Bahan bakar fosiladalah sumber utamaenergi. Karenameningkatnya jumlahpenduduk dankebutuhan akan bahanbakar, bahan bakarfosil ini sangat banyakdigunakan.

Harga bahan bakar yangterus meningkat,perubahan iklim, danpemanasan global jugamembuat para penelitiuntuk berpikir tentangbahan bakar alternatif.

Jatropha curcas dianggap sebagaitanaman biodiesel karenakandungan minyaknya tinggi (50-60% dari total biomassa biji), yangbisa menggantikan minyak fosildiesel konvensional.

J. curcas sangat mudah beradaptasi dandapat tumbuh di daerah semi-kering,kering, dan lahan-lahan marjinal, tetapimasih dalam tipe liar, sehinggapertumbuhannya serta hasilnya sangatdipengaruhi oleh berbagai cekaman biotikdan abiotik.

Perlu untuk mengembangkan J. curcas yangtoleran cekaman biotik dan abiotik, hasilyang tinggi, dan bebas racun.

Transformasi tanaman dapat mengurangiwaktu, biaya, tenaga kerja, danmenghindari variasi somaklonal.

Efisiensi transformasi diperoleh melaluitransformasi tanaman jauh lebih tinggidaripada transformasi berbasis kulturjaringan konvensional.

Perbanyakan konvensional menggunakan kulturjaringan membutuhkan lebih banyak waktu,dan tanaman rekalsitran seperti J. curcasmenunjukkan respon yang buruk terhadapperbanyakan. Hal ini dapat diatasi denganmenggabungkan transformasi tanaman danpenyambungan in vivo.

Penyambungan adalah teknik vegetatif yangdigunakan untuk menggabungkantunas/cabang dari sebuah tanaman denganakar dan pangkal tanaman lain.

Penelitian ini dilakukandengan tujuan untukmengembangkantanaman berbasispenyambungan in vivodiikuti dengantransformasi tanamanuntuk menghasilkantanaman J. curcasyang bertransformasi.

Bahan TanamBenih-benih J. curcas var. AG001

Konsentrasi penghambat minimum (MIC)garam amonium fosfinotrisin (PPT)

Penyemprotan MIC PPT (100 ml) padapertumbuhan tanaman dengan konsentrasi yangberbeda (0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 atau 3,0 g l-1)pada tanaman jenis liar (WT) yang berumur 45hari menggunakan hand sprayer. KonsentrasiPPT di mana seluruh daun menunjukkan gejalanekrotik dianggap sebagai MIC, dan konsentrasiini digunakan untuk menyeleksi tanamantransformasi. Setiap perlakuan terdiri dari 50tanaman dengan 3 kali ulangan.

Jenis Agrobacterium dan vektor biner

Tiga jenis Agrobacterium tumefaciens - LBA4404, EHA 101, dan EHA 105 - dengan vektorbiner pGA 492 membawa gen bar, npt II, dangus pada promotor kontrol CaMV35 S danpembatas nos.

Skema vektor pGA 492 yang digunakan dalam tranformasitanaman J. curcas

LBA 4404 adalah jenis otopine dengan latarbelakang kromosom Ach5 membawa pAL4404sebagai plasmid virulensi.

EHA 105 adalah jenis L,L-succinamopine denganlatar belakang kromosom C58. EHA 105mengandung pEHA 105 sebagai plasmid virulensipembantu yang berasal dari supervirulent pTiBo542.

EHA 101 mengandung jenis agropine supervirulenplasmid Ti pTiBo 542.

Tiga jenis Agrobacterium dipelihara pada mediumagar AB ditambah dengan 10 mg l-1 rifampicin dan50 mg l-1 kanamisin.

Transformasi tanaman menggunakanAgrobactorium

Koloni Agrobacterium ke dalam 35 ml LBdilengkapi dengan antibiotik dan diinkubasisatu malam pada suhu 28 °C di sebuahorbital shaker dengan 180 rpm.

Kemudian, sel-sel bakteri yang disentrifugasi pada 6.000 rpm selama 8menit.

Pelet sel bakteri disuspensikan kembalidalam medium infiltrasi (medium cair MSyang mengandung 5% sukrosa) danterakhir OD600 disetel hingga. 0,6.

