1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Masalah resistensi antibiotik telah menjadi perhatian dunia sejak zaman

dahulu kala. Kasus penyakit infeksi dan jumlah kematian akibat bakteri yang telah

mengalami resistensi antibiotik semakin meningkat setiap tahunnya. Data WHO

menunjukkan terdapat 440.000 kasus baru Multi Drug Resistance Tuberculosis

(MDR-TB) yang mengakibatkan 150.000 kematian di seluruh dunia pada tahun

2008 (Anonim, 2010). Kemudian pada tahun 2012, diperkirakan terdapat 450.000

kasus baru MDR-TB di seluruh dunia dengan jumlah kematian meningkat

menjadi 170.000 kematian. Di Indonesia sendiri terdapat peningkatan kasus

MDR-TB dari 200 kasus pada tahun 2010 menjadi 400 kasus pada tahun 2011 dan

lebih dari 400 kasus pada tahun 2012 (Anonim, 2013).

Penggunaan antibiotik yang tidak tepat indikasi, tidak tepat cara

penggunaan, atau konsumsi daging ternak yang diberi pakan mengandung

antibiotik dapat menyebabkan terjadinya mutasi gen yang mengkode berbagai

macam mekanisme resistensi antibiotik (Anonim, 2001). Hampir semua jenis

bakteri sekarang menjadi lebih kuat dan mengalami resistensi. Contoh beberapa

bakteri yang telah mengalami resistensi adalah Staphylococcus aureus,

Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa (Tenover, 2006). Resistensi ini

menimbulkan beban hidup bagi pasien karena infeksi bakteri yang awalnya dapat

disembuhkan oleh antibiotik ringan dan murah saat ini harus menggunakan

2

antibiotik yang lebih kuat aktivitasnya, lebih mahal, dengan jumlah yang lebih

banyak, waktu penyembuhan yang lebih lama serta dapat terjadi infeksi sekunder

yang meningkatkan keparahan penyakit. Masalah resistensi juga menimbulkan

keresahan bagi para peneliti karena perkembangan bakteri resisten lebih cepat

dibandingkan dengan adanya penemuan antibiotik baru. Faktor-faktor inilah yang

menyebabkan angka kematian akibat resistensi antibiotik mengalami peningkatan

setiap tahunnya (Anonim, 2001). Oleh karena itu dibutuhkan suatu bahan yang

dapat mengurangi daya resistensi bakteri atau menurunkan perkembangan bakteri

resisten (antipatogen).

Dewasa ini, penelitian mengenai antimikroba telah banyak diarahkan dan

dikembangkan pada penghambatan patogenisitas bakteri, bukan pada aktivitas

membunuh bakteri. Dengan menghambat patogenesitas bakteri maka

perkembangan bakteri resisten tidak terjadi (Veesenmeyer dkk., 2009; Rasko dan

Sperandio, 2010). Patogenisitas bakteri dapat dihambat melalui mekanisme

penghambatan komunikasi antar sel bakteri (quorum sensing) (Bryant dkk., 2008).

Tumbuhan merupakan sumber bahan yang menjanjikan untuk

pengembangan obat baru karena kandungan zat aktifnya yang beragam dan

berpotensi. Beberapa zat aktif tumbuhan yang berpotensi sebagai antimikroba

adalah kuinon, alkaloid, lektin, polipeptida, flavonoid, kumarin, terpenoid,

minyak atsiri, dan tanin (Srivastava dkk., 2013). Pemanfaatan tumbuhan sebagai

bahan obat juga telah dilakukan dari zaman dahulu hingga sekarang. Selain itu

juga, tumbuhan obat dipercaya memberikan sedikit (atau tidak sama sekali) efek

samping pada penggunanya. Ketersediaan tumbuhan yang melimpah di alam juga

3

semakin menguatkan potensinya sebagai sumber bahan untuk pengembangan obat

baru. Di Indonesia sendiri, tercatat ada sekitar 30.000 atau sekitar lebih dari 12%

tumbuhan tingkat tinggi di hutan tropis dari yang terdapat di muka bumi (250.000

tumbuhan) (Ersam, 2004).

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Palaniappan dan Holley

(2010), penggunaan bahan sebagai antimikroba bersamaan dengan antibiotik

dapat meningkatkan sensitifitas bakteri yang telah mengalami resistensi terhadap

antibiotik. Kandungan zat aktif tumbuhan seperti flavon dan alkaloid telah teruji

dapat meningkatkan sensitivitas bakteri MRSA terhadap antibiotik -laktam (Sato

dkk., 2004; Yu HH dkk., 2005). Menurut Srivastava dkk. (2013), bahwa

antimikroba yang berasal dari tumbuhan dapat digunakan sebagai alternatif untuk

mengontrol resistensi karena dapat bekerja secara sinergis dengan antimikroba

yang sudah ada.

