PENUNTUN PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI FARMASI

DISUSUN OLEHTIM DOSEN BIOTEKNOLOGI FARMASI

PROGRAM STUDI FARMASIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS TADULAKOPALU2011

PERCOBAAN IISOLASI MIKROBA DAN PRODUKSI ANTIBIOTIKA

Alat dan Bahana. Alat Cawan petri, Gelas piala, Gelas ukur, Kertas saring, Labu erlenmeyer, Lampu

spiritus, Laminary Air Flow (LAF), Ose lurus, Ose bulat, Otoklaf, Penangas air, pH meter, Shaker, Tabung reaksi dan lain-lain.

b. Bahan Agar, Air suling, Ekstrak beef, Mikroba uji, NaCl, Pati terlarut, Pepton,

Tepung Kedelai.

Prosedura. Isolasi dan Pemurnian Mikroba Penghasil Antibiotika

Timbang kira-kira sebanyak 1 gram cuplikan dan masukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi larutan pengencer NaCl 0,9%, kocok sampai homogen. Lakukan pengenceran bertingkat. Selanjutnya, pipet 1 ml beberapa pengenceran terakhir dan masukkan ke dalam cawan petri, lalu tuangkan sebanyak 15 ml medium PCA (Tabel 1), goyang-goyangkan sampai tercampur rata. Biarkan membeku lalu inkubasikan selama 2-5 hari pada suhu yang sesuai.

Dari koloni yang memperlihatkan adanya zona penghambatan, ambil 1 ose lalu goreskan pada PCA agar cawan yang lain lalu inkubasikan selama 1-2 hari. Selanjutnya, pindahkan 1 ose koloni yang terpisah baik ke dalam PCA agar miring dan inkubasikan selama 24 jam, sehingga diperoleh kultur koloni mikroba yang murni.

b. Peremajaan dan Pembenihan MikrobaAmbil sebanyak 1 ose koloni yang murni dan goreskan pada medium PCA

agar miring. Inkubasikan selama 24 jam pada suhu yang cocok. Inokulasikan 1-2 ose ke dalam 100 ml medium pembenihan MYB (Tabel 2), lalu inkubasikan selama 24 jam sambil di shaker.

c. Produksi AntibiotikaMasukkan medium pembenihan ke dalam 100 ml medium produksi (Tabel

3), lalu inkubasikan pada suhu kamar sambil di shaker selama 4 hari. Selanjutnya, lakukan sentrifuge dan saring. Ukur volume filtrat yang diperoleh. Lakukan pengujian daya penghambatan terhadap pertumbuhan beberapa mikroba uji yang bersifat patogen.

d. Pengujian Daya HambatanPengujian daya hambatan yang umum dilakukan ialah cara difusi agar

dengan menggunakan medium GNA (Tabel 4). Cara pengujian daya hambat adalah sebagai berikut :- Siapkan suspensi mikroba uji dengan menggunakan larutan NaCl 0,9% dan

ukur serapannya pada panjang gelombang 580 nm hingga T=25%.- Lakukan sterilisasi pencadang- Tuang medium uji sebanyak 5-10 ml ke dalam petri, biarkan membeku- Inokulasikan 1 ml suspensi mikroba uji ke dalam petri tersebut, lalu

tuangkan 10 ml medium uji, homogenkan dan biarkan membeku (jangan biarkan terlalu beku)

- Tempatkan pencadang silinder pada permukaan medium uji, atur sedemikian rupa dan masukkan filtrat antibiotika ke dalam pencadang

- Bila menggunakan pencadang kertas (paper disk), celupkan pencadang tersebut ke dalam filtrat antibiotika yang diperoleh selama ± 15 menit

- Inkubasikan pada suhu yang sesuai selama 24-48 jam, lalu amati dan ukur zona hambatan yang terbentuk

- Dapat digunakan larutan antibiotika baku sebagai pembanding

Tabel 1. Komposisi Media Plate Count Agar (PCA)Komposisi Media JumlahPeptone 5,00 gYeast Extract 0,25 gDextrose 1,00 gAgar 15 gAquadest ad 1000 mlpH 7,0 ± 0,2

Tabel 2. Komposisi Media Maltosa Yeast Broth (MYB)Komposisi Media JumlahYeast Extract 3,0 gMalt Extract 3,0 gPeptone 5,0 gDextrose 10,0 gAquadest ad 1000 mlpH 7,0 ± 0,2

Tabel 3. Komposisi Media ProduksiKomposisi Media JumlahGlukosa 10,0 gPati terlarut 10,0 gTepung Kedelai 12,5 gExtract Beef 0,5 gExtract Yeast 0,5 gNaCl 2,0 gAir suling ad 1000 mlpH 7,0 ± 0,2

