I. Nomor Percobaan: 8

II. Nama Percobaan: Penentuan Kadar Tirosin Dalam Kasein

III. Tujuan Percobaan: Menentukan Kadar Tirosin Dalam Kasein

IV. Dasar Teori

Metode Spektroskopi UV-visible

Sejumlah metode telah ditemukan untuk pengukuran kadar protein berdasarkan spektroskopi UV-visible. Metode ini berdasarkan kemampuan protein menyerap (atau membaurkan) cahaya di daerah UV-visible. Atau secara kimiawi atau fisik memodifikasi protein untuk membuatnya menyerap (atau membaurkan) cahaya di daerah UV-visible.

Prinsip dasar di balik masing-masing uji ini serupa.

Pertama-tama, semua serapan kurva kalibrasi (atau turbiditas) vs kadar protein disiapkan menggunakan satu seri larutan protein yang sudah diketahui kadarnya. Serapan (atau turbiditas) larutan yang dianalisis kemudan diukur pada panjang gelombang yang sama, dan kadar protein ditentukan dari kurva kalibrasi. Perbedaan utama pengujian ini adalah gugus fungsi yang berperan untuk absorbsi atau pembiasan radiasi elektromagnetik, misalnya ikatan peptida, rantai samping aromatis, gugus inti dan agregat protein.

Sejumlah metode UV-visibe untuk penetapan kadar protein sebagi berikut :

Prinsip

a. Pengukuran langsung pada 280nm.

Tryptophan dan tyrosine mengabsorbsi kuat cahaya uv pada 280 nm. Kandungan tryptophan dan tyrosine berbagai protein umumnya konstan sehingga serapan larutan protein pada 280 nm dapat digunakan untuk menentukan kadarnya.

Keuntungan metode ini karena sederhana untuk dilakukan, non-destruktif, dan tidak

dibutuhkan reagen khusus.

Kerugian utama : asam nukleat juga mengabsorbi kuat pada 280 nm dan sehingga mengganggu pengukuran protein jika ada dalam kadar yang bermakna.

Namun demikian, metode ini telah berkembang untuk mengatasi masalah ini, antara lain : dengan pengukuran serapan pada dua panjang gelombang yang berbeda.

b. Metode Biuret

Warna violet akan terbentuk bila ion cupri (Cu2+) berinteraksi dengan ikatan peptida dalam suasana basa. Reagen biuret, yang mengandung semua bahan kimia yang diperlukan untuk analisis sudah tersedia di pasaran. Reagen ini dicampurkan dengan larutan protein, didiamkan 15-30 menit, kemudian diukur serapannya pada 540 nm.

Keuntungan utama dari teknik ini adalah tidak adanya gangguan dari senyawa yang menyerap pada panjang gelombang yang lebih rendah. Teknik ini kurang sensitif terhadap jenis protein karena absorpsi yang terjadi melibatkan ikatan peptida yang ada di semua protein, bukan pada gugus samping spesifik.

c. Metode Lowry

Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin-Ciocalteau phenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein. Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara 500 - 750 nm, tergantung sensitivitas yang dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil di sekitar 500 nm yang dapat digunakan untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar di sekitar 750 nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah. Metode ini lebih sensitif untuk protein dengan konsentrasi rendah dibanding metode biuret.

d. Metode pengikatan pewarna

Pewarna dengan muatan negatif (anionik) ditambahkan dalam jumlah berlebih pada larutan protein yang pH nya telah disesuaikan sehingga protein menjadi bermuatan positif (misalnya dibuat di bawah titik isoelektrik). Protein membentuk kompleks tak larut dengan pewarna karena interaksi elektrostatik antar molekul, tapi masih tersisa pewarna tak terikat yang larut.

