petunjuk praktikum mikrobiologi...
TRANSCRIPT
PETUNJUK PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI INDUSTRI
JURUSAN TEKNIK KIMIA
FAKULTAS TEKNIK
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
2017
2
TATA TERTIB PRAKTIKUM
A. PRAKTIKAN
1. Praktikan wajib membaca dan mematuhi segala ketentuan yang terkait dengan
pelaksanaan praktikum sebelum masuk ke laboratorium.
2. Sebelum praktikum, praktikan wajib mengikuti tes awal tertulis dengan asisten 10
menit sebelum praktikum dimulai. Pukul 12.50 – 13.00.
3. Pada akhir praktikum, masing-masing grup mengumpulkan Laporan Sementara
sesuai format ke koordinator asisten.
4. Pada saat di laboratorium, praktikan wajib mengenakan jas laboratorium, sarung
tangan, masker dan sepatu tertutup.
5. Praktikan wajib hadir maksimal 10 menit sebelum tes awal dimulai.
6. Laporan Praktikum.
• Laporan Akhir Praktikum dibuat oleh masing-masing praktikan sesuai dengan
Format Laporan Praktikum yang telah ditentukandan didasarkan pada data
Laporan Sementara yang wajib dilampirkan.
• Laporan Akhir Praktikumdikumpulkan 1 minggu setelah pengamatan terakhir
dilakukan dan dinilai oleh asisten paling lambat selama satu minggu.
a. Apabila terlambat satu hari, dikenakan sanksi pengurangan nilai laporan
sebesar 20%, dua hari 50%, 3 hari tanpa nilai.
b. Nilai asisten selama satu semester direkap oleh PLP dan diserahkan kepada
dosen penanggung jawab praktikum sesuai format dan menyerahkan softcopy-
nya dalam format excel.
7. Peminjaman dan pengembalian alat-alat praktikum dilakukan sesuai ketentuan
laboratorium.Apabila terjadi kerusakan alat atau bahan yang terbuang, wajib diganti
oleh praktikan dengan alat/bahan yang sama.
8. Sebelum meninggalkan laboratorium, praktikan harus membersihkan serta merapikan
meja kerja, alat-alat praktikum dan bahan praktikum.
9. Meninggalkan tempat praktikum harus seijin asisten (maksimal 1x15 menit).
10. Ketidakhadiran karena sakit harus menyerahkan surat keterangan dokter disertai detail
penyakitnya dan percobaannya dapat dilakukan di luar jadwal praktikum dengan
persetujuan dari dosen pembimbing.
11. Ketidakhadiran karena kegiatan akademik dan non-akademik, wajib menyerahkan
bukti dokumen resmi dan percobaannya dapat dilakukan di luar jadwal praktikum
dengan persetujuan dari dosen pembimbing.
3
12. Ketidakhadiran karena urusan keluarga, wajib menyerahkan surat keterangan yang sah
dan Kartu Keluarga.
13. Praktikan wajib melaksanakan seluruh modul praktikum.
B. ASISTEN
1. Asisten wajib mengikuti pelatihan asisten dan membaca serta mematuhi ketentuan tata
tertib laboratorium dan praktikum.
2. Asisten wajib memberikan tes awal. Asisten menyiapkan materi dan menilai hasil
dengan konsultasi intensif pada dosen penanggung jawab praktikum.
3. Asisten yang tidak hadir, tugas dan kewajibannya dapat digantikan oleh PLP dan atau
asisten yang lainnya.
• Ketidakhadiran karena sakit harus menyerahkan surat keterangan dokter disertai detail
penyakitnya.
• Ketidakhadiran karena kegiatan akademik dan non-akademik, wajib menyerahkan
bukti dokumen resmi.
• Ketidakhadiran karena urusan keluarga, wajib menyerahkan surat keterangan yang
sah dan Kartu Keluarga.
Ketidakhadiran lebih dari 20%tidak mendapatkan sertifikat asisten.
4. Selama pelaksanaan praktikum, asisten wajib memberikan pendampingan kepada
praktikan selama praktikum berlangsung. Asisten dilarang meninggalkan laboratorium
selama praktikum berlangsung tanpa alasan yang jelas.
5. Setelah praktikum selesai
a. Asisten memberikanapproval pada laporan sementara.
b. Asisten memeriksa peralatan yang telah digunakan praktikan.
c. Asisten merevisi dan menilai laporan akhir praktikan
d. Asisten mengumpulkan laporan akhir praktikan hasil revisi ke PLP
6. Asisten wajib mengisi nilai praktikum pada format yang ditentukandan
diserahkankepada PLP paling lambat 2 minggu setelah praktikan mengumpulkan
laporan akhir. Apabila melebihi batas waktu yang telah ditentukan, maka penilaian
akan diberi nilai 70.
4
C. DISTRIBUSI NILAI
No Komponen Penilaian (per Modul) Persentase (%)
1 Tes Awal 20
2 Praktikum 40
3 Laporan 40
TOTAL 100
5
Lampiran 1. Lembar Penilaian
LEMBAR PENILAIAN
PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI INDUSTRI
TAHUN AKADEMIK 2017/2018
Nama :
NIM :
Hari / Group :
No. Materi Percobaan
Nilai
TOTAL Tanda Tangan
Asisten Tes Awal Praktikum Laporan
Foto 3 X 4
6
Lampiran 2. Format Proposal Praktikum
1. Isi Proposal Praktikum: Cover, Judul, Tujuan, Dasar Teori, Bahan dan Alat, dan
Prosedur Kerja
2. Format Proposal Praktikum sesuai format Laporan Akhir
Lampiran 3. Format Laporan Sementara
1. Laporan Sementara ditulis menggunakan bolpoint warna biru
2. Laporan Sementara harus mendapatkan Acc dari asisten
LAPORAN SEMENTARA
PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI INDUSTRI
(TKK- 2108)
Hari/Tanggal Percobaan : ...............................................................
Judul Percobaan :
Group : ...............................................................
Nama Praktikan (NIM) : 1. ...........................................................
2. ...........................................................
Asisten : ................................................................
Acc Asisten
7
Lampiran 4. Format Laporan Akhir
1. Laporan Akhir Praktikum ditulis tangan pada folio bergaris menggunakan bolpoint
warna biru
2. Margin: kiri 3 cm, kanan 1 cm, atas-bawah menyesuaikan ukuran kertas folio.
3. Substansi laporan sesuai dengan pengarahan asisten.
A. Cover
LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI INDUSTRI
(TKK-2108)
Group / Hari : ..............................................................
Nama Praktikan (NIM) : 1. ...........................................................
2. ...........................................................
JURUSAN TEKNIK KIMIA
FAKULTAS TEKNIK
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2017
8
B. Isi
PERCOBAAN 1
JUDUL PERCOBAAN
Hari/Tanggal Percobaan : ...............................................................
Group : ...............................................................
Nama Praktikan (NIM) : ................................................................
Asisten : ................................................................
ABSTRAK Ditulis setelah praktikum
I. TUJUAN
II. DASAR TEORI
III. BAHAN DAN ALAT
IV. PROSEDUR KERJA
V. HASIL DAN PEMBAHASAN
VI. KESIMPULAN
VII. DAFTAR PUSTAKA
VIII. LAMPIRAN (hasil pengamatan, pustaka yang dikutip, dll)
Ditulis sebelum praktikum
Ditulis setelah praktikum
9
Ketentuan Isi Laporan
1. Abstrak
Ringkasan setidak-tidaknya mengungkapkan tujuan, metode, hasil dan kesimpulan.
2. Tujuan
Tuliskan tujuan praktikum sesuai dengan percobaan yang telah dilakukan.
3. Dasar Teori
Dasar teori menguraikan teori, temuan, dan bahan referensi lain yang dijadikan
landasan untuk melakukan suatu praktikum. Dasar teori dibawa untuk menyusun
kerangka atau konsep yang akan digunakan dalam praktikum yang mengacu pada
daftar pustaka. Kutipan maupun dasar teori yang digunakan wajib disertakan sumber
pustaka dengan menuliskan nama pengarang dan tahun, misalnya: “Molekul terikat
sangat lemah dan energi yang dilepaskan pada adsorpsi fisika relatif rendah sekitar 20
kJ/mol (Castellan, 1982).
