311993111002

iii

RINGKASAN

Penyakit tidak menular akibat pola makan dan gaya hidup seperti penyakit jantung

koroner (PJK) dan tekanan darah tinggi semakin meningkat di Indonesia. Diperkirakan

sebanyak 150 orang dalam 10.000 penduduk meninggal akibat PJK. Oleh karena itu

diperlukan upaya-upaya pemanfaatan biodivesitas Indonesia guna menurunkan PJK.

Penelitian ini secara umum bertujuan untuk mengembangkan probiotik endogen

Indonesia dalam pencegahan PJK melalui penurunan dan atau pengendalian

kandungan kolesterol darah. Secara khusus, pada tahun pertama penelitian ini

bertujuan untuk mengembangkan sistem deteksi spesifik untuk melancak kolonisasi

dan populasi Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan manusia, melalui

pendekatan berbasis DNA mikrobiomik pada feses. Pengembangan sekuen pelacak

khusus Lactobacillus sp F213 didasarkan pada susunan nukleotida pada bagian

intrageneic spacer region (IGS) pada rDNA Lactobacillus sp F213 atau sekuen pita

khusus yang diperoleh dari random amplified DNA polymorphism (RAPD).

Pada tahap pengembangan pendeteksi khusus ini dilakukan PCR terhadap IGS

Lactobacillus sp F213 yang dibandingkan dengan Lactobacillus rhamnosus,

Pediococcus spp, serta strain dari kelompok non-bakteri asam laktat. Hasil penelitian

menujukkan bahwa Lactobacillus sp F213 mempunyai panjang IGS yang spesifik,

berbeda dengan L rhamnosus, Pediocoocus serta strain non-BAL, namun demikian

IGS Lactobacillus sp F213, L rhamanosus, dan Pediococcus spp menunjukkan pita

ganda / 2 buah IGS dengan panjang yang berbeda.

Lactobacillus sp F213 mempunayi dua buah IGS dengan susunan nukleotda

yang berbeda. Homologi yang dilakukan pada GenBank menunjukkan bahwa IGS tipe

I mempunyai panjang 290bp dan menunjukkan homologi sebesar 97%

( 283/290bp) dengan Weissella confusa 16S rRNA and 23S (AY342323|AY342323.1).

Sementara IGS tipe II dari LbF213 mempunyai ukuran 298bp dengan homologi

260/283bp (91%), W. confusa 16S rRNA and 23S sebesar >AY342323|AY342323.1.

Adanya sekuen nukleotida dengan variasi yang tinggi dibandingkan dengan galur

menyebabkan bagian IGS ini merupakan target yang baik untuk alat deteksi spesifik

(primer dan probe spesifik). Beberapa primer telah dirancang dan diuji dan diperoleh

primer bahwa B2FR mempunyai spesifisitas yang baik. Probe spesifik LbF213P juga

sudah didesign dan dilabel dengan label flourescens dengan satu set primer spesifik

untuk pengujian RT-PCR. Spesifisitas primer B2FR dapat mendeteksi 1.400 sel yang

setara dengan 3,4 pmol (3 x 10-9 gr) DNA. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa

primer B2FR dapat dipergunakan untuk mendeteksi Lactobacillus sp F213 pada feses

manusia dengan metode pelacakan berbasis DNA.

iv

PRAKATA

Puji syukur kami panjatkan, karena atas rachmat-Nya laporan ini dapat diselesaikan.

Laporan ini merupakan capaian dari serangkaian rencana penelitian pada tahun 2015.

Tim peneliti mengucapkan terimakasih kepada Dirjen DIKTI melalui Litabmas, yang

telah membiayai penelitian ini, Ketua Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada

Masyarakat, Univ. Udayana yang telah memfasilitasi dari pengusulan proposal sampai

pada pencairan dana. Pada laporan ini, masih banyak hal yang belum tercapai,

sehingga peneliti akan bekerja keras untuk merampungkan penelitian tahun pertama

ini sesuai kontrak yang etlah disepakati.

Semoga laporan ini bermanfaat bagi kita semua.

Bukit Jimbaran, 8 Nopember 2015

Tim Peneliti

v

DAFATR ISI

Halaman

HAL PENGESAHAN ----------------------------------- ii

RINGKASAN ----------------------------------- iii

PRAKATA ----------------------------------- iv

DAFTAR ISI ----------------------------------- v

DAFTAR GAMBAR ----------------------------------- vi

DAFTAR TABEL ----------------------------------- vii

BAB I. Pendahuluan ----------------------------------- 1

BAB II. Tinjauan Pustaka ----------------------------------- 5

BAB III. Metode ----------------------------------- 12

BAB IV. Hasil dan Pembahasan ----------------------------------- 17

BAB V. Simpulan ----------------------------------- 31

DAFTAR PUSTAKA ----------------------------------- 32

LAMPIRAN ----------------------------------- 36

vi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1 Peta jalan penelitian pengembangan probiotik (disesuaikan

dengan guide line pengembangan probiotic foods

FAO&WHO 2002)

11

Gambar 2 Ilustrasi target gen sebagai strategi dalam pengembangan

sistem deteksi molekuler Lactobacillus sp F213.

12

Gambar 3 Ilustrasi design primer/probe dari seukuen IGS

Lactobacillus sp F213

14

Gambar 4A Morfologi koloni Lactobacillus sp F213 pada media MRS

agar

17

Gambar 4B Morfologi mikroskopik Lactobacillus sp F213 pada media

MRS both

17

Gambar 5 Genomik DNA dari Lactobacillus sp F213 18

Gambar 6A Hasil PCR IGS Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sp

F213, Pedioccocus spp, dan non LAB (isolat B3).

29

Gambar 6B Optimasi PCR dengan termal gradient. 20

Gambar 7 Panjang IGS Lactobacillus sp F213, L. rhamnosus

SKG34 dan Pediococcus spp.

21

Gambar 8 Teknik elusi DNA dengan memberikan muatan magnetik 22

Gambar 9

Gambar 10.

Gambar 11.

Gambar 12.

Gambar 13.

Gambar 14

IGS dari Lactobacillus sp F213, L rhamnosus SKG34 dan

hasil PCR pita tunggal dari Lactobacillus sp F213 dan L

rhamnosus SKG34

Spesifisitas primer spesifik IGS LbF213.

Spesifisitas primer B2FR terhadap beberapa species bakteri

asam laktat dan non-bakteri asam laktat.

Spesifisitas primer B2FR terhadap DNA feses.

Deteksi LbF213 pada DNA feses dengan primer B2FR.

Limit deteksi primer B2FR.

22

27

28

28

30

30

vii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1 Primer yang dipergunakan untuk RAPD 15

Tabel 2 Tabel 2. Sekuen primer yang dipakai pada PCR IGS

Lactobacillus sp F213

19

Tabel 3 . Susuan primer spesifik yang untuk mendeteksi

Lactobacillus sp F213.

1

BAB I. PENDAHULUAN

Latar Belakang

Modernisasi memberikan andil pada pergeseran pola makan masyarakat dari

makanan tradisional berserat tinggi ke makanan gaya barat dengan lemak tinggi dan

rendah serat. Konsumsi makanan dengan kandungan asam lemak jenuh (asal hewani)

yang tinggi merupakan salah satu faktor resiko penyebab penyakit jantung koroner

(PJK), pembunuh nomor satu di dunia, sebagai akibat penimbunan kolesterol pada

pembuluh darah. Data WHO menunjukkan bahwa pada tahun 2002 diperkirakan PJK

menyebabkan 7 juta kematian di seluruh dunia dan pada tahun 2020 diperkirakan

akan naik menjadi 11 juta jiwa. Dan di Indonesia diperkirakan 150 orang dalam

10.000 penduduk meninggal akibat PJK (Anon, 2008).

Pembentukan asam empedu merupakan mekanisme utama untuk

megekskresikan kolesterol dari tubuh. Garam empedu (tauro-kolat dan gliko-kokolat)

merupakan produk antara metabolisme kolesterol. Hidrolisis garam empedu oleh

mikroorganisme saluran pencernaan yang mempunyai enzim bile salt hidrolase

(BSH) menghasilkan taurin atau glisin serta asam empedu bebas. Asam empedu

bebas ini berisfat tidak larut dan tidak direabsorbsi tubuh sehingga akan

diekskresikan melalui feses (Kurdi et al., 2000). Semakin banyak asam empedu yang

dibuang melalui siklus enterohepatik semakin banyak pula kolesterol darah

digunakan untuk sintesis asam empedu baru (Brisson, 1981).

Penurunan kolesterol darah dilaporan dapat dilakukan dengan mengkonsumsi

susu terfermentasi oleh Lactobacillus (Agerbaek et al., 1995; Bertolami et al, 1999;

Larsen et al, 2000; Schaafsma et al., 1998), walaupun secara mekanistik belum

diketahui secara pasti bagaiaman Lactobacillus berperan dalam proses ini di dalam

tubuh (De Rose dan Katan, 2000). Dari serangkaian hasil penelitian in vitro, diduga

bahwa mekanisme penurunan kolesterol oleh Lactobacillus dan Bifidobacterium

meliputi efek fisiologis dari asam lemak rantai pendek (short chain fatty acids) dalam

saluran pencernaan (Kurdi et al, 2000; 2003), asimilasi kolesterol oleh Lactobacillus

dan Bifidobacterium (Klaver et al., 1993; Gilliland et a.l, 1985), pengikatan

2

kolesterol pada permukaan sel Lactobacillus dan Bifidobacterium (Lin dan Cheh,

2000) serta dekonjugasi enzimatis garam empedu oleh Lactobacillus dan

Bifidobacterium (Tahri et al., 1985; Tahri et al., 1996).

Mengingat bahaya dari kandungan kolesterol yang terlalu tinggi pada darah

sebagai penyebab utama penyempitan pembuluh darah dan PJK sementara di terapi

medis yang dilakukan dengan mempergunakan obat-obatan yang sangat mahal, maka

dipandang perlu dilakukan penelitian untuk menggali potensi mikrobial alam

Indonesia guna menanggulangi masalah kolesterol dan PJK. Probiotik merupakan

salah satu pilihan yang menjanjikan.