Pewarna anionik berikatan dengan gugus kationik dari residu asam amino basa (histidine, arganine dan lysine) dan pada gugus asam amino bebas di ujung. Jumlah pewarna tak terikat yang tersisa setelah kompleks protein-pewarna dipisahkan (misalnya dengan sentrifugasi) ditentukan dengan pengukuran serapan. Jumlah protein yang ada di larutan awal berhubungan dengan jumlah pewarna yang terikat :

[Pewarnaterikat] = [Pewarnaawal] - [Pewarnabebas]

e. Metode Turbimetri

Molekul protein yang umumnya laruta dapat dibuat mengendap dengan penambahan senyawa kimia tertentu, seperti asam trikloroasetat. Pengendapan protein menyebabkan larutan menjadi keruh, sehingga konsentrasi protein dapat ditentukan dengan mengukur derajat kekeruhan (turbiditas).

Keuntungan dan kerugian

Keuntungan :

Teknik UV-visible merupakan teknik yang cepat dan sederhana, serta sensitif terhadap protein dengan konsentrasi rendah.

Kerugian :

Sebagian besar teknik UV-visible memerlukan larutan yang encer dan jernih, serta tidak mengandung senyawa kontaminan yang dapat mengabsorpsi atau memantulkan cahaya pada panjang gelombang di mana protein akan dianalisis. Karena diperlukan larutan jernih, maka makanan harus mengalami sejumlah tahap preparasi sampel sebelum dianalisis, seperti homogenisasi, ekstraksi pelarut, sentrifugasi, filtrasi, dsb. yang dapat menyita waktu dan tenaga. Selain itu, kadang-kadang sulit untuk secara kuantitatif mengekstraksi protein dari jenis makanan tertentu, terutama bila makanan tersebut telah mengalami proses dimana protein menjadi agregat atau terikat secara kovalen dengan senyawa lain. Kelemahan lain adalah, serapan tergantung pada jenis protein (karena protein yang berbeda mempunyai sekuens/urutan asam amino yang berbeda pula).

V. Alat dan Bahan

A. ALAT

1. Beker gelas

2. Gelas ukur

3. Pipet tetes

4. Penangas air

5. Refluks kondensor

6. Pipet tetes

7. Corong pemisah

8. Pengaduk kaca

9. Porselen

10. Statif dan klem

11. Erlenmeyer

12. Spektometer

13. Kuvet

14. Neraca analitik

15. Kaca arloji

16. Labu bundar

17. Penjepit kayu

B. BAHAN

1. 1 mg Kasein

2. Larutan Tirosin 1% - 5%

3. NaOH 6 N 20 ml

4. H2SO4 7 N 30 ml

5. HgSO4 (5%) 3 ml

6. H2SO4 5 N

7. H2SO4 7 N 2 ml

8. NaNO2 (0,2%) 2 ml

9. 12 ml air

VI. Prosedur Percobaan

Hidrolisa 1,0 mg Kasein dengan 20,0 ml NaOH 6 N pada refluks kondensor dalam penangas air selama 4 jam. Tambahkan hati-hati 30 ml H2SO4 7 N. campur. Tempatkan 1,0 ml hidrolisat ke dalam tabung yang bersih dan kering. Pada tabung-tabung lain pipet masing-masing 1,0 ml larutan tirosina standard dengan lima macam kadar yang berbeda. Tambahkan 3 ml HgSO4 5 % dalam H2SO4 5 N pada semua tabung. Panaskan dalam penangas air yang mendidih selama 10 menit. Dinginkan dan tambahkan ke dalam masing-masing tabung 2 ml H2SO4 7 N dan 2 ml 0,2 %. Campur dan tambahkan 12 ml air ke dalam masing-masing tabung. Baca ekstingsinya pada spectrometer dengan

l

maks = 470 nm.

VII. Hasil Pengamatan

PROSEDUR

HASIL PENGAMATAN

1. Hidrolisa 1 mg kasein + 20 ml NaOH + setetes demi tetes 30ml H2SO4 7N (pada refluks kondensor selama 4 jam)

Larutan menjadi berwarna putih

2. 1 ml Hidrolisat + 3 ml HgSO4 (dipanaskan dalam air mendidih 10 menit)

Didinginkan:

+ 2ml H2SO4 7N + 2 ml NaNO2 + 12 ml air

Saat 1 ml hidrolisat ditambah dengan 3 ml HgSO4 masih belum terlihat perubahan, tapi setelah dipanaskan didalam air mendidih selama 10 menit dan ditambah 2ml H2SO4 7N larutan yang tadinya berwarna putih menjadi bening.