Salah satu tumbuhan yang telah teruji memiliki aktivitas antimikroba

adalah tumbuhan jarak kepyar (Ricinus communis L.) karena kandungan aktifnya

flavonoid kaempferol-3-tersubtitusi pada bagian daunnya (Setyowati, 1992).

Selain itu, daun jarak kepyar juga mengandung metabolit sekunder lainnya yang

menguatkan aktivitasnya sebagai antimikroba, yaitu alkaloid, tannin, saponin dan

fenol (Obumselu dkk., 2011). Berbagai macam ekstrak daun jarak kepyar telah

banyak diteliti dan teruji aktivitasnya dalam menghambat berbagai macam bakteri

Gram negatif dan Gram positif seperti E. coli, S. aureus, Klebsiella pneumoniae,

Streptococcus pyogenes, Bacillus subtilis, P. aeruginosa, Proteus vulgaris,

Salmonella typhi, Shigella, Vibrio cholerae, dan Shigella flexneri (Iqbal dkk.,

4

2012; Islam dkk., 2010; Kensa dan Yasmin, 2011; Kota dan Manthri, 2011;

Malook dkk., 2013; Naz dan Bano, 2012; Obumselu dkk., 2011; Sharma dkk.,

2013).

Pada penelitian ini dilakukan pengujian aktivitas antibakteri kembali

pada bakteri S. aureus dan E. coli yang berstandar ATCC serta menguji aktivitas

ekstrak daun jarak kepyar sebagai sumber senyawa antipatogen melalui uji

penghambatan produksi pigmen pyoverdin sebagai komunikasi antar sel pada

bakteri P. aeruginosa.

B. Perumusan Masalah

1. Apakah fraksi hasil fraksinasi ekstrak metanol daun jarak kepyar memiliki

aktivitas sebagai antibakteri terhadap bakteri S. aureus ATCC 29213 dan

E. coli ATCC 25922 serta berapakah nilai KHM50 -nya?

2. Apakah fraksi hasil fraksinasi ekstrak metanol daun jarak kepyar dapat

menghambat produksi pigmen pyoverdin sebagai aksi quorum sensing

pada P. aeruginosa ATCC 27853?

3. Senyawa apakah yang memiliki aktivitas sebagai antipatogen?

C. Tujuan Penelitian

1. Untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari fraksi hasil fraksinasi ekstrak

metanol daun jarak kepyar terhadap bakteri S. aureus ATCC 29213 dan E.

coli ATCC 25922 beserta nilai KHM50.

2. Untuk menyelidiki efek antipatogenik fraksi hasil fraksinasi ekstrak

metanol daun jarak kepyar dilihat dari kemampuan menghambat produksi

pigmen pyoverdin pada P. aeruginosa ATCC 27853.

5

3. Untuk mengetahui jenis senyawa yang memiliki aktivitas sebagai

antipatogen.

D. Tinjauan Pustaka

1. Tumbuhan jarak kepyar ( Ricinus communis L.)

Gambar 1. Ricinus communis L

a. Klasifikasi tumbuhan. Klasifikasi/ sistematika tumbuhan jarak

kepyar adalah sebagai berikut (Jena dan Gupta, 2012) :

Kerajaan : Plantae

Bangsa : Malpighiales

Suku : Euphorbiaceae

Sub suku : Acalyphoideae

Tribe : Acalypheae

Sub Tribe : Ricininae

Marga : Ricinus

Jenis : Ricinus communis L.

6

b. Nama daerah dan nama asing. Nama asing: Castor oil-plant

(Inggris); Eranda, Chitra-bija, Triputi, Tribija, Vaataari, Chanchu, Manda,

Uruvaka, Gandharva-hastaa, Panchaangula, Vardhamaana, Uttaanpatraka,

Vyaaghrapuchha, Chitraa (Ayuverda); Bedanjeer, Arand (Unani); Ammanakku

(Siddha/Tamil). Nama daerah : Jarak (Jawa, Melayu, Sunda, Bali, dan

Minangkabau); Jawa: Jarak jitun, Jarak kaliki, Kaliki (Sunda); Kaleke (Madura);

Kaleke beritah (Kangean); Sumatera : Gloah (Gayo); Lulang (batak Karo);

Dulang (Batak Toba); Kalikih alang (Minangkabau); Jarag (Lampung); Sulawesi :

Malasai (Mongondow); Kelalei (Tonsaw); alale (Gorontalo); Tangang-tangang

jara (Makasar); Peleng kaliki jera (Bugis); Kalangan (Sulawesi Utara); Nusa

tenggara : Tetanga (Bima); Luluk (Roti); Lolo (Sawu); Paku perunai (Timor);

Maluku : Balacai tamekat (Halmahera); Balacai (Ternate) (Anonim, 1983; Khare,

2007; Widodo dan Sumarah, 2007).

c. Morfologi. Jarak kepyar merupakan tumbuhan perdu atau terna.