Serangkaian penelitian untuk mengembangkan probiotik telah dilakukan

secara in vitro dan in vivo. Penelitian in vitro dari aspek ketahan pada kondisi saluran

pencernaan meliputi ketahan Lactobacillus sp F213 pH rendah, enzim pencernaan,

dan asam empedu. Dari aspek keamanan meliputi bahwa Lactobacillus sp F213 tidak

melakukan transformasi asam empedu primer (tidak memicu kolon kanker), tidak

menyebabkan kerusakan pada saluran pencernaan, sifat tidak beracun (tidak me-lisis

sel darah meras) serta Lactobacillus sp F213 tidak akut pada larva udang. Aspek

fungsional meliputi kemampuan Lactobacillus sp F213 melekat pada epitel saluran

pencernaan mencit untuk mencegah diare dan stimulasi sistem imun serta

Lactobacillus sp F213 mampu menghidrolsisi garam empedu sebagai potensi dalam

menurunkan kolesterol darah. Potensi in vitro telah teruji dalam penelitian in vivo

seperti kemampuan berkompetisi untuk melekat apda saluaran pencernaan mencit

yang diinfeksi dengan E coli O157, sehingga Lactobacillus sp F213 berpotensi untuk

mencegah diare (Sujaya et al. 2010); Lactobacillus sp F213 mampu bertahan dalam

saluran pencernaan tikus putih (Nocianitri et al., 2010) dan menurunkan 35% dari

total kolesterol tikus (Nursini et al., 2010). Penelitian pada subjek manusia

menujukkan bahwa Lactobacillus sp F213 terdeteksi pada sidik DNA mikrobiomik

feces, serta dapat menurunkan 6,29% kolesterol dan dapat menurunkan TNF alfa

sebanyak 35,87% (dari 9,2 pg menjadi 0,59 pg, sebelum dan setelah pemberian

Lactobacillus sp F213). Disamping itu pemberian Lactobacillus sp F213 dapat

3

meningkatkan kenyamanan buang air besar (mencegah konstipasi) (Sujaya et al.,

2012, 2013).

Rumusan Masalah

Setelah melakukan serangkaian penelitian untuk mengembangankan Lactobacillus sp

F213 sebagai probiotik dengan potensi dapat menurunkan kolesterol, serta

berdasarkan persyaratan WHO bahwa probiotik adalah mikroorganisme hidup yang

dikonsusmsi dan dapat memberikan manfaat kesehatan bagi host, maka probiotik

harus mampu bertahan dan berkembang biak pada saluran pencernaan. Oleh karena

itu, rumusan masalah dalam penelitian ini adalah :

Apakah Lactobacillus sp F213 dapat tumbuh pada saluran pencernaan dan

berapakah populasi Lactobacillus sp F213 pada feses?

Berapa lamakah Lactobacillus sp F213 dapat berada pada saluran pencernaan

manusia sehat ?

Bagaimankan efek pemberian Lactobacillus sp F213 terhadap profile lipid

darah subjek yang diberikan Lactobacillus sp F213 ?

Tujuan Penelitian

Tujuan Umum :

Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan probiotik endogen Indonesia

dalam pencegahan PJK melalui penurunan dan atau pengendalian kandungan

kolesterol darah.

Tujuan khusus penelitian :

Untuk mengembangkan metode deteksi spesifik yang dapat diperguankan

untuk diagnostik Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan ?

Untuk mengetahui lama waktu kolonisasi dan populasi Lactobacillus sp F213

pada saluran pencernaan (feses)?

Untuk mengetahui efek fungsional pemberian Lactobacillus sp F213 terhadap

profile lipid darah.

4

Manfaat khusus:

Manfaat dari penelitian ini adalah, secara teoritis, dapat menjelaskan

bagaimana prilaku (aktivitas) dan pengaruh Lactobacillus sp F213 terhadap

kesehatan saluran pencernaan serta profile lipid pada darah.

Manfaat aplikasinya adalah dapat menjadi salah satu pilihan dalam terapi

biologis dalam penanggulangan masalah kolesterol darah dan berkontribusi

dalam menurunkan kejadian penyakit PJK di Indonesia.

5

BAB II. STUDI PUSTAKA

Kasus Penyakit Jantung Koroner

Penyakit jantung koroner (PJK) telah menjadi penyebab utama kematian di dunia

dewasa ini. Badan Kesehatan Dunia (WHO) mencatat lebih dari 7 juta orang

meninggal akibat PJK di seluruh dunia pada tahun 2002. Angka ini diperkirakan

meningkat hingga 11 juta orang pada tahun 2020. Di Indonesia, kasus PJK semakin

sering ditemukan karena pesatnya perubahan gaya hidup. Meski belum ada data

epidemiologis pasti, angka kesakitan/kematiannya terlihat cenderung meningkat.

Hasil Survei Kesehatan Nasional tahun 2001 menunjukkan 3 dari 10.000 penduduk

Indonesia menderita PJK (Anon., 2008).

Penyakit jantung koroner (PJK) terjadi karena penyempitan/ penyumbatan

pembuluh darah koroner yang berfungsi mendistribusikan darah dan oksigen ke otot

jantung. Penyumbatan (plak aterosklerosis) disebabkan tertumpuknya endapan lemak

(terutama kolesterol LDL), sel-sel otot polos pembuluh darah dan matriks

ekstraseluler lainnya di sepanjang dinding arteri sebagai hasil proses yang

berlangsung bertahun-tahun. Jika aliran darah berkurang secara bermakna, maka

penderita perlu segera mendapat tindakan medis. Karena pentingnya penyakit ini dan

kecendrungan peningkatan kasus dari tahun ke tahun maka telah diterbitkan pedoman

teknis penemuan dan penatalaksanaan penyakit hipertensi yang merupakan salah satu

faktor resiko dari PJK (Anon 2006, Depkes)

Kejadian PJK bervariasi antar negara dan lebih umum terjadi di negara-negara

industrialis sehingga penyakit ini juga dipandang sebagai akibat gaya hidup dan pola

makan. Western diet dengan kandungan lemak jenuh tinggi cenderung berasosiasi

pada PJK. Di Inggris (UK) ditemukan bahwa 27% kematin disebabkan oleh PJK serta

12% disebabkan oleh strok, walaupun mortality rate PJK bervariasi antar negara.

Mortality rate PJK ii Jepang dilaporkan sebesar 15 per 100.000 penduduk, sementara

di Finland sebanyak 198 per 100.000 penduduk (Marila-Sandholm dan Saarela, 2003).

Metabolisme kolesterol

6

Beberap studi epidemiologi menunjukkan bahwa ada korelasi positif antara

kandungan kolesterol khususnya low dencity lippprotein (LDL) dengan PJK.

Akumulasi LDL pada plasma menyebabkan penumpukan kolesterol pada dinding

pembuluh darah arteri, proses yang berhubungan dengan oksidasi LDL. LDL

teroksidasi akan diambil oleh makrofag yang segera menjadi gelembung sel yang

merupakan plak awal. Sehingga diperkirakan setiap kenaikan 1% LDL kolesterol

setara dengan peningkatan 2-3% resiko PJK (Lovegrove dan Jackson, 2003). Tetapi

sebaliknya, high dencity lipoprotein (HDL) memberikan efek yang berlawanan

dengan LDL terhadap resiko PJK sehingga HDL dianggap sebagai kolesterol baik.

Kolesterol merupakan penyebab utama hipertensi dan PJK, oleh karena itu

dalam penatalaksanaan PJK dan hipertensi kadar kolesterol dalam serum menjadi

salah satu acuan. Individu dengan kandungan kolesterol darah 8.0 mmol/lt dan atau

triasil gliserol di atas 3.0 mmol/lt tidak hanya memerlukan modifikasi diit tetapi juga

disarankan mengkonsumsi obat penurun kandungan lemak dalam darah untuk

membantu menurunkan faktor resiko PJK dan hipertensi. Pemberian obat yang ada

efektif pada beberapa hal yaitu: menurunkan sintesis very low dencity lippprotein

(VLDL) dan LDL, meningkatkan penghilangan VLDL, meningkatkan penghilangan

LDL dan penghambatan enzim hidroksi metil glutaril CoA reduktase (Martilla-

Sandholm dan Saarela, 2003).

Sintesis dan metabolisme kolesterol merupakan jalur metabolik utama dalam

penaggulangan PJK. Kolesterol homeostatis dipelihara dalam tubuh mamalia melalui

pengaturan tiga jalur metabolisme. Dua jalur metabolik adalah bagaimana mensuplai

kolesterol ke dalam sel yang meliputi endogenus sintesis kolesterol dari prekursornya

(asetat) dan eksogenus sintesis dimana LDL yang merupakan pembawa kolesterol

pada darah (Ramirez et al., 1994). Ketiga jalur metabolik adalah konversi kolesterol

yang melibatkan konversi kolesterol menjadi asam empedu. Kelainan pada regulasi

metabolisme kolesterol berimplikasi pada penyakit karena jalur metabolisme utama

dalam ekskresi kolesterol pada mamalia adalah melalui pembentukan asam empedu.

Sehingga eliminasi kolesterol merupakan faktor kritis pada beberapa penyakit seperti

7

atherosclerosis, gallstone diseases, dan penyakit selain pada penyimpanan lemak

(Ramirez et al., 1994).

Empedu merupakan produk utama metabolisme kolesterol yang tersimpan di

dalam kantung empedu yang terdiri dari asam empedu, kolesterol, pospolipid dan

pigmen bilirubin. Empedu disintetsis dalam sel hati dan akan disekresikan ke usus

dua belas jari setelah adanya makanan yang masuk. Sehingga fungsi utama dari

empedu adalah sebagai detergent biologis dan pelarut lemak dalam tubuh. Empedu

juga berfungsi sebagai salah satu zat antimikrobial dalam tubuh (Begley et al., 2006).

Probiotik dan kolesterol

Persyaratan pengembangan probiotik baru

Probiotik didefinisikan sebagai bakteri hidup yang apabila dikonsumsi dalam

jumlah yang memadai akan memberikan efek yang menguntungkan bagi yang

mengkonsumsinya (FAO-WHO, 2001). Pada awal perkembangan era probiotik,

L.casei strain Shirota (Yakult) serta L. rhamnosus GG, merupakan dua strain

lactobacilli yang mengawali (pionir) perkembangan probiotik bakteri. Seiring dengan

kemajuan teknologi, beberapa strain baru dikembangkan sebagai probiotik dengan

berbagai keunggulan spesifik pada aspek kesehatan yang diharapkan (Klaenhammer

dan Kullen, 1999).

