isolasi dan karakterisasi gen penyandi protein vp … · mengisolasi dan mengkarakterisasi gen ......

593 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2015

ISOLASI DAN KARAKTERISASI GEN PENYANDI PROTEIN VP-24 WSSV PADAUDANG WINDU (Penaeus monodon) UNTUK PENGEMBANGAN TEKNOLOGI RNAi

Andi Tenriulo*), Bunga Rante Tampangallo*), Andi Parenrengi*), dan Riani Andang Dewi**)*) Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Payau

Jl. Makmur Dg. Sitakka No. 129, Maros 90512, Sulawesi SelatanE-mail: [email protected]

**) Mahasiswa Jurusan Budidaya Perairan Fakultas Perikanan, Universitas Hasanuddin

ABSTRAK

Gen penyandi protein struktural VP-24 WSSV merupakan gen yang mengkode salah satu sifat dari proteinstruktural utama yang berada di lapisan perantara (intermediet) virus. Tujuan dari penelitian ini untukmengisolasi dan mengkarakterisasi gen penyandi protein struktural VP-24 WSSV yang diisolasi dari udangwindu, Penaeus monodon. Genom DNA WSSV diisolasi dari kaki renang dan kaki jalan udang windumenggunakan kit IQ 2000 dengan metode ekstraksi DTAB-CTAB. Gen tersebut diisolasi dari udang winduyang positif terserang WSSV menggunakan primer VP-24 dan VP24-R dan dilanjutkan dengan sekuensing.Data yang dihasilkan dianalisis menggunakan program Genetyx Versi 7 dan BLAST-N. Hasil penelitianmenunjukkan bahwa gen penyandi VP-24 WSSV berhasil diisolasi dari udang windu dengan panjang sekuensekitar 641-648 bp. Hasil alignment dengan BLAST-N menunjukkan tingkat similaritas yang identik (99%-100%) antara gen VP-24 yang diisolasi dengan gen VP-24 yang ada di data base Bank Gen. Dari hasil inidisimpulkan bahwa fragmen DNA hasil amplifikasi PCR tersebut merupakan sekuens gen penyandi proteinstruktural VP-24 WSSV. Gen ini diyakini mampu mengkode karakter penting penyakit WSSV yang utamayaitu VP-24.

KATA KUNCI: isolasi, karakterisasi, gen VP-24, WSSV, udang windu

PENDAHULUAN

Virus bintik putih atau dikenal sebagai penyakit white spot syndrome virus (WSSV) merupakansalah satu jenis virus penyebab utama berbagai kasus kematian udang yang hingga kini belum dapatdiatasi secara tuntas. Salah satu pendekatan yang mulai dikaji untuk meningkatkan resistensi udangwindu terhadap virus WSSV adalah teknologi RNAi. RNAi adalah fenomena biologi di dalam sel yangprinsip dasarnya adalah dengan masuknya dsRNA ke dalam sitoplasma yang akhirnya akanmembungkam ekspresi suatu gen di tingkat pasca transkripsi. Mekanisme RNAi ini juga terjadi secaraalami, yaitu dengan adanya miRNA (micro RNA) di dalam sel organisme sebagai pengganti dsRNA.miRNA ini merupakan pengkode gen dan mempunyai fungsi dalam regulasi gen. Mekanisme inicukup bermanfaat pada tumbuhan dan hewan dalam mengatasi penyakit yang disebabkan oleh gen-gen mutan, gen-gen letal, maupun penyakit lainnya yang disebabkan oleh virus.

Studi tentang transkripsi gen virulen WSSV yang menginfeksi P. monodon telah dilakukan (Zuidemaet al., 2004). Ekspresi gen WSSV di bagi dalam dua fase yaitu fase awal (early phase) yang terjadisebelum DNA virus bereplikasi; 2) fase lanjut (late phase) terjadi ketika inisiasi replikasi DNA virusatau setelahnya. Gen-gen WSSV yang ditranskripsikan pada fase lanjut (late phase) meliputi gen-genyang menyandi protein struktural utama WSSV yaitu VP-28, VP-26, VP-24, VP-19 dan VP-15. Gen VP28 telah digunakan sebagai pertahanan diri dari serangan WSSV (Mevicack et al., 2011). Xu et al.(2007) menyatakan bahwa penggunaan VP28 siRNA telah menyebabkan penurunan yang signifikandalam produksi DNA viral dari udang yang terinfeksi WSSV, dan penggunaan VP 28 siRNA dapatmeningkatkan sintasan sebesar 33% pada udang L. vannamei yang ditantang dengan WSSV (Wu et al.,2007).