Batang: tegak, tinggi 1-5 m, memiliki tekstur halus, dilapisi oleh lilin, berwarna

hijau muda sampai hijau tua, diameter batang 3-5 cm yang dihitung pada

ketinggian 50-100 cm dari permukaan tanah, berkayu lunak, berongga pada

bagian tengah, dan memiliki bentuk cabang yang tidak beraturan. Daun :

berwarna hijau muda sampai hijau tua, mempunyai helaian daun yang lebar

dengan ukuran 10-75 cm, daun menjari dengan 5-12 jari, tepi daun bergerigi,

memiliki tangkai daun dengan ukuran 35-50 cm yang berwarna hijau, dan tulang

daun pada permukaan daun bagian bawah menonjol. Bunga : malai yang bebentuk

tandan (tandan bagian atas adalah bunga betina sedangkan bagian bawah adalah

7

bunga jantan). Buah : bulat, berwarna hijau muda sampai hijau tua jika masih

muda dan berwarna coklat keabu-abuan jika sudah tua, akan pecah jika sudah tua,

berduri lunak/ berambut pendek, dan di dalamnya terdapat 3 bagian yang masing-

masing terdapat satu biji yang berbentuk oval/lonjong yang berwarna kecoklatan

dengan bintik-bintik atau motif tertentu (Anonim, 1978; Van Steenis, 1975;

Widodo dan Sumarah, 2007).

d. Habitat. Tumbuhan ini tumbuh tersebar pada daerah yang terletak

diantara 40 LU dan 40 LS dengan ketinggian 1-2.200 m. Biasanya tumbuhan ini

akan tumbuh pada daerah dataran rendah. Tapi, tumbuhan ini juga dapat tumbuh

di daerah pegunungan, terutama di daerah yang agak kering. Tumbuhan ini akan

tumbuh baik pada tanah yang bertekstur agak berpasir atau agak berlempung dan

tempat yang terbuka karena membutuhkan cahaya penuh untuk tumbuh (Anonim,

1978; Van Steenis, 1975; Widodo dan Sumarah, 2007).

e. Manfaat dalam bidang pengobatan. Penggunaan secara tradisional:

Minyak : mempermudah proses melahirkan jika diminum, sebagai zat pembawa

hormon steroid dalam penggunaan secara parenteral, sebagai purgatif untuk anak-

anak dan bayi, dan untuk megobati dermatosis dan eksim. Daun: kompres

payudara dengan menggunakan dekok dan poultice daun jarak kepyar dapat

meningkatkan sekresi air susu. Kemudian dekok juga dapat sebagai lactagogue

dan emmenagogue jika diminum. Serbuk daun sebagai insektisida. Jus daun

sebagai anti jamur dan mikobakteria. Selain itu, digunakan untuk emetikum dan

untuk penyakit kuning. Penggunaan secara poultice juga dapat digunakan untuk

menghilangkan nyeri seperti sakit gigi karena karies, bisul dan bengkak. Daun

8

yang dilapisi dengan minyak kemudian dihangatkan dapat digunakan sebagai

penghilang kembung pada anak-anak. Infusa daun digunakan untuk

menghilangkan sakit perut dan lotion mata. Akar : untuk sakit gigi, dekok akar

digunakan untuk menyembuhkan sakit pinggang dan kulitnya digunakan sebagai

purgatif. Fitofarmakologi : antioksidan, antinosiseptif, antiasma, antifertilitas,

antihistamin, imunomodulator, hepatoprotektif, antiinflamasi, anti-implantasi,

analgetik pusat, antitumor, sitotoksik, antimikroba, antifungi, antidiabetes,

penyembuh luka, lipolysis, insektisida, larvasida, moluskisida, antiulcer, dan

regenerasi tulang (Jena dan Gupta, 2012; Khare, 2007; Rana dkk., 2012).

