PERHITUNGAN MIKROBA

A.PENGANTARBeberapa cara dapat dilakukan untuk menentukan jumlah mikroba yang ada dalam bahan pemeriksaan,tergantung dari bahan dan jenis mikroba yang ditentukan.jenis populasi mikroba pada tanah,air,bahan makanan,minuman,air susu dan lain sebagainya etrgantung ada susunan bahan tersebut.pada umumnya ada 3 caraperhitungan jmlah mikroba,yakni perhitungan jumlah sel,perhitungan masa sel secara langsug dan perhitungan masa sel secara tidak langsung.

B.TEKNIK DAN METODE PERHITUNGAN MIKROBA1.Perhitungan Jumlah sel:Pengukuran kuantitatif mikroba sangat di perlukan dalam berbagai penelaahan mikrobiologi.Pada umumnya pengukuran dasar populasi mikroba dengan penentuan jumlah sel dan penentuan massa sel.Pengukuran jumlah sel biasanya dilakukan untuk mikroba bersel tunggal sedangkan penentuan masa sel dapat dilakukan tidak hanya pada mikroba ber sel satu tetapi juga untuk mikroba berfilamen (misalnya jamur).

Ada beberapa cara mengukur jumlah sel,antara lain dengan hitungan mikroskopik langsung,hitunganhitungan cawan,dan MPN.Cara lain untuk menentukan jumlah sel dengan menyaring sampel dengan saringan membran.Saringan tersebut kemudian di inkubasikan pada permukaan medium yang sesuai.Mikroba yang tertahan pada permukaan saringan menyerap nutrien dari medium dan menghasilkan koloni yang berasal dari satu sel tunggal yang masih hidup.

A.HITUNGAN MIKROSKOPIK LANGSUNGPerhitungan jumlah mikroba secara langsung dapat untuk menentukan julah mikroba keseluruhan, baik yang mati maupun yang hidup.Cara ini secara keseluruhan menggunakan chounting chamber.Alat atau metode dapat menggunakan Petroff-Hausser,haemacytometer,bacteria counter,colony counter,atau alat-alat sejenis.Dasar perhitunganya adalah dengan cara menempatkan 1 tetes suspensi bahan atau biakan mikroba pada alat tersebut.Kemudian ditutup dengan kaca penutup lalu diamati dengan mikroskop.Dengan menentukan jumlah sel rata-rata setiap petak (ruangan) yang telah di ketahui volumenya dari alat tersebut dapat ditentukan jumlah sel.

Ada beberapa cara menghitung mikroskopik secara langsung,yakni:METODE PETROF-HAUSSERMetode ini digunakan untuk menghitung mikroba dalam satuan isi yang sangat kecil.Metode ini juga menggunakan kaca objek khusus yang bergaris berbentuk bujur sangkar.Jumlah cairan yang terdapat antara kaca objek dan kaca penutup mempunyai volume tertentu,sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu.Dalam metode ini,hitungan mikroskopik dilakukan dengan pertolongan kotak-kotak skala,dimana dalam luas ukuran skala seluas 1mm terdapat 25 bah kotak besar dengan luas 0,04mm,dan setiap kotak terdiri dari 16 kotak kecil.Tinggi sampel yang terletak antara kaca benda dan kaca panutup adalah 0,02mm.Jumlah sel dalam beberapa kotak besar dapat dihitung, kemudian dihitung jumlah sel rata-rata dalam kotak besar.Hitungan mikroskopik merupakan hitungan yang cepat dan murah ,tetapi mempunyai kelemahan sebagai berikut:*Sel-sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang hidup.karena itu keduanya terhitung.*Sel-sel yang berukuran kecil sukar untuk dilihat dibawah mikroskop,sehingga kalau tidak teliti maka tidak terhitung*Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup tinggi.Hal ini di sebabkan dalam setiap bidang pandang yang diamati harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung.*Tidak dapat di gunakan untuk menghitung sel mikroba didalam bahan yang banyak mengandungdebris atau ektrak makanan,karena hal tersebut akan mengganggu dalam perhitungan sel.METODE BREEDHitungan miroskopik dalam metode breed sering diunakan untuk menganalisis susu yang mengandung bakteri dalam jumlah tinggi.Metode breed memliki kelemahan yakni tidak dapat dilakukan terhadap susu yang dipasteurisasi karena secara mikroskopik tidak dapat dibedakan antara sel-sel bakteri yang masih hidup atau yang sudah mati kaarena perlakuan pasteurisasi.Dalam metode breed, luas areal pandang miroskop yang akan di gunakan harus dihitung terlebih dahul.hal ini dapat dilakukan dengan cara mengukur diameter areal pandang menggunakan mikrometer yang dapat dilihat melalui lensa minyak emersi.Mikrometer yan digunakan adalah mikrometer gelas.Ojek yang memepunyai sekala terkecil 0,01mm.Areal pandang mikroskop biasanya mempunyai ukuran 14-16 skala atau 0,14-1,16mm.Tetapi beberapa mikroskop mempunyai ukuran diameter areal pandang lebih dari 0,18mm.B.METODE HITUNGAN CAWAN