Probiotik memberikan dampak menyehatkan pada individu yang

mengkonsumsinya. Beberapa aspek menyehatkan probiotik antara lain: ekslusi,

antagonis terhadp patogen, sebagai imun stimulator dan modulator, antikarsinogenik

dan mutagenik, peningkatan simpton laktosa intoleran, menurunkan kolestrol darah,

menurunkan tekanan darah, menghambat dan mencegah diare, mencegah vaginitis

dan memelihara integritas mukosa usus (Sanders, 1998; Tannock, 1999; Mattilla-

Shandholm et al., 1999). Adanya berbagai aspek menyehatkan tersebut, maka

memberi potensi baru dalam pengembangan makanan fungsional dan bahkan formula

makanan khusus untuk bayi dan manusia usia lanjut seperti yang telah dikembangkan

di Jepang melalui konsep FOSHU (food and ingredient for spesified health use).

8

Dalam pengembangan probiotik, strain yang dipergunakan sebaiknya telah

teridentifikasi dengan baik, umumnya dengan susunan gen 16S rDNA sudah

terdepositkan di bank data internasional. Adanya data genetik memungkinkan untuk

mengembangkan sistem monitoring untuk menentukan secara spesifik populasi

probiotik bakteri yang dikonsumsi di dalam saluran pencernaan agar efek fungsional

yang ditimbulkan bisa dijelaskan dengan lebih baik. Disamping identifikasi strain dan

sistem deteksi, ada beberapa kriteria yang diharapkan dalam pengembangan probiotik

baru seperti: (1) kecocokan (untuk probiotik konsumsi manusia sebaiknya diisolasi

dari saluran pencernaan manusia sehingga mengurangi resiko toksisitasnya); (2)

kecocokan dalam teknologi pengembangan/produksi dimana diharapkan mudah

diproduksi secara masal/skala besar, viabilitas yang tinggi, tidak mengganggu nilai

sensoris bahan pangan apabila diikutkan dalam bahan pangan tertentu, stabil secara

genetis dan memungkinkan dilakukan rekayasa genetika; (3) kemampuan bersaing

(competitiveness) seperti mampu bertahan dan berkembang biak di dalam saluran

pencernaan, tahan terhadap kondisi saluran pencernaan (asam empedu, pH rendah),

mampu bersaing dengan flora normal di dalam saluran pencernaan, dan mampu

melakukan adhesi pada sel epitel saluran pencernaan; (4) efek fungsional seperti

mampu menimbulkan dampak menyehatkan, antagonis terhadap patogen, produksi

zat antimikrobial, imunstimulator, anti karsinogenik dan anti mutagenik, produksi

bioaktif (enzyme, vaccines, peptida) (Klaemhammer dan Kullen, 1999).

Guna memahami peranan dari probiotik Lactobacillus sp F213 pada

kesehatan manusia dan marker biologi, merupakan hal penting untuk mengetahui

efeknya terhadap komunitas bakteria pada saluran pencernaan manusia yang

diberikan Lactobacillus sp F213. Pada penelitian ini perhatian difokuskan pada

deteksi Lactobacillus sp F213 dan lama waktu kolonisasinya pada saluran pencernan

yang dilihat dari DNA mikrobiomik feses serta pengaruh fungsional kesehatan yang

ditimbulkannya.

Probiotik dan mekanisme penurunan kolesterol

Hiperkolesterolemia (peningkatan kadar kolesterol di dalam darah) telah

diketahui sebagai salah satu pemicu PJK. Beberapa jenis obat-obatan telah tersedia

9

untuk mengobati PKJ, namun demikian masih dipandnag belum optimal karena

harganya yang relatif mahal serta adanya efek samping yang tidak diinginkan.

Konsumsi oral dari probiotik mampu menurunkan 22-33% dari total kolesterol darah

(De Smet et al. 1994:1998: Torano et al., 1998). Efek penurunan kolesterol ini dapat

disebabkan oleh aktivitas BSH (Kluver et al., 1993; Liong dan Saha, 2005). Asam

empedu yang telah mengalami dekonjugasi mempunyai kelarutan yang lebih rendah

dari pada bentuk garamnya sehingga menyebabkan ekskresi asam empedu bebas

lebih banyak dalam feses. Asam empedu bebas juga mempunyai kemampuan yang

kurang baik dalam melarutkan lemak serta kurang bisa diabsorbsi untuk

dipergunakan kembali (siklus enterohepatik). Dengan demikian dekonjugasi garam

empedu mempunyai peranan penting dalam menurunkan kolesterol di dalam darah.

Karakter inilah menyebabkan adanya BSH dalam strain probiotik memberikan

keuntungan ganda guna menurunkan kolesterol darah dan menjaga keseimbangan

bakteri saluran pencernaan.

Pemberian susu terfermentasi dengan mempergunakan Lactobacillus

menurunkan kolesterol darah dari pasukan Masai pria sebanyak 9.8% (Lovegrove dan

Jackson, 2003). Disamping itu, yoghurt yang difermentasi dengan mempergunakan

Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus dapat menurunkan total

serum kolesterol dan LDL (Jasper et al., 1984). Hal ini menunjukkan bahwa probiotik

memberikan kontribusi dalam penurunan kolesterol darah.

Beberapa mekanisme telah diusulkan, yang meliputi efek fisiologis dari asam

lemak rantai pendek yang terbentuk akibat aktivitas probiotik, kolesterol asimilasi,

pengikatan kolesterol pada sel bakteri, serta aktivitas dekonjugasi garam empedu

(Lovegrove dan Jackson, 2003). Mekanisme lain yang diperkirakan erat kaitannya

dengan penurunan kolesterol darah adalah melalui transport kolat oleh Lactobacillus

dan Bifidobacterium (Kurdi et al., 2000:2003), dimana asam kolat dapat terakumulasi

di dalam sel dan kemudian ikut terbawa feses. Aktifitas fermentatif probotik

cenderung menyebabkan pH saluran pencernaan menjadi lebih asam. Asam empedu

umumnya mempunyai derajat disosiasi pada pH agak netral (pH 64-6,5, untuk asam

10

kolat dan deoksi kolat). Sehingga pada pH saluran pencernaan relatif rendah (lebih

rendah dari pH 6,4) maka asam empedu akan mengendap dan terbawa feses. Hal ini

akan menyebabkan penurunan kolestrol darah.

Studi pendahulaun dan Hasil yang sudah dicapai

Serangkaian penelitian untuk mengembangkan probiotik telah dilakukan.

Penelitian in vitro dari aspek ketahanan pada kondisi saluran pencernaan meliputi

ketahan Lactobacillus sp F213 terhadap pH rendah di lambung, enzim pencernaan,

dan asam empedu. Dari aspek keamanan ditemukan bahwa Lactobacillus sp F213

tidak dapat mentransformasi asam empedu primer (sehingga diduga tidak memicu

kolon kanker), tidak menyebabkan kerusakan pada saluran pencernaan (histolgi

saluran pencernaan mencit), bersifat tidak beracun (tidak me-lisis sel darah) serta

tidak akut diuji menggunakan larva udang. Aspek fungsional meliputi kemampuan

Lactobacillus sp F213 melekat pada epitel saluran pencernaan mencit untuk

mencegah diare dan diduga dapat menstimulasi sistem imun. Ditemukan juga bahwa

Lactobacillus sp F213 mampu menghidrolisis garam empedu dan berpotensi

menurunkan kolesterol darah.

Potensi in vitro tersebut di atas telah teruji dalam penelitian in vivo seperti

kemampuan berkompetisi untuk melekat (competetive exclusion) pada saluran

pencernaan mencit yang diinfeksi dengan E coli O157, sehingga Lactobacillus sp

F213 berpotensi untuk mencegah diare (Sujaya et al. 2010); Lactobacillus sp F213

mampu bertahan dalam saluran pencernaan tikus putih (Nocianitri et al., 2010) dan

menurunkan 35% dari total kolesterol pada tikus hiperkolesteromik (Nursini et al.,

2010). Penelitian pada subjek manusia menujukkan bahwa Lactobacillus sp F213

terdeteksi pada sidik DNA mikrobiomik feces, serta dapat menurunkan 6,29%

kolesterol darah, serta menurunkan TNF alfa sebanyak 35,87% (dari 9,2 pg menjadi

0,59 pg, sebelum dan setelah pemberian Lactobacillus sp F213). Lebih jauh diperoleh

bahwa pemberian Lactobacillus sp F213 pada subjek manusia dapat meningkatkan

kenyamanan buang air besar (berpotensi untuk mencegah konstipasi) (Sujaya et al.,

2012, 2013).

- 11 -

Output: Lactobacillus sp F213

4. Safety assesment a. Uji in vivo atau pada

hewan

Toksisitas pada larva

udang

Kerusakan salaruan

pencernaan mencit

b. Studi pada manusia

(Fase 1)

Stimulasi pertumbuhan

bakteri menguntungkan

Populasi dan durasi

Lactobacillus sp F213

pada sal. pencernaan

3. Karakterisasi fungsional

Uji in vitro

Bile salt hydrolase (penurun

kolesterol)

Adhesi pada epitel (mencegah

pelekatan patogen spt E coli dll)

Studi pada hewan

Menurunkan kolesterol

Menghalangi pelekatan E coli

O157

Output:

Probiotik

5. Double blind,

randomized, placebo-

controlled (DBPC) pengujian pada manusia atau

dengan desain lain untuk

mengetahui efikasi produk

(Fase 2)

6. Percobaan yang lebih

efektif, untuk

membandingkan probiotik

dengan standar terapi

dalam kondisi yang

spesifik (Fase 3)

Pelabelan :

Contents : penandaan

genus, spesies, strain

Jml. minimum

bakteri hidup

Kondisi penyimpanan

Layanan informasi

konsumen

Fase 4: Post Marketing 2. Identifikasi strain

Fenotip: API50 CHL

Genotif : Seq. 16S rDNA

Genus, spesies, strain

ISOLAT

Lactobacillus sp koleksi

UNUDCC

1. Skrining karakteristik

probiotik Ketahanan pada kondisi

saluran pencernaan : pH

rendah, asam empedu, enzim

pencernaan

Produksi zat antimikrobial

Ketahan terhadap antibiotika

Modifikasi asam empedu

primer

Output:

Probiotic

foods

2006 – 2011 (1-4a) 2012 – 2017 (fase 1. 4b)

Strain disimpan di

International Culture Collection

Penelitian yg

disusulkan

Sudah dilakukan

Gambar 1. Peta jalan penelitian pengembangan probiotik

(disesuaikan dengan guide line pengembangan probiotic

foods FAO&WHO 2002)

- 12 -

BAB III. METODE PENELITIAN

Usulan Tahun 1. Pengembangan metode deteksi Lactobacillus sp F213

Untuk mengembangkan metode diagnostik Lactobacillus sp F213 ada beberapa target

gen yang akan dipergunakan (Gambar 2).

