PENGARUH PENAMBAHAN CaClENZIM PROTEASE DARI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PENAMBAHAN CaCl 2 TERHADAP PRODUKSI ENZIM PROTEASE DARI Bacillus licheniformis HSA3

HERLINA KANDOLLA’ H 311 07 030

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2013

TERHADAP PRODUKSI Bacillus licheniformis HSA3-1a

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PENGARUH PENAMBAHAN CaClENZIM PROTEASE DARI

Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat

PENAMBAHAN CaCl 2 TERHADAP PRODUKSI ENZIM PROTEASE DARI Bacillus licheniformis HSA3

Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat

untuk memperoleh gelar sarjana sains

Oleh

HERLINA KANDOLLA’

H311 07 030

MAKASSAR

2013

TERHADAP PRODUKSI Bacillus licheniformis HSA3-1a

SKRIPSI

PENGARUH PENAMBAHAN CaCl 2 TERHADAP PRODUKSI ENZIM PROTEASE DARI Bacillus licheniformis HSA3-1a

Disusun dan diajukan oleh

HERLINA KANDOLLA’

H311 07 030

Skripsi ini telah diperiksa dan disetujui oleh:

Pembimbing Utama Dr. Hj. Hasnah Natsir M.Si NIP. 19620320 198711 2 001

Pembimbing Pertama Dr.Maming, M.Si NIP. 19570228 198703 1 001

Ketika Kegagalan menjadi suatu keberhasilan, ketika air

mata berganti menjadi senyum yang paling indah, ketika

semua usaha menghasilkan buah yang baik, ketika

mimpi itu berada di genggamanku, disaat itulah aku

menyadari bahwa semua yang ada sudah digariskan oleh

DIA YANG MAHA PENGASIH

I LOVE YOU JESUS

Kupersembahakan karya kecil ini kepada. Ayah dan ibu

tercinta serta saudara-saudaraku

PRAKATA

Segala puji, syukur, hormat, dan kemuliaan yang tiada terbatas hanya

kepada Tuhan Yesus Kristus atas segala anugrah dan penyertaanNya sehingga

penulis dapat menyelesaikan tugas akhir ini dengan baik seturut dengan

kehendakNya. Terima kasih Tuhan, Engkau membuktikan semuanya menjadi

indah pada waktunya. Skripsi yang berjudul “Pengaruh Penambahan CaCl2

Terhadap Produksi Enzim Protease dari Bacillus licheniformis HSA3-1a” ini

disusun sebagai salah satu syarat untuk menyelesaikan program strata satu (S1)

pada Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Hasanuddin.

Ungkapan terima kasih yang mendalam dan penuh ketulusan sebagai bakti

dan hormat penulis persembahkan kepada kedua orang tua tercinta, ayahanda M.B

Saruran dan ibunda Hermin Saalino, S.P atas cinta kasih yang tulus, doa dan

dukungan yang tiada henti dalam segala aspek kehidupan penulis, serta kesabaran

membimbing penulis khususnya dalam menuntut ilmu. Terima kasih kepada

saudaraku kak Emma, kak Lilis, kak Gusti, kak Ikka, Salling, Ade dan Aldi

yang juga senantiasa memberikan doa dan semangat sebagai bentuk rasa cinta

kasih kepada penulis, serta ponakan ku tercinta Aurel, Tisha, Kamaya dan

Kinawa yang menjadi sumber semangat saat melihat wajahnya.

Keberhasilan penulis sampai pada tahap penulisan skripsi ini tidak lepas

dari bantuan, baik materil maupun spiritual dari lingkunagn penulis. Karena itu

penulis menghaturkan terima kasih kepada :

1. Dr. Hj. Hasnah Natsir, M. Si dan Dr. Maming, M.Si selaku pembimbing

yang telah meluangkan banyak waktunya untuk membimbing penulis dengan

segala kemampuan dan pemikiran dari awal rencana penelitian hingga

terselesaikannya skripsi ini dan juga kepada Alm. Prof. Noor Jalaluddin

yang selama hidupnya, Beliau selalu menjadi tempat menumpahkan keluh

kesah penulis, meskipun pada akhirnya beliau tidak dapat menemani hingga

saat ini, namun dalam hati penulis, Beliau akan tetap menjadi sosok ayah

terbaik di kampus merah ini.