f. Kandungan kimia. Daun : asam gentisat, flavonoid (rutin,

kuersetin-3-O-beta-d- xylopiranosida, kuersetin3-O-beta-d- glukopiranosida ,

kuersetin-3-O-beta-d-rutinosida, kaempferol-3-O-beta-d-rutinosida, kaempferol-3-

O-beta-d-xylopiranosida, dan kempferol-3-O-beta-D-glukopiranosida,), asam

galat, alkaloid ( ricinin dan N-dimetilricinin), tanin, monoterpenoid (1,8-sineol,

kamper, dan -pinene), dan seskuiterpen (-caryophyllene). Akar : indol-3-asam

asetat. Biji : asam risinoleat, isorisinoleat, stearat,dan dihidroksistearat, indol-3-

asam asetat, agglutinin, risin. Buah : alkaloid dan risinin. Batang: risinin (Jena dan

Gupta, 2012; Rana dkk., 2012 )

2. Maserasi

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana dan murah. Maserasi

diawali dengan cara menyerbuk bahan simplisia dengan derajat halus tertentu dan

kemudian direndam dengan cairan penyari yang sesuai pada wadah yang tertutup.

Selanjutnya, penyari disaring dan residu diperas untuk mengeluarkan penyari

9

yang masih tertinggal dalam serbuk (Azmir dkk., 2013; Anonim, 1986). Dalam

buku Farmakope Herbal Indonesia (2008), disebutkan bahwa proses maserasi

dilakukan dengan memasukkan satu bagian simplisia ke dalam maserator

kemudian ditambahkan sepuluh bagian pelarut dan direndam selama 24 jam yang

mana pada 6 jam awal dilakukan pengadukan sesekali. Sedangkan pada buku

Acuan Sediaan Herbal (2000) disebutkan bahwa proses maserasi tidak hanya

dilakukan selama 24 jam melainkan selama seminggu. Tahapan maserasi

berdasarkan Acuan Sediaan Herbal (2000) adalah melakukan maserasi dengan

pengadukan selama 5 hari dengan 75 bagian penyari kemudian disaring dan pada

ampas dilakukan maserasi kembali tanpa pengadukan dengan 25 bagian penyari

selama 2 hari.

Pada proses maserasi terjadi proses difusi dimana cairan penyari akan

menembus dinding sel dan masuk ke dalam sel yang mengandung zat aktif, zat

aktif akan larut dan menyebabkan perbedaan konsentrasi antara penyari yang ada

di luar sel dengan yang ada di dalam sel sehingga penyari yang ada di dalam sel

akan didesak keluar sel. Peristiwa difusi akan terjadi berulang hingga tercapainya

kesetimbangan konsentrasi antara penyari yang ada di dalam sel dengan yang ada

di luar sel (Anonim, 1986). Untuk menghindari tercapainya kesetimbangan

konsentrasi, maka diperlukan pengadukan sehingga meningkatkan hasil penyarian

(Azmir dkk., 2013).

Cairan penyari yang digunakan sebaiknya mempertimbangkan toksisitas

terhadap manusia, kelestarian lingkungan, ekonomis, afinitas molekul antara zat

yang disari dengan penyari baik, transfer massa, penggunaan co-solvent, dan

10

polaritas zat yang akan disari (Azmir dkk., 2013). Dalam Farmakope Herbal

Indonesia (Anonim, 2008) disebutkan bahwa pelarut yang umum digunakan

adalah etanol 70%.

Kelarutan senyawa aktif dalam penyari berdasarkan kepolaritasannya

dijabarkan oleh Pramono (2013) pada tabel berikut ini:

Tabel I. Urutan kelarutan senyawa aktif dari pelarut non polar hingga pelarut polar

Penyari Senyawa yang larut

Heksan

Petroleum eter

Lemak , terpenoid atau minyak atsiri,

steroid atau triterpenoid, antrakinon,

kumarin, flavonoid polimetoksi,

resin, klorofil

Toluen

Kloroform

Diklorometan

Semua senyawa aktif yang telah

disebutkan di atas,isoflavon, alkaloid

bebas, kurkumin dan fenil propan,

fenol sederhana

Dietil eter Semua senyawa aktif yang telah

disebutkan di atas, flavonoid

polihidroksi, asam fenolat

Etil asetat

Aseton

Semua senyawa aktif yang telah

disebutkan di atas, flavonoid

monoglikosida, antrakinon glikosida,

steroid glikosida, kumarin glikosida

Etanol

Metanol

Semua senyawa aktif yang telah

disebutkan di atas, flavonoid

glikosida, tannin, saponin

Air panas Semua senyawa aktif yang larut

dalam penyari mulai dari dietil eter

ke hingga metanol, alkaloid garam,

karbohidrat, protein

Keuntungan dari maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang

sederhana dan mudah. Sedangkan kerugiannya adalah membutuhkan waktu yang

lama dan proses penyariannya tidak sempurna (Anonim, 1986).