Planlet J. curcas umur tiga minggu digunakan dalamtransformasi tanaman menggunakan Agrobacterium.

Tiga jenis infeksi dilakukan. Pada infeksi pertama, planletdipotong batangnya dengan mengambil meristem apikal dan daunmenggunakan pisau bedah No. 22. Getah dari pelukaan itudibersihkan dan suspensi Agrobacterium (2 ml) diaplikasikandengan menggunakan kapas penyerap steril.

Di jenis infeksi kedua, daun diambil dari tunas dan daerah tunasapikal ditusuk (8-10 kali) dengan jarum bedah steril dansuspensi Agrobacterium (2 ml) diaplikasikan denganmenggunakan kapas penyerap steril.

Pada tipe infeksi ketiga, daerah apikal tunas ditusuk (8-10 kali),supensi Agrobacterium (2 ml) diaplikasikan dengan menggunakankapas penyerap steril, dan di vakum infiltrasi dalam suspensiAgrobacterium pada 100, 150 atau 200 mmHg selama 1, 2, 3atau 4 menit dengan menggunakan vakum desikator yangterhubung ke pompa vakum.

1

2

3

Tanaman yang terinfeksi dipelihara padakondisi gelap selama 3 hari tanpa air dankemudian tanaman disiram secara normal dirumah kaca. Tanaman yang didugabertransformasi dipilih dengan penyemprotan2 g l-1 PPT pada tanaman umur 8 minggumenggunakan hand sprayer. Tanaman yangmenunjukkan resistensi signifikan terhadapPPT dipilih untuk analisis lebih lanjut. Setiappercobaan diulang tiga kali dengan 50 planlet.

Plantlet J. curcas umur tiga

minggu

Plantlet J. curcasdipotong, ditusuk, di-

vakum infiltrasiselama infeksi

dengan A. tumefaciens EHA

105

Pengembangancabang dan daundari titik yang

terinfeksi setelah45 hari infeksi

Analisis histokimia dari ekspresi gen gus. Sampeldaun yang diduga bertransformasi, tanamansambungan, dan tanaman WT diinkubasi selama24 jam pada suhu 37 °C dalam sebuah bufferyang mengandung 0,1 M NaPO4 (pH 7.0), 0,1 Mkalium ferrisianida, 0,1 M ferrosianida, 0,2 MEDTA (pH 7.0), 0,05 % Triton X-100, 500 mg l-1

5-bromo-4-kloro-3-indolyl-β-D-glukuronat (X-gluc) dan 20% metanol. Setelah pewarnaan X-gluc, sampel daun diinkubasi dalam aseton dinginuntuk menghilangkan klorofil.

Lima tanaman umur 12 minggu dipilih secara acak yangdiduga bertransformasi yang positif GUS dan tanamanWT digunakan untuk penyambungan. Metode yangdigunakan adalah sambung celah atau berbentuk V.

Batang atas (panjang 3-5 cm) disiapkan dari tunasdengan memangkas daun dan memotong pangkal batangbawah untuk sambungan dan batang bawah disiapkandengan memotong daun dan kemudian membuatpotongan vertikal 1-2 cm di pusat batang.

Sambungan batang bawah/batang atas dibungkusdengan Parafilm dan pembungkus Saran untuk mencegahpenguapan air dan menjaga dari hama. Ketika batangatas yang menyatu dengan batang bawah, pembungkusSaran dan Parafilm dilepas. Tanaman disiram 2 harisekali dan dipelihara di rumah kaca.

Tanaman sambungan berumur 8 minggu dipilih denganmenyemprotkan 2 g l-1 PPT menggunakan hand sprayer.Tanaman yang bertahan diseleksi dengan analisishistokimia GUS, polymerase chain reaction (PCR), danSouthern blot hybridization.