Gambar 2. Ilustrasi target gen sebagai strategi dalam pengembangan sistem deteksi

molekuler Lactobacillus sp F213.

Pada ilustrasi Gambar 2 terlihat bahwa kemungkinan target adalah berdasarkan variasi

susunan basa nukleotida seperti variable region 1-3 pada 16S rDNA pada

Lactobacillus sp F213. Namun dalam penelitian sebelumnya 16S rDNA dari

Lactobacillus sp F213 menunjukan 99.9% homology dengan strain lain sehingga

pendekatan yang akan dipergunakan adalah bagian intragenik spacer region (IGS),

molekul 23S rDNA, 5,8S rDNA dan bahkan bagian tertentu dari keseluruhan DNA

genom Lactobacillus sp F213. Pada penelitian ini akan dicoba beberapa kemungkinan

yaitu (1) sekuensing IGS serta (2) pita spesifik yang diperoleh dengan Random

Amplified DNA Polymorpism (RAPD).

Strain dan kondisi pembiakan strain bakteri

Strain yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah Lactobacillus sp F213 yang

- 13 -

merupakan strain potensial probiotik. Selain strain Lactobacillus sp F213 juga

dipergunakan strain lain yang merupakan koleksi UNUDCC.

Strain Lactobacillu spp. dibiakkan dalam MRS broth, dalam keadaan anaerob

(menggunakan anaerobic OXOID gas pouch) dan diinkubasi selama 24-48 jam pada

suhu 37oC.

Isolasi Genomic DNA dari Lactobacillus sp F213

DNA diisolasi dengan mepergunakan Kit Isolasi DNA (Promega) sesuai petunjuk dalam

kit. Sebanyak 2 uL suspesi DNA dielektroforesis pada 1,2% agarose dan divisualisasikan

pada UV transiluminator untuk mengkonfirmasi keberhasia proses isolasai DNA.

Selanjutnya DNA dilarutkan dengan TE-buffer dan disimpan pada suhu -20oC sampai

dilakukan analisis selanjutnya.

PCR dan Sequencing IGS

Typing Lactobacillus sp dilakukan dengan sekuensing intragenic spacer region (IGS),

bagian rDNA dengan susunan nukleotida yang sangat variatif pada seluruh prokaryota

menggunakan primer: FGPS1490F- TGC GGC TGG ATC ACC TCC TT dan

FGPS132R- CCG GGT TTC CCC ATT CGG (Laguere et al., 2006) dan primer lain

sesuai dneagn kebutuhan. Reaksi campuran PCR dilakukan pada total volume 12,5 μl

yang mengandung: 10 mM masing-masing dNTPs, primer 27F dan 520R (25 pmol), 1X

PCR Buffer II, 75 mM MgCl2, 0.45 U AmpliTaq, 1 μl DNA. Reaksi amplifikasi

dilakukan sebagai berikut: satu kali siklus pada 94oC selama 5 menit, diikuti dengan 35

kali siklus pada 94oC selama 20 detik, 55oC selama 2 menit, dan 72oC selama 30 detik.

Tahap akhir ditambahkan dengan satu kali siklus pada suhu 72oC selama 5 menit. Produk

PCR selanjutnya dielektroforesis dengan menggunakan 1% agarosa dengan 1X TAE

bufer, dilakukan pewarnaan dengan EtBr (50 ng/ml), divisualisasikan pada UV

iluminator dan difoto.

Produk PCR dimurnikan dengan menggunakan PCR SUPRECTM PCR (Takara

Biomedicals, Otsu, Japan) dan selanjutnya disekuen dengan menggunakan Big Dye

Primer Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) dengan

- 14 -

menggunakan sekuensing automatis 3100 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems).

Untuk studi homologi, sekuen dilakukan di NCBI/GenBank.

Untuk men-desing primer/probe spesifik untuk deteksi Lactobacillus sp F213

dengan target IGS dilakukan dengan melalukan multiple alligment dari sequence IGS dari

Lactobacillus sp F213 dengan IGS strain species yang sama yang dapat di ambil dari

GenBank (NCBI/DDBJ). Dari multiple alligment akan diketahui sekuen nucleotida yang

paling berbeda diantara sekuen IGS yang ada. Selanjutnya sekuen yang berbeda ini dapat

dijadikan probe/dapat juga di pakai sebagai primer spesifik (ilustrasi Gambar 4)

Gambar 3. Ilustrasi design primer/probe dari seukuen IGS Lactobacillus sp F213 setelah

di align dengan IGS dari Lactobacillus lain (misal: IGS Lb-1, IGS Lb-2, IGS

Lb-3 dst).

RAPD dan sekuensing pita spesifik

Tahapan RAPD dilakukan mengacu pada prosedur Ivanova et al., (2008). Campuran

reaksi RAPD dilakukan pada total volume 12,5µl dengan komposisi 6,25µl Master Mix

Solution Intron Biotechnology, 1,25µl primer (Tabel 2), 1µl DNA dan 4µl air steril

sehingga total volume reaksi 12,5µl. Amplifikasi dilakukan pada mesin Infinigen

thermocycler, dengan kondisi satu siklus pada 940C selama 5 menit, diikuti dengan 40

siklus pada 940C selama 20 detik, 400C selama 2 menit dan 720C selama 30 detik, dan

tahap akhir yaitu elongasi tambahan pada 720C selama 5 menit. Setelah reaksi selesai

sampel dikeluarkan dari mesin dan diambil sebanyak 5µl untuk dielektroforesis.

Tabel 1. Primer yang dipergunakan untuk RAPD

Target probe/primer

- 15 -

Primer Susunan primer (5´-> 3´)

OP-1 CAg gCC CTT C

OP-2 TgC CgA gCT g

OP-3 AgT CAg CCA C

OP-4 AAT Cgg gCT g

OP-5 Agg ggT CTT g

OP-6 ggT CCC TgA C

OP-7 gAA ACg ggT g

M13F CgA CgT TgT AAA ACg ACg

gCC AgT

M13R CAg gAA ACA gCT ATg AC

Gambar 4. Ilustrasi design

primer/probe spesifik dari

genom LbF213

Dari hasil RAPD dengan mempergunakan primer pada Tabel 1, akan dihasilkan pita

yang paling berbeda (ukuran panjang pita) dengan strain yang lainya yang dipakai

sebagai pembanding. Pita yang paling berbeda ini menunjukkan sesuan basa basa

nukleotida yang paling khas yang ada pada genom Lactobacillus sp F213. Selanjutnya di

pita pada gel di potong, dimurbikan dan disekuen untuk mendapatkan susunan

nuklotidanya yang dapat dijadikan primer/probe spesifik untuk deteksi Lactobacillus sp

F213 (Gambar 3).

Optimasi Primer

Primer didesign memeprgunakan susuan nukleotida specifi dari Lactobacillus sp F213,

yang kemungkinan terletak pada sesuan nukleotida IGS atau pita RAPD. Primer di-

design memeprgunakan software Primer express.

Optimasi dan spesifisitas primer dilakukan sesuai kondisi penelitian/percobaan yang

tergantung dari jenis reagent PCR yang dipakai. Dengan demikian optimasi spesificitas

PCR dilakukan dengan mengatur konsentrasi suhu annealing (pelekatan/hibridisasi)

primer dengan target sekeun pada DNA yang di-amplifikasi, serta dengan mengatur

DNA LbF213

PCR

Pita spesifik

Sekuens

Primer/probe

spesifik

- 16 -

stringency reaksi polimerasi dengan mangatur konsentrasi ion MgCl2 pada campuran

reaksi PCR (Innis et al., 1990).

Setelah didapatkan kondisi spesifik untuk Lactobacillus sp F213 maka selanjutnya

dilakukan PCR dengan mempergunakan DNA yang diisolasi dari feces yang sengaja

ditambahkan dengan Lactobacillus sp F213. Isolasi DNA feces dilakukan untuk

mengetahui konsentrasi/populsi Lactobacillus sp F213 minimal di mana DNA

Lactobacillus sp F213 dapat di-recovery dengan protokol isolasi DNA yang dipergunakan.

Dengan demikian akan diketahui kosntrasi sel Lactobacillus sp F213 yang ada pada feces

yang mungkin dapat di deteksi deangan primer spesifik ini. Disamping itu dilakukan pula

optimasi dengan mempergunakan RT-PCR dengan pewarna cyber green untuk

mengetahui hubungan antara intenstitas flourisensi dengan kosnntrasi DNA/sel. Dari

langkah ini akan diketahui jumlah sel yang ada pada sampel berdasarkan tingkat intensitas

flouresensi dari cyber green.

Analisis data

Data dianalisis secara deskriptif berdasarkan ada tidaknya produk PCR yang dihasilkan

yang terlihat dari foto gel elektroforesis.

- 17 -

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Penyegaran strain Lactobacillus sp F213

Lactobacillus sp F213 disegarkan dari stok beku (-50oC). Strain di segarkan dalam

MRS broth dan diinkubasi dalam keadaaan anaerob selama 24 jam pada suhu 37oC.

Setelah tumbuah, strain di streak pada MRS agar dan koloni yang tumbuah (Gambar

4A) diisolasi secara tunggal (single colony isolation) untuk menjamin kemurnian strain

yang dipergunakan dalam penelitian ini. Konfirmasi strain dilakukan dengan

mengamati pembutukan gas pada MRS broth serta pengecatan Gram (Gambar 4B).

Gambar 4A. Morfologi koloni

Lactobacillus sp F213 pada media

MRS agar

Gambar 4B. Morfologi mikroskopik

Lactobacillus sp F213 pada media MRS

both

Isolasi Genomic DNA

Genomik DNA diisolasi dari 2,5 ml kultur Lactobacillus sp F213 (strain no 1 dan no 6).

Dengan metode isolasi sekala kecil ini, diperoleh DNA yang masih mengandung RNA,

walaupun pita DNA genomik pada gel tidak tampak dengan jelas (Gambar 5), tetapi

hasil analisis menunjukkan bahwa konsentrasi DNA Lactobacillus sp F213 (2) dan

Lactobacillus sp F213 (6) yang berhasil diperoleh sebanyak masing-masing 37,5 ng/ul

dan 26,5 ng/ul.