3. Uraian tentang mikrobiologi

a. Bakteri. Berikut ini adalah uraian tentang bakteri yang akan

diujikan, yaitu:

11

1) Staphylococcus aureus. Berdasarkan Garrity dkk. (2004),

klasifikasi/ sistematika S. aureus adalah sebagai berikut :

Filum : Firmicutes

Kelas : Bacilli

Bangsa : Bacillales

Suku : Staphylococcaceae

Marga : Staphylococcus

Jenis : Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif yang berbentuk

bulat, berdiameter 0,8-1 m, tersusun dalam bentuk kelompok yang tidak teratur,

bersifat fakultatif anaerob, tidak bergerak, membentuk koagulasi, penyebab

hemolisis, mencairkan gelatin, meragikan manitol, bersifat lipolitik pada

perbenihan yang mengandung kuning telur, membuat fosfatasa, peka terhadap

lisostafin, dan tidak membentuk spora. Dalam media biakan cair, S. aureus dapat

berbentuk tunggal, berpasangan, tetrad dan rantai (Brooks dkk., 2001; Gupte,

1990; Staf Pengajar FK UI, 1994).

Staphylococcus aureus dapat tumbuh baik pada suhu 37C dalam

suasana aerobik dan mikroaerofilik. Bakteri ini akan tumbuh dengan membentuk

pigmen secara optimal temperatur 20-35C. Pigmen yang dihasilkan oleh koloni

S. aureus adalah kuning emas yang mana proses pigmentasinya akan lebih baik

jika terdapat cahaya. Batas suhu untuk pertumbuhan S. aureus adalah 15- 40C

dengan pH 7,4 (Brooks dkk., 2001; Gupte, 1990; Staf Pengajar FK UI, 1994).

12

Staphylococcus aureus dapat menyebabkan penyakit berkat kemampuan

daya sebar yang invasif dalam jaringan serta adanya toksin dan enzim yang

dihasilkannya. Toksin dan enzim yang dihasilkan oleh S. aureus adalah hemolisin,

fibrinolisin, lekosidin, toksin eksfoliatif, toksin sindroma syok, enterotoksin,

enzim katalase, enzim koagulase, enzim fosfatase, enzim hialuronidase, dan enzim

deoksiribonuklease (Brooks dkk., 2001; Gupte, 1990; Staf Pengajar FK UI, 1994).

S. auerus merupakan bakteri penyebab penyakit pada kulit atau jaringan lunak,

pembuluh darah, dan saluran pernafasan bagian bawah (Plata dkk., 2009), namun

S. aureus ini juga bersimbiosis komensalisme dengan kulit, kelenjar kulit, dan

membran mukosa hidung pada orang sehat (Crossley dan Archer, 1997).

2) Escherichia coli. Berdasarkan Garrity dkk (2004), klasifikasi/

sistematika E. coli adalah sebagai berikut :

Filum : Proteobacteria

Kelas : Gammaproteobacteria

Bangsa : Enterobacteriales

Suku : Enterobacteriaceae

Marga : Escherichia

Jenis : Escherichia coli

Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif yang berbentuk batang

pendek, berukuran 0,4-0,7 m x 1,4 m, dapat meragikan laktosa pada media

isolasi kuman enterik, mikroaerofilik, hemolisis tipe beta pada media Agar darah,

dan bersifat fakultatif anaerob yang hidup sebagai flora normal di dalam usus

besar manusia. E. coli akan menyebabkan penyakit pada manusia jika imunitas

13

manusia menurun dan adanya infeksi pada pelindung saluran gastrointestinal

(Nataro dan Kaper, 1998; Staf Pengajar FK UI, 1994). Penyakit-penyakit yang

disebabkan oleh E. coli adalah infeksi saluran kemih, sepsis atau meningitis, dan

diare. Zat toksin yang dihasilkan oleh E. coli adalah toksin LT (heat-labile

enterotoxin) dan toksin ST (heat-stable enterotoxin) (Staf Pengajar FK UI, 1994).

3) Pseudomonas aeruginosa. Berdasarkan Garrity dkk (2004),

klasifikasi/ sitematika P. aeruginosa adalah sebagai berikut :

Filum : Proteobacteria

Kelas : Gammaproteobacteria

Bangsa : Pseudomonadales

Suku : Pseudomonadaceae

Marga : Pseudomonas

Jenis : Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri Gram negatif yang

memiliki bentuk batang tunggal, ganda dan kadang-kadang membentuk rantai

pendek; berukuran 0,5-1,0 m x 3,0-4,0 m; dapat bergerak dengan flagel polar;

memiliki pili (fimbriae); aerob dan fakultatif anaerob; bersifat oksidase positif;

dapat memproduksi bau amis; beberapa strain dapat menghemolisis darah; tidak

memfermentasikan kabohidrat; bersifat saprofit pada orang sehat (Brooks dkk.,

1991; Moore dkk., 2006; Staf Pengajar FK UI, 1994).