2. Prof. Hanapi Usman, MS. Dr. H.Syarifuddin Liong , M. Si, dan Dr.

Muhammad Zakir, M.Si. selaku dosen penguji yang telah meluangkan

waktunya untuk memberi saran yang berharga.

3. Dr. Firdaus Zenta, MS selaku ketua Jurusan Kimia dan Dr.Hj.Seniawti

Dali M.Si selaku sekretaris beserta seluruh dosen Jurusan Kimia, FMIPA,

Unhas yang telah membagikan ilmu dan pengalamannya kepada penulis.

Seluruh staff karyawan dan analis laboratorium terutama kepada Kak Fibi, ,

Pak Idris , Pak Ikbal, Kak Linda secara khusus kepada Kak Anti yang

telah mengarahkan dan membantu penulis dalam menyelesaikan penelitian

ini.

5. Keluarga Besar Universitas Islam Negeri - SAMATA yang telah menerima

penulis dalam menyelesaikan penelitian secara khusus buat Kak Fitri selaku

analis di Lab. Biokimia UIN-Samata yang selalu menemani dan membantu

serta menjadi penyemangat penulis.

6. Keluarga Besar Mahasiswa Kimia angkatan 2006, 2008, 2009, 2010 dan

2011 terima kasih untuk kebersamaan dan tawa serta canda yang kalian

berikan, terkhusus buat Adriani yang tak pernah mengenal lelah menemani

penulis saat melakukan penelitian di UIN-Samata Gowa dan Unhy yang

selalu setia menemani dan membuat penulis tetap tersenyum meskipun

sedang menghadapi masalah… thanks sist… I love u

7. My inspiration n teman-teman terbaikku “ cherzs” kimia angkatan 2007,

Charmi, Bia, Uki’ , Muce’, Tenri, Fahmi, Kiki, Evi, Nita, Risal, Dian,

Justin, Irwan, Tanti, Avril, Leang, Muli , Agnes, Norma, Nita, Isa, Ria

Armas, Ame’, Nila, Mia, suri, Riri’, Nurhayati, Isa , Novi, Irma, Adiman.

Terima kasih telah hadir menemani baik dalam susah maupun senang.

You all are my closer friends….Don’t stop fighting until the end!!!

8. Teman-teman penelitian di Lab. Biokim :Unhy, Adriani, Evo, Nani, Irwan,

Nano’, Fitri, Devi, Nia, Evi, K’ Edar, dan K’ amman k terima kasih untuk

pengertian, segala bentuk bantuan, dan kebersamaan dalam mengerjakan

penelitian, serta memberikan hiburan dalam menghadapi masa-masa sulit

selama penelitian. Thank’s a lot friends!!!!

9. My second family Korps Pencinta Alam Universitas Hasanuddin

(KORPALA UNHAS) kakak-kakak dan teman-teman semua terkhusus

saudaraku, DDXXII , Jalal, Nanank, Rhani, Kasma, Cummink, Baso’,

Fadli, dan Ucam terima kasih karena telah hadir mengisi hari-hari penulis.

Sungguh suatu kebahagian ketika bercanda diantara barisan pinus lembanna,

belajar mengartikan kehidupan, menikmati dinginnya embun pagi, dan

belajar bekerja sama di bawah atap Mabes KORPALA tercinta.

Thank’s for everything…SURVIVE WITH KORPALA…

10. Teman-teman TWEXO , Andi, Oland, Suri’, Rio, Noris, Nova, Vin, Sinta

yang selalu menyemangati penulis serta memberikan dukungan selama ini

dan juga teman-teman Pandu Alam Lingkungan (PAL) Fadli, Kia, Natan,

Takke, Daud, Ana, Karla, Indra, Rian, Fajar, pokoknya semua yang

sudah menjadi teman penulis, yang sudah menjadi penyemangat dan

membuat penulis tersenyum disaat menghadapi masalah. Selamanya kalian

akan menjadi sahabat sejatiku.