- 18 -

Gambar 5. Genomik DNA dari Lactobacillus sp F213 (no 1 adalah

Lactobacillus sp F213 strain no 2); no 2 adalah Lactobacillus sp F213 strain

no 6. M : DNA ladder (100 bp). Pita DNA genom (ditunjukkan dengan tanda

panah, tidak begitu jelas pada foto gel), sementara RNA tampak seperti smear

pada bagian bawah gel.

Amplifikasi Intragenic Spacer Region (IGS) Lactobacillus sp. F213

Primer yang dipergunakan dalam amflifikasi IGS Lactobacillus sp F213 dapat dilihat

pada Tabel 2.

1 2 M

RNA

DNA

- 19 -

Tabel 2. Sekuen primer yang dipakai pada PCR IGS Lactobacillus sp F213.

Name Seq 5’->3’ Referensi

FGPS1490F TGC GGC TGG ATC ACC TCC TT Laguere et al., 2006

FGPS132R CCG GGT TTC CCC ATT CGG

L1F GAA GTC GTAACA AGG Jensen et al., 1993

Lt1-R CAA GGC ATCCAC CGT

Nour 514F TGG ATC ACC TCC TTT CTA Nour, 1998(*)

Nour 601R GTG CGC CCT TTA TTA ACT T

(*) belum dilakukan karena primer sedang disintesis oleh suplier

Hasil PCR dengan primer FGPS1490F/FGPS132R terlihat bahwa Lactobacillus

sp. F213, Lactobacillus rhamnosus dan Pediococcus spp., menunjukkan pita ganda,

sementara hanya non bakteri asam laktat (Isolat B3) menunjukkan pita tunggal

(Gambar 6A). Lactobacillus sp. F213 menghasilkan pita dnegan ukuran 500bp dan 400

bp; Lactobacillus rhamnosumenghasilkan pita 500 bp dan 350; Pediococcus spp.

Menhasikan pita dengan ukuran 400 bp dan 350bp, semantar non bakteri asam laktat

(Isolat B3) menghasilkan pita tunggal dnegan estimasi ukuran 700 bp.

Laguere et al 2003) juga menemukan pita ganda dan tunggal pada beberapa

species bakteri Rhyzobium yang diteliti. Dalam peleitian ini dilakukan konfirmasi

kembali khususnya optimasi suhu annealing guna menghindari terjadinya miss-priming

pada primer FGPS1490F/FGPS132R.

Peningkatan suhu annealing primer, denagn gradient 1oC, dari suhu tengah

55oC dari suhu 48oC sampai 62oC, denan 12 jenis suhu annealing dimuali dari: 48;

48,7; 49,8;51,1; 52,6;54,2;55,8; 57,5; 58,9; 60,2; 61,3; dan 62oC. Dari 12 jenis suhu

annealing ini dilakukan PCR Lactobacillsus sp F213 dilakukan pada suhu 55,8 sampai

62oC. Hasil gradient PCR menggunakan primer ini menujukkan bahwa amplifikasi

dengan primer FGPS1490F/FGPS132R semakin berkurang apabila suhu annealing

lebih dari 55oC (Gambar 6B). Hal ini menunjukkan bahwa suhu anneling optimum

- 20 -

primer FGPS1490F/FGPS132R adalah 55oC sesuai yang dilaporkan oleh

FGPS1490F/FGPS132R dimana produk IGS dari Lactobacillus sp F213 selalu

ditemukan dua pita. Hasil ini menujukkan bahwa dengan primer ini selalu diperoleh 2

pita IGS dari Lactobacillus sp F213.

Gambar 6B. Optimasi PCR dengan termal gradient.

Keterangan gambar 6B:M: 100 bp DNA ladder. No 1,2 3 4 5,6 adalah suhu

annelaing primer FGPS1490F/FGPS132R untuk amplifikasi DNA Lactobacilus

sp F213 masing-masing 55,8oC; 57,4oC; 58,9oC; 60,2oC; 61,3oC; 62oC.

Konfirmasi Intragenic Spacer Region (IGS) Lactobacillus sp. F213

Untuk meyakinkan bahwa Lactobacillus sp F213 mempunayi 2 buah IGS yang

berbeda, dilakukan PCR dengan mempergunakan primer yang lain. Amplifikasi IGS

Lactobacillus sp F213 dengan primer L1-F (GAA GTC GTAACA AGG) / Lt1-R

500 bp

500 bp

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

400 bp

M 1 2 3 4 5 6

500 bp

A

B

Gambar 6 A. Hasil PCR IGS

Lactobacillus rhamnosus,

Lactobacillus sp F213,

Pedioccocus spp, dan non LAB

(isolat B3). M; 100 bp DNA

ladder.

- 21 -

(CAA GGC ATCCAC CGT) juga menghasilkan produk IGS dua pita dengan panjang

pita sekitar 500 bp dan 400 bp sementara L rahmnosus SKG34 dengan panjang pita

sekitar 500 bp dan 350 bp, serta Pediococcus sp dengan pajang pita IGS sekitar 400 bp

dan 350 bp (Gambar 7). Hal ini menjukkan kembali bahwa IGS Lactobacillus sp F213

terdiri dari dua buah pita. Hal ini memperkuat dugaan bahwa Lactobacillsus sp F213, L

rhamnosus SKG34, dan Pediococcus spp mempunyai 2 helai IGS dengan panjang

yang berbeda.

Gambar 7. Panjang IGS Lactobacillus sp F213 (1, 2), L. rhamnosus SKG34 (3) dan

Pediococcus spp (4,5)

Adanya pita IGS ganda dengan ukuran panjang yang berbeda menyebabkan

kesulitan kalau dilakukan direct sequencing, sehingga harus dipisahkan terlebih daulu

melalui subcloning masing-masing pita atau cara lainnya. Pita IGS dapat dipisahkan

menjadi pita tunggal sehingga dilakukan Direct Sequening PCR dengan me-motong

gel mengandung IGS selanjutnya DNA pada gel dimurnikan atau di-elusi dari dalam

matrik gel. Dalam penelitian ini dicoba dengan meng-elusi DNA dengan memberikan

daya magnet sehingga DNA yang bermuatan negatif di tarik dengan magnet kutub

positif (Gambar 8). Elusi dilakukan dengan merendam gel di dalam 25 ul buffer TE

dan diberikan magnet pada satu sisinya. Elusi dilakukan pada suhu 5oC selama 12 jam

(semalam) dan selanjutnya DNA yang telah keluar gel di PCR dengan mempergunakan

primer yang sama dengan primer yang dipergunakan pada saat PCR (L1-F / Lt1-R

(Gambar 9).

500 bp

M 1 2 3 4 5

- 22 -

Hasil PCR dari DNA yang telah dielusi dari gel dapat dilihat pada Gambar 9.

Setelah re-PCR justru menghasilkan pita tunggal dengan ukuran yang lebih pendek

(sekitar 350 bp) dibandingkan dengan panjang pita sebekumnya. Belum diketahui

secara pasti kenapa hal ini terjadi dan akan dilakukan sequencing guna memanstikan

IGS dari Lactobacillus sp F213 dan IGS L rhamnosus SKG34.

Gambar 8. Teknik elusi DNA dengan memberikan muatan magnetik.

Gambar 9. IGS dari Lactobacillus sp F213 (A), L rhamnosus (B) dan hasil PCR pita

tunggal dari LbF213(C dan D) dan L rhamnosus (E dan F). Terlihat PCR pita dengan

panjang 500 bp pada A dan B menghasilkan produk PCR dengan ukuran 300 bp (C

dan E).

M A B C D E F

500 bp

300 bp

(+) (-) DNA

- 23 -

Susunan Nukleotida Intragenic Spacer dari Lactobacillus sp F213

Hasil sekuensing IG Lactobacillus sp F213 pita IGS 1 dan 2 diberikan seperti di bawah

ini.

>Lactobacillus sp F213 IGS band no 1.

ttgatgatataagtttgagtatgtggctcaaaggccacaagcgattttaaactaattta

aaaaactcaaaaaattacgcggggtattttttcggctcaatttatattgattaacaata

ttaaatgaatttaaaaatttacaattatgattcagttttcaaagaactaattttgagtg

taaatcactcaaaactgaatatcgtttcaacgaatgtgtaggtttcccattttccttat

aaaggaggtgatccacccccaggttctcctacggctaccttgttacaacttcaca

Homology BLAST untuk menentukan susunan nukleotida yang

paling dekat dengan IGS 1. Score E

Sequences producing significant alignments: (bits) Value

AY342323|AY342323.1 Weissella confusa 16S ribosomal RNA and 23S ... 519 e-144

JX118838|JX118838.1 Lactobacillus brevis strain GDA-4 16S riboso... 446 e-122

KJ880099|KJ880099.1 Weissella cibaria strain C34 16S ribosomal R... 444 e-121

JX118839|JX118839.1 Lactobacillus brevis strain GDA-1 16S riboso... 444 e-121

AF158558|AF158558.1 Lactobacillus sp. GTH2 16S-23S ribosomal RNA... 363 9e-97

>AY342323|AY342323.1 Weissella confusa 16S ribosomal RNA and

23S ribosomal RNA genes, partial sequence.Length = 918

Score = 519 bits (262), Expect = e-144

Identities = 283/290 (97%)

Strand = Plus / Minus

Query: 8 ttgatgatataagtttgagtatgtggctcaaaggccacaagcgattttaaactaatttaa 67

Sbjct: 389 ttgatgatataagtttgagtatgtggctcaaaggccacaagcgattttaaactaatttaa 330

Query: 68 aaaactcaaaaaattacgcggggtattttttcggctcaatttatattgattaacaatatt 127

Sbjct: 329 aaaactcaaaaaattacgcggtgtattttttcggctcaatttatattgattaacaatatt 270

Query: 128 aaatgaatttaaaaatttacaattatgattcagttttcaaagaactaattttgagtgtaa 187

Sbjct: 269 aaatgaatttaaaaatttacaattatgattcagttttcaaagaactaagtttgagtgtaa 210

Query: 188 atcactcaaaactgaatatcgtttcaacgaatgtgtaggtttcccattttccttataaag 247

Sbjct: 209 atcactcaaaactgaatatcgtttcaacgaatgtgtaggtttccgattttccttagaaag 150

Query: 248 gaggtgatccacccccaggttctcctacggctaccttgttacaacttcac 297

Sbjct: 149 gaggtgatccagccgcaggttctcctacggctaccttgttacgacttcac 100

Aligment IGS I dari LbF213 dengan data yang ada pada genbank (BLAST),

menujukkan bahwa IGS LbF213 I mempunyai homologi tertinggi (97%) dengan W

confusa. Nukleotida yang berbeda ditunjukkan dengan warna biru.