Pseudomonas aeruginosa dapat tumbuh baik pada berbagai tipe media

dengan suhu 37-42C dan pH 6,4-7,8. Bakteri ini akan membentuk lapisan lendir

polisakarida ekstraseluler jika ditumbuhkan pada perbenihan tanpa sukrosa. P.

14

aeruginosa membentuk koloni bulat dan menghasilkan pyocyanin (pigmen

berwarna kebiruan dan tidak berfluoresensi yang dapat berdifusi ke dalam Agar),

pyoverdin (pigmen kehijauan dan berfluoresensi), pyorubin (pigmen merah

gelap), dan pyomelanin (pigmen hitam) (Brooks dkk., 1991; Staf Pengajar FK UI,

1994).

Bakteri P. aeruginosa menginfeksi kulit dan selaput lendir pada orang

yang mengalami penurunan daya tahan tubuh akibat penggunaan alat-alat bantu

kedokteran, penyakit metabolik, kemoterapi, neutropenia atau luka bakar.

Patogenesitas dari P. aeruginosa dipengaruhi oleh enzim, pili, dan toksin yang

dihasilkan. Adapun enzim dan toksin yang dihasilkan adalah elastase, protease,

dan hemolisin (Brooks dkk., 1991).

b. Uji aktivitas dan potensi antimikroba. Uji antimikroba merupakan

metode untuk membuktikan agen antimikroba sintetik maupun agen antimikroba

yang berasal dari bahan alami. Aktivitas antimikroba dilihat dari respon

pertumbuhan bakteri yang diuji terhadap bahan yang diujikan. Metode uji

aktivitas dan potensi antimikroba yang lazim digunakan adalah sebagai berikut:

1) Metode difusi. Berikut ini adalah macam-macam metode

difusi yang sering digunakan dalam penelitian yaitu disc diffusion (tes Kirby &

Bauer), ditch-plate technique, cup-plate technique, metode Stokes dan metode

primary disc. Metode disc diffusion merupakan metode yang paling sering

digunakan untuk mengukur diameter hambat yang dihasilkan oleh antimikroba

yang terdapat dalam piringan yang mana piringan tersebut ditempelkan pada

media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang diujikan. Media agar yang

15

biasa digunakan adalah media agar Mueller-Hinton. Metode Stokes memiliki

prinsip yang sama dengan metode disc diffusion dan yang membedakan hanyalah

penempatan bakteri uji dengan bakteri kontrol dalam cawan Petri. Pada Metode

Stokes, bakteri kontrol dan bakteri uji diletakkan dalam satu cawan Petri dimana

bakteri kontrol ditumbuhkan pada bagian tengah, sedangkan bakteri uji pada

bagian atas dan bawah agar yang dibagi secara horizontal. Sedangkan pada

metode disc diffusion, bakteri kontrol dan bakteri uji ditumbuhkan pada cawan

Petri yang terpisah. Metode primary disc juga memiliki prinsip yang sama dengan

metode disc diffusion dan metode Stokes. Namun yang membedakan hanyalah

spesimen uji yang digunakan, pada metode disc diffusion dan metode Stokes

menggunakan kultur bakteri murni sedangkan pada metode primary disc

menggunakan urin atau cairan yang mengandung bakteri (Parija, 2012;

Vasanthakumari, 2007).

Metode lain yang memiliki prinsip sama dengan metode disc

diffusion adalah cup-plate technique dimana tidak menggunakan disc melainkan

menggunakan sumuran. Ditch-plate technique dilakukan dengan cara membuat

parit pada bagian tengah agar kemudian diisi dengan bahan antimikroba. Bakteri

uji pada ditch-plate technique diaplikasikan dengan cara digores ke arah parit

(Pratiwi, 2008). Metode difusi yang dapat digunakan untuk mengetahui nilai

KHM adalah metode E-test dimana menggunakan strip yang mengandung

antimikroba dengan seri kadar terendah hingga tertinggi. Strip tersebut

ditempelkan pada media agar yang telah diinokulasikan dengan bakteri uji dimana

16

KHM ditunjukkan dengan kadar terendah yang masih memberikan tampilan zona

jernih pada media agar (Parija, 2012; Pratiwi, 2008; Vasanthakumari, 2007).

