prinsip dan teknik isolasi protein
DESCRIPTION
pTRANSCRIPT
Prinsip dan Teknik Isolasi danPurifikasi Protein
Teknik isolasi dan purifikasi
• Merupakan proses hilir dalam bioteknologi
• Tidak kurang penting dibanding proses hulu –rekayasa genetik, teknik fermentasi
• Yang diolah – produk dari proses terdahulu
• Protein – produk dari rekayasa genetika
• Yang paling banyak – isolasi / purifikasi proteindari tumbuhan, hewan, mikroorganisme
Teknik isolasi / purifikasi – dapat dalam• skala laboratorium• skala industri
Sebelum melakukan isolasi – pentingdiperhatikan sumber produk yang akandiisolasi• Hewan• Tumbuhan• Mikroorganisme
< tahun 1970 an – digunakan sumber dari• hewan
- tripsin, lipase, rennin- mahal, sumber terbatas
• tumbuhan- papain, bromelain, amilase, lipoksigenase- dipengaruhi cuaca, politik
Sumber dari mikroorganisme- banyak digunakan setelah perkembangan
teknologi fermentasi- relatif lebih murah
ISOLASI
Metode isolasi tergantung• Sumber produk• Skala produksi (lab / industri)• Stabilitas produk• Bentuk murni / tidak murni
Proses isolasi dimulai dengan mengetahui letak / lokasiproduk yang akan disolasi• Intrasel• Ekstrasel• Terikat membran
• Protein larut intrasel dari tumbuhan –teknik isolasi tidak rumit – karena jaringanlunak, mudah dihancurkan dengan tissuehomogenizer
• Protein intrasel dari mikroorganisme –lebih liat – perlu metode lebih kuat
• Protein terikat membran – masalahtersendiri – tidak tergantung sumber
Metode penghancuran (lisis) sel
1. Abrasif- dengan blender laboratorium dengan butiran gelas(glass beads)
2. Liquid shear- suspensi sel dilewatkan dengan tekanan tinggi melalui
lubang kecil ke dalam ruang dengan tekanan atmosfir- karena perbedaan tekanan mendadak – sel pecah- untuk dinding sel bakteri yang tidak terlalu keras –misal bakteri Gram negatif
3. Osmotic shock- sel disuspensikan di dalam akuades / larutan hipotoniksehingga sel lisis
- protein dilepaskan dari sel yang lisis- tidak efektif untuk sel bakteri dan tumbuhan
4. Penambahan alkali- metode paling sederhana untuk melisis sel- sebagian besar sel pecah pada pH 11,5 – 12,5- protein yang diisolasi harus stabil selama 20 – 30 menitpada pH tinggi tsb
5. Penambahan deterjen.- selain lisis sel, sebagian besar protein sel mengalamidenaturasi
- untuk isolasi protein terikat membran
6. Solid shear- dengan membekukan sel - 20oC, dipaksa melalui lubangkecil pada tekanan tinggi
7. Penambahan lisozim dan EDTA- cocok untuk skala kecil karena mahal- efektif untuk sel bakteri
8. Pelarut organik- toluen dan aseton – untuk melisis berbagai sel- tidak untuk skala besar – toksik, mahal, mudah terbakar
9. Sonikasi- lisis sel dengan getaran ultrasonik- untuk skala kecil
PURIFIKASI (PROTEIN)
Pada waktu lisis sel – seluruh isi sel keluar –banyak kontaminan oleh karena itu harusdisingkirkan, antara lain asam nukleat
Asam nukleat – meyebabkan viskositastinggi – pada tahap awal harus disingkirkan• Presipitasi – penambahan polikation BM
(protamin, streptomisin, polietileneimin) – mahal• Digesti – dengan nuklease – mudah, murah
Setelah asam nukleat disingkirkan – sisa selyang tidak larut (dinding sel, proteinmembran, bagian sel yang hancur) harusdisingkirkan dengan• Sentrifugasi – sangat baik untuk solid
yang bersifat licin (slimmy or gelatinoussolids)
• Filtrasi
Sentrifugasi• Kecepatan mulai 100 x g sampai 600.000
xg• Dapat memisahkan organel sel