Untuk menganalisis integrasi gen bar pada tanaman J.curcas yang bertransformasi, genom DNA diisolasi daridaun tanaman sambunganyang positif GUS dan tanamanWT dengan menggunakan GenElute™ plant genomic DNAminiprep kit. Penggunaan PCR dengan menggunakan gen barspesifik (BARFP: 5'-ATCGTCAACCACTACATCGAGAC-3')dan (BARRP: 5'-CCAGCTGCCAGAAACCCACGTC-3') yangsecara spesifik mengaplifikasi 462 bpbar. PCR dilakukandalam PTC100™ thermal cycler diprogram dengandenaturasi awal DNA pada 95 °C selama 5 menit, kemudiandengan 35 siklus 95 °C selama 1 menit, 71 °C selama 1menit, 72 °C selama 1 menit, diikuti dengan ekstensi akhirpada suhu 72 °C selama 5 menit. Plasmid pGA 492 dangenom DNA tanaman WT digunakan masing-masing sebagaikontrol positif dan negatif. Hasil amplifikasi dipisahkanpada 1% (w/v) gel agarosa.

Southern blot hybridization dilakukan untuk mencarijumlah salinan gen bar pada tanaman sambungan J.curcas yang melalui PCR.

Sepuluh microgram genom DNA dari tanamansambungan yang melalui PCR, tanaman WT, dan 5 μgplasmid DNA pGA 492 dicerna semalam dengan SacIpada 37°C. Sampel DNA yang dicerna dipisahkan pada1% (w/v) gel agarose dan di-blotted dengan membranHybond N+.

Membran di hibridisasi dengan pemeriksaan denganmenggunakan produk amplifikasi PCR 462 bp dari genbar. Membran hibridisasi dicuci dan diperlakukanuntuk perkembangan chemiluminescent menggunakansubstrat CDP-Star, dan terkena sinar X-ray. Vektorbiner pGA 492 dan genom DNA dari tanaman WTberperan masing-masing sebagai kontrol positif dannegatif.

Analisis kemurnian genetik dilakukan tiga kali padatanaman yang diduga bertransformasi dan tanamansambungan dengan penanda RAPD. Sebanyak sepuluhprimer RAPD digunakan untuk meneliti kemurniangenetik pada tanaman yang disambung.

RAPD-PCR, diprogram untuk memulai denaturasi padasuhu 94 °C selama 6 menit dan 35 siklus pada suhu 94°C selama 1 menit, 37 °C selama 1 menit, 72 °C selama2 menit dilanjutkan dengan ekstensi akhir pada 72 °Cselama sekitar 7 menit.

Produk yang diamplifikasi dipisahkan secaraelektroforesis pada 1% (w/v) gel agarosa yangmengandung etidium bromida pada 100 V dan difotodibawah sinar ultraviolet dengan menggunakan GelDoc 2000. Setiap RAPD-PCR dilakukan sebanyak 3kali.

MIC PPT pada perkembangan tanaman Pemilihan tanaman transformasi dari non-

transformasi merupakan langkah penting dalammemproduksi tanaman transgenik. Adanya genbar di daerah T-DNA dari vektor biner pGA 492memberikan perlawanan terhadap PPT dandigunakan untuk memilih jaringan/tanaman yangbertransformasi. PPT digunakan sebagai agenpenyeleksi pada beberapa tanaman minyakseperti jarak, canola, dan kelapa sawit. Namun,belum ada laporan penggunaan PPT sebagai agenpenyeleksi dalam transformasi J. curcas.Perbedaan konsentrasi penyemprotan PPT padatanaman WT, pada 2,0 g l-1 menunjukkan gejalanekrotik pada daun, dan dalam waktu seminggusemua tanaman mati. Oleh karena itu, 2,0 g l-1digunakan sebagai MIC untuk menyeleksi tanamanJ. curcas

Jenis Agrobacterium, latar belakang kromosom, potensigen yang aktif di wilayah virulensi dan jenis pelukaanadalah faktor penting yang mempengaruhi efisiensitransformasi. Tiga jenis Agrobacterium dievaluasi,tanaman yang terpotong diinfeksi dengan EHA 105, 62,30%tanaman bertahan setelah penyemprotan PPT (14,33tanaman dari 23 tanaman yang bertahan setelah infeksi) ,dari tanaman ini 79,06% mengekspresikan gen gus (11.33tanaman dari 14.33 tanaman yang bertahan setelahpenyemprotan PPT) dengan efisiensi transformasi 22,66%.