4. Alat dan Bahan
a. Alat
Tuliskan semua alat yang digunakan (tulis spesifikasi, ukuran dan jumlah)
b. Bahan
Tuliskan semua bahan yang digunakan beserta spesifikasinya, misalnya
konsentrasi.
5. Prosedur Kerja
Buat dalam bentuk diagram alir secara singkat, jelas dan tidak berupa kalimat
panjang. Jika menggunakan kata kerja, gunakan bentuk kata kerja pasif.Diagram alir
dibuat dengan bagan-bagan yang mempunyai arus yang menggambarkan langkah atau
prosedur dalam percobaan yang dibuat secara sederhana, terurai, rapi dan jelas dengan
menggunakan simbol- simbol standar.
10
Bentuk simbol Keterangan
Simbol proses
Menyatakan suatu proses atau langkah yang dilakukan dengan
suatu alat atau instrument
Contoh: diekstrak, dipipet, penimbangan, pengadukan
Simbol keputusan
Menunjukkan suatu proses tertentu yang akan menghasilkan
dua kemungkinan.
Contoh: filtrasi menghasilkan filtrat atau endapan
Simbol keying operation
Menyatakan langkah yang diproses menggunakan instrument.
Contoh: diukur absorbansinya dengan spektometer UV-Vis
atau AAS, dianalisis dengan IR, HPLC, GC, dll.
Simbol manual input
Memasukkan data secara manual menggunakan suatu
software.
Contoh: Analisis data dengan excel, SPSS, minitab.
Flow Direction Symbols
Simbol arus (flow)
Menyatakan jalannya suatu proses atau langkah
Input/ Output Symbols
Simbol input/ output
Menyatakan proses input atau output tanpa tergantung jenis
peralatannya.
Simbol Dokumen
Mencetak keluaran atau hasil dalam bentuk dokumen
Contoh: absorbansi, kromatogram, spectra, dll.
11
Contoh Diagram Alir:
Standarisasi larutan AgNO3 0,1 N
Pada bab prosedur kerja, sertakan pula gambar rangkaian alat, berupa foto atau
gambar.
6. Hasil dan Pembahasan
a. Hasil Pengamatan
Tuliskan semua data setiap langkah yang dilakukan sesuai dengan hasil
percobaan.Data pengamatan dapat dibuat dalam bentuk tabel atau kalimat
sederhana.Data pengamatan dituliskan sesuai hasil pengamatan pada jurnal
praktikum. Penulisan data pengamatan yang baik akan memudahkan dalam
penyusunan analisis data, pembahasan dan kesimpulan.
b. Pembahasan
Menjelaskan semua langkah yang telah dilakukan(bukan berisi cara kerja), hasil
dan data yang telah dicapai, dan kesimpulan dari percobaan yang telah dilakukan.
Pembahasan ditulis sesuai dengan mengikuti kaidah penulisan kalimat yang baik,
87,75 mg NaCl
Dilarutkan dengan 25 ml
H2O
Ditambahkan 2 ml
indikator K2CrO4 0,1 M
Dititrasi dengan larutan
AgNO3 0,1 N
Endapan Kuning
(titik akhir titrasi)
Data Hasil Pengamatan
12
yang terdiri dari subyek, predikat, obyek, dan keterangan.Gunakan berbagai
sumber referensi sebagai pembanding.
7. Kesimpulan
Kesimpulan berisi jawaban sesuai tujuan percobaan yang ditulis dalam kalimat
sederhana.
8. Daftar Pustaka
Tuliskan semua referensi yang digunakan sesuai dengan ketentuan penulisan pustaka.
Tidak diperbolehkan mengambil pustaka dari blog.
Contoh penulisan daftar pustaka:
Castellan, Gillbert William. 1982. Physical Chemistry 3rd edition. Menlo Park, Calif.
Benjamin-Cummings.
Mitchel, W. J. 1995. City of Bits: Space, Place and the Infobahn. Cambridge:
MITPress. http://www.mitpress.mitpress.mit.edu:80/City of Bits/Pulling
Glass/ Index.html.(diakses 1 Agustus 2013).
9. Lampiran
Laporan harus dilampiri laporan sementara yang telah disetujui oleh asisten, pustaka
dan lampiran pendukung lainjika diperlukan.
10. Penulisan Tabel dan Gambar
Contoh penulisan tabel dan gambar adalah sebagai berikut:
Tabel 1.1 Sifat fisik dimethyl ether
Sifat Fisik Nilai
Titik didih, °C -25
Titik kritis, °C 239,43
Densitas, g/cm3 pada 20°C 0,67
Viskositas, kg/m.s pada 25°C 0,12-0,15
Specific gravity 1,59
Tekanan uap, MPa pada 25°C 0,61
Cetane number 55-60
Net Calorific Value, kcal/kg 6900
Sumber: Geankoplis, 2004
13
Gambar 3.1. Diagram skematik ebulliometer (Marshall dkk., 2004)
14
MODUL 1
PENGENALAN ALAT
Kompetensi: mahasiswa mengenal dan mengetahui fungsi dari tiap-tiap alat, prinsip
kerjanyaserta cara menggunakannya.
Berikut ini adalah beberapa alat-alat mikrobiologi yang perlu dikenal:
Alat-alat elektrik:
• Autoklaf
• Hot plate & stirrer
• Inkubator
• Biofermentor
• Mikroskop
• Shaker
• Jet Ejector
• Vortex
• Oven
Alat-alat gelas dan keramik:
• Cawan petri • Mortar & pestle • Filtering Flask
• Pipet ukur • Beaker glass • Corong Buchner
• Pipet tetes • Bunsen burner • Picnometer
• Tabung reaksi • Gelas ukur
• Labu erlenmeyer • Alkoholmeter
• Spreader • Hemositometer
Alat-alat nongelas
• Jarum inokulum / ose
• Rubber bulb/ bola hisap
• Syringe
Tugas :
1. Tuliskan fungsi dari setiap alat yang ada di list di atas!
NO NAMA ALAT FUNGSI
2. Jelaskan prinsip kerja alat autoklaf, inkubator, hot plate & stirrer!
3. Jelaskan cara menggunakan autoklaf, pipet ukur, rubber bulb, alkoholmeter dan gelas
ukur (termasuk cara membacanya)!
4. Jelaskan cara mencuci pipet ukur!
15
MODUL 2
FERMENTASI
Kompetensi: Mahasiswa dapat membuat alkohol dari berbagai sumber karbohidrat melalui
proses fermentasi dan dapatmenentukan konsentrasi alkohol yang dihasilkan
Dasar Teori:
Ada banyak produk hasil fermentasi yang dapat dijumpai, seperti keju, wine, dan
asam amino. Fermentasi merupakan proses dimana substrat dikonversi menjadi produk-
produk sebagai akibat dari pertumbuhan dan aktivitas metabolik mikroorganisme. Istilah
‘fermentasi’ (fermentation) berasal dari bahasa Latin fervere yang berarti mendidih, sehingga
mendeskripsikan adanya tindakan ragi (yeast) pada ekstrak buah atau biji-bijian yang
dicampur ragi (Stanbury dkk., 1995).Mendidih tersebut terjadi karena produksi gelembung-
gelembung karbon dioksida yang disebabkan oleh katabolisme anaerobik dari gula-gula yang
ada dalam ekstrak. Dalam biokimia, fermentasi diartikan sebagai sebuah proses yang
menghasilkan energi dengan katabolisme dari senyawa-senyawa organik, dimana senyawa-
senyawa organik bertindak sebagai donor elektron dan akseptor elektron terminal. Sedangkan
dalam mikrobiologi industrial, fermentasi memiliki arti yang jauh lebih luas.
Mikroorganisme yang bertanggung jawab pada proses fermentasi meliputi bakteri,
ragi (yeast), dan jamur (fungi). Pemilihan mikroorganisme biasanya didasarkan pada jenis
karbohidrat yang digunakan sebagai medium. Proses-proses fermentasi kadang-kadang
melibatkan satu komponen substrat (misalnya,susu) dan satu mikroorganisme (misalnya,
Lactococcus lactis), tetapi kadang-kadang bisa melibatkan sebuah campuran yang kompleks
dari substrat-substrat dan sejumlah mikroorganisme (Batt, 2016).