Penulis sepenuhnya menyadari akan segala kekurangan dalam penulisan

skripsi ini. Oleh karenanya, penulis berharap adanya kritik dan saran yang

membangun untuk lebih menyempurnakan skripsi ini. Akhirnya, penulis berharap

skripsi ini dapat bermanfaat kepada siapapun yang membutuhkan.

Makassar, Februari 2012

Penulis

viii

ABSTRAK

protease merupakan enzim yang dapat menghidrolisis protein menjadi monomer asam amino. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan waktu produksi, konsentrasi CaCl2 suhu dan pH optimum serta pengaruh kofaktor terhadap aktivitas enzim protease dari B. licheniformis HSA3-1a. Aktivitas enzim protease diuji dengan metode Walter yang telah dimodifikasi. Waktu produksi optimum protease adalah selama 60 jam dengan nilai aktivitas 0,0561 Unit/mL pada konsentrasi CaCl2 0,015%, kadar protein 2,0165 mg/mL. Aktivitas pH optimum enzim protease adalah pH 7 dengan nilai aktivitas 0,0104 U/mL. Sedangkan suhu optimum aktivitas enzim protease adalah 50oC sebesar 0,012 U/mL, serta stabil pada penambahan CaCl2 pada konsentrasi 0,015 M dengan nilai aktivitas relatif 100%.

Kata kunci: Protease; Enzim; Aktivitas enzim; B. licheniformis

ix

ABSTRACT

Protease is an enzyme that can hydrolyze proteins to be amino acid monomers. This study aims to determine the production time of production, the concentration of CaCl2 optimum temperature and pH, as well as the influence of cofactors for enzyme activation protease of B. licheniformis HSA3-1a. Protease enzyme actitested was tested by Walther Method that have been modified. Protease optimum production time is over 60 hours of activation values 0,0561 U/mL at the CaCl2 concentration 0,015%, the level of protein 2,0165 mg/mL. The activity pH optimum enzyme protease 7,0 with activity value 0,0104 U/mL. While the optimum temperature of the enzyme activation protease is at 50oC for 0,012 U/mL, and stable to the addition of CaCl2 at the concentration of 0,015M with a value of 100% relative activation.

Key word : Protease; enzyme; enzyme activity; B. licheniformis

x

DAFTAR ISI

halaman

ABSTRAK ………………………………………………………………

ABSTRACT ………………………………………………………………

DAFTAR ISI ……………………………………………………………

DAFTAR TABEL …………………………………………….…………

DAFTAR GAMBAR …………………………………………………………

DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………..

DAFTAR SIMBOL DAN SINGKATAN ……………………………….

BAB I PENDAHULUAN ...........................................................................

1.1 Latar Belakang ................................................................................

1.2 Rumusan Masalah ...........................................................................

1.3 Maksud dan Tujuan Penelitian ........................................................

1.3.1 Maksud Penelitian ................................................................

1.3.2 Tujuan Penelitian ................................................................

1.4 Manfaat Penelitian ..........................................................................

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................

2.1 Uraian Umum Tentang Bakteri……………………………

2.1.1 Pertumbuhan Bakteri........................................................

2.1.2 Pengaruh Beberapa Unsur terhadap Pertumbuhan Bakteri

2.1.3 Mikroorganisme Penghasil Protease..................................

2.1.4 Bacillus licheniformis.........................................................

2.2 Uraian Umum Tentang Enzim…………………………….

viii

ix

x

xiii

xiv

xv

xvivi

1

1

2

3

3

3

3

5

5

5

7

9

10

11

xi

2.2.1 Penggolongan Enzim…………………………………….

2.2.2 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim……..

2.3 Enzim Protease......................................................................

2.3.1 Mekanisme Kerja Enzim Protease......................................

2.3.2 Aplikasi Enzim Protease………………………………….

BAB III METODE PENELITIAN ................................................................

