Sabouraudia (1976), 14, 265-273

P R E P A R A C I O N Y ESTUDIO DE U N A N T I G E N O CELULAR DE PARA- COCCIDIOIDES BRASILIENSIS, UTIL P A R A PRUEBAS C U T A N E A S

R . NEGRONI, MARIA ROSA I. DE ELIAS COSTA, O . BIANCHI AND R . GALIMBERTI

Centro de Micologla de la 1 ° Cdtedra de Microbiologla y Parasitologia de ta Facultad de Medicina de Buenos Aires y Hospital F. or. Mu~iz

Se describe la preparaci6n y estandardizaci6n de una paracoccidioidina celular obtenida del sobrenadante de cfilulas levaduriformes del Paracovddioides brasiliensis rotas, por un procedimiento semejante al empleado para la preparaci6n de la esferulina det Cocddioides immitis.

E1 estudio de la composlci6n qufmica demostr6 que este antlgeno estA compuesto por polisacAridos (55/lg/mg) y protefnas (7, 8/tg/mg).

Las pruebas de antigenieidad "in vitro" demostraron que es capaz de producir reacciones de inmunodifusi6n y fijaci6n de eomplemento positivas frente a sueros de pacientes con paracoccidioidomi- eosis. La titulaei6n del antfgeno pot medio de esta filtima prueba serol6gica, determin6 que su tftulo 6ptimo eorresponde a la eoncentraei6n de 0,5 mg/ml.

E1 estudio de su poder antig~nieo y espeeifieidad "in vivo" fue realizado sobre tres grupos de pacientes; el primero integrado por 56 casos con paraeoeeidioidomieosis eonfirmada, el segundo por 15 enfermos con histoplasmosis y el restante pot 70 personas con diversas alteraeiones pulmonares no mic6ticas y proeedentes de distintas zonas del pMs. En todos ellos se efeetuaron pruebas cutAneas con paraeoeeidioidina eelular en la coneentraei6n de 3 mg/ml, antfgeno de Fava Netto diluldo 1[10 e histoplasmina dilulda 1/100.

Los enfermos con paraeoecidioidomieosis presentaron pruebas eut~neas positivas con paraeoeidioi- dina eelular en 44 de los 56 easos, con antfgeno de Fava Netto en 42 de los 56 y con histoplasmina en 28 de 56 paeientes. La totalidad de los enfermos de histoplasmosis, seleeeionados para este estudio, presentaban pruebas eutAneas posltivas con histoplasmina con m~s de 15 mm de infiltrado, 3 de ellos reaecionaron positivamente con el antigeno de Fava Netto y 2 con la paracoccidioidina.

E1 32% de los pacientes sin mieosis broneopulmonares evideneiaron reaeciones positivas con la histoplasmina y s61o 10% con ambos antigenos del P. brasiliensis.

En 7 de 10 paeientes de paraeoceidloldomieosis, con pruebas eut~neas espeeffieas negativas, due posible demostrar eierto grado de hipersensibilidad retardada empleando la paraeoceidioidina eelular en la eoneentraci6n de 8 ug/ml.

Los estudios histol6gicos de las pruebas eut~meas con este antlgeno evideneiaron alteraciones tfpieas de la hipersensibilidad mediada por edlulas.

A p a r t i r de la e s t a n d a r d i z a c i d n de la c o c c i d i o i d i n a p o r S m i t h , W h i t i n g , Baker , R o s e m b e r g , B e a r d & Sia to (1948), se p r o c u r 6 a p l i c a r esta t f icnica en la p r e p a r a c i d n de an t fgenos p a r a otras micosis. E n la p a r a c o c c i d i o i d o m i c o s i s L a c a z (1951), N e g r o n i , P., N e g r o n i , M . B., Dag l io , V i v a n c o s y Bona t t i (1952) y M a k i n n o n , A r t a g a v e y t i a - A l l e n d e y A r r o y o (1953), e m p l e a r o n r eac t ivos de este t ipo en encues tas e p i d e m i o - Idgicas y es tudios expe r imen t a l e s .