Tabel 4. Komposisi Media Glukosa Nutrien Agar (GNA)Komposisi Media JumlahGlukosa 10,0 gExtract Yeast 5,0 gPepton 10,0 gNaCl 2,5 gAgar 15,0 gAir suling ad 1000 mlpH 7,0 ± 0,2

LEMBAR KERJAPERCOBAAN I

ISOLASI MIKROBA DAN PRODUKSI ANTIBIOTIKA

I. Buatlah Skema Kerja Isolasi dan Produksi Antibiotika

II. Gambar Koloni yang memberikan zona hambatan

III. Tabel Diamater Zona Hambatan Filtrat Antibiotika

Sampel Diameter (mm)

Filtrat

Baku Pembanding

IV. Pembahasan dan Kesimpulan

PERCOBAAN IIPRODUKSI ENZIM AMILASE

Alat dan Bahana. Alat Alat sentrifus, Buret, Corong kaca, Erlenmeyer, Gelas ukur, Inkubator, Kertas

saring, Lampu spiritus, Laminary Air Flow (LAF), Ose, Otoklaf, Penangas air, pH meter, Tabung reaksi dan lain-lain.

b. Bahan Agar, Air suling, Asam sulfat 2 N, Aspergillus niger, Dekstrosa, Indikator

larutan kanji 1%, Kentang, Larutan baku Natrium tiosulfat 0,0005 N, Larutan NaCl 0,9%, Pereaksi iodida oksalat, Pereaksi Shaffer smogyi, Tepung beras.

Prosedura. Peremajaan dan Pembenihan Kultur

Sebanyak 1 ose dari kultur murni Aspergillus niger goreskan ke dalam medium PDA agar miring (Tabel 1). Inkubasi pada suhu 25°C selama 48 jam. Suspensikan koloni mikroba dengan larutan NaCl 0,9% steril dan pindahkan ke dalam 50 ml medium fermentasi (Tabel 2) sebagai starter. Inkubasi pada suhu kamar selama 24 jam sambil di shaker.

b. Produksi Enzim AmilaseSebanyak 10 ml medium starter masukkan ke dalam 100 ml medium

fermentasi produksi, lalu diinkubasi pada suhu kamar selama 3 hari sambil di shaker. Selanjutnya, dilakukan sentrifugasi dan masukkan filtrat ke dalam lemari es selama 24 jam lalu didekantasi. Filtrat yang diperoleh diukur volumenya dan uji aktivitasnya.

c. Pengujian Aktivitas EnzimSebanyak 5 ml enzim dimasukkan ke dalam tabung, lalu tambahkan 10 ml

pati 2% b/v dan atur pH hingga 4,5 kemudian inkubasi pada suhu 60°C selama 30 menit di dalam penangas air.

Pipet sebanyak 5 ml dan masukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 5 ml pereaksi Shaffer-smogyi dan kocok. Tutuplah tabung dengan corong dan panaskan di atas penangas air selama 15 menit lalu secara hati-hati angkat tabung dan dinginkan selama 4 menit. Kemudian dinding tabung tambahkan 2 ml iodida oksalat dan 3 ml Asam sulfat 2N. Isi tabung dikocok sampai endapan larut dan diamkan selama 5 menit di dalam pendingin. Selanjutnya, titrasi dengan larutan baku Natrium tiosulfat 0,005 N menggunakan indikator larutan kanji 1%. Lakukan titrasi blanko dengan perlakuan sama tanpa filtrat enzim.

c. Perhitungan Aktivitas Enzim

mg Dextrosa = N x (Vt blanko – Vt sampel) + 0,048

Aktivitas Enzim = mg dextrosa x fp x 1000 180 x V enzim x t inkubasi

Tabel 1. Komposisi Media Potato Dextrosa Agar (PDA)Komposisi Media JumlahKentang 200,0 gDextrosa 20,0 gAgar 15,0 gAir suling ad 1000 mlpH 7,0 ± 0,2

Tabel 2. Komposisi Media Fermentasi Enzim AmilaseKomposisi Media JumlahTepung beras 30,0 gAir suling Ad 1000 mlpH 5,0 ± 1,0

LEMBAR KERJAPERCOBAAN II

PRODUKSI ENZIM AMILASE

I. Buatlah Skema Kerja Produksi Enzim Amilase

II. Data Filtrat Enzim Amilase Volume Filtrat =

III. Perhitungan Aktivitas Enzim

IV. Pembahasan dan Kesimpulan

PERCOBAAN IIIPEMBUATAN YOGHURT DAN SOYGHURT

Alat dan Bahana. Alat Erlenmeyer, Dandang bertermometer, Kompor, Inkubator, Pengaduk, Botol,

dan lain-lain.b. Bahan Susu segar, Susu skim, Susu kedelai, Susu kacang hijau, Starter Lactobacillus

bulgaricus, Streptococcus thermophylus, Lactobacillus casei, Glukosa, Sukrosa, Yakult.