Berdasarkan substratnya, dikenal fermentasi karbohidrat dan fermentasi senyawa N
organik. Macam-macam fermentasi karbohidrat antara lain: fermentasi alkohol oleh ragi atau
bakteri, fermentasi asam laktat, fermentasi asam propionat, fermentasi asam butirat,
fermentasi asam campuran, dan fermentasi butanadiol (Hendrianie, 2001). Fermentasi
alkohol terutama dilakukan oleh ragi, khususnya Saccharomyces yang bersifat anaerob
fakultatif.Berbeda dengan ragi, bakteri pembentuk alkohol tumbuh lebih baik pada kondisi
anaerob, dimana lintasan glikolisisnya adalah EDP (Entner Doudoroff Pathway).Contohnya
adalah bakteri Zymomonas.Bakteri-bakteri tertentu, seperti Sarcina ventriculi dan Erwina
amylovora, seperti halnya ragi, melakukan lintasan HDP (heksosa difosfat) untuk
menguraikan glukosa.
Pada fermentasi alkohol, biakan (culture) Saccharomyces yeast starter digunakan
untuk menginisiasi fermentasi secepat mungkin. Berikut adalah reaksi fermentasi glukosa:
C6H12O6 → 2CH3CH2OH + 2CO2
Glukosa atau Fruktosa Etanol Karbon dioksida
Selama fermentasi, Saccharomyces mengkonversi gula menjadi alkohol dan karbon
dioksida seperti persamaan Gay–Lussac dimana 1 mol gula menghasilkan 2 mol etanol dan 2
mol karbon dioksida (Fugelsang dan Edwards, 2007). Fermentasi alkohol menghasilkan
hanya 2 molekul ATP/molekul glukosa.
16
Mikroorganisme Saccharomyces cereviseae mampu tumbuh dengan cepat dan
mempunyai toleransi terhadap konsentrasi gula yang tinggi, mampu menghasilkan alkohol
dalam jumlah yang banyak dan tahan terhadap alkohol tersebut (Simanjutak, 2009). Untuk
memperoleh hasil fermentasi yang optimum, persyaratan untuk pertumbuhan ragi harus
diperhatikan, yaitu:
• pH dan kadar karbohidrat dari substrat
• Temperatur selama fermentasi
• Kemurnian dari ragi itu sendiri
Temperatur dan pH optimum untuk pertumbuhan Saccharomyces cereviseae, berturut-turut
adalah 28–36°C dan 4,5–5,5 (Simanjutak, 2009). Alkohol yang diperoleh dari proses
fermentasi ini biasanya memiliki kadar 8 sampai 10 persen volume, sehingga untuk
memperoleh etanol yang berkadar 95 persen diperlukan proses lainnya, misalnya proses
distilasi.
Produksi alkohol dengan menggunakan ragi telah dilakukan pada skala besar selama
bertahun-tahun dan merupakan proses industrial pertama untuk produksi metanolit mikrobial
(Fugelsang dan Edwards, 2007). Produksi alkohol dari molase (tetes tebu) dengan
menggunakan ragi mulai banyak dikembangkan. Molase merupakan hasil samping dari
industri pengolahan gula yang masih mengandung gula cukup tinggi sehingga merupakan
bahan baku yang baik untuk fermentasi alkohol (Simanjutak, 2009).
Bahan dan Alat yang digunakan:
1. Molase
2. NPK, ZA
3. Gula pasir
4. Saccharomyces cerevisiae
5. Malam
6. Panci volume 3 liter, 1 buah
7. Wadah plastik 3 liter, 1 buah
8. Botol 1 liter
9. Beaker glass
10. Kain saring
11. Stopwatch
12. Selang
11. Akuades
12. Alkoholmeter
Prosedur Kerja:
1. Tuang 150 ml molase yang sudah disaring ke dalam beaker glass.
2. Larutkan gula 0,3 kg, NPK 0,64 gr dan 2,4 gr ZA dalam air secukupnya lalu tuang ke
beaker glass (no.1). Pindahkan larutan ke dalam panci. Tambahkan air sampai volumenya
mencapai 2 liter.
3. Panaskan selama 15 menit (dihitung mulai dari setengah mendidih). Setelah itu saring
dengan kain saring dan dinginkan dengan cara diangin-anginkan sampai suhu ruang
17
4. Masukkan ke dalam botol 1 liter yang sudah disterilisasi menggunakan air panas.
5. Tambahkan Saccharomyces cerevisiae sebanyak 3 ose.
6. Tutup dengan plastik dan dilapisi dengan malam.
7. Pasang selang keluaran CO2 yang dihubungkan dengan erlenmeyer berisi air.
8. Pasang selang untuk sampling.
9. Biarkan selama 2 minggu pada suhu ruangan.
Tugas :
Amati perubahan muncul tidaknya gelembung dan busa setiap hari selama satu minggu, serta
hitung kandungan alkohol dalam media pada minggu pertama dan kedua. Lalu berikan
komentar terhadap hasil yang diperoleh!
Daftar Pustaka :
Carl A. Batt. 2016. Microbiology of Fermentations. Elsevier.
Peter F. Stanbury, Allan Whitaker, Stephen J. Hall. 1995. Principles of fermentation
technology. Elsevier Science Ltd.
Nuniek Hendrianie, I. Tjondronegoro, Musfil A. S. 2001. Diktat Kuliah Mikrobiologi
Industri. Fakultas Teknologi Industri Institut Teknologi Sepuluh Nopember. Surabaya.
Kenneth C. Fugelsang, Charles G. Edwards. 2007. Wine microbioly. Second edition.Springer
Science+Business Media.
Riswan Simanjutak. 2009. Studi Pembuatan Etanol dari Limbah Gula (Molase).Skripsi.
Departemen Teknologi Pertanian Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara.
18
MODUL 3
MEDIA PERTUMBUHAN DAN STERILISASI
Kompetensi: - Mahasiswa dapat membuat media pertumbuhan Potato Dextrose Agar (PDA)
- Dapat melakukan sterilisasi menggunakan autoklaf.
Dasar Teori
1. Media Pertumbuhan
Media pertumbuhanadalah tempat untuk menumbuhkan mikroorganisme.
Mikroorganisme memerlukan nutrisi untuk memenuhi kebutuhan energi dan untuk bahan
pembangun sel, untuk sintesa protoplasma dan bagian-bagian sel lain. Setiap mikroba
mempunyai sifat fisiologi tertentu, sehingga memerlukan nutrisi tertentu pula. Selain untuk
menumbuhkan mikroorganisme, medium dapat digunakan untuk isolasi, pengujian sifat-sifat
fisiologi, dan perhitungan jumlah mikroorganisme.
Media tumbuh mikroorganisme adalah larutan berbentuk gel (semi-padat) atau cair
yang mengandung berbagai zat nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroorganisme.
Pada umumnya media mengandung sumber energi,unsur-unsur C, N, S, P, H, O, buffer,
mineral dan air. Kadangkala dalam media ditambahkan pula faktor pertumbuhan untuk
kultivasi mikroorganisme tertentu.Media cair disebut kaldu (broth), sedangkan yang semi-
padat disebut media agar, karena dipadatkan dengan 1,5–2,0% agar yang berasal dari
ganggang merah. Jenis polisakarida ini berguna sebagai bahan pemadat media karena :
1. Agar tidak dapat diuraikan oleh hampir semua jenis mikroorganisme
2. Agar tetap berbentuk padat pada kisaran suhu inkubasi yang luas (0–80oC)
3. Agar mencair pada titik didih air, tetapi tidak segera memadat pada suhu pendinginan
42oC. Hal ini memungkinkan pembuatan suspensi biakan mikroorganisme pada suhu
45oC untuk tujuan pengenceran biakan dan isolasi mikroorganisme
Media pertumbuhan dapat digolongkan menjadi 3 kategori, yaitu media kimiawi,
media kompleks, dan media hidup.
1. Media Kimiawi
Jenis media ini dibuat dari garam-garam anorganik dan senyawa organik sederhana
(misal glukosa dan asam amino murni) dengan komposisi dan konsentrasi tertentu.