Beberapa penelitian vaksinasi udang menggunakan agen WSSV sebagai sumber vaksin baru-baruini telah menunjukkan kemajuan dan memperoleh hasil yang menggembirakan. Xie & Yang (2006)menemukan anti-VP24 IgG yang berasal dari struktural protein permukaan VP24 WSSV, yang mana

594Isolasi dan karakterisasi gen penyandi protein ..... (Andi Tenriulo)

dapat dijadikan vaksin sebagai pencegah terjadinya penyakit yang disebabkan oleh White spot syn-drome virus (WSSV) pada udang windu. Penelitian tersebut membuktikan bahwa pada penyuntikanlobster dengan menggunakan anti-VP24 IgG WSSV yang terlebih dahulu diinkubasi menunjukkanpencegahan awal kematian setelah terjangkit WSSV. Hal ini disebabkan karena senyawa yangdisuntikkan di lobster dapat merangsang sistem hostdefence tersebut. Infeksi yang disebabkan WSSVbenar-benar ditangguhkan atau dinetralkan oleh VP-24.

Gen VP-24 memiliki homologi yang tinggi dengan protein-protein histon oleh karena itu proteinini diperkirakan memiliki peran dalam pengikat DNA WSSV, membentuk poros nukleoprotein(nucleoprotein core) dan berperan dalam infeksi sistemik pada udang, dan dapat menstimulasimunculnya sistem kekebalan pada udang windu (Underwood et al., 2013). Informasi mengenaipenggunaan gen VP-24 untuk meningkatkan kekebalan pada udang windu masih sangat kurang,oleh karena itu penelitian mengenai isolasi dan karakterisasi gen penyandi VP-24 WSSV pada udangwindu perlu dilakukan sebagai informasi dasar dalam upaya peningkatan resistensi udang winduterhadap penyakit virus WSSV melalui teknologi RNAi.

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi gen virulen VP-24 WSSV dariudang windu yang akan digunakan sebagai bahan pengembangan teknologi RNAi.

METODE PENELITIAN

Deteksi WSSV

Sampel udang windu yang sakit dengan bobot berkisar 7-15 g dengan gejala terinfeksi WSSV,seperti berenang di pinggir pematang, sebagian udang mati dan terdapat bintik putih dikarapaksnya,diambil secara aseptik dan dimasukkan ke dalam botol yang telah berisi larutan ethanol 70%. Proseduridentifikasi virus WSSV meliputi ekstraksi DNA genom, amplifikasi dengan menggunakan thermacycler,dan elektroforesis. Ekstraksi DNA genom dan uji PCR untuk mengetahui keberadaan virus WSSVpada udang windu menggunakan kit IQ-2000 WSSV metode DTAB-CTAB (Dodecyl Hexadecyl TrimetgylAmmonium Bromide - Cationic Hexadecyl Trimetgyl Ammonium Bromide). Untuk mengetahui konsentrasidan kemurnian DNA udang windu yang diisolasi, DNA genom dianalisis dengan metodespektrofotometer. Sebanyak 7 μL DNA genom dimasukkan ke dalam kuvet kemudian diukurabsorbannya pada panjang gelombang (ë) 260 dan 280 nm menggunakan Gen Quant 1300. Setelahdilakukan uji PCR, sampel yang positif terinfeksi WSSV selanjutnya digunakan untuk mengisolasigen VP-24.