3.1 Bahan Penelitian .............................................................................

3.2 Alat Penelitian ..................................................................................

3.3 Metode Penelitian ...........................................................................

3.3.1 Pembuatan Medium Padat ...........................................................

3.3.2 Pembuatan Media Inokulum…………………………….

3.3.3 Pembuatan Media Produksi .........................................................

3.3.4 Peremajaan Mikroba Isolat Bacillus licheniformis

HSA3-1a………………………………………………….

3.3.5 Penyiapan Inokulum...........................................................

3.3.6 Penentuan Konsentrasi Optimun CaCl2 serta Waktu

Produksi Optimum Enzim..................................................

3.3.7 Produksi Enzim Protease Ekstraseluler..............................................................

3.3.8 Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Lowry...........

3.3.9 Uji Aktivitas Protease.........................................................

3.3.10 Penentuan pH Optimum………………………………….

3.3.11 Penentuan Suhu Optimum ................................................

3.3.12 Penentuan Pengaruh Senyawa Kofaktor terhadap

Aktivitas Enzim…………………………………………..

13

14

17

18

20

22

22

22

23

23

23

23

24

24

24

25

25

26

27

27

27

xii

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN..........................................

4.1 Penentuan Konsentrasi Optimum CaCl2 serta Waktu

Optimum Produksi Enzim Protease ..................................

4.2 Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Lowry.............

4.3 Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Protease dari B.

licheniforemis HSA3-1a...................................................

4.4 Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Protease dari B.

licheniformis HSA3-1a......................................................

4.5 Pengaruh Senyawa Kofaktor terhadap Aktivitas Enzim

Protease dari B. licheniformis HSA3-1a..................

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................

5.1 Kesimpulan ......................................................................................

5.2 Saran ................................................................................................

DAFTAR PUSTAKA..................................................................................

LAMPIRAN ................................................................................................

28

28

31

33

34

36

38

38

38

39

43

xiii

DAFTAR TABEL

Tabel halaman

1. Fungsi fisiologis umum dari setiap unsur dalam sel bakteri, ................ 8

2. Mikroorganisme penghasil protease.......................................................

3. Aplikasi protease dari berbagai sumber...................................................

4. Data hasil penentuan konsentrasi optimum CaCl2 dan waktu optimum produksi enzim protease dari Bacillus lcheniformis HSA3-1a................

9

21

28

5. Data pengukuran kadar protein protease pada panjang gelombang 670 nm............................................................................................................

32

xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar halaman

1. Kurva pertumbuhan mikroba………........................................................ 6

2. Bentuk sel dari bakteri B. licheniformis HSA3-1a………………………… 10

3. Teori Kunci gembok dan teori kecocokan induksi ………………........ 12

4. Kalsium (Ca) .......................................................................................... 5. Struktur Enzim Protease...........................................................................

16 17

6. Mekanisme pembentukan senyawa antara asilenzim…………………

7. Mekanisme reaksi protease aspartat pada reaksi pemutusan ikatan

peptida…………………………………………………………………

8. Penentuan konsentrasi optimum CaCl2 serta waktu produksi optimum enzim protease dari B. licheniformis HAS3-1a......................................

18 19 30

9. Kadar protein protease dari B. licheniformis HSA3-1a selama waktu fermentasi...............................................................................................

32

10. pH Optimum Enzim Protease dari B.s licheniformis HSA3-1a 1a pada [S] = 2,0%; suhu 50ºC ………………………………………………..

33

11. Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease dari B. licheniformis HSA3-1a pada [S] = 2,0%; pH 7............................................................

12. Pengaruh senyawa kofaktor terhadap aktivitas protease dari B. licheniformis HSA3-1a pada [S] = 2,0%; pH 7; suhu 50ºC.......................................

35 37

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran halaman

1. Skema Isolasi Protease dari B. licheniformis HSA3-1a.......................... 43

2. Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry …………………… 44

3. Skema Pengujian Aktivitas Enzim Protease ……………………….....

4. Peremajaan Bakteri B. licheniformis HSA3-1a dengan penambahan CaCl2.......................................................................................................