P o s t e r i o r m e n t e F a v a N e t t o y R a p h a e l (1961) p r e c o n i z a r o n el e m p l e o de u n an t i - geno pol isacArido o b t e n i d o de la fase l e v a d u r i f o r m e del P. brasiliensis. D i c h o pol i - sacArido fue usado en es tudios ep idemio ldg icos y c l lnicos p o r A l b o r n o z , M. y A l b o r n o z , R . ( i971) , B a r b o s a (1968) y N e g r o n i , R . y Rob les , A. 1VL (1974).

R e s t r e p o y S c h n e i d a u (1967) p r e p a r a r o n u n a n t i g e n o fitil p a r a p r u e b a s cutAneas po r p r e c i p i t a c i 6 n con e t ano l de f i l t rados de cul t ivos de a m b a s fases de l P. brasiliensis. D e t e r m i n a r o n , i g u a l m e n t e , q u e l a f r acc idn r e sponsab le de su a c t i v i d a d e ra u n g luco- p~pt ido.

M u s a t t i (1974) e m p l e 6 u n an t fgeno p ro t e i co o b t e n i d o del s o b r e n a d a n t e de c61ulas l e v a d u r i f o r m e s del P. brasiliensis rotas, en la r ea l i z ac idn de p r u e b a s de h ipe r - sens ib i l idad r e t a r d a d a , t a n t o "in v i v o " c o m o " i n v i t r o " .

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Desde que Levine, Cobb & Scalarone (1969) obtuvieron la esferulina y demos- straron que era m~s sensible que la coccidioidina de Smith y col. (1948), se abri6 un nuevo campo para la preparacidn de antlgenos similares a partir de otros hongos patdgenos.

Con el presente trabajo nos propusimos estudiar un antfgeno del P. brasiIiensis obtenido de acuerdo a la tfcnica empleada para preparar la esferulina.

Preparaci6n del antigeno de P. brasiliensis

Se utilizaron las cepas 12499 y 19333 de P. brasiliensis pertenecientes a la coleccidn del Centro de Micologla, las mismas fueron mantenidas en su fase levaduriforme pot repiques cada 12 dlas en medio de Sabouraud, modificado por Emmons, Binford & Utz (1970) e incubados a 37°C.

E1 medio de cultivo empleado para obtener abundante desarrollo de la fase levaduriforme fue el mismo que utilizamos para la preparacidn de antfgenos para serologia, Negroni, R. (1968). E1 mismo fue distribuido en frascos de Erlenmeyer de 250 ml a razdn de 125 ml de medio llquido cada uno. Los frascos fueron sembrados con una suspensidn densa de elementos levaduriformes e incubados en agitador mec~nico rotatorio New Brunswick Co., a razdn de 120 giros por minuto, a 37°C y durante 4 semanas.

Las c6lulas ffingicas se separaron por centrifugacidn y fueron lavadas seis veces con agua destilada, despuds del filtimo lavado se las resuspendi6 en un volfimen de agua destilada cinco veces inferior al que originalmente tenia el medio de cultivo. Esta suspensidn se dej6 20 d~as en el agitador, a 37°C y manteniendo una frecuencia de 120 rotaciones por minuto.

La ruptura de los elementos levaduriformes se efectud en homogeinizador de tejidos Braun, empleando 10 gr de perlas de vidrio de 0,45 a 0,50 mm por cada 20 ml de suspensidn. La misma fue sometida 3 veces a 4000 rev/min durante 1 minuto y con ello se obtuvo la ruptura del 100 ~ de los elementos. E1 control del porcentaje de cdlulas rotas se efectud con microscopio 6ptico. (Fig. 1 y 2). E1 sobrenadante fue separado pot centrifugacidn refrigerada a 5°C, a razdn de 5000 rev/min y durante 15 minutos. E1 mismo fue adicionado de 0 ,85~ de cloruro de sodio para restituir la isotonicidad, se le agregd 1/10.000 de mertiolato-borato de sodio y se lo filtrd por Seitz esterilizante.