- 24 -

Sekuen nukleotida Lactobacillus sp F213 IGS band no 2. 304

bp

1st_BASE_1960555_2_L1F.ab1

ccatcttactgacgttgatgatataagtttgagtatgtggctcaaggcccaagcgattt

taaactaattaaaaaactcaaaaaataacgcggggtattttttcggctcattttatatt

gctaaacaatattaaatgaatttaaaaatttacaattttgattcagttttcaaagacct

aagtttgagcgtaaatccctcaaaactgattatcgtttcaacgaatgtggaggtttccc

attttccttagaaagggggggatccacccccccgttctcctccggctcccttgttccac

ctccacaat

Homology BLAST untuk menentukan susunan nukleotida yang

paling dekat dengan IGS 1. s

Score E

Sequences producing significant alignments: (bits) Value AY342323|AY342323.1 Weissella confusa 16S ribosomal RNA and 23S ... 355 2e-94

F158558|AF158558.1 Lactobacillus sp. GTH2 16S-23S ribosomal RNA... 317 5e-83

JX118839|JX118839.1 Lactobacillus brevis strain GDA-1 16S riboso... 315 2e-82

JX118838|JX118838.1 Lactobacillus brevis strain GDA-4 16S riboso... 315 2e-82

KJ880099|KJ880099.1 Weissella cibaria strain C34 16S ribosomal R... 307 5e-80

AF158570|AF158570.1 Lactobacillus sp. GTH24 16S-23S ribosomal RN... 307 5e-80

AF158569|AF158569.1 Lactobacillus sp. GTH22 16S-23S ribosomal RN... 295 2e-76

Score = 355 bits (179), Expect = 2e-94

Identities = 260/283 (91%), Gaps = 3/283 (1%)

Strand = Plus / Minus

Query: 12 acgttgatgatataagtttgagtatgtggctcaa-ggcc-caagcgattttaaactaatt 69

Sbjct: 392 acgttgatgatataagtttgagtatgtggctcaaaggccacaagcgattttaaactaatt 333

Query: 70 -aaaaaactcaaaaaataacgcggggtattttttcggctcattttatattgctaaacaat 128

Sbjct: 332 taaaaaactcaaaaaattacgcggtgtattttttcggctcaatttatattgattaacaat 273

Query: 129 attaaatgaatttaaaaatttacaattttgattcagttttcaaagacctaagtttgagcg 188

Sbjct: 272 attaaatgaatttaaaaatttacaattatgattcagttttcaaagaactaagtttgagtg 213

Query: 189 taaatccctcaaaactgattatcgtttcaacgaatgtggaggtttcccattttccttaga 248

Sbjct: 212 taaatcactcaaaactgaatatcgtttcaacgaatgtgtaggtttccgattttccttaga 153

Query: 249 aagggggggatccacccccccgttctcctccggctcccttgtt 291

Sbjct: 152 aaggaggtgatccagccgcaggttctcctacggctaccttgtt 110

Aligment IGS I dari LbF213 dengan data yang ada pada genbank (BLAST),

menujukkan bahwa IGS LbF213 II mempunyai homologi tertinggi (91%) dengan W

confusa. Nukleotida yang berbeda ditunjukkan dengan warna biru.

- 25 -

Hasil sekuensing pita IGS I dan II pada LbF213 menunjukkan persen homologi yang

berbeda. Pita IGS-I menunjukkan homologi sebesar 97% dengan

AY342323|AY342323.1 Weissella confusa 16S ribosomal RNA and 23S ...sementara

IGS-type II menujukkan homologi sebesar 91%. Hal ini menujukkan bahwa LbF213

membawa dua IGS dengan ukuran dan sekuen yang berbeda. Perbedaan sekuan yang

tinggi ini menjadi target yang baik dalam pengembangan nukleotida untuk mendeksi

LbF213.

Diagnostik spesifik F213 yang dapat dikembangkan adalah primer spesifik dan

probe spesifik. Untuk tahap awal, dikembangankan beberapa set primer spesifik

dnegan mempergunakan berdasarkan apda IGS tipe I dan Tipe II (Table 3). Primer ini

selanjutnya dipergunakan untuk mengamplifikasi IGS pada LbF213. Hasil PCR

menunjukkan bahwa primer yang dikembangkan mengamplifikisi dua IGS yang

berbeda, karena IGS mempunyai susunan nukleetida yang sama /komplementer dengan

susunan nukleotida primer, tetapi pada posisi yang berbeda sehingga menghasilkan

pita yang berbeda (Gambar 10). Dari set primer yang dikembangkan tersebut (Tabel ...)

diperoleh bahwa primer dnegan target IGS-type II menunjuukan hasil yang paling

spesifik dimana terbenu 2 pita, yang satu dengan ukuran 300 p dan yang kedua dnegan

ukuran sekitar 200 bp. Design primer B2F-R ini dihitung berdasarkan posisi prier pada

susuan IGS type II, secara teoritis menghasilkan panjang produk PCR 197bp.

Berdasarkan data ini, maka B2F-R secara spesifik dapat mengamplifikasi IGS type II

(Gambar ..).

SUSUNAN PRIMER SPESIFIK LbF213

Beberapa set primer spesifik dicoba dikembangakna dari susunan nukleotida pada IGS

1 dan IGS 2 dari LbF213. Primer disusun berdasarkan rekomendasi melalui

www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast (Tabel ...).

Sekuen nukleotida IGS1 pada Lactobacillus sp F213

Target primer (warna merah., 241 bp). Susunan nukleotida primer yang diberi latar

- 26 -

belakang hijau.

TTGATGATATAAGTTTGAGTATGTGGCTCAAAGGCCACAAGCGATTTTAAACTAATTTAAAAAACTCAAAAAATTACGCGGGGTATTTTT

TCGGCTCAATTTATATTGATTAACAATATTAAATGAATTTAAAAATTTACAATTATGATTCAGTTTTCAAAGAACTAATTTTGAGTGTAA

ATCACTCAAAACTGAATATCGTTTCAACGAATGTGTAGGTTTCCCATTTTCCTTATAAAGGAGGTGATCCACCCCCAGGTTCTCCTACGG

CTACCTTGTTACAACTTCACA

Sekuen nukleotida IGS2 pada Lactobacillus sp F213

Targt primer (wrana merah, 197 bp), Susunan nukleotida primer yang diberi latar

belakang hijau.

CCATCTTACTGACGTTGATGATATAAGTTTGAGTATGTGGCTCAAGGCCCAAGCGATTTTAAACTAATTAAAAAACTCAAAAAATAACGC

GGGGTATTTTTTCGGCTCATTTTATATTGCTAAACAATATTAAATGAATTTAAAAATTTACAATTTTGATTCAGTTTTCAAAGACCTAAG

TTTGAGCGTAAATCCCTCAAAACTGATTATCGTTTCAACGAATGTGGAGGTTTCCCATTTTCCTTAGAAAGGGGGGGATCCACCCCCCCG

TTCTCCTCCGGCTCCCTTGTTCCACCTCCACAAT

Tabel 3 . Susuan primer spesifik yang untuk mendeteksi Lactobacillus sp F213.

TARGET Name Seq. 5’ 3’ Produc size

BAND-1 F213B1F1 TTGAGTATGTGGCTCAAAGGC

F213B1R1 GGGGTGGATCACCTCCTTTA 241

F213B1F2 TCAAAGGCCACAAGCGATTTTA

F213B1F3 CTCAAAGGCCACAAGCGATTTTA

F213B1F4 GTTTGAGTATGTGGCTCAAAGGC

F213B1R4 AGGAGAACCTGGGGGTGGAT

BAND-2

F213B2F CTCAAGGCCCAAGCGATTTT 197 bp

F213B2R TGGGAAACCTCCACATTCGT

- 27 -

SPESIFISITAS PRIMERS

Spesifisitas primer diuji dengan mempergunakan DNA LbF213. PCR dilakukan

mempergunakan PCR kit (Kappa PCR Master Mix 2X) dengan campuran reaksi PCR

sebegai berikut : PCR master mix 12,5 ul; DNA 1 ul; primer F dan primer R masing-

masing 2,5 ul (konsntrasi primer 2 mM), dan akuades sampai volume 25 ul. PCR

dilakukan pada pre-denaturasi pada suhu 94oC selama menit, diikuti sebanak 30 siklus

yang terdiri dari denaturasi 2 menit pada suhu 94oC, annealng pada suhu 60oC selama

30 detik; elongasi pada suhu 72oC selama 30 detik. Siklus terkahir diikuiti dengan

ekstensi selama 2 menit pada suhu 72oC. Hasil PCR dielektrofooresisi pada agarose gel

2%, diwarnai dnegan EtBr dan divisualisasi dengan UV iluminator.

Gambar 10. Spesifisitas primer spesifik IGS LbF213. Hhanya primer B2FR yang

memberikan panjang produk PCR sesuai dengan yang diharapkan

(berdasarkan susuan nukleotida IGS2)

Dari 6 set primer yang diuji, tenraynata hanaya B2FR (primer dnegan target IGS2 dari

LbF213) menunjukkan hasil ynag spesifik dansesuai dengan ukuran pandajnag DNA

yang diharapkan (197 bp).

M : 100 bp DNA Ladder

1. B1F1-B1R1

2. B1F2-B1R4

3. B1F3-B1R4

4. B2F-B2R

5. B1F2 –B1R4

6. B1F3-B1R4

7.

4 3 2 1 M 4 6 5 M

197 bp

- 28 -

SPESIFISITAS PRIMER B2FR PADA SPESIES LAINNYA

Spesifisitas B2FR selanjutnya diuji pada DNA dari beberapa spesies BAL lainnya (L

rhamnosus, Pediococcus) an non BAL (Gambar 11).

Gambar 11. Spesifisitas primer B2FR terhadap beberapa species bakteri asam laktat

dan non-bakteri asam laktat. Terlihat primer B2FR hanya memberikan

hasil positif dnegan LbF213 (tanda panah).