2) Metode dilusi. Metode dilusi yang sering digunakan ada 2

macam, yaitu metode dilusi cair dan padat. Baik metode cair dan padat dapat

digunakan untuk menentukan nilai MIC. Pada metode dilusi cair, nilai MIC dapat

ditentukan dengan cara melihat seri kadar terendah dari agen antimikroba yang

terlihat jernih. Selain itu, nilai MBC juga dapat ditentukan dengan cara melihat

seri kadar terendah dari agen antimikroba yang terlihat jernih dan tidak ada

pertumbuhan bakteri jika digoreskan ke media agar padat (Parija, 2012; Pratiwi,

2008; Vasanthakumari, 2007). Sedangkan pada metode dilusi padat, nilai MIC

merupakan konsentrasi terendah yang memberikan tampilan jernih atau tidak

adanya bakteri yang tumbuh pada tempat dimana bakteri di gores pada media agar

(Parija, 2012). Keuntungannya adalah dalam plate satu kadar agen antimikroba

dapat diujikan untuk beberapa macam mikroba uji (Pratiwi, 2008;

Vasanthakumari, 2007).

3) Bioautografi. Uji bioautografi ini menggunakan plat KLT

untuk mengetahui bercak mana yang memiliki aktivitas sebagai antibakteri,

antivirus atau antijamur. Ada tiga macam metode bioautografi, yaitu :

a) Bioautografi Kontak. Pada metode ini, cara mendeteksi

adanya aktivitas antibakteri yaitu dengan cara menyentuhkan plat pada media agar

yang telah ditanami bakteri selama beberapa menit atau jam kemudian

diinkubasikan dan dilihat zona jernih yang terbentuk di sekitar bercak (Choma

dan Grzelak, 2010; Pratiwi, 2008). Kerugian menggunakan metode ini adalah

17

sulitnya mendapatkan kontak yang sempurna antara plat dan media agar serta

dapat menempelnya adsorben pada media agar (Choma dan Grzelak, 2010).

b) Bioautografi overlay. Pada metode ini, media yang telah

dicampur dengan mikroba uji dituang diatas permukaan KLT. Media yang telah

memadat bersama bakteri kemudian diinkubasikan ke dalam inkubator. Untuk

melihat zona jernih yang dihasilkan, dilakukan penyemprotan dengan

menggunakan tetrazolium klorida (Pratiwi, 2008). Kerugian penggunaan metode

ini adalah adanya pengenceran agen antimikroba sehingga sensitivitasnya lebih

rendah dibandingkan bioautografi kontak (Choma dan Grzelak, 2010).

c) Bioautografi langsung. Untuk mendeteksi adanya aktivitas

antibakteri, plat KLT dicelupkan dalam suspensi bakteri atau disemprot langsung

dengan mikroba kemudian diinkubasi dan zona hambatan dilihat menggunakan

garam tetrazolium dimana daerah yang tidak berwarna menunjukkan tidak adanya

bakteri yang hidup (Choma dan Grzelak, 2010).

c. Quorum sensing. Quorum sensing merupakan mekanisme

komunikasi antar sel bakteri untuk berkoordinasi. Setiap sel bakteri menghasilkan

autoinducer dalam jumlah yang sangat sedikit dan setiap bakteri juga memiliki

reseptor untuk autoinducer tersebut (Lal, 2009). Autoinducer ini merupakan

molekul sinyal yang kecil dan dapat berdifusi (Hentzer dan Givskov, 2003;

Rasmussen dan Givskov, 2006). Konsentrasi autoinducer akan meningkat seiring

dengan meningkatnya jumlah populasi. Jika konsentrasi autoinducer mencapai

batas minimal, maka autoinducer akan mengaktivasi reseptor dalam sel bakteri

yang dapat meregulasi transkripsi gen yang bertanggung jawab dalam sintesis

18

autoinducer itu sendiri dan juga memberikan respon berupa perilaku tertentu

(Hentzer dan Givskov, 2003; Lal, 2009; Sifri, 2008; Williams, 2007). Respon

berupa perilaku tertentu ini terjadi jika adanya perubahan densitas populasi bakteri

yang bisa disebabkan oleh ketersediaan nutrisi dan adanya toksin dari mikroba

lain (Lal, 2009). Inilah yang disebut dengan mekanisme quorum sensing.

Quorum sensing meregulasi proses-proses penting seperti

bioluminescence, pembentukan antibiotik, pembentukan biofilm, motilitas dan

virulensi (Bosgelmez-Tinaz, 2006). Mekanisme quorum sensing pada bakteri

patogen dalam proses terjadinya infeksi adalah dengan menundanya faktor

virulensi bakteri hingga bakteri mencapai populasi yang cukup untuk melawan

sistem imun tubuh dan menimbulkan infeksi. Penundaan faktor virulensi ini

bertujuan untuk meminimalkan adanya respon dari sistem imun tubuh (Hentzer

dan Givskov, 2003).