berdasarkan massa dan densitasnya- 3000 g = sel dan nukleus- 12.000 g = mitokondria / kloroplas- 100.000 g = mikrosom, ribosom
Penyingkiran asam nukleat + debris sel (=presipitat, pelet) - menghasilkan supernatanyang mengandung
- protein yang diinginkan- kontaminan (protein yang tidak diinginkan,
molekul organik dan inorganik)
Penyingkiran kontaminan – presipitasi dengan
• Amonium sulfat dengan berbagai konsentrasi- protein yang tidak diinginkan diendapkan terlebih
dahulu, baru protein yang diinginkan diendapkandengan konsentrasi yang lebih tinggi
- paling banyak digunakan- pada skala besar – masalah penanganan danpembuangan – korosif
• Natrium sulfat- tidak bersifat korosif- kelarutan rendah, perlu suhu > 35 oC untuk fraksinasi
• Pelarut organik- skala lab, jarang skala industri karena mudahterbakar
• Polimer- polietilen glikol (PEG)
- tidak toksik- tidak mudah terbakar- penggunaan terbatas karena meningkatkanviskositas larutan
- polyacrylic acid- non toksik
• Presipitasi pada titik isoelektrik (pI)
Lisis sel
sentrifugasi
presipitat
kontaminan
supernatan
Am. sulfat
presipitat
supernatan presipitat
supernatanAm. sulfat
Fraksinasi
Pemisahan selanjutnya (fraksinasi) – melibatkan 3komponen
1. Fasa solid / stasioner- berupa film, kolom, gel atau membran
2. Pelarut- fasa mobil pada kromatografi
3. Solut- molekul yang harus dipisahkan
Teknik
Dialisis
Filtrasi gel
Krom. Adsorpsi
Krom. Partisi
Krom. Pertkrion
Krom. Afinitas
Elektr sel. Aset
PAGE
Dasar pemisahan
Uk / btk molekul
Uk / btk molekul
Adsorpsi
Solubilitas
Ionisasi
Interaksi ligan
Muatan listrik
Muatan listr + uk mol
Fasa solid
Gel
Adsorben
Innert support
Mtrks + ggsterionisasiMatriks + ligan
Innert support
Innert supportberpori
Pelarut
Mbr semipermabel Air
Bufer
Nonpolar
Polar – nonpolar
Bufer
Bufer
Bufer
Bufer
Pada dasarnya pemisahan molekul protein dapat berdasarkan
SifatMuatan
Polaritas
Ukuran molekul
Spesifisitas
Prosedur- kromatografi pertukaran ion- elektroforesis
- kromatografi adsorpsi- kromatografi kertas
- dialisis dan ultrafiltrasi- gel elektroforesis- kromatografi gel filtrasi- ultrasentrifugasi
- kromatografi afinitas
Dialisis• Untuk memisahkan protein (molekul besar) dari garam
(molekul kecil) dan kontaminan berukuran kecil
• Protein dimasukkan ke dalam kantong selofan yang berporikecil
• Kantong dimasukkan ke dalam wadah yang mengandungakuades / bufer, sambil di putar dengan pemutar magnetiksemalaman dengan penggantian akuades / bufer beberapakali dalam wadah
• Pori memungkinkan molekul kecil berdifusi keluar, molekulbesar tertahan di dalam kantong
• Dapat untuk memekatkan larutan – dengan meletakkankantong dialisis dalam polimer desikan , misal polietilen glikol
Dialisisis
Kantong selofanberisi larutan yangakan dimurnikan
Magnetic stirrer
Kromatografi
Pemisahan molekul berdasarkan perbedaanstruktur dan atau sifat fisik pada saat berinteraksidengan• fasa mobil• fasa stasioner (matriks)
- kertas saring ( krom. kertas)- lapis tipis selulosa / silika / alumina –
kromatografi lapis tipis
Kromatografi Kertas
• Beberapa tetes larutan yang mengandung komponenyang akan dipisahkan diteteskan pada sepotong kertas –dibiarkan kering
• Ujung kertas dicelupkan ke dalam pelarut yang terdiridari campuran pelarut polar dan nonpolar
• Komponen polar akan terikat pada kertas membentukfasa stasioner, sedangkan komponen nonpolar bergerakmembentuk fasa mobil