Gambar 12. Spesifisitas primer B2FR terhadap DNA feses. Terlihat primer B2FR

memberikan hasil positif dengan eberapa DNA feses yytetapi hasil hanya

dneagn DNA LbF213 diperoleh ukuran pita yang berbeda dneagn DNA

lainnhya (tanda panah).

8 7 6 5 4 3 2 1 M

1. L rhamnosus GME10

2. L rhamnosus SMM53

3. Pediococcus sp M58

4. Pediococcus sp GMB30

5. L rhamnosus SMM55

6. L rhamnosus Skg34

7. B3 (non LAB)

8. F213

9. M ladder

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 M 1. F213

2. DNA feses 51

3. DNA feses 52

4. DNA feses 53

5. DNA feses 54

6. DNA feses 55

7. DNA feses 56

8. DNA feses 57

9. DNA feses 58

10. DNA feses 59

11. DNA feses 60

- 29 -

Pada kondisi pennelitian, dimana annealing pada suhu 60oC primer B2FR tidak

menghasilkan pita dengan strain lain selain LbF213. Selanjutnya ditemukan bahwa

B2FFR mengasilkan pita dari DNA yang diisolasi dari feses manusia, tetapi dengan pola

yang berbeda dengan DNA LbF213 (Gambar 12). Hal ini menunjukkan bahwa B2FR

dapat dipakai sebagai pendeteksi spesifik keberadaan LbF213 dalam konsorsium

mikroorganisme.

Selanjutnya untuk lebih meyakinkan kehandalan dari primer ini serta limit deteksi B2FR

(konsnetrasi DNA yang masih dapat di amplifikasi) maka dilakuakn isolasi DNA feses

yang telah ditambahkan dengan LbF213. Dengan memeprgunakan B2FR tdiak terdeteksi

keberadaan LbF213 pada DNA feses, walaupun sebelum diisolasi dnegan MoBioSOOIL

KIT feses sudah ditambahkan 50 dan 100 ul kultur LbF213 (setelah diinkubasis leama 48

jam). Seanjutnya setelah dilakukan PCR ternyata masih terbentuk pita pada konsnetrasi

DNA 3,75 piko gram (Gambar 13). Hal ini menjukkan bahwa hasil negatif pada Gambar

13., disebabkan karena DNA LbF213 todak daat diektraksi pada campuran konsorsium

mikorb feses (DNA lebih rendah dari 3,7 piko gram). Hal ini mungkin sbeagia akibat

rendahnya jumlah LbF213 pada feses.

- 30 -

Deteksi LbF213 pada DFNA feses

1. DNA feses

2. DNA Feces

3. PCR DNA F213

4. PCR DNA feses dgn B2FR

5. PCR DNA feses +F213 dgn B2FR

6. PCR DNA fese dgn 27F-520R

7. PCR DNA fese dgn 27F-520R

8. PCR DNA feses dgn B2FR

9. PCR DNA feses dgnB2FR

10. PCR DNA F213 dgn B2FR

M : 100 bp DNA marker

Gambar 13. Deteksi LbF213 pada DNA feses dengan primer B2FR. Primer B2FR

tidak memberikan hasil positif pada DNA yang diisolasi dari feses yang

ditambahkan LbF213. Hal ini menunjukkan bahwa DNA dari LbF213 tidak

dapat ter-ekstraski.

Gambar 14. Limit deteksi primer B2FR.

Gambar 14 di atas menunjukkan bahwa B2FR masih menunjukkan pita positif pada

kosnnetrasi LbF213 sebedar 3,75 pg. Jika satu (1) sel bakteri mengandung 1,6-2,4 fg

DNA (1 fg = 1x10-12 g). (Lars Reier Bakken, Rolf Arnt Olsen. Soil Biology and

1 2 M 3 4 5 6 7 8 9 10 M

1. 3,75 pg

2. 37,5 pg

3. 375 pg

4. 3,75 ng

5. 37,5 ng

M : 100 bp DNA marker

1 2 3 4 5 M

- 31 -

Biochemistry, 21(6): 789–793 (1989) maka 3,57 pg = 3.570 f gr yang setara dnegna +-

1.487 sel. Tetai, walaupun LbF213 ditamvahkab pada feses tetapi tdiak menunjukkan pita

dnegan B2FR. Hal ini menunjukkan recovery DNA LbF213 pada feses dangat rendah.

VI. SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari hasil penelitian ini adalah :

1. Lactobacillus sp F213 merupakan strain probiotik yang unik yang mempunyai

2 buah Interagentic spacer regions (IGS) dengan ukuran yang berbeda dnegan

L rhamnosus dan Pediococcus spp.

2. Lactobacillus sp F213 mempunyai dua buah IGS dnegan susuann ukleotida

yang berbeda dan menunjukkan homologi yang rendah dneagn strain lainnya

sehingga potensial sebaa target pengemabnag sistem deteksi spesifik.

3. Primer spesifik telah dikembangkan B2FR dan dapat membedakana LbF213

dengan straian BAL dan non BAL lainnya.

Saran

Perlu dilakukan optimasi primer/probe spesifik Lactobacillus sp F213 pada

kondisi feses manusia.

- 32 -

DAFTAR PUSTAKA

Agerbaek, M. Gerdes, L.U., Richeslsen, B. 1995. Hyphoschelesterolemic effect of a new

sfermented milk product in healthy middle-aged men. Eur.J. Clin, Nutr., 49: 346-352.

Anonimous. 2001. Health and nutritional properties of probiotics in food including powder

milk with live lactic acid bacteria, Food and Agriculture Organization for the United

Nations (FAO) and World Health Organization (WHO).

Anonimus. 2006. Pedoman teknis penemuan dan tatalaksana penyakit hipertensi.

Direcktoral Pegendalian Tidak Menular, Direktoral Jenderal PP dan PL, Departemen

Kesehatan Republik Indonesia.

Aryantini, P.D. 2008. Isolasi dan karakterisasi bifidobacterium dari feces bayi. PS Ilmu

Kesehatan Mayarakat. Univiersitas Udayana, Denpasar.Skripsi.

Artatai, LPSA. 2009. Karakteristik Probiotik dari Lactobacillus sp F212 dan F213 serta

kemampuan kompetisi pelekatannya dengan Eschericia coli O157 pada enterosit

Mencit. Skrip PS Farmasi, FMIPA Unud.

Begley, M., Hill, C., Gahan, C.G.M. 2006. Bile salt hydrolase activity in probiotics. Appl.

Environ. Microbiol. 72: 1729-1738.

Bertolami, M.C., Faludi, A.A., Batlouni, M. 1999. Evaluation of the effect of a new

fermented milk product (Gaico) on rimary hypercholesterolemia. Eur.J. Clin, Nutr.,

53: 97-101.

Debruyne, P.R., Bruyneel, E.A., Li, X., Zimber, A., Gespach, C., Mareel., M.M. 2001. The

role of bile acids in carcigonesis. Mutation Res. 359-369.

De Smet, I., van Hoorde, I., De Saeyer, M., Vande, W.M., Verstraete, W. 1994. In vitro

study of bile salt hydrolase (bsh) activity of bsh isogenic Lactobacillus plantarum 80

strains and estimation of cholesterol lowering through enhanced BSH activity.

Microbiol. Ecol. Haelth Dis., 7:315-329.

De Smet, I., De Boever, P., and Versetraete, W. 1998. Cholesterol lowering in pigs through

enhanced bacterial bile salt hydrolase activity. Br. J. Nutr. 79:185-194.

De Rose, Nicole M and Martijin B. Katan. 2000. Effect of probiotic bacteria on diarrhea,

lipid metabolism, and carcinogenesis: a review of papers published between 1988 and

1998. Am J. Clin. Nutr. 71: 405-411.

Dwipayanti, N.M., Suariani, Pt., K.A. Nocianitri. 2007. Isolasi dan karakterisasi bakteri

asam laktat dari susu kuda sumbawa. PS Ilmu Keseahatn MAsyarakat Universitas

Udayana. Laporan Penelitian Dosen Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan.

Dwipayanti, N.M., Suariani, Pt., K.A. Nocianitri. 2008. Identifikasi bakteri asam laktat dari

susu kuda sumbawa. PS Ilmu Keseahatn Masyarakat Universitas Udayana. Laporan

Penelitian Dosen Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan.

Gilliand, S.E., Nelso, C.R. and Maxwell, C. 1985. Assimilataion of cholesterol by

Lactobacillus acidophilus. Appl. Environ. Microbiol. 49: 377-381.

Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., White, T.J. 1990. PCR Protocols. A Guide to

Methods and Applications. Academic Press. San Diego, New York.

- 33 -

Jasper, D.A., Massey,, L.K., and Luedecke, L.O. 1984. Effect of consuming yoghurt

prepared with three culture strains on human serum lipoproteins. J. Food Sci.,

49:1178-1181.

Jensen, M.A., Webstr, J.A., Straus, N. 1993. Rapid Identification of Bacteria on the Basisi

of Polymeras eChain Reaction-Amplified Ribosomal DNA Spaser Polymorphisms.

Appl. Environ. Microbiol. 59: 945-952.

Klaenhammer, T.R. and Kullen, M.J. 1999. Selection and design of probiotics. Int. J. Food

Microbiol. 50: 45-57.

Klaver, F.A.M. and van der Meer, R. 1993. The assume assiliation cholesterol by

lactobacilli dan Bifidobacterium bifidum is due to their bile salt-deconjugation activity.

Appl. Environ. Microbiol. 59: 1120-1124.

Kurdi, P., Tanaka, H., van Veen, H., Asano, K., Tomita, F., Yokota, A 2003. Cholic acid

accumulation and its deminuation by short chain fatty acids in bifidobacteia.

Microbiology 149:2031-2037.

Kurdi, P., Van Veen, H, Tanaka, H., Mierau, I, Konings, W.N., Tannock, G.W., Tomita, F.,

Yokota, A. 2000. Cholic acid is accumulated spontaneously, driven by membrane

▲pH, in many lactobacilli. J. Bact. 182:6525-6528.

Larson, L.A., Raben, A., Haulrik, N., Hansen, A.S., Manders, M., Astrop, A. 2000. Effetct

of 8 weeks intake of probiotic milk products on risk factors for cardiovascular diseases.

Eur.J. Clin, Nutr., 54: 288-297.

Liong, M.T. and Saha, N.P. 2005. Bile slat deconjugation ability, bile salt hydrolase activity

and cholesterol co-precipitation ability of lactobacilli strains. Int. Dairy J., 15:391-398.