5. Peremajaan Bakteri B. licheniformis HAS3-1a tanpa penambahan CaCl2.....................................................................................................

45

46 46

6. Penentuan Zona Hidrolisi B. licheniformis HAS3-1a............................

7. Penyiapan Medium Produksi Enzim Protease dari B. licheniformis HSA3-1a ................................................................................................

8. Kurva standar Bovin Serum Albumin pada λ 670 nm........................... 9. Data pengukuran Kadar Protein dari Enzim Protease...........................

10. Data Penentuan pH Optimum Enzim Protease dari B. licheniformis HSA3-1a.................................................................................................

11. Data pengukuran aktivitas protease dari B. licheniformis HSA3-1a terhadap pengaruh suhu.........................................................................

12. Data pengaruh kofaktor (CaCl2) terhadap aktivitas protease dari

B.licheniformis HSA3-1a.......................................................................

47 47 48

48 50 50 51

xvi

DAFTAR SIMBOL DAN SINGKATAN

Abl : nilai absorbansi blanko Asp : nilai absorbansi sampel Ast : nilai absorbansi standart BSA : Bovine Serum Albumin BM : Berat Molekul HSA3-1a : Hasnah Sulili Air Lokasi 3-1a M : molar ml : milliliter mg : milligram MSM : Medium Sintetik Minimum nm : nanolimeter OD : Optical Density P : faktor pengenceran pH : potensial hidrogen rpm : rotate per minute sp. : spesies T : waktu inkubasi (menit) UA : unit aktivitas enzim UV/Vis : Ultraviolet/Visible U/ml : Unit per milliliter oC : derajat celcius [S] : substrat % : persen λ : lambda

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Keanekaragaman hayati di Indonesia yang terdiri dari berbagai jenis

tumbuhan, hewan dan mikroba memiliki potensi dalam produksi enzim. Produksi

enzim dari mikroba banyak dikembangkan karena dapat diproduksi dengan waktu

cepat dalam skala besar pada lingkungan yang dapat dikontrol dan bekerja sangat

sfesifik dan efisien. Berbagai jenis isolat mikroba telah diketahui memiliki

peranan yang besar sebagai penghasil enzim yang berguna dalam industri.

Penggunaan enzim pada berbagai industri saat ini semakin berkembang,

baik untuk industri pangan maupun non pangan. Dalam industri, enzim digunakan

sebagai bahan alternatif untuk menggantikan berbagai proses kimiawi dalam

bidang industri, diagnosis penyakit, analisis biologi molekuler, transformasi

senyawa kimia, dan pengolahan limbah dalam lingkungan. Enzim ini sebagai

biokatalisator pada berbagai reaksi kimia seperti: reaksi hidrolisis, oksidasi,

reduksi, isomerisasi, adisi, transfer gugus, dan terkadang pemutusan rantai karbon

(Falch, 1991).

Protease merupakan enzim golongan hidrolase yang memiliki nilai

ekonomi tinggi karena aplikasinya yang sangat luas antara lain: industri deterjen,

penyamakan kulit, tekstil, makanan, hidrolisat protein, pengolahan susu, farmasi,

makanan, bir, film, dan pengolahan limbah (Moon dan Parulekar 1993). Oleh

karena itu, tidak mengherankan apabila protease yang digunakan mencapai 60%

dari total enzim yang diperjualbelikan di seluruh dunia (Ward 1985).

2

Penelitian tentang isolasi protease dan aplikasinya telah dilakukan oleh

beberapa peneliti sebelumnya seperti: Isolasi protease alkali termostabil dari B.

thermoglucosidasius AF-01 oleh Fuad, dkk. (2004); isolasi protease dari bakteri

patogen Staphylococcus epidermidis oleh Baehaki, dkk. (2005) dan penggunaan

protease dari Bacillus sp. dalam mendeproteinasi lateks sebelum digunakan

sebagai bahan pembuatan sphgmomanometer oleh Siswanto, dkk (2009).