Isolasi dan Karakterisasi Gen Virulen VP-24 WSSV

Isolasi gen VP-24 WSSV dilakukan dengan menggunakan teknik PCR. DNA genom yang telahdiisolasi dari udang windu digunakan sebagai cetakan DNA (templat) pada proses PCR. Metode isolasimengacu pada metode yang dikembangkan oleh Xie and Yang (2006), menggunakan primer forwardVP-24 F: 5’- CGCGGATCCGATGCACATGTGGGGGGTTTAC -3’ dan VP24-R: 5- CCGGAATTCTTATTTTTCCCCAACCTTAAACAG -3. Amplifikasi fragmen DNA dilakukan pada thermacycler (GeneAmp PCR System2700, Applied Biosystem). Dalam reaksi amplifikasi digunakan kit PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GEHealtcare). Genom DNA sebagai templat sebanyak 1µL dicampur dengan masing-masing 1 μL primerforward dan reverse, PCR dikondisikan dengan : Pre-denaturasi pada suhu 94oC selama 3 menit, diikuti35 siklus (Denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, Annealing pada suhu 57oC selama 30 detik,Ekstensi pada suhu 72oC selama 1 menit), dan ekstensi akhir pada suhu 72oC selama 3 menit.

Amplikon selanjutnya dipisahkan dengan menggunakan teknik elektroforesis. Untuk melihatkeberhasilan amplifikasi fragmen DNA target, 10 μL amplikon dielektroforesis pada gel agarose 2%pada tegangan 50 Volt selama 2 jam dan didokumentasi dengan Gel Documentation System. Beratmolekul fragmen DNA ditentukan dengan menggunakan marker 100 bp plus. Gen VP24 WSSV hasilPCR selanjutnya dipurifikasi dengan mengacu pada prosedur manual kit GF-1 Nucleic Acid Extraction(Vivantis). Hasil purifikasi selanjutnya dilakukan penderetan (sekuensing) dengan menggunakan mesinsekuensing otomatis ABI PRISM 310 yang dilakukan di laboratorium First Base di Singapura.


Sekuens hasil penderetan dianalisis dengan menggunakan program Genetyx Version 7 (GenetyxCoorporation) untuk mendapatkan sekuens sampel dari sekuens forward dan reverse. Kemiripan(similaritas) DNA gen virulensi WSSV yang dihasilkan disejajarkan (alignment) dengan sekuen DNAgen virulensi WSSV yang telah ada di Bank Gen dengan menggunakan program BLAST-N (Basic LocalAlignment Search Tool-Nucleotide). Data hasil analisis disajikan secara deskriptif.

HASIL DAN BAHASAN

Kemurnian dan Konsentrasi DNA

Hasil ekstraksi DNA genom dari udang windu yang telah terinfeksi WSSV menunjukkan analisasecara kuantitatif yaitu tingkat kemurnian DNA udang windu yang terinfeksi WSSV berkisar 1,802-1,844 (Tabel 1). Nilai tersebut menunjukan kemurnian DNA genom yang tinggi karena nilainya beradapada kisaran kemurnian yang tinggi. Linacero et al. (1998) telah melaporkan bahwa tingkat kemurnianDNA genom yang diisolasi sebaiknya berada dalam kisaran 1,8-2,0.

Salah satu faktor yang mempengaruhi tingkat kemurnian DNA adalah metode ekstraksi yangdigunakan. Metode yang digunakan pada penelitian ini yaitu metode DTAB-CTAB (Dodecyl HexadecylTrimetyl Ammonium Bromide - Cationic Hexadecyl Trimetyl Ammonium Bromide). Metode ini mampumenghasilkan kemurnian DNA yang tinggi karena dengan penggunaan buffer CTAB sebagai penggantinitrogen cair sebanyak 2% yang dapat menghasilkan produk DNA yang berkualitas yang ditunjukanoleh pita DNA genom. Buffer ekstraksi CTAB yang mempunyai fungsi untuk melisiskan membran seldan membran fosfolipid bilayer. PVP dan mercaptoethanol dalam DTAB akan mereduksi senyawa-senyawafenolik yang keberadaannya dapat merusak kualitas DNA (Santoso, 2005).