Metode hitungan cawan didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi suatu koloni.Jumlah koloni yang muncul pada cawan merupakan suatu indeks jumlah mikroba yang hidup terkandung dalam sampel.Hal yang erlu diuasai dalam hal ini adalah teknik pengenceran.setelah di inkubasi,jumlah koloni masing-masing cawan diamati.Untuk memenuhi persyaratan statistik,cawan yang dipilih untuk dihitung mengandung 30-300 koloni.untuk memenuhi persyaratan tersebut harus melakkan sederetan pengenceran dan pencawanan.Jumlah mikroba dalam sampel ditentukan ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan.Prinsip dari etode hitungan cawan adalah bila sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium, maka mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung, dan kemudian dihitung tanpa mengguakan mikroskop.Metode ini merupakan metode yang sangat sensitif dalam menentukan jumlah mikroba,dengan alasan:*Hanya sel mikroba yang hidup yang dapat dihitung*Beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus*Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba,karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari mikrobe yang mempunyai penempakan spesifik.Selain keuntungan tersebut,metode diatas juga mempunyai kelemahan,yaitu:*Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya,karena beberapa sel yang berdekatan mungkin memebentuk koloni*Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda munkin menghasilkan jumlah yang berbeda pula.*Mikroba yang di tumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk kolni yang komplek,jelas,tidak menyebar.*Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi yang relatif lamaDalam metode hitungan cawan,bahan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel mikroba per ml atau per gr atau per cm (jika pengambilan sampel dilakukan pada permukaan),memerlukan perlakuan pegenceram sebelumnya ditumbuhkan pada medium agar dicawan petri.setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung,dimana jumlah yang terbaik antara 30-300 koloni.pengenceran biasanya dilakukan secara desimal ,yaitu 1:10,1:100,1:1000,dan seterusnya.Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat berupa larutan buffer fosfat,0,85% NaCl atau larutan ringer.Metode hitungan cawan dibedakan atas dua cara,yakni metode cawan tuang dan metode cawan gores.METODE CAWAN GORES

Metoda ini mempunyai dua keuntungan, yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan ketrampilan yang memadai yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metoda cawan gores yang dilaksanakan dengan baik akan menyebabkan terisolasinya mikroba seperti yang diinginkan. Namun, ada dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan terutama bagi yang baru melakukan pekerjaan adalah:

• tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik-baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroba menjadi kurang lanjut.

• cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel-sel yang digoreskan.

METODE CAWAN TUANGCara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran

mikroba ialah dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar yang telah disterilkan dan dicairkan kemudian didinginkan 50°C yang kemudian dituang ke cawan. Karena kadar sel-sel mikroba di dalam spesimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang- kurangnya satu di antara cawan-cawan tersebut mengandung koloni-koloni terpisah di atas permukaan ataupun di dalam agar. Metoda ini memboroskan bahan dan waktu, namun tidak memerlukan ketrampilan yang terlalu tinggi.

C.METODE MPN(Most Probable Number)Metode hitungan cawan menggunakan medium padat tetapipada metode MPN dengan mengunakan medium cair didalam tabung reaksi.Perhitungan MPN berdasarkan jumlah tabung reaksi yng positif, yakni yang telah ditumbuhi mikroba setelah diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu.Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas didalam tabung kecil (tabung durham) yang diletakkan pada posisi terbalik,yaitu untuk jasad renik yang membentuk gas.Untuk setiap pengenceran pada umumnya dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung.Lebihbanyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi,tetapi tabung reaksi yang di gunakan juga banyak.