Pertumbuhan mikroba membutuhkan senyawa kofaktor sebagai sumber

mineral seperti, mangan, kalsium, besi, nitrogen, sulfur, dan magnesium, karena

mikroba juga membutuhkan nutrisi yang lengkap. Salah satu hasil penelitian

tentang pengaruh ion logam terhadap pertumbuhan bakteri dilakukan oleh

Susanto dan Sopiah (2003) yang melihat adanya pengaruh ion Mn2+, Co2+, Cu2+

dan Zn2+ terhadap pertumbuhan bakteri proteolitik.

Berdasarkan uraian pada latar belakang, maka akan dilakukan penelitian

tentang pengaruh penambahan ion Ca2+ terhadap pertumbuhan bakteri Bacillus

licheniformis HAS3-1a dan produksi enzim protease serta bagaimana stabilitas

enzim protease tersebut. B. licheniformis HSA3-1a adalah bakteri termofil yang

diisolasi dari sumber air panas Sulili-Pinrang (Natsir, dkk,2010).

1.2 Rumusan Masalah

Rumusan masalah dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Apakah senyawa CaCl2 berpengaruh terhadap produksi enzim protease

dari B. licheniformis HSA3-1a?

2. Berapa konsentrasi CaCl2 yang yang digunakan untuk memproduksi

protease maksimum?

3

3. Berapakah pH dan suhu optimum enzim protease dari B. licheniformis

HSA3-1a?

4. Berapakah konsentrasi kofaktor (CaCl2) yang dapat meningkatkan

aktivitas enzim protease dari B. licheniformis HAS3-1a ?

1.3 Maksud dan Tujuan Penelitian 1.3.1 Maksud Penelitian

Penelitian ini dimaksudkan untuk mengetahui pengaruh penambahan

senyawa CaCl2 terhadap produksi enzim protease dari B. licheniformis HSA3-1a.

1.3.2 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Menentukan aktivitas enzim protease dari B. licheniformis HSA3-1a

dengan adanya senyawa CaCl2.

2. Menentukan konsentrasi optimum senyawa CaCl2 terhadap produksi

enzim protease dari B. licheniformis HSA3-1a.

3. Menentukan pH dan suhu optimum enzim protease B. licheniformis HSA3-

1a

4. Menentukan konsentrasi kofaktor (CaCl2) yang dapat meningkatkan

aktivitas enzim protease dari B. licheniformis HAS3-1a ?

1.4 Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang pengaruh

penambahan serta konsentrasi optimum dari senyawa CaCl2 terhadap

pertumbuhan bakteri B. licheniformis HAS3-1a sehingga proses produksi enzim

protease semakin meningkat dan nantinya dapat dimanfaatkan dan dikembangkan

4

dalam semua bidang terutama bidang industri, pangan, famasi dan kesehatan guna

meningkatkan kesejahteraan manusia.

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Uraian Umum Tentang Bakteri

Bakteri berasal dari bahasa yunani yaitu “bakterion” yang berarti tongkat

atau batang. Sekarang nama itu dipakai untuk menyebut sekelompok

mikroorganisme yang bersel satu, tidak berklorofil, berkembang biak dengan

membelah diri, karena demikian kecilnya sehingga hanya tampak dengan

mikroskop. Bakteri dapat dari mana saja, misalnya dari rongga mulut, dari sela-

sela gigi, dari tanah yang banyak terdapat sampah, dan sisa-sisa makanan yang

sudah basi (Dwidjoseputro, 1998).

Bakteri banyak tersebar luas di alam, yaitu dalam tanah, atmosfer, lumpur,

di laut, di dalam tubuh hewan, manusia dan tanaman. Jumlahnya bergantung pada

keadaan sekitarnya, misalnya bakteri di dalam tanah jumlahnya bergantung pada

jenis dan tingkat kesuburan tanahnya (Djide dan Sartini, 2005).

Bentuk tubuh bakteri dipengaruhi oleh keadaan medium dan usia. Bentuk

serta besar kecilnya bakteri dapat dibandingkan dengan memperhatikan kondisi

bakteri yang harus sama, temperatur dimana bakteri itu disimpan harus sama,

penyinaran oleh sumber cahaya dan usia bakteri pun harus sama. Bakteri-bakteri

yang menunjukkan kelainan-kelainan akan memperoleh bentuknya yang normal

kembali apabila ditumbuhkan di dalam medium yang baru (Dwidjoseputro, 1998).