Pada infeksi virus WSSV sesaat setelah terjadi infeksi, tahap selanjutnya adalah proses ekspresigen di dalam tubuh inang. Ekspresi gen WSSV dibagi dalam dua fase yaitu: 1) fase awal (early phase)yang terjadi sebelum DNA virus bereplikasi; 2) fase lanjut (late phase) terjadi ketika inisiasi replikasiDNA virus atau setelahnya. Gen-gen WSSV yang ditranskripsikan pada fase awal meliputi RR1(ribunuckleotide reductase berukuran besar), RR2 (ribunuckleotide reductase berukuran kecil), PK (ProteinKhinase), TK-TMK (thymidine kinase-thymidylate chimeric protein) dan DNA pol (DNA polymerase), sedangkangen-gen yang ditranskripsi pada fase lanjut meliputi gen-gen yang menyandikan WSSV protein-proteinstruktural utama WSSV seperti VP-28, VP-26, VP-24, VP-19 dan VP-15. Ekspresi gen-gen yang termasuk

Kode A 260 A 280Konsentrasi DNA

(μg/mL)Kemurnian DNA

A260/A280

Sampel 1 0,876 0,475 43,80 1,844Sampel 2 0,800 0,444 40,00 1,802Sampel 3 0,519 0,277 25,95 1,874

Tabel 1. Kemurnian dan konsentrasi DNA udang windu yang terinfeksi WSSV

M B1 B2 B3 KN KP

Gambar 1. Hasil elekroforesis udang windu yang positif terinfeksi WSSV. Ket :M = marker, 1-3 = sampel, KN= kontrol negatif, KP= kontrol positif


dalam kelompok early gen teramati sejak 2 jam pasca infeksi WSSV, sedangkan gen-gen dalam kelompoklate gen dapat dilihat setelah 18-24 jam pasca infeksi (Alim, 2010).

Amplifikasi gen VP-24 dengan panjang pita DNA antara 500-750 bp menghasilkan pita tunggal(Gambar 2). Untuk lebih memastikannya, maka dilakukan tahap analisis selanjutnya yakni analisisurutan gen penyandi VP-24 WSSV. Menurut Parenrengi (2010), pemurnian fragmen DNA sangat pentinguntuk menghindari adanya kontaminasi fragmen DNA yang dapat terinsersi pada saat pembacaannukleotida (sekuensing).

Gen penyandi VP-24 WSSV merupakan salah satu gen yang penting dalam pencegahan penyakitbintik putih pada udang windu, dimana gen ini mampu menonaktifkan gen VP-24 yang berada didalam WSSV sehingga penyebaran infeksi tidak semakin melebar luas ke sistem tubuh inang P.monodon. Hal itu disebabkan karena gen penyandi VP-24 WSSV merupakan repressor dimana proteinini yang akan menghambat terjadinya inisiasi suatu transkripsi ketika protein itu berikatan dengansekuen pengontrol (operator) di dalam perkembangan WSSV di inang. Kebanyakan proses transkripsiakan berakhir bila adanya suatu sinyal dari sekuen terminator spesifik yang terdapat pada DNAtersebut atau RNA yang baru ditranskripsi (Underwood et al., 2013).

Analisis Urutan Nukleotida Gen Penyandi VP-24 WSSV

Alignment sekuens ditunjukkan pada gambar berikut, dimana dari hasil alignment dapat diketahuibagian star codon (inisiasi) yang mengkode metionin pada permulaan (ujung amino) pada semuarantai polipeptida eukariotik yaitu ATG, dan stop kodon TAA yang merupakan bagian dari komplemenprimer VP-24 R terletak pada 637-639 bp (Lampiran 1).

Hasil sekuens DNA gen VP-24 WSSV yang diisolasi menunjukkan tingkat kemiripan yang tinggidengan sekuen gen VP-24 yang ada di Bank Gen. Hasil analis sekuensing sampel VP-24 WSSVmenggunakan software GENETYX 7 diketahui memilki panjang fragmen DNA yaitu 641-648 bp.Analisis kesejajaran lokal (BLAST-N) memperlihatkan isolat gen VP-24 WSSV yang diisolasi memilikitingkat kesamaan dengan isolat gen yang ada di Bank Gen yaitu 99% - 100% (Tabel 2).