Kelemahan jenis media ini adalah sangat mahal karena tersusun dari zat-zat kimia murni.
Selain itu, media kimiawi hanya dapat digunakan untuk menumbuhkan hanya beberapa
jenis mikroorganisme.
2. Media Kompleks
Media ini dibuat dari bahan-bahan alami, seperti ekstrak daging atau tumbuhan. Jenis
media ini banyak digunakan di laboratorium karena mudah membuatnya, tidak mahal,
dan dapat digunakan untuk pertumbuhan berbagai jenis mikroorganisme. Kelemahan dari
media kompleks adalah komposisi kimiawinya yang dapat bervariasi, yang dapat
mengubah karakteristik pertumbuhan mikroorganisme. Jenis media ini tidak dianjurkan
untuk digunakan dalam studi fisiologis mikroba.
19
3. Media Hidup
Mikroorganisme tertentu, seperti virus, hanya dapat tumbuh dan berkembang biak
dalam jaringan makhlu hidup. Contoh jenis media ini antara lain : embrio ayam atau
tikus, atau kultur jaringan.
Sebelum digunakan, media harus disterilkan terlebih dahulu untuk mencegah
kontaminasi oleh mikroorganisme yang tidak dikehendaki.
2. Sterilisasi
Sterilisasi dalam mikrobiologi merupakan suatu proses untuk mematikan semua
organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Steril merupakan syarat mutlak
keberhasilan kerja dalam laboratorium mikrobiologi. Teknik-teknik tertentu diperlukan agar
sterilisasi dapat dilakukan secara sempurna, dalam arti tidak ada mikroorganisme lain yang
mengkontaminasi media. Hal-hal yang dilakukan ketika pertama kalinya melakukan
pemindahan biakan bakteri secara aseptik, sesungguhnya hal itu telah menggunakan salah
satu cara sterilisasi, yaitu pembakaran. Prinsip dalam sterilisasi dapat dilakukan dengan 3
cara yaitu secara mekanik, fisik, dan kimiawi.
Bahan dan Alat yang digunakan:
1. Kentang
2. Akuades
3. Glukosa (Dekstrosa)
4. NPK
5. ZA
6. Agar
7. Beaker glass
8. Saringan
9. Petri dish
10. Kapas dan kasa
11. Kertas coklat
12. Autoklaf
13. Tabung reaksi
Prosedur Kerja:
Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)
1. Mengupas kentang dan mengirisnya kecil-kecil. Menimbang kentang sebanyak 250 gr.
2. Rebus kentang dalam 400 mL akuades sampai lunak (kira-kira 1 jam), kemudian diambil
ekstraknya sebanyak 250 mL dengan menyaring menggunakan saringan lalu ditampung di
beaker glass.
3. Timbang komponen media untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi
berikut:
- glukosa 3 gr
- NPK 0,08 gr
- ZA 0,3 gr
20
- agar 3,00 gr
4. Tambahkan keempat komponen media tersebut ke dalam ekstrak kentang dan panaskan.
Aduk hingga semua komponen larut.
5. Tuang media ke dalam petridish dan tabung reaksi kemudian ditutup dengan
menggunakan tutup yang terbuat dari kapas dan kasa. Lapisi tutup tersebut dengan
aluminium foil untuk mencegah terjadinya kontaminasi media setelah disterilisasi. Untuk
petridish, bungkus petridish dengan kertas coklat dan ikat
6. Media siap untuk disterilisasi menggunakan autoklaf.
7. Jika ingin membuat media agar miring maka setelah disterilisasi, media yang ada dalam
tabung reaksi dimiringkan dengan cara meletakkan tabung reaksi pada posisi miring.
Prosedur penggunaan autoklaf:
Bagian-bagian alat autoklaf:
1. Digital Display (Temperatur, Error)
2. Digital Display (Time, Exhaust Pattern)
3. Cycle Display (ST-BY,HEATG,STER.,EXHT.,WARM,COMP.)
4. Mode Display (LIQ,SOLID)
5. Mode Switch
21
6. Power ON/OFF Switch
7. Set Value Increase/Decrease Switches
8. SET/ENT Switch
9. NEXT Switch
10. START/STOP Switch
Cara Pengoperasian Autoklaf Hirayama:
1. Power On. Tekan POWER ON/OFF di bagian depan alat.
2. Menuangkan Air, Hirayama HVE-50 membutuhkan 2 Liter air.
3. Memuat Bahan. Tempatkan substansi yang akan disterilkan ke dalam chamber. Tekan
bagian depan-tengah tutupnya sampai magnet catch tertarik ke magnet. Sambil
menekan tutup, geser tuas open/close ke sisi LOCK.
4. Memilih Mode (Process).
Mode Aplikasi
1
LIQ
Sterilisasi medium agar (dihangatkan untuk pencegahan
koagulasi setelah sterilisasi).
2
LIQ
Sterilisasi cairan, seperti air, media, reagen, dan obat-obatan
cair, yang bertahan pada suhu tinggi, uap bertekanan tinggi.
3
SOLID
Sterilisasi alat dari kaca, logam keramik, atau karet yang tahan
terhadap suhu tinggi, uap tekanan tinggi dan penurunan tekanan
uap secara tiba-tiba selama proses pembuangan.
5. Mengubah Nilai Set.
a. Tekan tombol SET/ENT.
b. Tekan tombol NEXT untuk memilih item untuk mengubah.
c. Ubah nilai ditampilkan menggunakan tombol increase/decrese (↑,↓).
d. Tekan tombol SET/ENT.
• Untuk membatalkan perubahan pengaturan selama perubahan operasi, tekan
tombol MODE. Nilai-nilai yang berubah tidak akan disimpan dan peralatan akan
kembali ke keadaan standby.
6. Memulai Operasi. Tekan tombol START/STOP.
7. Membongkar. Pastikan bahwa pengukur tekanan dalam chamber tertera "0 MPa"
8. Setelah Operasi Komplit. Matikan tombol power setelah selesai operasi.
9. Membatalkan Operasi. Tekan tombol START / STOP.
Tugas:
1. Jelaskan fungsi masing-masing bahan dalam pembuatan media pertumbuhan Potato
Dextrose Agar (PDA)
2. Jelaskan kenapa media yang dimasukkan dalam tabung reaksi jika ingin digunakan
sebagai media pertumbuhan mikroorganisme harus dimiringkan
3. Jelaskan keuntungan dan kerugian menggunakan media yang diletakkan dalam tabung
reaksi dan petri dish
4. Sebutkan dan jelaskan jenis-jenis sterilisasi dan apa tujuan sterilisasi
5. Jelaskan prinsip kerja autoklaf
6. Mengapa sterilisasi dengan autoklaf menggunakan temperatur, tekanan tinggi dan waktu
yang singkat
22
Daftar Pustaka :
Nuniek Hendrianie, I. Tjondronegoro, Musfil A. S. 2001. Diktat Kuliah Mikrobiologi
Industri. Fakultas Teknologi Industri Institut Teknologi Sepuluh Nopember. Surabaya.
Petunjuk Praktikum M.K. Mikrobiologi Pertanian Prodi Agroteknologi (Agustus 2014-
Januari 2015), Laboratorium Biologi dan Bioteknologi Tanah, Fakultas Pertanian, UNS
23
MODUL 4
INOKULASI
Kompetensi: mahasiswa dapat melakukan penanaman mikroba secara aseptis
Dasar Teori
1. Inokulasi Bakteri
Penanaman mikroba/bakteri atau yang biasa disebut inokulasi adalah pekerjaan
memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian
yang sangat tinggi (Dwijeseputro, 1998).Inokulasi dimaksudkan untuk menumbuhkan,
meremajakan mikroba dan mendapatkan populasi mikroba yang murni.
Menjaga kondisi lingkungan tetap bersih dan steril dalam mikrobiologi sangat penting
untuk menghindari kontaminasi.Kontaminan di laboratorium dapat menyebabkan banyak
masalah dalam penelitian mikrobiologi.Maka, teknik aseptis dalam sangat penting untuk
dilakukan dalam penelitian yang menggunakan mikroorganisme. Dalam proses inokulasi,
teknik aseptis sangat penting untuk mencegah kontaminasi pada mikroba spesifik yang kita
kerjakan dan mencegah kontaminasi oleh ruangan dan personal dengan mikroba yang kita
kembangbiakkan. Kontaminan yang bereaksi dengan mikroba menyebabkan mikroba yang
ditumbuhkan tidak sesuai dengan yang dikehendaki.
Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik penanaman
bakteri (inokulasi) yaitu (Pelczar, 1986):
a. Menyiapkan ruangan
Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadaannya harus steril agar tidak
terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaan dalam laboratorium pembuatan
serum vaksin dan sebagainya/ inokulasi dapat dilakukan dalam kotak kaca
(encast).Udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui suatu jalan
agar terkena sinar ultraviolet.
b. Pemindahan dengan pipet
Cara ini dilakukan dalam penyelidikan untuk diambil 1 ml contoh yang akan diencerkan
oleh air sebanyak 99 ml murni.
c. Pemindahan dengan kawat inokulasi
Ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau nikel, ujungnya boleh lurus juga
boleh berupa kolongan yang diameternya 1-3 mm. Dalam melakukan penanaman
bakteri, kawat ini terlebih dahulu dipijarkan, sedangkan sisanya tungkai cukup
dilewatkan nyala api saja setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala
api.
2. Media
Ada beberapa media yang digunakan untuk inokulasi yaitu (Gupte, 1990):
a. Mixed culture : berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme
b. Plate culture : media padat dalam petridish
c. Slant culture : media padat dalam tabung reaksi
24
d. Stap culture : media padat dalam tabung reaksi, tetapi penanamannya dengan media
penusukan
e. Liquid culture : media cair dalam tabung reaksi
f. Shake culture : media cair dalam tabung reaksi yang penanamannya di kocok.
3. Teknik Inokulasi
Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni
mikroorganisme, yaitu (Winarni, 1997):
a. Metode Gores
Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi
memerlukan keterampilan-keterampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan
yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan ke
permukaan media agar nutrient cawan petri dengan jarum pindah (lup inoculum). Di
antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat
tumbuh menjadi koloni.Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat
bentuk lempeng.Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam
pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya
sama yaitu membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan.Ada
beberapa teknik dalam metode goresan, yaitu:
1) Goresan T
2) Goresan kuadrane
3) Goresan radiand
4) Goresan sinambung
b. Metode Tebar
Setetes inokulum diletakkan dalam sebuah medium agar nutrient dalam cawan petri dan
dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itu disebar dalam
medium betang yang sama dapat digunakan menginokulasikan pinggan kedua untuk
dapat menjamin penyebaran bakteri yang merata dengan baik. Pada beberapa pinggan
akan muncul koloni yang terpisah-pisah.
c. Metode Tuang
Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan
pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya
ditemukan satu sel dalam tabung.
d. Metode Tusuk
Metode tusuk yaitu dengan cara meneteskan atau menusukkan ujum jarum ose yang
didalamnya terdapat inokulum, kemudian dimasukkan ke dalam media.
Bahan dan Alat yang digunakan :
1. Media PDA yang dibuat pada modul pembuatan PDA
2. Alkohol 70%
3. Aspergillus Niger
4. Jarum Ose
5. Bunsen
6. Plastik 2 kg
7. Plastik wrap
25
Prosedur Kerja:
A. Teknik aseptis
1) Desinfeksi meja kerja
26
2) Memindahkan biakan secara aseptis
27
B. Non aseptis
Bekerja tidak menggunakan api.
1) Memindah biakan dari cawan
28
Setelah melakukan penanaman, media yang telah diinokulasi dengan bakteri di inkubasi
selama ± 2 hari.
Tugas:
Buatlah sampel untuk masing-masing kegiatan dimana satu sampel dilakukan dengan aseptis
sedangkan sampel yang lain tidak. Lalu laporkan hasil yang anda dapatkan dan beri
komentar.
Daftar Pustaka:
Dwijoseputro, D. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambaran: Malang.
Pelczar, M. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Erlangga: Jakarta.
Gupte, Satish. 1990. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Binarupa Aksara.
Winarni, D. 1997. Diktat Teknik Fermentasi. Program D3 Teknik Kimia FTI ITS: Surabaya.
29
MODUL 5
MENGHITUNG JUMLAH MIKROORGANISME
Kompetensi: Mahasiswa mempelajari dan mengetahui caramenghitung jumlah sel
mikroorganisme menggunakan dengan metode Total Count (Counting
Chamber) dan Cell Dry Weight
Dasar Teori :
1. Perhitungan Jumlah Sel
a. Metode Total Count(Counting Chamber)
Perhitungan jumlah sel mikroorganisme menggunakan dengan metode Total
Count (Counting Chamber) menggunakan hemositometer.Hemositometer adalah
metode perhitungan secara mikroskopis dengan ruang hitung yang terdiri dari 9 kotak
besar dengan luas 1 mm².Satu kotak besar di tengah, dibagimenjadi 25.Satu kotak
sedang dibagi lagimenjadi 16 kotak kecil.Dengan demikian satu kotak besar tersebut
berisi 400 kotakkecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm (Hansen, 2000). Sel
bakteri yang tersuspensi akanmemenuhi volum ruang hitung tersebut sehingga jumlah
bakteri per satuan volumedapat diketahui.
(a)
(b)
Gambar 5.1 (a) Alat Hemositometer (b) Ruang Hitung Hemositometer
30
Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer adalah
dapatmenghitung jumlah sel yang hidup maupun yang mati, tergantung dari pewarna
yangdigunakan. Pewarna Trypan blue dicampurkan kedalam larutan selmaka sel yang
hidup tidak akanberwarna dan sel yang mati akan berwarna biru.Kelebihan lainnya
adalah morfologi sel dapat diamati, dapat mengevaluasihomogenitas dan data
mendeteksi.
Menghitung jumlah sel per mL dan jumlah sel total (Corning cellgro, 2012):
(1)
(2)
(3)
Angka 104 pada rumus (1) didapatkan dari konversi volume ruang hitung ke satuan
per mL :
Volume ruang hitung = luas ruang hitung x tebal ruang hitung
= 1 mm2 x 0,1 mm
= 0,1 mm3→ 10-4 cm3
→ 10-4 mL
Menghitung sel hidup (Corning cellgro, 2012) :
(4)
b. Metode Cell Dry Weight
Cell Dry Wieght merupakan salah satu metode untuk mengamati pertumbuhan sel
mikroorganisme. Metode ini biasa digunakan untuk menghitung massa Filamentous
Bacteria dan jamur, karena perhitungan biasa kurang memuaskan. Perhitungan cawan
tidak dapat menghitung pertumbuhan massa filamen, sehingga metode ini cocok
untuk menghitung pertumbuhan sel organisme berfilamen (Tortora, 2010).
Metode ini menentukan berat total sel, baik yang hidup maupun mati, dalam
sampel kultur cairan. Metode ini relatif mudah dilakukan, yaitu dengan media cair
yang berisi pertumbuhan sel dikumpulkan dengan sentrifugal, dibersihkan,
dikeringkan dalam oven, dan dihitung. Metode ini cukup memakan waktu dan sangat
tidak sensitif karena berat bakteri sangat kecil dan memerlukan sentrifugasi dalam
mengumpulkan jumlah yang cukup (Willey dkk., 2008).
Hasil perhitungan metode ini dinyatakan dalam miligram sel per kultur.
Keakuratan perhitungan metode ini bergantung dengan cara pengumpulan jumlah
bakteri yang cukup untuk hasil penimbangan yang akurat (Waites, 2001).
31
2. Metode Pengenceran
Metode pengenceran dapat dilihat pada Gambar 3.2. Pengenceran 10x pada tabung
reaksi dilakukan dengan cara mengambil 1 ml larutan sel dari erlenmeyer dan dimasukkan ke
dalam 9 ml pengencer tabung reaksi kemudian mengocoknya hingga homogen. Melakukan
langkah yang sama untuk tabung reaksi selanjutnya, sehingga diperoleh pengenceran
sebanyak 100 kali pada tabung reaksi kedua, 1.000 kali pada tabung reaksi ketiga, dan
seterusnya.