El ant~geno fue distribuldo en alicuotas de 1 ml en ampollas y se determin6 su peso seco despuds de liofitizado.

Para las pruebas cutgneas fueron empleadas dos concentraciones, una "standard" de 3 mg/ml y otra solo utilizada en pacientes andrgicos con paracoccidioidomicosis, de 8 mg/ml.

Controles de antigenicidad in vitro

La capacidad antigfinica de cada lote de este reactivo fue determinada mediante su titulaci6n, con un suero patr6n positivo, por medio de la fijacidn de complemento, de acuerdo a la tficnica de microtitulacidn propuesta por la Oficina Sanitaria Panamericana (1974) y con la misma finalidad, empleamos la inmunodifusidn en gel de agar, siguiendo el m~todo de Huppert aceptado, igualmente, por la Oficina Sanitaria Panamericana (1972). Fueron examinados 5 sueros de pacientes con paracoccidioidomicosis y uno de histoptasmosis.

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Controles de Esterilidad

Se sembraron 0,5 ml de ant lgeno en 2 tubos de agar caldo glucosado al 1 ~ y en iguaI nfimero de tubos en agar b lando glucosado para anaerobiosis.

Figura 1.--Parac0ccidi0ides brasiliensis suspensi6n de elementos levaduriformes antes de la ruptura con el homogenizador de te.iidos Braun.

Figura 2.--Elementos de P. brasiliensis rotos, antes de separar 1as paredes celulares por centri fugaci6n.

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Estudios de la composici6n qulmica del antigeno

Los mismos fueron realizados sobre 2 lotes de antlgeno. Los polisadtridos se determinaron por et m~todo de1 fenol de Norris & Ribbons (1971) y las protelnas por el de Folin-Ciocalteau de acuerdo a Chase (1968). Los resultados se expresaron en concentraci6n de estas sustancias por miligramo de peso seco.

Antlgenos controles empleados

Utilizamos como andgeno control del P. brasiliensis el polisac/trido de Fava Netto (1955), procedente del Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, Lote 73 y provisto pot el autor. Este reactivo se emple6 dilu~do 1/10 para pruebas cut~neas.

Con el objeto de estudiar las reacciones cruzadas utilizamos la histoplasmina L 4 s del Centro de Micologla de la Facuttad de Medicina de Buenos Aires, la misma fue preparada de acuerdo a la tficnica de Smith (1948) y se la empled dilulda 1/100.

Fueron estudiados 56 pacientes con paracoccidioidomicosis confirmados mico- 16gicamente, de ellos 32 estaban cursando la enfermedad y los restantes se encontra- ban en estado de curacidn cllnica, despu6s de haber recibido diversos tratamientos. Se examind un grupo de 15 personas con histoplasmosis actual o pasada y que presen- taban reacciones de histoplasmina fuertemente positivas. Finalmente, el filtimo grupo estudiado, estuvo integrado por 70 personas, procedentes de diversas regiones del pals y sin diagn6stico de micosis profundas.

En todos los casos se practicaron las mismas reacciones, inyectando en la t a ra anterior del antebrazo izquierdo 0,1 ml de histoplasmina 1/100, igual volumen de antlgeno de Fava Netto 1/10 en la parte superior del antebrazo derecho y 0,1 ml de paracoccidioidina celular dilulda a raz6n de 3 mg/ml en la parte distal del mismo antebrazo. La lectura de las pruebas cut~neas fue realizada a l a s 24 y 48 hs., midi- dndose el gtrea indurada en millmetros. En aquellos pacientes con paracoccidioido- micosis que presentaron reacciones negativas con los ant~genos homdlogos en las diluciones ya mencionadas, se efectud la intradermorreaccidn con paracoccidioidina dilu~da a razdn de 8 mg/ml.