Prosedura. Yoghurt

Bahan : Susu segar1. Panaskan susu segar pada suhu ± 90°C di atas api kecil sehingga volumenya

menjadi 2/3-1/2 bagian. Lakukan pengadukan agar lebih cepat menguap.2. Sebelum penguapan dapat ditambahkan susu tepung (skim) dengan cara

menambahkan sedikit demi sedikit ke dalam air sambil diaduk, kemudian disaring, selanjutnya dididihkan pada suhu ± 90°C.

3. Selanjutnya dinginkan cairan susu sampai suhu mencapai 45°C, kemudian tambahkan 2-3% starter (biakan aktif) Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophylus dan aduk merata. Dapat juga diganti dengan sejumlah tertentu yoghurt jadi yang masih baru.

4. Campuran dimasukkan ke dalam wadah kecil steril, kemudian diinkubasi suhu 41-45°C selama 4-6 jam, yoghurt yang dihasilkan dengan keasaman 0,9% (jika ingin lebih asam waktu inkubasi dapat diperpanjang). Inkubasi pada suhu kamar dapat dilakukan, hanya waktu yang dibutuhkan lebih lama yaitu 12 jam.

5. Jika ingin memperoleh rasa yang enak, dapat ditambahkan pengaroma sesuai selera yang diinginkan.

6. Selanjutnya dinginkan pada suhu 2°C atau pasteurisasi pada suhu 65°C selama 30 menit, dengan tujuan agar mikroba tidak terus aktif.

Bahan : Susu skim1. Larutkan dengan menggunakan air matang campuran yang terdiri dari susu

skim 10%, glukosa 0,2% dan sukrosa 16,7%.2. Panaskan pada suhu 80°C selama 30 menit.

3. Selanjutnya dinginkan cairan susu sampai suhu mencapai 45°C, kemudian tambahkan 2-3% starter (biakan aktif) Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophylus dan aduk merata.

4. Diinkubasi suhu 41-45°C selama 4-6 jam, yoghurt yang dihasilkan dengan keasaman 0,9% (jika ingin lebih asam waktu inkubasi dapat diperpanjang). Inkubasi pada suhu kamar dapat dilakukan, hanya waktu yang dibutuhkan lebih lama yaitu 12 jam.

5. Jika ingin memperoleh rasa yang enak, dapat ditambahkan pengaroma sesuai selera yang diinginkan.

6. Selanjutnya disimpan dalam lemari pendingin.

b. Soyghurt1. Dibuat susu kedelai, dengan cara kedelai direndam terlebih dahulu di dalam

air selama 8 jam, dikupas kulitnya, dicuci dan direbus selama 10 menit.2. Selanjutnya, digiling dengan 800 ml air panas dan disaring dengan kain

kasa, tampung filtrat. Tambahkan 100 g sukrosa. Panaskan pada suhu 80°C selama 30 menit.

3. Selanjutnya, dinginkan susu kedelai sampai suhu mencapai 45°C, kemudian inokulasikan 2-3% kultur starter (biakan aktif) Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophylus dan aduk merata.

4. Diinkubasi suhu 45°C selama 6-8 jam, soyghurt yang dihasilkan dengan keasaman 0,9% (jika ingin lebih asam waktu inkubasi dapat diperpanjang). Inkubasi pada suhu kamar dapat dilakukan, hanya waktu yang dibutuhkan lebih lama yaitu 12 jam.

5. Jika ingin memperoleh rasa yang enak, dapat ditambahkan pengaroma sesuai selera yang diinginkan.

6. Selanjutnya dinginkan pada suhu 2°C, dengan tujuan agar mikroba tidak terus aktif.

LEMBAR KERJAPERCOBAAN III

PEMBUATAN YOGHURT DAN SOYGHURT

I. Buatlah Skema Kerja Pembuatan Yoghurt

II. Buatlah Skema Kerja Pembuatan Soyghurt

III. Pengamatan OrganoleptisA. Sebelum dilakukan penambahan starter bakteri 1. Yoghurt (bahan susu segar) - Konsistensi :

- Warna :- Bau :- Rasa :- pH :

2. Yoghurt (bahan susu skim)- Konsistensi :- Warna :- Bau :- Rasa :- pH :

3. Soyghurt- Konsistensi :- Warna :- Bau :- Rasa :- pH :

B. Sesudah dilakukan penambahan starter bakteri dan diinkubasi 1. Yoghurt (bahan susu segar) - Konsistensi :

- Warna :- Bau :- Rasa :- pH :

2. Yoghurt (bahan susu skim)- Konsistensi :- Warna :- Bau :- Rasa :- pH :

3. Soyghurt- Konsistensi :- Warna :- Bau :- Rasa :- pH :

IV. Pembahasan dan Kesimpulan