Sampel sel yang
akan dihitung1 ml
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
9 ml
pengencer
1/10
(10-1)
Total
pengenceran1/100
(10-2)
1/103
(10-3)
1/104
(104)1/105
(105)1/106
(106)dan seterusnya
Gambar 5.2 Metode Pengenceran
Bahan dan Alat yang digunakan:
1. Sampel (suspensi Saccharomyces cerevisiae)
2. Pewarna (Methylene Blue 0,1%)
3. Aquadest steril
4. Alkohol 70%
5. Mikroskop
6. Hemositometer
7. Cover glass
8. Pipet tetes
9. Pipet ukur (1 ml dan 10 ml)
10. Tabung reaksi
11. Rak tabung reaksi
12. Erlenmeyer 250 ml
13. Tissue lensa
14. Kertas saring
15. Pompa vakum
16. Neraca analitik
17. Vortex
18. Filtering Flask
19. Corong Buchner
32
Prosedur Kerja:
a. Total Count
1. Menyiapkan sampel (suspensi Saccharomyces cerevisiae)
2. Menyiapkan tabung reaksi yang berisi 9 ml akuades steril
3. Mengambil 1 ml suspensi Saccharomyces cerevisiaedan memasukan ke dalam tabung
reaksi yang telah berisi akuades (2). Mengaduk larutan dalam tabung reaksi dengan
menggunakan vortex
4. Mengambil suspensi dengan menggunakan pipet tetes dan meneteskan suspensi
sampai tidak terbentuk gelembung (sekitar 2 tetes) pada permukaan counting
chamber yang sebelumnya sudah tertutup dengan deck glass.
5. Mengamati suspensi larutan di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x.
6. Menentukan letak kotak pada hemositometer yang akan di amati.
7. Menghitung jumlah mikroorganisme yang tampak.
8. Melakukan pengenceran jika sel belum menyebar. (Pengenceran10x – 1.000.000x).
Adapun metode pengenceran dapat dilihat pada Gambar 3.2.
9. Jika pada pengenceran ke–nmikroorganisme sudah bisa terhitung, mengulangi
pengamatan dan perhitungan untuk pengencerann tersebut dengan penambahan 1 ml
Methylene Blue. (Larutan pengamatan disiapkan dengan cara mengambil suspensi
dari pengenceran sebelumnya n-1 sebanyak 1 ml dan menambahkan ke dalam
tabung reaksi yang telah berisi 8 ml akuades steril, kemudian menambahkan 1 ml
Methylene Blue ke dalam tabung reaksi tersebut).
10. Amati dan hitung mikroorganisme yang hidup dan yang mati.
b. Cell’s Dry Weight
1. Menimbang kertas saring kosong, kemudian mencatat massanya.
2. Mengeringkan kertas saring kosong di dalam oven selama 10 menit pada temperatur
110°C.
3. Segera memasukkan kertas saring berisi sampel tersebut ke desikator dan
mendiamkan selama 10 menit.
4. Menimbang massa kertas saring kosong kering, kemudian mencatat massanya.
5. Mengambil 100 ml sampel (suspensi Saccharomyces cerevisiae) yang telah
dipersiapkan sebelumnya.
6. Menyaring sampel (suspensi Saccharomyces cerevisiae) menggunakan pompa vakum.
7. Mengeringkan kertas saring yang berisi sampel di dalam oven selama 20 menit pada
temperatur 110°C.
8. Segera memasukkan kertas saring berisi sampel tersebut ke desikator dan
mendiamkan selama 10 menit.
9. Menimbang kertas saring berisi sampel (7), kemudian mencatat massanya.
10. Mengulangi pengeringan dan penimbangan hingga diperoleh 3 kali berat konstan.
Tugas :
1. Hitung jumlah sel mikroorganisme menggunakan metode Total Count dan Cell Dry
Weight!
2. Bandingkan hasil perhitungan kedua metode tersebut!
33
Daftar Pustaka :
Corning cellgro. 2012. Mediatech, Inc., a Corning Subsidiary, U.S.A
P.J.Hansen. 2000. Use of a Hemacytometer. Dept of Animal Sciences, University of Florida
Tortora, Gerard J., Funke, Berdel R., Case, Christine L. 2010. Microbiology: An Introduction
10th edition. Pearson Education. USA.
Waites, Michael J., Morgan, Neil L., Rockey, John S., Higton, Gary. 2001. Industrial
Microbiology: An Introduction. Blackwell Science Ltd. UK.
Willey, Joanne M., Sherwood, Linda M., Woolverton, Christopher J., 2008. Prescott, Harley,
and Klein’s Microbiology 7th Edition. McGraw-Hill Companies Inc. New York. USA.
34
MODUL 6
IMOBILISASI SEL
Kompetensi: - Mahasiswa dapat mengetahui cara imobilisasi sel
- Mahasiswa mengetahui fungsi dari imobilisasi sel
Dasar Teori:
1. Immobilisasi
Sel imobilisasi adalah suatu sel yang secara fisik terlokalisasi/terjerat pada suatu
daerah tertentu. Sel tersebut tetap mempunyai aktivitasnya sebagai biokatalisator/katalis,
serta sel tersebut dapat dipergunakan secara terus menerus dan sangat penting untuk proses
berkesinambungan.
Sel terimobilisasi adalah suatu sel yang dilekatkan pada suatu bahan inert dan tidak
larut dalam bahan tersebut, misal dalam sodium alginat atau kalsium alginat.Dengan sistem
ini, sel dapat lebih tahan terhadap perubahan kondisi seperti pH, juga temperatur. Sistem ini
juga membantu sel berada di tempat tertentu selama berlangsungnya reaksi sehingga
memudahkan proses pemisahan dan memungkinkan untuk dipakai lagi di reaksi lain (Sumo,
1993).
Immobilisasi sel mikroba dibedakan atas 3 macam yaitu,
1. Sel mati: untuk reaksi konversi sederhana (1 tahap)
2. Sel hidup: untuk reaksi konversi yang melibatkan biokatalis heterogen (multi
enzim)/memerlukan ATP atau biokoenzim seperti NADP atau koenzim A.
3. Sel dalam fase pertumbuhan: keadaan dimana terdapat aktivitas sel untuk pertumbuhan.
Imobilisasi dapat dilakukan terhadap sel maupun terhadap enzim. Imobilisasi enzim
dapat dianggap sebagai metode yang merubah enzim dari bentuk larut dalam air “bergerak”
menjadi keadaan “tak begerak” yang tidak larut. Imobilisasi mencegah difusi enzim ke dalam
campuran reaksi dan mempermudah memperoleh kembali enzim tersebut dari aliran produk
dengan teknik pemisahan padat/cair yang sederhana. Imobilisasi dapat dilakukan dengan
berbagai cara, antara lain melalui pengikatan kimiawi molekul enzim pada bahan pendukung,
pengikatan silang intermolekuler sesama enzim, atau dengan cara menjebak enzim di dalam
gel atau membran polimer (Palmer, 1991).
Imobilisasi sel berkembang setelah imobilisasi enzim.Dalam teknologi imobilisasi
enzim terdapat hambatan pada regenerasi koenzim dan keterbatasan metode yang dapat
diterapkan untuk menyusun molekul enzim dalam rangkaian tertentu, sehingga dapat
melakukan tahapan reaksi katalitis enzim yang berkesinambungan.Untuk mencegah
hambatan tersebut dilakukan penelitian-penelitian, sehingga terjadi pengembangan pada
imobilisasi sel, yang dapat digunakan sebagai biokatalis.Hal ini memungkinkan untuk
melakukan imobilisasi seluruh sel dan menjaga sel tetap hidup (viabel).Dalam prakteknya,
metode yang digunakan adalah menjebak sel dalam gel dengan metode adsorpsi.Selain itu,
pengontrolan perlu dilakukan untuk mencegah inaktivasi dari aktivitas metabolisme yang
35
penting, sehingga pemisahan biokatalis dari produk lebih mudah dan membuat biokatalis
lebih stabil (Sumo, 1993).
Dewasa ini, teknologi immobilisasi memegang peranan penting dalam perkembangan
proses biokimia dalam suatu boreaktor. Sel yang mengalami immobilisasi (immoblized
microbial cells) telah banyak diterapkan dalam fermentasi misalnya produksi alkohol, asam
amino, antibiotik atau pada degradasi polutan limbah cair.
