Harus tepat agar hasil analisa valid

Kalo tidak ?

Eg: penetapan kadar digoksin.

PENANGANAN SAMPEL

Dalam penyimpanan sampel, harus diperhatikan hal–hal berikut yang mungkin dapat mempengaruhi sampel: Suhu tinggi: dapat menguapkan analit yang bersifat volatile, degradasi baik oleh panas tau agen biologis, peningkatan reaktivitas kimia, dll Suhu rendah: menurunkan kelarutan analit dalam pelarut sehingga mengancam homogenitasnya. Perubahan kelembaban: dapat mempengaruhi kandungan air pada analit yang higroskopis, atau ancaman hidrolisis Radiasi UV: dapat menginduksi reaksi–reaksi fotokimia, fotodekomposisi, atau polimerasi Oksidasi yang diinduksi oleh udara dapat menyebabkan kerusakan sampel yang peka terhadap oksidasi seperti vitamin C dan lainnya.

Penyimpanan Sampel

Sampel

Pengotor Analit

Eksogen Endogen

Sensitivitas & Selektivitas

PENANGANAN SAMPEL

Pemurnian awal/ penanganan awal

Ekstraksi

Kromatografi

Pemurnian sampel

PRE-TREATMENTPresipitasi / denaturasi

protein

Ekstraksi solven

Liofilisasi Hidrolisis konjugat

Homogenisasi

Derivatisasi kimia sebagai pendahuluan

ekstraksi

Pemurnian awal

Protein pengotor endogen :◦Mengikat obat hasil analisis tidak valid

◦Merusak alat (kolom HPLC)

Presipitasi / denaturasi proteinPerusakan ikatan antara protein dg obat / metabolitnya

Presipitasi /denaturasi protein

Penambahan zat kimia

Sentrifugasi

Pemanasan

Ultrafiltrasi

Presipitasi /denaturasi protein

Presipitasi/denaturasi protein

Sampel Metanol Asetonitril

Sentrifuge

Endapan Supernatan

Pemanasan

Sentrifuge

Endapan Supernatan

Ekstraksi pelarut untuk menghilangkan senyawa hidrokarbon

Atur pH

Obat terionisasi

Ekstraksi dg pelarut organik

Fase organik /hidrofobik :hidrokarbon

Fase hidrofilik :Obat terionisasi

Alasan pemilihan liofilisasi :◦ Air sangat banyak, analit sangat larut air shg tidak dapat

dipisahkan secara ekstraksi pelarut◦ Analit mudah menguap & rusak oleh pemanasan

Contoh :◦ Feses mengandung mikroflora yang merusak analit pada

suhu kamar◦ Feses liofilisasi serbuk larutkan dengan pelarut yg

sesuai ekstraksi

Liofilisasi

Liofilisasi

Sampel dibekukan

Lyophilizer

Uap air divacum

Sublimasi

Padatan kering

Larutkan dg pelarut yg sesuai

Hidrolisis dengan penambahan enzim

Hidrolisis konjugat

tidak dapat dipisahkan

dengan ekstraksi pelarut

sangat hidrofil

Metabolit terkonjugasi

Sampel padat

Feses (homogenisasi : + metanol)

Sampel gelatinus

Sputum (homogenisasi : sonifikasi)Sampel yang mengandung protein tidak larut

Sampel otot (homogenisasi : + HCl 1N)

Homogenisasi

Obat / metabolit ekstraksi rusak Derivat obat / metabolit ekstraksi tidak rusak Hidralazin ekstraksi pelarut organik (pH basa)

rusak Hidralazin + NaNO3 (pada pH asam) tetrazolo

(1,5a) phthalazin ekstraksi pelarut organik (pH basa) tidak rusak

Derivatisasi kimia

Pemisahan senyawa berdasarkan perbedaan kelarutan

Ekstraksi padat – cair Pemisahan senyawa menggunakan kolom

kromatografi. Pemisahan didasarkan perbedaan

kelarutan dalam fase gerak (pelarut) Parameter : konstanta distribusi (KD)

Ekstraksi cair – cair

Ekstraksi

KD = [Vlarutan x Wsolut dalam fase diam] [Wfase diam x Wsolut dalam larutan]

Nilai KD dipengaruhi oleh :◦Polaritas pelarut◦Kecepatan aliran larutan◦Kontak larutan dengan fase diam

Konstanta Distribusi (KD)

Pemisahan didasarkan perbedaan kelarutan senyawa pada pelarut organik & air.

Parameter : koefisien partisi (P) P = Corganik / Cair

Faktor yang mempengaruhi P

◦Pelarut yang digunakan◦pH◦Derajat ionisasi

Ekstraksi cair – cair

Ekstraksi cair–cair digunakan untuk mengisolasi analit yang berada dalam suatu cairan (tidak peduli apakah analit tersebut larut di dalamnya atau tidak.

untuk memudahkan, selanjutnya cairan ini disebut sebagai cairan 1) menggunakan suatu cairan lain sebagai pelarut (selanjutnya cairan ini disebut sebagai cairan 2).

Syarat utama cairan 2 yang digunakan adalah: Tidak saling melarutkan dengan cairan 1 Tidak saling campur dengan cairan 1 Titik didih rendah Kemurnian tinggi Sedapat mungkin tidak toksik

Teknik SPE digunakan untuk pra-perlakuan sampel atau clean-up sampel-sampel yang kotor seperti sampel dengan kandungan matriks yang tinggi seperti garam-garam, protein, polimer, resin dll.

Efisiensi SPE dapat memperoleh recovery yang tinggi (>99 %).

Solid Phase Extraction (SPE)

Tahapan SPE

Elusi

Pembilasan

Retensi (tertahannya)

sampel

Pengkondisian

Fase diam : padatFase gerak : cairPemisahan

senyawaAnalisis kualitatif &

kuantitatif (kurang sensitiv)

KLT

Fase diam : padat / cair Fase gerak : gas inert Analisis kualitatif &

kuantitatif Untuk pemeriksaan zat

yang volatil & tahan panas

GC

Fase diam : padat Fase gerak : cair Analisis kualitatif &

kuantitatif Untuk pemeriksaan zat

yang tidak tahan panas & tidak volatil

HPLC

Pemisahan berdasar perbedaan ukuran partikel Fase diam : gel Gel berupa butiran – butiran berpori (dekstran,

poliakrilamid, polistiren) Fase gerak : cair Contoh : pemisahan makromolekul (lemak, protein,

garam) dari sampel

Gel Permeation Chromatography (GPC)