Se practicaron estudios histopatol6gicos de las pruebas cutgmeas positivas en 5 pacientes, en uno la toma fue efectuada a l a s 24 hs en dos a los 48 hs y en los restantes a l a s 72 hs. Las biopsias se realizaron sobre las pruebas cut~neas practicadas con todos los antlgenos, con el objeto de comparar el cuadro histol6gico de la hiper- sensibilidad que provocan. La toma bidpsica fue efectuada con "punch" estfiril de 3 m m y se profundizd hasta la hipodermis, los trozos de tejidos obtenidos fueron 13jados en formol al 10 ~ , incluldos en parafina y tefiidos con hematoxilina-eosina.

RESULTADOS

Las pruebas de antigenicidad "in vitro" demostraron que este preparado es capaz de fijar el complemento en presencia de un suero patrdn positivo, su tltulo 6ptimo corresponde a 0.5 mg/ml. Es tambi6n fitil para inmunodifusi6n en gel de agar, los cinco sueros de pacientes con paracoccidioidomicosis presentaron bandas de precipitaci6n frente a una concentraci6n de ant~geno de 16 mg/ml.

Los estudios de la composici6n quimica de la paracoccidioidina celular demos- traron que contiene 7,8 #g/mg de protelnas y 55 #g/rag de polisacgtridos.

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TABLA 1 .--PRuEBAS CUTkaNEAS CON ANTiGENOS DEL P. brasi- liensis e histoplasmina ~N 32 tSNFERMOS CON PARACOCCIDIOIDO-

MIGOSlS ACTIVA

2 4 h 4 8 h F.N. Pw. F.N. Pw. H.c.

Neg-ativas 10 10 11 10 18 5-10 m m 4 5 8 4 - -

10-15 m m 4 5 1 3 6 15-20 m m 5 4 5 2 5

20 m m 9 8 8 13 3

TABLA 2.--PRUEBAS CUTANEAS CON ANTIGENO$ DEL V. brasi- liensis e histoplasmina EN 24 Er,mBF.~OS CON P.~ACOCCIDIOIDO-

MITOSIS INACTXVA

24 h 48 h F.N. P.v. F.N. P.o. H.c.

Negadvas 4 2 4 2 10 5-10 m m 4 8 3 2 - -

10-15 m m 3 4 5 1 5 15-20 m m 10 4 9 5 5

20 m m 3 6 3 14 4

TABLA 3.--REsuLTADOS DE LAS t~RUEBAg CUT~NEAS CON HISTOPLASMINA Y ANTiGENOS ])EL P. brasiliensis

~N 15 PACIENTES CON HISTOPLASMOSIS

Hx. P.c. F.N.

Negativas - - 13 12 5-10 m m - - - - - -

10-15 m m 1 - - 1 15-20 m m 4 - - 1

20 m m 10 2 1

Lectura a ias 48 horas. F.N. : ant igeno de Fava Netto. P.o. : paracoccldioidina celular. H.c. : histoplasmina.

L o s r e s u l t a d o s d e l a s p r u e b a s c u t ~ n e a s c o n p a r a c o c c i d i o i d i n a c e l u l a r , a n t l g e n o

d e F a v a N e t t o , e h i s t o p l a s m i n a , p r a c t i c a d a s e n p a c i e n t e s c o n p a r a c o c c i d i o i d o m i c o s i s ,

e s tAn e x p r e s a d a s e n l a t a b l a n ° 1 y 2.

L a s p r u e b a s c u t ~ n e a s c o n a m b o s a n t i g e n o s d e l P. brasiliensis f u e r o n n e g a t i v a s

e n 10 d e los 32 p a c i e n t e s c o n p a r a c o c c i d i o i d o m i c o s i s a c t i v a . E n 7 d e e l los l a p r u e b a

c u t ~ n e a c o n p a r a c o c c i d i o i d i n a c e l u l a r e n l a c o n c e n t r a c i 6 n d e 8 m g / m l p r o d u j o

r e a c c i o n e s p o s i t i v a s c o n m A s d e 10 m m d e i n f i l t r a d o .