2. Kelebihan Sel Immobilisasi
Kelebihan penggunaan sel immobilisasi dibandingkan dengan sel bebas antara lain
sebagai berikut:
1. Immobilasi menyediakan konsentrasi sel yang tinggi.
2. Immobilisasi memungkinkan penggunaan sel kembali dan mengurangi biaya recovery
sel dan recyclesel.
3. Immobilisasi mengurangi masalah wash out sel pada laju alir yang tinggi.
4. Kombinasi konsentrasi sel yang tinggi dan laju alir yang tinggi (tanpa batasan wash out)
menghasilkan produktivitas volumetric yang tinggi.
5. Immobilisasi menyediakan kondisi micro environmental yang menguntungkan seperti
kontak antar sel, gradient nutrient-produk, gradient pH untuk sel sehingga menghasilkan
kinerja biokatalis yang lebih baik (kecepatan pembentukan dan yield produk yang lebih
tinggi).
6. Immobilisasi menyebabkan kestabilan genetik.
7. Immobilisasi menyediakan perlindungan terhadap kerusakan sel.
3. Kekurangan Sel Immobilisasi
Kekurangan penggunaan sel terimobilisasi adalah hambatan pada proses difusi baik
substrat maupun produk yang terbentuk. Untuk sel yang hidup, pertumbuhan dan evaluasi gas
sering merusak matriks pendukung sel terimmobilisasi.
4. Jenis-Jenis Immobilisasi sel
Secara umum, ada dua jenis sel immobilisasi yakni:
a. Immobilisasi Aktif
Immobilisasi ini dilakukan dengan dua metoda yaitu metoda penjeratan dan metoda
pengikatan.Metoda penjeratan dilakukan secara fisik dalam matriks pendukung.Matriks
pendukung yang bisa digunakan yaitu polimer porous (agar, alginate, carragenan,
polyacrylamide, chitosan, gelatin, collagen), porous metal screen, polyurethane, silicagel,
polystyrene, dan selulosa triacetate.Polymeric beads harus cukup porous untuk keluar
masuknya substrat dan produk. Polymeric beads biasanya dibentuk dengan
menggunakan sel hidup di dalamnya.
b. Immobilisasi Pasif
Berbentuk biological films yang berbentuk lapisan-lapisan koloni sel yang tumbuh dan
melekat pada permukaan pendukung yang padat.Material pendukung dapat bersifat inert
atau aktif secara biologis.Biological films digunakan pada pengolahan limbah atau
fermentasi mikroba dengan jamur.
5. Metode Immobilisasi
Beberapa ahli menggolongkan metode imobilisasi dengan tiga kelompok, yaitu:
metode carrier binding, metode cross linking, dan metode entrapping (Sa’id, 1987). Pada
metode carrier binding, enzim diikatkan pada suatu matriks yang bersifat tidak larut adalam
36
air.Sebagai matriks dapat digunakan bahan organik maupun anorganik.Bila menggunakan
metode ini, hal yang perlu diperhatikan adalah pemilihan matriks dan pengikatan enzim pada
matriks tersebut. Teknik pengikatan enzim pada matriks dapat dilakukan berdasarkan
adsorpsi fisik, gaya elektrostatik atau ikatan kovalen (Chibata, 1978).
Metode crosslinking didasarkan pada pembentukan ikatan intermolekuler antara
molekul-molekul enzim.Gugus fungsional dalam molekul enzim yang biasa digunakan untuk
pembentukan ikatan intermolekmuler adalah gugus amino pada asam amino terminal, gugus
amino dari lisin, gugus fenolik dari tirosin, gugus sulhidril dari sistein dan gugus imidazole
dari histidin.
Pada metode entrapping, imobilisasi enzim/sel didasarkan pada penempatan enzim di
dalam kisi dari suatu polimer atau di dalam membran yang bersifat semi permiabel. Bila
enzim ditempatkan dalam kisi, maka metode yang digolongkan adalah jenis kisi, sedang bila
ditempatkan dalam membran yang bersifat semipermiabel, maka metodenya digolongkan ke
dalam jenis mikrokapsul (Chibata, 1978). Selain itu metode imobilisasi dapat digolongkan
sebagai berikut:
➢ Adsorpsi
➢ Penjeratan dalam matriks polimer
➢ Penjeratan dalam membran
Teknik imobilisasi yang paling baik adalah yang memenuhi kriteria utama tidak
terjadi perubahan konformasi enzim dan tidak mengganggu gugus fungsi di pusat aktif enzim
sehingga enzim tetap dapat berfungsi. Metode penjebakan enzim lebih banyak digunakan
karena enzim ada dalam keadaan bebas dan tidak terikat pada bahan pendukung sehinga
secara relatif fungsi katalitik dan struktur alami molekul enzim tidak mengalami gangguan
goncangan (Wirahadikusumah, 1988).
6. Penjerat Atau Pembawa Immobilisasi Sel
Karakteristik yang harus dimiliki oleh penjerat/pembawa immobilisai sel antara lain,
1. Mudah digunakan serta ukuran dan porositas media penjerat dapat dikontrol, terutama
pada skala industri.
2. Media penjerat berbentuk matrik stabil pada kondisi fermentasi (temperatur dan pH
optimum).
3. Harga murah dan mudah didapat.
4. Mempunyai sifat mekanik yang stabil, sehingga dapat tahan dalam waktu yanglama
dalam reaktor yang digunakan.
5. Penjerat harus inert terhadap mikrorganisme yang akan dijerat.
6. Substrat, produk, dan metabolisme lain harus dapat berdifusi secara bebas dengan media
penjerat.
G. Natrium alginat
Natrium alginat merupakan bahan yang digunakan sebagai penjerat sel, spesifikasi
sebagai berikut,
1. Alginat merupakan koloid ganggang (fikokoloid) yang dapat diekstrak dari ganggang
coklat (phasophyceae), terutama anggota laminariates, berbentuk asam alginat atau
natrium alginat.
2. Asam alginat adalah suatu getah selaput membran (membrane mucilage).
37
3. Garam alginat dapat larut dalam air, seperti natrium alginate, potassium alginate, dan
ammonium alginate, sedikit larut dalam air, sedang kalsium alginat tidak larut dalam air.
4. Umumnya alginat berbentuk serbuk putih kekuningan dan kadang-kadang dalam bentuk
pasta yang merupakan senyawa organik kompleks dengan selulosa atau polisakarida.
Senyawa alginat dapat dimurnikan sebgai garam natrium alginat dengan alginat atau
garam alginat yang lain.
Berikut adalah karakteristik natrium alginat:
1. Berbentuk serbuk berwarna putih atau kekuningan, tidak berbau, dan tidan berasa. Secara
umum susut pengeringan tidak lebih dari 22 %.
2. Larut lambat dalam air membentuk larutan koloid yang kental, berwarna putih pucat
sampai coklat kekuningan. Tidak larut dalam alkohol, kloroform dan eter,serta larutan air
yang mengandung lebih besar dari 30 % alkohol. Variasi mutu natrium algianat
ditentukan oleh variasi viskositas, antara 20-400 cp dari larutan 1% pada suhu 20oC.
3. Larutan alginat stabil pada pH 4 sampai 10.
4. Natrium alginat harus disimpan dalam wadah yang terlindung dari cahaya, bentuk larutan
tidak boleh disimpan pada wadah logam.
5. Alginat sebagai polisakarida hidrofilik menyerap uap air dari udara.
Bahan dan Alat yang digunakan:
1. Sodium alginate
2. Saccharomyces cerevisiae
3. Calcium chloride
4. NPK
5. ZA
6. Molase
7. Akuades
8. Beaker glass
9. Saringan
10. Suntikan (syringe)
11. Gelas ukur
12. Kaca arloji
13. Spatula
14. Erlenmeyer
Prosedur Kerja:
Bagian I: Cara Membuat Imobilisasi Sel.
1. Timbang 0,5 gr sodium alginate dan masukkan ke dalam 12,5 ml akuades. Aduk hingga
rata.
2. Tambahkan3 ose Saccharomyces cerevisiaeke dalam 12,5 ml akuades, aduk hingga rata.
3. Timbang 0,75gr calcium chloride dan tambahkan calcium chlorideke dalam 50 ml
akuades.