Lovegrove, J. and Jackson, K. 2003. Coronary heart diseases. In: Mattila-Sandholm, T. and

Saarela, M. (Ed), Functional Dairy Products. Woodhead Pub.Limited, Sambridge,

Englan. Pp: 54-87.

Mattilla-Shandholm, T., Blum, S., Collins, J.K., Crittenden, R., de Vos, W., Dunne, C.,

Fonden, R., Grenov, G., Isolaury, E., Kiely, B., Marteau, P., Morelli, L., Ouwehand,

A., Reniero, R., Saarela, M., Salminen, S., Shanahan, F., Vaughan, E., von Wright, A.

1999. Probiotics: towards demosntrating efficacy. Trend Food. Sci. Technol., 10:393-

399.

Nocianitri, K. A., dan I.D.G.M. Permana. 2006. Seleksi Bakteri Asam Laktat Sebagai Galur

Probiotik Untuk Bayi Alergi Susu Formula. Fakultas Teknologi Pertanian Universitas

Udayana. Laporan Penelitian Dosen Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan

Nocianitri, K. A., dan I.D.G.M. Permana. 2008. Identifikasi Lactobacilus sp. F16 dan

Lactobacillus sp. BY85 dan kemampuan adhesinya pada epitel saluran pencernaan

mencit. Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana. Laporan Penelitian Dosen

Muda-DIKTI. Tidak Dipublikasikan.

Nocianitri, K.A., Aoyama, Y. 2001. Different response to choline deficiency of the serum

ornithine carbamoyltransferase activity in four strains of rats. J. Biosci. Biophysics

Biochem. 65: 935-938.

Nocianitri, K.A. Sakata, S., Kanno, T., Kikuchi, H., Kurasaki, M., Aoyama, Y. 2002.

Influence of dietary methionine level on the liver metallothionein mRNA level in rats.

J. Biosci. Biophysics Biochem. 66:2465-2470.

Nour, M. 1998. 16S-23S-5S intragenic spacer regions of Lactobacilli: nucleotide sequence,

secondary structure and comparative analysis. Res. Microbiol., 149: 433-448.

- 34 -

Nursini, W., NP. Desy Aryantini, K.A. Nocianitri, Y. Ramona, W. Redi Aryanta and I N Sujaya. Colonization of Lactobacillus sp. F2 in the Intestinal Tract and its Functional Effect to Reduce Blood Cholesterol Content of Rats (Rattus Norvegicus). The 2nd International Conference on Bioscience and Biotechnology, Udayana University, Bali, Indonesai, 23-24 Sept. 2010.

Ramirez, M.I., Karaoglu, D., Haro, D., Barrilas, C., Bashirzadeh, Gil, G. 1994. Cholesterol

and bile acid regulate cholesterol 7a-hydroxylase expression at the ranscriptional level

in culture and in transgenic mice. Mol. Cell. Biolog. 14: 2809-2821.

Rayuda, M.A. 2006. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat dari berbagai sumber alami.

Jur. Biologi, FMIPA, Universiats Udayana. Denpasar. Skripsi.

Sanders, M.E. 1998. Overview of functional foods: emphasis on probiotic bacteria. Int.

Dairy J. 8: 341-349

Schaafsma, G., Meuling, W.J.A., van Dokkum, W., Bouley, C. 1998. Effect of a milk

product , fermented by Lactobacillus acidophilus and with fructo-oligosaccharides

added, on blood lipid in male volunteers. Eur.J. Clin, Nutr., 52: 436-440.

Sugita, I.M., Wijaya, N.K., Sujaya, I N. 2007. Rekayasa Starter dan Pembuatan Tablet

Kunyah DAKULI , Untuk Menekan Pertumbuhan Kanker Dan Penurun Kolesterol

Darah.Ditjen Dikti, Penelitian Hibah Bersaing.

Sujaya, I N, Ramona, Y. , Widarini, NP., Suariani, NP, Dwipayanti, N.M.U, Nocianitri ,

K.A., Nursini, N.W. 2008a. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Susu

Kuda Sumbawa. J. Vet. 9:33-40.

Sujaya, I.N., Dwipayanti, N.M.U., Suariani, N.L.P., Widarini, N.P., Nocianitri, K.A.,

Nursini, N.W., 2008b. Uji in vitro ketahanan Lactobacillus spp. isolat susu kuda

Sumbawa pada model saluran pencernaan. J. Vet. 9:52-59.

Sujaya, I N. Amachi, S. Yokota, A. Asano, K. and Tomita, F. 2001. Identification and

characterization of lactic acid bacteria in ragi tape. W. J. .Microbiol. Biotechnol., 17:

349-357.

Sujaya, I N., D.M. Sukrama, K.J.P. Pinatih. 2006. Efek bifidogenik pisang secara in vitro

dalam usaha pengembangan probiotic bifidobacterium. Laporan hasil penelitian Riset

Pembinaan Ilmu dan Teknologi Kedokteran (RISBIN IPTEKDOK-2006)

(unpublished)

Sujaya, I N. 2010. Development of Probiotic for Diarrheagenic Pathogens. International

Symposium on Bioscinece and Biotechnology, Udayana University, 14-17 Sepet.

2010

Sujaya, I.N, DWM Sukrama, Y. Ramona, K.A Nocianitri, T Sone, K Asano. 2012.

Resistantce of Lactobacillus sp. F213 in human gastrointestinal tract as reveal by

Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis of fecal

microbiome. (Hlaporan peneklitian Kerja sama luar negeri, Unud).

Sujaya, I.N, DWM Sukrama, Y. Ramona, K.A Nocianitri, T Sone, K Asano. 2013.

Resistantce of Lactobacillus sp. F213 in human gastrointestinal tract as reveal by

Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis of fecal

microbiome. (Hlaporan peneklitian Kerja sama luar negeri, Unud).

Tannock, G. 1999. Introduction. In: Tannock, G.W. (Ed).Probiotics: A Critical Review.

Horizon Scientific Press. Norfolkm UK. Pp:1-4.

- 35 -

Torano, M.P., Medici, M., Perdigon, G., Ruiz Holgado, A.P., Valdae, G.F. 1998. Efidennce

of hypocholesterolemic effect of Lactobacillus reuteri in hypercholesterolemic mice. J.

Dairy Sci., 81:2336-2340.

Yustiantara, PS. 2009. Aspek Keamanan dari Lactobacillus sp F213 dalam

penegmabngannya sebagai probiotik endogen Indonesia. Skripsi PS Farmasi, FMIPA

Unud.

- 36 -

Lampiran: UNDANGAN SEBAGAI PEMBICARA the 5th IC-ISLAB

Hasil penelitian ini akan dipresentasi dalam The 5th International Conference of Indonesian

Society for Lactic Acid Bacteria (5th IC-ISLAB)

Guest Speaker Invitation for The 5th International Conference of Indonesian Society for

Lactic Acid Bacteria (5th IC-ISLAB)

Islab Islab

Dear Dr. I Nengah Sujaya,

Indonesian Society for Lactic Acid Bacteria (ISLAB) would like to organize its 5th International

Conference at Faculty of Agricultural Technology, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta,

Indonesia in November 13-14, 2015, and now being proposed to be Scopus indexed.

During this conference we would like to invite you as a guest speaker in this conference.

However since we are limited in budget, we are truly sorry that we couldn't afford your airfare

from your country to Indonesia, but we will provide your local transportation and accommodation

during your stay in Yogyakarta.

We also would like to ask your permission to put your name as our guest speaker in the

conference's publication.

We are looking forward to your positive respond.

Thank you and I look forward to hearing from you.

CC: Prof. Dr. Endang S. Rahayu (Chairperson of Indonesian Society for Lactic Acid Bacteria)

With kind Regards,

Linda Windiarti

Organizing Committee

The 5th International Conference of Indonesian Society for Lactic Acid Bacteria (5th IC-ISLAB)

Faculty of Agricultural Technology, Gadjah Mada University,

Bulaksumur, Yogyakarta, 55281. Indonesia

Phone/Fax : +62-274-549650,

http://islab.tp.ugm.ac.id

Email: ic_islab4@yahoo.com

- 37 -

Resistance of Lactobacillus sp F213 in Human Gastrointestinal Tract and Its Health

Promoting Effects.

I Nengah Sujaya

Lab. Bioscience and Biotechnology, School of Public Health, Fact. Medicine Udayana

University, Badung Bali Indonesia

ABSTRACT

Increasing death causing by noncommunicable diseases (NCD) is not only more common

in modern societies but also in developing countries. Tis disease is thought associated

with unhealthy life style. Probiotic offers opportunities in managing NCD and becoming

popular world wide. This research was aimed to determine the resistance of

Lactobacillus sp F213 (LbF213) in human gastrointetstinal tract and its health

promoting effects. Fifteen healthy human subjects participated in this study were

administered with a capsule containing 7.5 x 108 cfu for 28 days. Fecal and blood

samples were collected before, during and after 28 days administration. The population of

lactic acid bacteria and anerobes in fecal samples was enumerated by culture methods,

while the LbF213 in fecal samples were detected using PCR-DGGE of fecal

microbiomic DNA. Health promoting parameters such as lipid profile and TNF alfa were

analysed in blood samples.

The results showed that administration of 7.5 x 108 cfu for 4 weeks increased LAB

population, 2.19X109 cfu/g before administration to 1.58x1010 after 28 days

adminstration, while total anaerob decreased from 4.47x1010 before admnistration to

1.78x1010 cfu/g after 28 days. Lactobacillus sp F213 was detected in fecal samples

suggested that the LbF213 survived in the human GI and play role in modulation of

human intestinal microbiota. The LbF213 altered lipid profile of human subjects, which

likely to be subject dependent. The F213 reduced 6,29% cholesterol, 7,70% HDL and

8,54% LDL and increased 0,19% of TG after 28 days administration. The effect of

LbF213 in lowering blood cholesterol was found to be higher in high blood cholesterol

subjets compared to normal blood cholesterol subjects, 8.1% and 4.06%, respectively.

Administration of F213 for 28 days lowered about 36% of TNF alfa titer in serum, 0.91

pg/dL before and 0.59 pg/dL after adinistration. Those results demosntrated that LbF213

resisted in human GI, slightly modify human normal intestinal microbiota and excerted

health promoting effects.

Keywords : Lactobacillus sp F213, intestinal microbiota, probiotic, cholesterol