resume jurnal pendukung

5/14/2018 Resume Jurnal Pendukung - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/resume-jurnal-pendukung 1/6

Nama : Tri Ekawati Heryanto

NIM : 080061

REVIEW JURNAL

Perbedaan Kemampuan Hidup Strain Listeria monocytogenes dan

Pertumbuhannya pada Katiki, sebuah Keju Tradisional Yunani yang Lembut, di

Suhu Penyimpanan yang Berbeda

Dafni-Maria Kagkli, Vassilios * Iliopoulos, Virginia Stergiou, Lazaridou Anna, dan NychasGeorge-John

Agricultural University of Athens, Laboratory of Microbiology and Biotechnology of Foods, Iera Odos 75, Athens 11855,

Greece

Listeria monocytogenes adalah patogen yang umumnya hidup dalam makanan dan berada di

mana-mana, hal ini terkait dengan wabah listeriosis yang berasal dari konsumsi berbagai komoditas

pangan, terutama produk susu, makanan laut, dan daging. Penyakit yang disebabkan bakteri ini cukup

parah, terutama pada wanita hamil, neonatus, orang tua, dan orang-orang imunodefisiensi,

sehingga tingkat patogen dalam makanan harus tetap rendah untuk memastikan produk makanan

tersebut aman. Produk dengan pH≤5,0 dan aktivitas air≤0.94 dengan masa simpan kurang dari 5 harisecara otomatis termasuk dalam kategori makanan RTE ( Ready to eat ) yang tidak dapat mendukung

pertumbuhan dari L. monocytogenes. Produk ini berupa keju putih dengan struktur krem, secara

tradisional dihasilkan dari susu kambing atau dari campuran susu kambing dan domba. Telah diakui

sebagai Protected Designation of Origin sejak 1994 (www.greekcheese.gr), dengan konsumsi yang

siap meningkat dalam beberapa tahun terakhir. Susu ini awalnya dipasteurisasi dan didinginkan pada

27 hingga 28°C. Kemudian dilakukan koagulasi dengan atau tanpa penambahan rennet, lalu campuran

dibiarkan pada suhu 20 hingga 22°C. Dadih ini ditempatkan di kantung kain untuk pengeringan,

dengan konsentrasi air akhir yang tinggi (ca. 75%) dan kandungan garam rendah (ca. 1%) dan pH

(4,3-4,5) ketika disimpan pada suhu 4 sampai 5°C. Karakteristik strain atau kelangsungan hidup

belum diperhitungkan (belum dianggap). Hal ini mungkin menjelaskan variabilitas temuan dalam

hal kondisi penyimpanan yang berbeda. Elektroforesis gel Pulsed-field (PFGE) adalah alat yang

digunakan untuk epidemiologi, yang memberikan hasil berulang. Ia memiliki kemampuan untuk

menghasilkan profil berbagai mikroorganisme dan mampu membedakan strain dengan ketelitian yang

tinggi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menilai kelangsungan hidup lima strain L.

monocytogenes yang diinokulasi baik secara individu atau sebagai campuran dalam keju Katiki. Keju

disimpan di 5, 10, 15, dan 20°C selama 1 bulan. PFGE digunakan untuk memantau strain (s) yang

mungkin bertahan dan atau tumbuh pada temperatur yang berbeda dalam ekosistem yang kompleks

seperti Katiki. Strain yang digunakan dalam penelitian ini untuk membentuk inokulum terdiri dari dua

jenis serotipe strain 4b dan tiga isolat koleksi laboratorium yang terisolasi dari keju lembut dan

makanan RTE. Strain dipilih berdasarkan sumber isolasi, karena sangat penting untuk penafsiran data.

Selain itu populasinya pun dipantau di seluruh penyimpanan, sehubungan dengan mungkinnya

terjadai evolusi baik secara kuantitatif juga kualitatif.

Bahan dan Metode

Strain dari L. monocytogenes dan persiapan inokulum campuran.