Ketika tanaman yang terpotong diinfeksikan jenisAgrobacterium EHA 101 dan LBA 4404, efisiensitransformasi adalah masing-masing 18% dan 12,66%. Latarbelakang kromosom dan plasmid pembantu vir (pEHA 105)ada dalam jenis Agrobacterium EHA 105 yang mengandunglebih banyak gen vir dibandingkan dengan 2 jenis yang lain.EHA105 memiliki kemampuan kuat untuk menginfeksi J.curcas daripada EHA101 dan LBA4404.

Efisiensi transformasi tergantung pada sejauh manasel-sel meristematik terkena A. tumefaciens. Perluuntuk membuat Agrobacterium masuk lebih dalam kedalam jaringan. Penusukan adalah salah satu metodeyang digunakan untuk menginfeksi sel-sel meristematik.Tiga jenis Agrobacterium dievaluasi, saat tanamanditusuk dan diinfeksikan EHA 105, 73,17% tanamanbertahan setelah penyemprotan PPT , dan 86,65%(17,33 tanaman dari 20 tanaman bertahan setelahpenyemprotan PPT) tanaman ini mengekspresikan gengus dengan efisiensi transformasi 34,66% (17,33tanaman dari 20 tanaman bertahan setelahpenyemprotan PPT). Di sisi lain, EHA 101 dan LBA 4404menunjukkan efisiensi transformasi masing-masing 24%dan 16.66%.

Tabel 1

Untuk meningkatkan efisiensi transformasi pada J.curcas, suspensi A. tumefaciens EHA 105 diaplikasikanpada tempat tusukan daerah apikal dari tanaman dengankapas penyerap steril dan diperlakukan vakum infiltrasipada tekanan yang berbeda (100, 250 atau 500) padainterval waktu yang berbeda (1, 2, 3 atau 4 menit). .Efisiensi transformasi meningkat dengan peningkatantekanan vakum dan 250 mm Hg (selama 1 menit)ditemukan optimal dimana pada 84,99% (28,33 tanamandari 33,33 tanaman bertahan setelah infeksi) daritanaman bertahan setelah penyemprotan PPT dan darijumlah 88,24% (25 tanaman dari 28,33 tanamanbertahan setelah penyemprotan PPT) tanaman inimengekspresikan gen gus dengan efisiensi transformasi50%.

Penginfiltrasian vakum selama 3 menit optimal pada 100dan 250 mmHg, dimana 83,19 % (31,33 tanaman dari37,66 tanaman bertahan setelah infeksi) dan 89,91%(35,66 tanaman dari 39,66 tanaman bertahan setelahinfeksi) tanaman bertahan setelah penyemprotan PPTdan dari jumlah ini 91,47% (28,66 tanaman dari 31,33tanaman bertahan setelah penyemprotan PPT) dan87,85% (31,33 dari 35,66 tanaman bertahan setelahpenyemprotan PPT) tanaman mengekspresikan gen gusdengan efisiensi transformasi masing-masing 57,32%dan 62,66 %.

Jika melewati 3 menit (pada 100 dan 250 mmHg) dan 1menit (pada 500 mmHg), infiltrasi vakum berdampaknegatif terhadap kelangsungan hidup tanaman danakhirnya menyebabkan efisiensi transformasi rendah.

Oleh karena itu, penusukan (8-10 kali) di daerah tunasapikal utama dengan jarum suntik steril dan vakuminfiltrasi dengan suspensi A. tumefaciens EHA 105 pada250 mmHg selama 3 menit optimal dan menyebabkanefisiensi transformasi maksimum 62,66%.

Daun dari tunas yang tumbuh umur 70 haridari tanaman J. curcas yang terinfeksi dantanaman WT diuji secara histokimia untukekspresi gen gus. Warna biru intens diamatidari daun yang diduga bertransformasi,sedangkan tidak berwarna biru seperti yangdiamati dari sampel daun WT. Hal inimenunjukkan bahwa gen gus terintegrasi danterekspresi dalam transformasi genom J.curcas. Pengujian tunas positif GUS untukseleksi dalam perbanyakan tanamantransformasi melalui penyambungan.