• Berbagai komponen dalam larutan akan terpisahkanberdasarkan perbedaan kelarutan dalam fasa stasioneratau fasa mobil – koefisien partisi
• Setelah bergerak dalam jarak tertentu –kromatogram diangkat dan dikeringkan
• Dideteksi dengan- radioaktif- sinar UV- pewarnaan dengan zat warna
• Kecepatan migrasi – Rf (rate of fractionation)– perbandingan jarak yang ditempuh solutdengan jarak yang ditempuh solven
Kromatografikertas - duadimensi
Kromatografi kolom
• Fasa stasioner – kolom butiran kecil selulosa / akrilamid/ silika
• Fasa stasioner berinteraksi dengan protein berdasarkan- muatan- interaksi hidrofobik- interaksi ligan
• Campuran protein dimasukkan ke dalam kolom,kemudian di luruhkan dengan fasa mobil (eluen)
• Fasa mobil yang keluar (eluat) ditampung dalam fraksi-fraksi dengan volume tertentu
Matriks yang digunakan
••••••
Cross-linked dextran (Sephadex)Agarosa (Sepharose, Biogel)Cross-linked agarosa (Sepharose CL)Poliakrilamid (Biogel P)Porous glass (Bio-glass)Polistiren (Bio-beads)
Kromatografi kolom
Kromatografi kolom
Kromatografi Partisi
• Pemisahan dengan kromatografi kolom berdasarkanafinitas relatif berbagai protein terhadap fasa mobil danfasa stasioner
• Protein yang lebih kuat berinteraksi dengan matriks akantertahan
• Lamanya waktu protein berinteraksi dengan matrikstergantung dari komposisi fasa stasioner dan fasa mobil
• Pemisahan protein optimal – diperoleh denganmanipulasi komposisi fasa stasioner dan mobil
Kromatografi Berdasarkan Ukuran Molekul(Filtrasi Gel, Size Exclusion Chromatography)
• Pemisahan protein berdasarkan perbedaan ukuranmolekul dan melewatkannya melalui kolom gel yangtelah mengembang
• Yang paling banyak dipakai – Sephadex – partikel kecilhidrofilik, tidak larut karena cross-linking dekstranmembentuk jaringan 3 dimensi
• Molekul >> keluar lebih dahulu, molekul << tertahankarena masuk ke dalam butiran gel
• = Molecular sieving
• Dapat memperkirakan BM suatu sampel
Size exclusionchromatography
Size exclusionchromatography
Size exclusion chromatography
Kromatografi adsorpsi
• Teknik kromatografi paling tua – I x digunakan olehTswett untuk memisahkan pigmen tumbuhan
• Senyawa diadsorpsi ke dalam kolom – terjadikeseimbangan antara molekul yang terikat pada matriksdengan yang terdapat di dalam pelarut
• Derajat pengikatan ditentukan oleh muatan, ikatan vander Waals, interaksi ionik, ikatan hidrogen, struktursenyawa yang dipisahkan
• Adsorben – alumina, kieselguhr, sukrosa, silika gel
• Eluen – kloroform, heksan, etil eter, campuran pelarutorganik
Kromatografi pertukaran ion
• >> digunakan untuk purifikasi protein, molekul kecil
• Matriks – bahan inert dengan gugus terionisasi – DEAEselulosa, CM selulosa
• Atom N dari DEAE pada pH < 9 – mengikat molekulbermuatan negatif – disebut penukar anion (anionexchanger)
• CM selulosa – penukar kation (cathion exchanger)
• Peluruhan protein – berdasarkan muatan ataukonsentrasi garam dalam bufer
• Penting diperhatikan – resin yang dipakai, pH, ionicstrength larutan bufer
Kromatografi afinitas
• Ligan – terikat secara kovalen pada matriks porous yanginert
• Ligan- spesifik – substrat, analog, inhibitor- umum – AMP, hidrokarbon, zat warna
• Dalam skala besar jarang digunakan – mahal,keterbatasan kapasitas, tidak stabil
• Resolusi tinggi, proses purifikasi berlangsung cepat
Kromatografi afinitas