2.1.1 Pertumbuhan Bakteri

Bakteri umumnya melakukan proses reproduksi dengan cara pembelahan

biner menghasilkan dua sel anakan dengan ukuran yang sama. Waktu yang

6

digunakan untuk membelah diri disebut waktu waktu generasi. Waktu generasi

tidak selalu tepat tetapi tergantung pada faktor-faktor dalam medium, spesies, dan

umur bakteri. Sel yang tumbuh akan berkembang ukurannya. Selama tumbuh,

komponen sel seperti protein, RNA dan sebagainya akan bertambah sampai siap

membelah. Pembelahan sel diawali dengan pertumbuhan dinding sel kearah dalam

membentuk septa. Proses pemisahan dengan membelah sekat sehingga terbentuk

dua sel anakan (Hidayat dkk, 2006).

Waktu yang dibutuhkan untuk satu kali siklus lengkap dalam bakteri

sangat beragam dan bergantung pada sejumlah faktor baik faktor nutrisi maupun

genetik (Ali, 2005). Menurut (Rachdie, 2006), faktor-faktor penting yang

mempengaruhi pertumbuhan mikroba, yaitu: suplai nutrisi, suhu, keasaman atau

kebasaan (pH), dan ketersediaan oksigen.

Gambar 1. Kurva pertumbuhan mikroba (Djide dan Sartini, 2005)

Kurva pertumbuhan mikroba (Gambar 1) merupakan gambaran dari

pertumbuhan secara bertahap sejak awal hingga terhenti mengadakan kegiatan

(Suriawiria, 2005). Kurva di bawah ini disebut sebagai kurva pertumbuhan

bakteri. Menurut Prasetyo (2010), pertumbuhan bakteri terdiri atas 4 fase

sebagaimana tampak pada kurva, yaitu:

7

1. Fase Lag (A)

Fase adaptasi. Pada fase ini terjadi reorganisasi konstituen makro dan mikro

molekul. Ada yang lama ada juga yang cepat, bergantung pada kondisi

lingkungan.

2. Fase Eksponensial (B)

Fase ini merupakan fase pertumbuhan sebenarnya. Jika dilihat dalam kurva

akan dilihat kenaikan jumlah mikroba berdasarkan bertambahnya waktu.

3. Fase Stasioner (C)

Pada fase ini penambahan dengan pengurangan jumlah mikroba hampir sama.

Sehingga di kurva dapat dilihat berupa garis lurus. Hal ini disebabkan karena

mulai menipisnya jumlah nutrisi dalam médium yang ditempati.

4. Fase Kematian (D)

Ada kalanya setelah fase stasioner jumlah mikroba menurun. Hal ini karena

habisnya nutrisi dalam media. Mikroba juga menghasilkan metabolisme

sekunder yang hasilnya menjadi toksik untuk mikroba lainnya.

Menurut (Sofa, 2008). metode pengukuran pertumbuhan yang sering

digunakan adalah dengan menentukan jumlah sel yang hidup dengan jalan

menghitung koloni pada pelat agar dan menentukan jumlah total sel atau jumlah

massa sel.

2.1.2 Pengaruh Beberapa Unsur terhadap Pertumbuhan Bakteri

Suplai nutrisi juga dibutuhkan dalam pertumbuhan bakteri. Pada tingkat

dasar, kebutuhan nutrisi bakteri seperti E. coli yang diungkapkan oleh komposisi

unsur sel, yang terdiri dari C, H, O, N, S. P, K, Mg, Fe, Ca, Mn, dan jejak Zn, Co,

Cu, Mo dan unsur-unsur ini ditemukan dalam bentuk air, ion anorganik, molekul

8

kecil, dan makromolekul yang berfungsi baik peran struktural atau fungsional

dalam sel (Kenneth, 2009).