L a s p r u e b a s i n t r a d f r m i c a s c o n h i s t o p l a s m i n a 1 / 1 0 0 f u e r o n p o s i t i v a s e n 2 8 d e los

56 c a s o s d e p a r a c o c c i d i o i d o m i c o s i s , c o n i n f i l t r a d o s d e 10 m m o mi l s . ( t a b l a s 1 y 2) .

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De los 15 enfermos con histoplasmosis, que presentaron reacciones de histoplas- mina positivas con infiltrados de 15 m m o mAs, 3 tuvieron intradermorreacciones con antigeno de Fava Netto positivas y 2 con la paracoccidioidina celular. Estos 3 pacientes habian vivido, durante largos periodos, en la zona end6mica de para- coccidioidomicosis. (tabla n ° 3).

De los 70 pacientes con lesiones pulmonares no mic6ticas que estudiamos, la p rueba cut{mea con histoplasmina 1/100 result6 positiva en 23 casos y las intra- dermorreaeciones con ambos antlgenos del P. brasiliensis fueron positivas en 7 casos cada uno.

Los exAmenes histopatoldgicos de las pruebas con paracoccidioidina celular acusaron la presencia de infiltrados linfocitarios perivasculares y perianexiales en la dermis, un marcado grado de eosinofilia, vasodilatacidn y edema. Los estudios realiza- dos simultAneamente, sobre las reacciones con anffgeno de Fava Netto e histoplasmina presentaron un euadro semejante, salvo que el grado de eosinofilia fue menor con el ant lgeno de Fava Netto y nulo con la histoplasmina. (Fig. 3 y 4).

DlSCUSI6N

La paracoccidioidina celular, objeto de este trabajo, pcrmite aprovechar los elementos levaduriformes del P. brasiIiensis sobrantes de la preparacidn del antlgeno

Figura 3.--Examen histopatol6gico de piel de una reacci6n con antlgeno de Fava Netto. N6tase los infiltrados linfocitarios perivasculares.

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Figura 4.--Examen histopatol6gico de piel en el mismo paciente, sobre una reacci6n con para- coccidioidlna celular. N6tese los infiltrados linfocitarios m~s densos, intensa vaso- dilataci6n y edema.

utilizado en las reacciones seroldgicas. Su elaboraci6n es sencilla, econdmica y en el producto final obtenido s61o est~n presentes elementos del bongo. Tal como la esferulina, esta paracoccidioidina, tiene como principal componente los polisac~ridos, sigui6ndole, en mucha menor concentraci6n, las proteinas.

Las pruebas de antigenicidad realizadas, tanto in vivo como in vitro, demostraron una aceptable sensibilidad. De la comparaci6n con el antlgeno de Fava Netto surge un acentuado grado de coincidencia en los resultados obtenidos in vivo. Sin embargo la paracoccidioidina celular result6 ligeramente m~s sensible (2 reacciones negativas menos entre los pacientes con paracoccidioidomicosis), present6 pruebas m~s intensas a las 48 hs y con infiltrados mayores de 20 mm (27 reacciones con infiltra- ciones superiores a los 20 mm para la paracoccidioidina y 11 para el antlgeno de Fava Netto).

Las pruebas cutdmeas fueron negativas en 10 de los 32 pacientes con para- coccidioidomicosis activa (31 ~) , lo que representa un porcentaje habitual en esta afeccidn de acuerdo alas comprobaciones de Fava Netto y Raphael (1961), Negroni, R., y Robles, A. M. (1974) y Musatti (1974). Et empleo de una concentracidn mayor de paracoccidioidina celular permiti6 comprobar cierto grado de hipersensibilidad en 7 de los 10 reactores negativos a la concentracidn de 3 mg/ml. Esto muestra que

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es posible de te rminar con bas tante exactitud, la in tensidad de la hipersensibil idad especffica en los pacientes con paracoccidioidomicosis evolutiva, comprobacidn 4sta, que posee u n impor tan te valor prondstico.