Analisi Histokimia GUS tanaman yang diduga bertransformasi

Analisi Histokimia GUS tanaman kontrol WT

Perkembangan daun dari sambungan batang atas diamatidari hari ketiga penyambungan dan banyak daun munculdalam waktu 2 minggu dari sambungan. Setelah 3minggu penyambungan, perkembangan jaringan diamatidi sekitar tempat sambungan. Daun berkembang dariseluruh daerah nodal dari sambungan atas. Tidak adapenolakan sambungan yang diamati antara tanamansambungan, dan karenanya, 100% penyambunganberhasil. Hal ini disebabkan aktivitas meristematik ditempat penyambungan yang sangat penting dalampenyatuan batang atas dengan batang bawah.

Sebanyak 15 tanaman sambungandiperoleh dari limatunas yang diduga bertransformasi. Tanaman yangdisambung disemprot dengan 2 g l-1 PPT dan diamatiuntuk mendapatkan resistensi yang signifikan terhadapPPT, sedangkan tanaman kontrol dengan batang atasWT mengalami gejala nekrotik terhadap penyemprotanPPT. Integrasi transgen dan ekspresi pada tanamansambungan selanjutnya dilihat dengan analisis GUShistokimia, PCR, dan Southern hybirdization.

Batang atas yang diduga

bertransformasidisambung pada

tanaman WT

Munculnya daundari daerah nodus

dari tanamansambungan

setelah 3 hari

Tanamansambungan umur 2

minggu

Untuk mengkonfirmasi integrasi gen bar dalam uji positif gus dalamtanaman transformasi J. curcas, PCR dan Southern blot hybridizationdilakukan dengan menggunakan genomik DNA yang diisolasi dari ujisambungan yang positif gus dan tanaman J. curcas WT. Dalam PCR, adanyafragmen yang diamplikasi dari 462 bp pada sampel genom DNA dari ujitanaman sambungan yang positif gus dan plasmid pGA 492.

Untuk mengkonfirmasi integrasi gen bar dan jumlah salinan dalam tanamantransformasi J. curcas, Southern blot hybridization dilakukan pada genomDNA yang diisolasi dari PCR tanaman sambungan J. curcas dan J. curcasWT. Karena daerah T-DNA dari plasmid pGA 492 hanya memiliki satu situsSacI diatas dari gen bar, kita menyingkat genomik DNA dengan SacI danhibridisasi dengan produk PCR yang diamplifikasi dari gen bar. Setiapfragmen hibridisasi dihasilkan berada dibawah tempat restriksi SacI dalamgenom tanaman dan selanjutnya berhubungan dengan jumlah urutan gen bar.DNA dari tanaman sambungan WT konttrol negatif tidak menunjukkanhibridisasi, sedangkan plasmid pGA 492 menghasilkan sinyal hibridisasi.Tanaman yang sambung memunculkan empat salinan integrasi gen bar, danpola hibridisasi yang non-identik karena peristiwa transformasi yangberbeda.

Lima tanaman sambungan yangbertransformasi yang dipilih secara acak dantanaman pendonor bagian atas sambunganyang dihasilkan jelas dan bisa meproduksifragmen yang diamplifikasi ketika disaringdengan menggunakan sepuluh primer RAPD.Kemiripan genetik juga ditemukan 100%antara tanaman sambungan dan tanamanpendonor bagian atas. Penanda RAPD berhasildigunakan untuk mempelajari kemurniangenetik tanaman J. curcas secaramikropropagasi.

Penelitian ini jelas menunjukkan bahwa ketika daerahapikal ditusuk dan mengalami vakum infiltrasi dengan A.tumefaciens EHA 105 pada 250 mmHg selama 3 menit,mengakibatkan efisiensi transformasi tertinggi 62,66%.Tanaman transformasi diperbanyak menggunakansambungan, yang lebih mudah daripada di perbanyakantanaman transformasi berbasis in vitro. Analisiskemurnian genetik sambungan tanaman transformasi J.curcas menggunakan penanda RAPD mengungkapkantidak ada variasi genetik. Protokol yang dikembangkandapat digunakan untuk mengembangkan tanamantransformasi J. curcas dengan sifat yang diinginkandalam waktu yang relatif singkat.