Strain L. monocytogenes TS125, TS124, TS128, TS131, dan TS133 diambil dari koleksi strain di

Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Makanan. Strain TS124 dan TS125 adalah jenis strain

serotipe 4b. TS124 adalah jenis strain NCTC 10527, dan TS125 adalah Scott strain A. Strain TS133

dan TS128, telah ditemukan di keju lunak, dan strain TS131 diisolasi dari makanan RTE. Strain

ditumbuhkan semalam dalam medium Brain Heart Infussion Broth (BHI) (Lab M, Bury, Lancashire,

United Kingdom) pada suhu 37°C. Kultur bakteri disentrifugasi pada 10.000 x g selama 5 menit dan

diresuspensi dalam larutan Ringer (Lab M, Bury, Lancashire, Inggris). Lalu sel dicuci dua kali,disentrifugasi dalam kondisi yang sama, dan diresuspensi untuk volume akhir 1 ml dalam larutan




NIM : 080061

Ringer. Kultur digunakan untuk inokulum strain individu atau "campuran" dari kelima strain dimana

dari kelima strain tersebut dicampur dengan tujuan untuk mendapatkan inokulum standar yang terdiri

dari kira-kira jumlah sel yang sama per strain. Ini merupakan campuran terakhir yang berisi semua

strain yang digunakan untuk diinokulasikan pada keju sebanyak 106

CFU/g. Konfirmasi ukuran

inokulum sebelum digunakan diperoleh dengan metode pengenceran serial di PALCAM (polimiksin,

acoustic, lithium klorida, seftazidim, aesculin, dan manitol) agar (Oxoid Ltd, Basingstoke,Hampshire, Inggris).

Kondisi penyimpanan keju Katiki.

Penelitian dilakukan rangkap tiga. Setiap kali, untuk setiap pengulangan, delapan paket keju Katiki

250 g dibeli dari pasar dan segera dipindahkan ke laboratorium untuk analisis. Untuk menentukan

populasi L. monocytogenes dan bakteri asam laktat (LAB), sampel (10 g) diambil dari setiap pack,

dihomogenkan, dan ditempatkan masing-masing pada PALCAM agar dan MRS agar. Medium

selektif juga digunakan ketika sampel keju yang diuji menunjukkan hasil negatif. Selanjutnya, empat

bungkus keju diinokulasi (1%, vol/berat) L. monocytogenes (strain tunggal atau inokulum campuran)

dengan populasi akhir 5 x 106

CFU/g. Inokulum tersebut dihomogenkan dengan cara diaduk

menggunakan spatula steril sebelum paket disegel kembali. Satu bungkus ditempatkan disetiap suhu(5, 10, 15, dan 20°C). Sisa empat bungkus lainnya tidak diinokulasi tetapi diperlakukan sama dan

ditempatkan pada suhu yang sama, sebagai kontrol.

Sampling dari prosedur keju dan isolasi.

Sampel di seluruh penyimpanan dianalisis pada interval waktu yang diatur. Bakteri asam laktat dan

populasi listerial keju baik secara individu maupun sebagai campuran pada suhu masing-masing

diperiksa pada titik awal, tengah (3, 4, 6, dan 10 hari masing-masing pada suhu 20°, 15°, 10°, dan

5°C), dan titik akhir penyimpanan (5, 8, 12, dan 18 hari masing-masing pada suhu 20°, 15°, 10°, dan

5°C, masing-masing). Setiap interval waktu, 10 g keju secara aseptik dikeluarkan dari wadah,

dihomogenkan dengan menggunakan larutan Ringer dalam stomacher, dan disebar pada pelat agar-

agar yang sesuai (MRS untuk LAB dan PALCAM untuk Listeria). Bila perlu, pengayaan selektif dilakukan meskipun hanya sebentar, pengayaan yang primer dilakukan dengan membekukan 25 g

sampel produk dalam 225 ml 1/2 kaldu selektif Listeria (Merck Darmstadt, Jerman). Setelah inkubasi

pada suhu 30°C selama 24 jam (pengayaan primer), 0,1 ml sampel dipindahkan ke 10 ml kaldu

selektif Listeria (Merck) dan diinkubasi pada 35°C selama 48 jam (pengayaan sekunder). Setelah

setiap langkah dilakukan, kemudian diinokulasikan pada agar PALCAM Listeria (30°C selama 48

jam). Dalam rangka memantau strain dari inokulum campuran, 50 koloni dipilih

dari setiap replikasi dari pengenceran tertinggi pada tahap awal penyimpanan keju diinokulasikan, dan