4. Tambahkan larutan Saccharomyces cerevisiae ke dalam larutan sodium alginate.Aduk
hingga rata.
38
5. Ambil larutan (4) sebanyak 20 ml dengan menggunakan syringe dan teteskan ke dalam
larutan calcium chloride sehingga terbentuk pelet yang mengandung Saccharomyces
cerevisiae.
6. Biarkan pelet di dalam larutan calcium chloride selama 5 menit hingga pelet mengeras.
7. Pisahkan pelet dari larutan calcium chloride dengan cara disaring dan bilas pelet dengan
akuades.
Bagian II :Uji Hasil Fermentasi Menggunakan Free Cell dan Imobilize Cell
1. Ukur 21 ml molase dan encerkan hingga volumenya 260 ml dengan akuades.
2. Tambahkan NPK 1,44 gr dan 5,4 gr ZA dalam air secukupnya (40 mL akuades).
3. Campurkan larutan no 1 dan no 2 hingga homogen.
4. Panaskan selama 15 menit (dihitung mulai dari setengah mendidih). Kemudian
didinginkan dengan cara diangin-anginkan sampai suhu ruang.Tuang ke dalam 2
erlenmeyer (masing-masing ± 150 ml).
5. Tambahkan 3 oseSaccharomyces cerevisiaeke dalam 10 mL aquades. Aduk hingga
homogen.
6. Masukkan free cell (5) ke dalam 150 mL larutan (4).
7. Masukkan imobilize cell(bagian I) ke dalam 150 mL larutan (4) lainnya.
8. Biarkan selama satu hari pada suhu ruangan. Selama fermentasi, fermentor dihubungkan
dengan erlenmeyer yang berisi air agar tidak ada udara luar yang masuk ke fermentor.
Tugas :
Ukur konsentrasi alkohol untuk kedua sampel. Bandingkan dan beri komentar terhadap hasil
pengamatan.
Daftar Pustaka:
Chibata, I., 1978. Immobilized Enzymes.Research and Development. Tokyo: Kodansha Ltd.
Palmer T., 1991, Understanding Enzymes. New York: Ellis Horwood.
Sumo, U.F., Sumantri, B., Subono, A., 1990.Prinsip Bioteknologi. Jakarta: Gramedia.
Wirahadikusumah M., Teknik Amobilisasi Enzim Dalam Bidang Pengobatan, ActaPharm
Indon. 13 (1988) 32-42.
39
MODUL 7
DAYA KERJA ANTIMKROBA DAN OLIGODINAMIK
Kompetensi: Mahasiswa mengetahui cara kerja pengujian oligodinamik dan zat antimikroba.
Dasar Teori :
Pertumbuhan yaitu penambahan secara teratur semua komponen sel suatu jasad. Pada
organisme bersel satu pertumbuhan lebih diartikan sebagai pertumbuhan koloni, yaitu
pertambahan jumlah koloni, ukuran koloni yang semakin besar atau subtansi atau masssa
mikroba dalam koloni tersebut semakin banyak, pertumbuhan pada mikroba diartikan sebagai
pertambahan jumlah sel mikroba itu sendiri. Perubahan lingkungan dapat mempengaruhi
pertumbuhan dan aktivitas dari mikroba. Faktor abiotik merupakan salah satu faktor yang
mempengaruhi pertumbuhan mikroba (Sumarsih, 2003).
Logam berat pada kadar rendah dapat bersifat racun (toxis) terhadap mikroba. Daya
hambat atau bunuh mikroba pada konsentrasi/ kadar rendah logam berat dinamakan daya
oligodinamik. Logam-logam tersebut adalah timbal (Pb), tembaga (Cu), kadmium, merkuri,
dan lain-lain. Logam-logam tersebut akan mendenaturasi protein pada dengan mengikat
kelompok reaktif menyebabkan pengendapan dan nonaktif. Pada logam perak, mikroba akan
nonaktif karena ada pengikatan pada bagian kelompok sulfhydryl membentuk silver sulfides
(Shrestha, 2009).
Umumnya, ion logam menghancurkan atau melewati membran sel dan ikatan
kelompok SH pada enzim seluler. Penurunan kritis akibat aktivitas enzimatik menyebabkan
metabolisme mikro-organisme berubah dan menghambat pertumbuhan mereka, hingga terjadi
kematian sel. Ion logam juga mengkatalisis produksi radikal oksigen yang mengoksidasi
struktur molekul bakteri. Pembentukan oksigen aktif terjadi menurut reaksi kimia:
Mekanisme tersebut tidak memerlukan kontak langsung antara agen antimikroba dan
bakteri, karena oksigen aktif yang dihasilkan berdifusi dari serat ke lingkungan sekitarnya.
ion perak dapat menyebabkan denaturasi protein dan sel mati karena reaksi mereka dengan
residu asam amino nukleofilik dalam protein, dan melekat pada sulfhidril, amino, imidazol,
fosfat dan gugus karboksil dari membran atau enzim protein (Bobbarala, 2012).
Zat antimikroba adalah senyawa yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan
mikroorganisme. Zat antimikroba dapat bersifat membunuh mikroorganisme (microbicidal)
atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme (microbiostatic). Desinfektan yaitu suatu
senyawa kimia yang dapat menekan pertumbuhan mikroorganisme pada permukaan benda
mati seperti meja, lantai dan pisau bedah. Adapun antiseptik adalah senyawa kimia yang
digunakan untuk menekan pertumbuhan mikroorganisme pada jaringan tubuh, misalnya kulit.
Efisiensi dan efektivitas desinfektan dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu:
1. Konsentrasi
2. Waktu terpapar
3. Jenis mikroba
4. Kondisi lingkungan: temperatur, pH dan jenis tempat hidup
40
Bahan dan Alat yang digunakan:
1. Bacillus sp
2. Kertas Cakram
3. Alkohol 70%
4. Lysol 5%
5. Betadin
6. Hipoklorit 5%
7. Pinset
8. Inkubator
9. Koin tembaga
10. Koin seng
Prosedur Kerja:
Bagian I: Pengujian zat desinfektan dengan kertas cakram.
1. Inokulasikan Bacillus sp pada NA(Nutrient Agar)/media dipetridish & ratakan dengan
menggunakan kaca spreader.
2. Kertas cakram steril dicelupkan ke dalam larutan desinfektan (alkohol 70%, Lysol 5%,
betadin, dan hipoklorit 5%). Setelah diangkat, sisa tetes larutan yang berlebihan pada
kertas cakram diulaskan pada dinding wadah karena dikhawatirkan larutan akan meluas
di permukaan agar jika larutan terlalu banyak.
3. Kertas cakram diletakkan dipermukaan agar dengan pinset. Tekan secara perlahan
dengan pinset supaya kertas cakram benar-benar menempel pada agar. (Jangan merusak
media NA).
4. Kertas cakram yang sudah menempel pada NA, jangan digeser-geser.
5. Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC
Bagian II: Pengujian pengaruh daya oligodinamik
1. Inokulasikan Bacillus sp pada NA dipetridish & ratakan dengan menggunakan kaca
spreader.
2. Letakkan koin tembaga dan seng ke dalam cawan dengan pinset.
3. Koin tembaga & seng yang sudah menemel pada NA, jangan digeser-geser.
4. Inkubasi 37oC selama 48 jam
Tugas :
Bagian 1: Ukur diameter zona hambat yang terbentuk, bandingkan dengan daya kerja
berbagai desinfektan
Bagian 2: Hitung zona hambat yang terbentuk dengan mengukur diamater daerah yang
jernih atau tidak ada pertumbuhan.
Daftar Pustaka :
Bobbarala, Varaprasad. 2012. A search for Antibacterial Agents. InTech. Croatia
Shrestha, R., Joshi, Dev Raj., Gopali, J., Piya, S., 2009. Oligodynamic Action of Silver,
Copper, and Brass on Enteric Bacteria Isolated from Water of Kathmandu Valley.
Nepal Journal of Science and Technology
Sumarsih, Sri. 2003. Diktat Kuliah Mikrobiologi Dasar.UPN Veteran. Yogyakarta