Ketika ditambah 2 ml NaNO2, larutan berubah warna menjadi orange. Dan ketika ditambah lagi dengan 12 ml air, larutan menjadi orange muda.

3. 1 ml Tyrosin 0,1 % + 3 ml HgSO4 (dipanaskan dalam air mendidih 10 menit)

Didinginkan:

+ 2ml H2SO4 7N + 2 ml NaNO2 + 12 ml air

Saat 1 ml Tyrosin 0,1 % ditambah dengan 3 ml HgSO4 masih belum terlihat perubahan, tapi setelah dipanaskan didalam air mendidih selama 10 menit dan ditambah 2ml H2SO4 7N larutan menjadi putih.

Ketika ditambah 2 ml NaNO2, larutan berubah warna menjadi orange. Dan ketika ditambah lagi dengan 12 ml air, larutan menjadi orange muda.

4. 1 ml Tyrosin 0,2 % + 3 ml HgSO4 (dipanaskan dalam air mendidih 10 menit)

Didinginkan:

+ 2ml H2SO4 7N + 2 ml NaNO2 + 12 ml air

Saat 1 ml Tyrosin 0,2 % ditambah dengan 3 ml HgSO4 masih belum terlihat perubahan, tapi setelah dipanaskan didalam air mendidih selama 10 menit dan ditambah 2ml H2SO4 7N larutan menjadi putih.

Ketika ditambah 2 ml NaNO2, larutan berubah warna menjadi orange lebih pekat dari Tyrosin 0,1%. Dan ketika ditambah lagi dengan 12 ml air, larutan menjadi orange muda agak pekat dari Tyrosin 0,1%.

5. 1 ml Tyrosin 0,3 % + 3 ml HgSO4 (dipanaskan dalam air mendidih 10 menit)

Didinginkan:

+ 2ml H2SO4 7N + 2 ml NaNO2 + 12 ml air

Saat 1 ml Tyrosin 0,3 % ditambah dengan 3 ml HgSO4 masih belum terlihat perubahan, tapi setelah dipanaskan didalam air mendidih selama 10 menit dan ditambah 2ml H2SO4 7N larutan menjadi putih.

Ketika ditambah 2 ml NaNO2, larutan berubah warna menjadi orange lebih pekat dari Tyrosin 0,2%. Dan ketika ditambah lagi dengan 12 ml air, larutan menjadi orange muda agak pekat dari Tyrosin 0,2%.

6. 1 ml Tyrosin 0,4 % + 3 ml HgSO4 (dipanaskan dalam air mendidih 10 menit)

Didinginkan:

+ 2ml H2SO4 7N + 2 ml NaNO2 + 12 ml air

Saat 1 ml Tyrosin 0,4 % ditambah dengan 3 ml HgSO4 masih belum terlihat perubahan, tapi setelah dipanaskan didalam air mendidih selama 10 menit dan ditambah 2ml H2SO4 7N larutan menjadi putih.

Ketika ditambah 2 ml NaNO2, larutan berubah warna menjadi orange lebih pekat dari Tyrosin 0,3%. Dan ketika ditambah lagi dengan 12 ml air, larutan menjadi orange muda agak pekat dari Tyrosin 0,3%.

7. 1 ml Tyrosin 0,5 % + 3 ml HgSO4 (dipanaskan dalam air mendidih 10 menit)

Didinginkan:

+ 2ml H2SO4 7N + 2 ml NaNO2 + 12 ml air

Saat 1 ml Tyrosin 0,5 % ditambah dengan 3 ml HgSO4 masih belum terlihat perubahan, tapi setelah dipanaskan didalam air mendidih selama 10 menit dan ditambah 2ml H2SO4 7N larutan menjadi putih.

Ketika ditambah 2 ml NaNO2, larutan berubah warna menjadi orange lebih pekat dari Tyrosin 0,4%. Dan ketika ditambah lagi dengan 12 ml air, larutan menjadi orange muda agak pekat dari Tyrosin 0,4%.

_1446308082.unknown