20 koloni dipilih tiap ulangan pada setiap interval waktu untuk kemudian diteliti. Dari jumlah total

270 koloni diambil, 80 isolat diambil dari replikasi 1, 80 lainnya diambil dari replikasi 2, dan 55

diambil dari replikasi 3, dengan jumlah total 215 isolat yang kemudian ditumbuhkan, dimurnikan, dan

disimpan di 80°C dalam kaldu tryptic kedelai mengandung gliserol 25%. Hanya bakteri dengan

katalase-positif, batang gram positif yang digunakan untuk analisis lebih lanjut dan menghasilkan 159

isolat yang diduga Listeria. PH keju juga dimonitor selama penyimpanan.

Diferensiasi strain dari inokulum campuran menggunakan PFGE.

Semua 159 isolat merupakan bakteri gram-positif, batang katalase-positif diisolasi dari agar-agar

PALCAM yang diisolasi untuk ditipekan menjadi tingkatan strain oleh PFGE. Dua puluh unit ApaI

digunakan sebagai campuran reaksi pembatas. Kemudian bagian tersebut dimasukkan ke gel agarose

1% PFGE grade, dan gel tersebut dicampurkan dalam buffer 0,5 mM Tris-borate (45 mM Tris-HCl,

45 mM asam borat, 1 mM EDTA) menggunakan aparatus elektrik lapangan contour-clamped

homogeneous dan modul pendinginan pada 6 V/cm selama 18 jam, dengan waktu produksinya 1-40

s. Gel kemudian diwarnai dengan bromida (0,5 μg/ml) dalam air selama 2 jam dan didestain selama 1

jam sebelum difoto menggunakan sistem GelDoc (Bio-Rad). Konversi, normalisasi, dan analisis lebih




NIM : 080061

lanjut dilakukan dengan menggunakan koefisien Pearson dan kelompok unweighted-pair rata-rata

menggunakan metode analisis cluster dengan perangkat lunak GelCompar.

Konfirmasi species

Bagian V1-V3 gen 16S rRNA yang mewakili isolat per pola PFGE diamplifikasi berbeda. Primer P1

(5_-GCGGCGTGCCTAATACATGC-3_) dan P4 (5_-ATCTACGCATTTCACCGCTAC-3_). Produk

PCR dimurnikan menggunakan QIAquick PCR Pemurnian Kit sesuai dengan petunjuk. Purifiedamplikon langsung sekuensing dengan DNA sequencer 3730 ABI XL otomatis oleh Macrogen.

Pencarian urutan DNA dilakukan di National Center for Biotechnology Information GenBank.

Analisis data.

Semua analisa dilakukan dalam rangkap tiga. Data dinyatakan sebagai standar deviasi, dan dianalisis

dengan menggunakan xlstat untuk perangkat lunak Windows. Diuji menggunakan one-way analisis

varians. Sedikitnya perbedaan signifikan multi-range test (P≤0,05) diterapkan ke setiap variabel

individu untuk membandingkan arti nilai pH terhadap titik waktu dengan suhu dan untuk menilai

apakah perbedaan tersebut signifikan.