Mekanisme quorum sensing pada bakteri Gram negatif dan Gram positif

diinduksi oleh autoinducer yang berbeda. Pada bakteri Gram positif biasanya

berupa molekul peptida yang sering disebut sebagai AIPs sedangkan pada bakteri

Gram negatif berupa AHL. Selain itu juga ada autoinducer yang belum diketahui

strukturnya yaitu AI-2 yang mana AI-2 ini dapat ditemukan dalam mekanisme

quorum sensing pada bakteri E. coli (Antunnes dan Ferreira, 2009).

Pada bakteri P. aeruginosa, quorum sensing meregulasi beberapa faktor

virulensi meliputi AHL signaling, nucleotide-based signals (cAMP; c-di-GMP; c-

di-GMP dan SCV; ppGpp dan pppGpp), aktivasi DKPs dan LuxR, 4-quinolone

19

signaling, sistem GAC, pigmented signal (pyoverdin dan pyocianin), dan

diffusible signal factors (Jimenez dkk., 2012).

Salah satu faktor virulensi, pyoverdin, merupakan senyawa fluorosensi

hijau kuning yang larut dalam air yang berperan sebagai siderophore yang

berikatan dengan besi dengan perbandingan stokiometri 1:1 (Mayer dan Abdallah,

1978; Barbhaiya dan Rao, 1985; Cornelis dkk., 1989). Siderophore merupakan

senyawa yang memiliki kemampuan membentuk khelat dengan besi dan

membawanya ke dalam sel melalui reseptor pada permukaan sel (Neilands, 1981).

Siderophore disekresikan jika bakteri berada dalam lingkungan yang memiliki

kadar besi yang rendah. Besi merupakan logam yang dibutuhkan oleh bakteri

sebagai kofaktor untuk enzim redox-dependent (Griffiths, 1987). Pyoverdin

bertanggung jawab dalam menginisiasi beberapa fakltor virulesi seperti ToxA,

PrpL endoprotease dan pyoverdin itu sendiri (Lamont dkk., 2002).

E. Landasan Teori

Berdasarkan pemakaian secara tradisional dan juga telah dibuktikan oleh

banyak penelitian, daun jarak kepyar memiliki aktivitas antibakteri. Penelitian in

vitro membuktikan bahwa daun jarak kepyar memberikan hambatan kepada

berbagai macam bakteri seperti E. coli, S. aureus, Klebsiella pneumoniae,

Streptococcus pyogenes, Bacillus subtilis, P. aeruginosa, Proteus vulgaris,

Salmonella typhi, Shigella, Vibrio cholerae, dan Shigella flexneri. Adanya

aktivitas antibakteri pada daun jarak kepyar dikarenakan adanya kandungan utama

senyawa flavonoid. Senyawa flavonoid memiliki gugus fenol dimana salah satu

mekanisme aksinya dapat mendenaturasi protein mikroba. Flavonoid polihidroksi

20

lebih larut pada pelarut etil asetat dan jika dalam bentuk glikosida maka akan larut

pada pelarut yang lebih polar seperti air. Oleh karena itu, fraksi etil asetat dan

fraksi air dari hasil fraksinasi ekstrak metanol berpotensi memberikan efek

antibakteri pada bakteri E. coli dan S. aureus berstandar ATCC.

Senyawa antibakteri dapat memberikan efek penghambatan quorum

sensing jika diberikan pada konsentrasi dibawah KHM. Penelitian Adonizio dkk.

(2007) terhadap beberapa tumbuhan di Florida Selatan, salah satunya adalah C.

hypericifolia yang memberikan hasil positif terhadap penghambatan pigmen

pyoverdin pada P. aeruginosa. Tumbuhan C. hypericifolia berasal dari suku yang

sama dengan R. communis, Euphorbiaceae. Berdasarkan buku Chemotaxonomie

der pflanzen (1989), tumbuhan yang berasal dari suku yang sama akan memiliki

senyawa yang hampir sama. Oleh karena itu, fraksi dari ekstrak daun jarak kepyar

(R. communis L.) berpotensi memberikan efek antipatogen pula terhadap P.

aeruginosa melalui mekanisme penghambatan pigmen pyoverdin.

F. Hipotesis

1. Fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak metanol daun jarak kepyar memiliki

aktivitas antibakteri terhadap S. aureus ATCC 29213 dan E. coli ATCC

25922.

2. Fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak metanol daun jarak kepyar memiliki

kemampuan menghambat produksi pigmen pyoverdin pada P. aeruginosa

ATCC 27853.

3. Senyawa yang bertanggung jawab terhadap aktivitas ekstrak daun jarak

kepyar sebagai antipatogen adalah flavonoid.