Dalam metode MPN pengenceran sampel harus lebih tinggi dari pengenceran pada hitungan cawan,sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung 1 jasad renik,beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari satu sel,sedangkan tabung yang lain tidak mengandung sel sama sekali.Dengan demikian setelah diinkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung yang dinyatakan sebagai tabung positif edangkan tabung yang lainya negatif. Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah mikroba didalam sampel yang berbentuk cair,meskipun dapat juga dipakai dalam sampel berbentuk padat dengan lebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari sampel tersebut.Kelompok jasad renik yang dapat di hitumg dengan metode MPN juga bervariasi tergantung dari medium yang digunakan untuk pertumbuhan.

2.PERHITUNGAN MASA SEL SECARA LANGSUNGMetode hitungan cawan bukan metode pilihan yang terbaik bila kita

akan memeriksa sejumlah besar biakan,karena memakan waktu dan

memerlukan medium serta peralatan kaca yang tidak sedikit.Untuk kasus yang demikian disarankan memakai metode yang lebih cepat dan raktis,yaki pengukuran kekeruhan biakan dengan spektrofotometer atau nefelometer. Dasar teknik perhitungan ini adalah banyaknya cahaya yang diabsorpsi sebanding dengan banyaknya sel mikroba pada batas-batas tertentu.

Cara lain perhitungan massa sel dengan cara mengukur berat kering sel atau filamen miselium sampel dalam suatu volume tertentu.Dalam penentuanya,sampel mula-mula disetrifugasi atau disaring lalu dicuci,dikeringkan dan beratnya ditimbang.Perhitungan pehitungan masa sel secara langsung maupun tidak langsungjarang digunakan untuk menguji mikroba dalam bahan,tetapi juga sering digunakan untuk mengukur pertumbuhan sel dalam proses fermentasi.Dalam perhitungan masa sel secara langsung, jumlah mikroorganisme dapat dihitung jika medium pertumbuhanya tidak mengganggu pengukuran.

Metode Volumetrik dan Gravimetrik,pengukuran volume,dan berat sel dilakukan terlebih dahulu dengan menyaring mikroba tersebut.Oleh karena itu,bila tempat substrat tubuhnya banyak mengandung padatan,misal bahan angan,sel mikroba tidak dapat diukur dengan menggunakan metode volumetrik.Perhitungan masa sel secara tidak langsung sering digunakan dalam mengamati pertumbuhan sel selama proses fermentasi,dimana komponen substrat atau bahan yang difermentasi dapat diamati dan diukur.

Data yang diperoeh dari pengukuran spektrofotometer dinyatakan dalam konsantrasi mikroba,diperlukan suatu kurva standar yang menyatakan korelasi antara kekeruhan biakan dengan jumlah organisme per ml biakan.Kurva dapat diperoleh dengan menggunakan metode hitungan cawan untuk menentukan jumlah organisme didalam suatu biakan yang kekeruhanya diketahui.Setelah kurva standar diperoleh, maka sejumlah besar biakan organisme sejenis dengan cepat diukur kekeruhan dan konsentrasinya segera diketahui dengan membaca kurva tersebut.

Sumber cahaya spektrofotometer memancarkan seberkas cahaya putih melalui dua buah lensa dan celah masuk kesuatu sisi difaksi.Cahaya tersebut kemudian menyebarkan cahaya menjadi berkas horizontal dengan semua warna spektrum,dari gelombang pendek (gelombang ungu) sampai gelombang panjang (inframerah).Spektrum cahaya jatuh pada secarik layar gelap yang dilengkapi dengan celah keluar.Hanya bagian spektrum yang kebetulan jatuh pada celah tersebut memasuki sampel dan akan menjadi berkas cahaya monokromatik.Panjang gelombang yang akan masuk melalui celah tersebut dapat diatur dengan menyesuaikan arah kisi difraksi melalui pemutaran tombol pengatur panjang gelombang pada alat tersebut.

Sumber cahaya kemdian mengenai sel-sel mikroba dalam suspensi sampel akan dihamburkan,sedang cahaya yang diterskan setelah melewati sampel akan mengaktivasi foto tabung.Selanjutnya akan mencatat persen transmitas (%T) pada galvano meter.makin sedikit jumlah sel didalam suspensi,makin besar intensitas cahaya yang lolos,dan makin tinggi pula persen transmitas yang tercatat.jumlah cahaya yang ditransmisikan berbanding terbalik dengan jumlah mikroba dan jumlah cahaya yang diabsorpsi.Julah cahaya diabsorpsi tergantung pada bentuk dan besar sel.