Hasil dan Diskusi

Semua sampel Listeria pada awal percobaan tidak ada koloni yang tumbuh pada agarPALCAM baik sebelum atau setelah prosedur pengayaan. Noninoculated keju tetap Listeria negatif

seluruh penyimpanan. Populasi Listerial bervariasi dengan suhu dan menunjukkan kelangsungan

hidup tertinggi disuhu yang lebih rendah (Gambar 1a dan b) karena mereka terdeteksi sampai hari 18

dan 30 penyimpanan di inokulum campuran dan inokulum strain tunggal. Tingkat terendah terdeteksi

pada 20°C, dimana deteksi itu mungkin hanya sampai 10 hari penyimpanan dalam kasus strain

tunggal dan sampai dengan 5 hari penyimpanan dalam inokulum campuran (Gambar 1a dan b).

Pertumbuhan LAB mengikuti pertumbuhan bakteri hidup total dan meningkat terus 6,2-6,5 log CFU/g

menjadi 8,0-8,2 log CFU/g (Gambar 1c), sedangkan sedikit penurunan pH diamati, nilai pH awal

berada di urutan 4,5 sampai 4,6 dan mencapai 4,2-4,3 pada akhir penyimpanan (data tidak

ditampilkan). Tidak ada nilai pH yang berbeda signifikan secara statistik antara sampel disimpan padatemperatur yang berbeda. Dalam pemantauan inokulum strain tunggal, perbedaan yang diamati

diantara suhu rendah dan tinggi. Pertumbuhan seluruh strain mirip pada 5 dan 10°C meskipun pada

suhu 5°C populasi pada hari ke 30 adalah sekitar 1 log CFU/g dibandingkan pertumbuhan pada 10°C,

di mana ia tidak terdeteksi. Pada 15 dan 20°C, selisih kurang signifikan terdeteksi antara inokulasi

tunggal strain Listerial, setidaknya pada awal penyimpanan, sampai TS125 strain akhirnya

mendominasi yang lainnya. Namun demikian, perbedaan tidak jelas pada suhu rendah (Gbr. 1b).

Dari 215 koloni dari analisis inokulum campuran, hanya 159 isolat yang diduga Listeria

(74%) menjadi sasaran PFGE untuk mendeteksi kelangsungan hidup strain tertentu selama

penyimpanan (Gbr. 2). Lima belas isolat diduga dari replikasi 1 dan 2, dan 20 telah diduga dari

replikasi 3 pada awal penyimpanan (data tidak ditampilkan). Secara khusus, TS125 strain unggul

diantara yang lainnya dengan persentase sebesar 40% (20 dari 50 awal isolat), sedangkan strain

TS131 itu hanya 4%, TS133 sebesar 28%, TS124 sebesar 20%, dan TS128 di 8 % dari inokulum

awal. Sejumlah wakil dari isolat dari setiap cluster Dendrogram diidentifikasi menggunakan 16S

rRNA gen sequencing dan dikonfirmasi spesies sebagai L. monocytogenes. PFGE juga

mengungkapkan informasi menarik mengenai temperatur yang berbeda. Hanya C TS131 bisa

bertahan setelah 18 hari inkubasi, dan semua isolat yang lain menunjukkan tidak dapat bertahan hidup

pada suhu ini. Tidak ada isolat Listerial ditemukan pada suhu 5°C pada akhir penyimpanan dalam

replikasi ketiga sejak tidak ada koloni yang tumbuh pada agar-agar PALCAM berhubungan dengan

karakteristik Listerial dari genus tentang katalase, pewarnaan Gram, dan pengamatan mikroskopis

(data tidak ditampilkan). Dua puluh satu Listerial diduga isolat yang diduga berasal dari tahap akhir

penyimpanan pada 10°C (Gbr. 2) merupakan milik dua strain yang berbeda, yaitu: TS125, TS133

dengan persentase 5 dan 95%. Hanya delapan isolat Listerial (27% dari total koloni diambil) yang




NIM : 080061

hadir di akhir penyimpanan pada 15°C, dan ini milik tiga jenis: TS125, TS124 dan TS131. Persentase

bervariasi antara 12,5 dan 62,5%, dan TS125 adalah yang paling lazim.