Kromatografi afinitas
Kromatografi lapis tipis
• Pemisahan senyawa pada lempeng tipis
• Dasar – adsorpsi, pertukaran ion, partisi, filtrasi gel
• Berlangsung cepat
• Dapat memisahkan beberapa pemisahan sekaligus
• Bercak yang timbul diwarnai dengan pewarnaan tertentu– diukur kadarnya secara spektrofotometri
Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi Lapis Tipis
HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
• Separasi berdasarkan – adsorpsi, pertukaran ion ataufiltrasi
• Sampel diuapkan dan dimasukkan ke dalam kolomdengan tekanan tinggi (sp 5000 psi)
• Eluat dideteksi dengan mengukur serapan padagelombang UV
• Resolusi tinggi, cepat, sensitivitas >> - dapat mengukursampai ng
• Sering digunakan untuk steroid, vitamin
Prinsip HPLC
Elektroforesis
• Merupakan teknik pemisahan protein yang paling seringdigunakan di lab
• Berdasarkan pergerakan molekul bermuatan dalammedan listrik
• Pada pH > pI, protein bermuatan negatif – bergerak keanoda; pada pH < pI, protein bermuatan positif – bergerakke katoda; pada pH = pI, protein tidak bergerak
• Matriks yang digunakan – membran selulosa asetat,starch gel, akrilamid, agarosa
Elektroforesis
SDS-PAGE (Polyacrylamide GelElectrophoresis)
• SDS = Sodium dodecyl sulphate
• Akrilamid berpolimerisasi dan cross-linked – membentukmatriks yang porous
• SDS – membuat protein bermuatan negatif, sehinggapemisahan terjadi berdasarkan kecepatan bergerakdalam medan listrik yang dipengaruhi oleh besar molekul
• Molekul besar lebih tertahan pergerakannya dibandingmolekul kecil
• Protein yang terpisah divisualisasi dengan zat warna –Coomassie blue
Pada tiap tahap purifikasi harus dilakukan• Pengukuran volume sampel• Penetapan kadar protein Mulai dari tahap awal sampai tahap akhir
penetapan – untuk mengetahui seberapajauh terjadi pemurnian produk
Bila pada elektroforesis diperoleh 1 puncaksetelah melalui berbagai tahap purifikasi –presipitasi, krom pertukaran ion, filtrasi gel, kromafinitas – dapat dikatakan protein telah murni
Bila mungkin – protein murni disimpan dalambentuk kristal
IDENTIFIKASI & PENGHITUNGAN KADAR PROTEINDALAM BAHAN UJI PADA TAHAP PURIFIKASI- secara spektrofotometri
- serapan pada 280 nm (sinar UV)- serapan protein setelah diwarnai dengan pewarna yangbereaksi dengan asam amino / protein- ninhidrin ( biru ) kromatografi lapis tipis- biuret (lembayung)- Bradford (biru)- fluoresamin
Dibandingkan terhadap serapan larutan standar yangdiketahui kadarnya
Untuk enzim – dihitung aktivitas danaktivitas spesifik pada setiap tahappurifikasi
• Aktivitas (Unit) enzim = jumlah proteinyang dapat mengubah 1 mol substratmenjadi produk per menit pada suhu 25oC pada pH optimum
• Aktivitas Spesifik = Unit per mg protein
Homogenat
supernatanpresipitat
Am. sulfat
Krom. Pert. Ion
Gel filtrasi
Krom. Afinitas
Vol, kdr protein, Akt, AS
Volume, kadar protein,Akt, AS
Fraksinasi
Vol, kdr protein, Akt, AS – pilih fraksi dengan AS paling
Vol, kdr protein, Akt, AS – pilih fraksi dengan AS paling
Vol, kdr protein, Akt, AS – pilih fraksi dengan AS paling
1 pita Enzim murni
Elektroforesis
Contoh purifikasi enzim X
Tahap
Homogenat
Presipitat
Krom Pert Ion
Filtrasi gel
Krom Afinitas
Vol fraksi (mL)
1.400
280
90
80
6
Prot total (mg)
10.000
3.000
400
100
3
Aktivitas (U)
100.000
96.000
80.000
60.000
45.000
Akt Spesifik(U/mg prot)
10
32
200
600
15.000
Contoh Tabel Purifikasi Enzim X