Lampiran 2 menunjukkan pohon filogenetik gen penyandi VP24 yang telah diteliti sebelumnyadiantaranya China (AY249455.1), South Carolina (AY249456.1), Iran (DQ196431.1), India

Gambar 2. Visualisasi gen penyandi VP-24 WSSV yang diisolasi dari udangwindu yang terinfeksi WSSV. Ket : B1-B3 = sampel M = marker 1kb.Tanda panah menunjukan posisi fragmen target

Tabel 2. Similaritas sekuens gen VP-24 WSSV yang diisolasidengan sekuen gen VP-24 yang telah ada di BankGen (No.Aksesi DQ902656.1)

DeskripsiPemenuhan

(query)Similaritas

SampelB1 97% 99%SampelB2 96% 100%


(DQ902656.1) dan Jepang (AY249487.1). Terlihat bahwa gen VP-24 WSSV dari hasil dari penelitianini memiliki kemiripan dengan gen VP-24 WSSV dan berkorelasi dengan sekuens yang telah ada.Hasil ini menunjukkan bahwa gen VP-24 WSSV yang diisolasi memiliki kesamaan karakterisasi dengangen VP-24 WSSV yang telah diteliti sebelumnya.

KESIMPULAN

1. Isolasi gen penyandi protein VP-24 WSSV pada udang windu (Penaeus monodon) berhasil dilakukanditandai dengan keberadaan pita DNA pada bobot molekul sekitar 640 bp.

2. Gen penyandi protein VP-24 WSSV ini memiliki kemiripan 99%-100% dengan sekuen gen VP-24WSSV yang ada di Bank Gen.

DAFTAR ACUAN

Alim, S. (2010). Kloning dan Sekuensing Gen Penyandi Protein Permukaan VP19 WSSV Isolat Situbondo.Institut Pertanian Bogor, hlm. 10.

Linacero, J., Rueda, Vazquez, A.M. (1998). Quantification of DNA. Pages 18-21, Isaac G, Ingram DS,editor. Molecular Tools for Screening Biodiversity : Plants and Animals. Chapman and Hall. London,Weinheim, New York, Tokyo, Melbourn, Madras.

Mavichak, R., Takano, T., Kondo, H., Hirono, I., Wada, S., & Hatai, K. (2010). The effect of liposome-coated recombinant protein VP28 against white spot syndrome virus in kuruma shrimp,Marsupenaeus japonicus, J Fish Dis., 33, 69-74.

Parenrengi, A. (2010). Peningkatan resistensi udang windu Penaeus monodon terhadap penyakit whitespot syndrome virus melalui transfer gen Penaeus monodon antiviral. Disertasi Sekolah Pascasarjana,Institut Pertanian Bogor, 108 hlm.

Santoso, P.J. (2005). Modified CTAB-based DNA isolation procedure for fruit crops. Jurnal Stigma,XIV(1), 1-4.

Underwood, D.J., Cowley, J.A., & Johnson, K.N. (2013). Antiviral immunity and protection in penaeidshrimp, Review Article, Versita, Invertebrate Immunity, p. 2-14.

Wu, Wenlin, L., Wang, X., & Zhang. Identification of white spot syndrome virus (WSSV) enveloperoteins involved in shrimp infection. J of Virology, 332, 578–583.

Witteveldt, J., Cifuentes, C.C., Vlak, J.M., & van Hulten, M.C.W. (2004). Protections of Penaeus monodonagainst white spot syndrome virus by oral vaccination. J Virology, 78, 2057-2061.

Xie, X., & Yang, F. (2006). White spot syndrome virus VP24 interacts with VP28 and is involved invirus infection, J. of General Virology, 87, 1903–1908.

Zuidema, D., van Hulten, M.C.W., Marks, H., Witteveldt, J., & Vlak, J.M. (2004). Virus-Host.Interactionsof White Spot Syndrome Virus. Di dalam: Leung KY, editor. Current Trends in the Study of Bacterialand Viral Fish and Shrimp Diseases. Molecular Aspects of Fish and Marine Biology; volume ke-3. Singapore:World Scientific Publishing, p. 237-255.


Lampairan 1. Alignment sekuens gen VP-24 WSSV pada sampel udang windu

Lampiran 2. Pohon filogenetik gen VP-24 WSSV isolat sampel udang windu

isolasi dan karakterisasi gen penyandi protein vp … · mengisolasi dan mengkarakterisasi gen ......

Documents