Hal yang paling menarik tentang suhu ini adalah bahwa sebagian besar isolat (73%) milik

Bacillus spp. dan Lactobacillus spp, yang outgrew Listerial (data tidak ditampilkan). Metode

pengayaan gagal mendeteksi dan adanya isolat Listerial hanya terdeteksi Bacillus spp saja. Isolat

ditemukan sebagaimana ditentukan oleh karakterisasi fenotipik koloni pulih dari agar-agar PALCAM.Lima belas isolat terdeteksi pada akhir penyimpanan pada suhu 20°C; variabilitas tinggi mengenai

deteksi diamati, pada strain TS128, dan TS131 hadir pada akhir penyimpanan, sedangkan strain

TS124 tidak hadir pada setiap tahap penyimpanan walaupun hadir pada 15°C. TS133 terdeteksi di

tengah penyimpanan tetapi tidak bertahan sampai akhir penyimpanan. Sisa dari isolat tidak termasuk

ke dalam genus Listeria tetapi gram-positif, batang katalase-negatif.

Kontribusi PFGE adalah sangat penting karena dapat memberikan informasi tentang

pendugaan strain berkaitan dengan suhu penyimpanan. PFGE telah banyak digunakan untuk

memantau L. monocytogenes dari produk susu yang diproduksi dari susu mentah (10), yang mengarah

ke kesimpulan bahwa susu mentah dan produk susu mentah bisa menjadi potensi resiko bagi

konsumen. Keju katiki tidak diproduksi dengan susu mentah, tapi postcontamination produk dalamkondisi yang miskin higienis merupakan potensi bahaya. Temuan penelitian ini menunjukkan bahwa

kondisi penyimpanan dapat mempengaruhi keragaman populasi mikroba serta kelangsungan hidup

dan pertumbuhan yang berbeda strain L. monocytogenes dalam sistem makanan nyata. Dalam studi

ini, pada suhu yang lebih tinggi, yang akan mengizinkan diduganya pertumbuhan yang lebih luas

mikroorganisme, Bacillus spp. tumbuh pada medium PALCAM pada 15 dan 20°C. Sehubungan

dengan strain keragaman isolat listerial, hasil mengejutkan diperoleh untuk analisis campuran.

Temuan yang paling penting adalah bahwa tidak semua strain survive pada semua suhu, dan

perbedaan yang diamati bahkan dalam suhu rendah dan tinggi. Selain itu, strain yang terdeteksi pada

tingkat rendah pada inokulum awal berhasil bertahan hidup, misalnya, TS131, yang tidak dapat

bertahan bila diinokulasi sebagai strain tunggal. Temuan ini bisa disebabkan bahwa strain ini tidak mudah beradaptasi dengan kondisi keju Katiki, misalnya, pH rendah, dan sebagai hasilnya tidak dapat

diduga awalnya menggunakan metode lempeng. Strain TS131 sebelumnya telah diisolasi dari

makanan RTE, dan ini bisa menjelaskan mengapa hal itu tidak segera disesuaikan dengan ekosistem

keju. Meskipun kita tidak belajar populasi LAB sehubungan dengan strain keanekaragaman, fakta

bahwa Listeria bertahan untuk jangka waktu pendek pada 20°C dibandingkan pada 15°C dapat

menunjukkan persaingan lebih tinggi dalam tingkat pertama sejak isolat Lactobacillus tumbuh pada

agar PALCAM (data tidak ditampilkan).

Dalam studi ini strain berbeda dengan suhu yang berbeda merupakan pengamatan yang sangat

penting. Ada beberapa strain yang memiliki kapasitas kelangsungan hidup yang lebih baik, tapi yang

lainnya tidak menunjukkan perilaku yang sama dan bila diinokulasi individual, lebih atau kurang

dipengaruhi oleh keberadaan jenis-jenis lain. Fakta ini menunjukkan pentingnya kriteria seleksi satu

strain dengan yang lain ketika analisis menegenai resiko dilakukan yakni lingkungan di mana Listeria

ditemukan, misalnya, keju atau daging, dapat mempengaruhi kelangsungan hidup.




NIM : 080061

LAMPIRAN




NIM : 080061

resume jurnal pendukung

Documents