Resultd notable la elevada freeuencia de pruebas cutfineas positivas con histo- p lasmina presentada por los enfermos de paracoccidioidomicosis ( 5 0 ~ ) , en tanto que sdlo el 20 ~ de los pacientes con histoplasmosis presentaron reacciones positiva de Fava Netto y 13,3 ~ de ellos reaccionaron con la paracoccidioidina celular. La total idad de los enfermos de histoplasmosis que tuvieron reacciones positivas con los antigenos del P. brasiliensis hab la residido en zona endfimica de paracoccidioido- micosis. Estas comprobaciones hacen suponer q u e e n el Nordeste argent ino y en el Paraguay ambas endemias se superponen, produciendo infecciones po t Histoplasma capsutatum y P. brasiliensis y que en la mayor parte de los sujetos s61o esta filtima se to rna evolutiva. Por el contrario la regi6n de La P a m p a hf imeda es s61o endfimica de histoplasmosis y los enfermos que no a b a n d o n a r o n dicha zona no presentaron intradermorreacciones positivas con antfgenos de P. brasiliensis.

E1 estudio de las pruebas cutfineas en los pacientes portadores de afecciones pulmonares no rnic6ticas demostraron indices de positividad habituales para el firea pampeana , segfin Negroni (1970), 3 2 ~ de reactores positivos a la his toplasmina y 10 ~ pa ra los antlgenos del P. brasiliensis.

Los estudios histol6gicos de las pruebas cutAneas con paracoccidioidina eelular presentaron las alteraciones propias de la hipersensibil idad re tardada, con infiltrados linfocitarios perivasculares y perinexiales semejantes a los producidos por el andgeno de Fava Netto y por la histoplasmina. Desconocemos cuA1 es el motivo de la acen tuada eosinofilia observada con el pr imero de estos reactivos. Es de destacar la ut i l idad y sencillez de la es tandardizaci6n de los antlgenos pa ra pruebas cutAneas en pacientes, par t i cu la rmente en aquellos centros que cuen tan con u n gran movimiento de enfermos.

SUMMARY

A cellular antigen from Paracoccidioides brasiliensis, obtained from the supernate of the disrupted yeast phase, was studied. It was prepared by a method similar to that for obtaining the spherulin from Coccidioides immitis. This antigen is composed of 55 pg/mg of polysaccharides, de termined by the phenol method, and 7.8/~g/mg of protein, determined by Folin-Ciocalteu's technique.

In vitro tests of antigenicity were done by immunodiffusion and complement fixation. The optimum dilution of the antigen was 0.5 mg/ml determined by microtiter complement fixation.

The in vivo standardization of the cellular paracoccidioidin was performed on three groups of patients. The first was composed of 56 patients with mycologically proved paracoccidioidomycosis. The disease was active in 32 and clinically healed in 24 of this group. The second was composed of 15 cases of histoplasmosls with strong histoplasmin skin tests. The third group were 70 patients with no mycotic pulmonary diseases who had come from different zones in Argentina.

Each individual was injected with 0"1 ml cellular paracoccidioidin (3 mg/ml), 0.1 ml of Fava Netto's antigen diluted 1/10, and 0.1 ml histoplasmln L4s, diluted 1/100.

The cellular paracoccidioidin skin test was positive in 44/56 (78.5%) patients with paracoccidioido- mycosis. The Fava Netto's antigen gave 42 (75%) positive results and the histoplasmin skin tests gave 28 (50%) in the same group. Twenty-eight (50%) presented positive histoplasmin skin tests.

The paracoceidioidin skin test was positive in 2 of the histoplasmosis group (13-3%) and the Fava Netto's antigen gave 3 positive results in the same group (20%).

The histoplasmin skin test was positive in 32% of the individuals with no mycotic disease. Ten per cent of these exhibited positive reaction with both P. brasiliensis antigens.

Of those paracoccidioidomycosis cases (Group i) who had negative skin tests with 3 mg/ml of the cellular paracoccidioidin, 7/10 gave positive skin tests when tested at a concentration of 8 mg/ml.

Characteristic changes of cell medicated hypersensitivity were observed in the histopathological studies of the cellular paracoceidioidin skin test.

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