Tabel 1. Fungsi fisiologis umum dari setiap unsur dalam sel bakteri (Kenneth, 2009).

Unsur Berat kering (%)

Sumber Fungsi

Karbon 50 Senyawa organik atau CO2

Bagian utama dari bahan selular.

Oksigen 20 Senyawa organik, H2O, CO2 dan O2

Bagian penting dari bahan sel dan air sel; O2 adalah akseptor elektron dalam respirasi aerobik.

Nitrogen 14 NH3, NO32-, senyawa

organik dan N2 Bagian penting dari asam amino, asam nukleat nukleotida, dan koenzim.

Sulfur 1 SO42-, H2S, S,

senyawa organik sulfur

Bagian Penting dari sistein, metionin, glutation, beberapa koenzim.

Magnesium

0,5 Garam-garam magnesium

Kation seluler anorganik, kofaktor untuk reaksi enzimatik tertentu.

Kalsium 0,5 Garam-garam kalsium

Kation seluler anorganik, kofaktor untuk enzim tertentu dan komponen endospora.

Hidrogen 8 H2O, senyawa organik dan H2

Bagian utama senyawa organik dan air sel.

Fosfor 3 Fosfat anorganik (PO4

3-) Bagian utama asam nukleat, nukleotida, fosfolipid, LPS.

Kalium 1 Garam-garam kalium

Anorganik utama seluler dan kofaktor untuk enzim tertentu.

Besi 0,2 Garam-garam besi Komponen sitokrom dan beberapa zat besi nonheme-protein dan kofaktor untuk beberapa reaksi enzimatik.

9

2.1.3 Mikroorganisme Penghasil Protease

Sumber enzim menurut Kosim dan Putra (2010), yang paling banyak

digunakan dibandingkan dengan tanaman dan hewan adalah mikroorganisme.

Sebagai sumber enzim, mikroorganisme lebih menguntungkan karena

pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh pada substrat yang murah, lebih mudah

ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan kondisi pertumbuhan dan rekayasa

genetik, serta mampu menghasilkan enzim yang ekstrim. Adanya mikroorganisme

yang unggul merupakan salah satu faktor penting dalam usaha produksi enzim.

Tabel 2. Mikroorganisme penghasil protease

Sumber Protease pH

Optimum

Suhu Optimum

(°C) Aktivator Pustaka

Thermoplasma volcanium

7,0 50 Ca2+, Mg2+ Kocabiyik dan Ozdemir, 2006

Bacillus subtilis 7,5

60 Fe2+ Setyorini dkk., 2006

Bacillus claussi Bacillus sp. KSM-KP43

12,3

11-12

55

60

- -

Saeki dkk., 2007

Curtobacterium luteum

7

20 Zn2+, Cr2+ Kuddus dan Ramteke, 2008

Arthrobacter nicotinovorans

7,0 50 Ca2+, Mg2+, Mn2+

Ren, dkk., 2004

Pseudomonas aeruginosa

9 60 - Karadzic, dkk., 2004

Staphylococcus epidermidis

8 50 Fe2+ Baehaki, dkk., 2005

Bacillus licheniformis Lbbl-11

7 50 - Olajuyigbe dan Ajele, 2008

10

2.1.4 Bacillus licheniformis

B. licheniformis merupakan bakteri gram positif, berbentuk batang dengan

panjang antara 1,5 µm sampai 3 µm dan lebar antara 0,6 µm sampai 0,8 µm. Spora

dari bateri ini berbentuk batang silindris atau elips dan terdapat pada sentral atau

parasentral. Suhu maksimum pertumbuhannya adalah 50–55°C dan suhu

minimumnya 15°C. B. licheniformis merupakan spesies bakteri yang mampu

menghasilkan protease dalam jumlah yang relatif tinggi dan enzim golongan

hidrolase lainnya (Mao, dkk., 1992).

Bakteri termofil isolat HSA3-1a merupakan bakteri golongan Bacillus

yang tumbuh pada suhu 45-55°C yang telah diketahui karakteristik morfologi dan

fisiologinya. sifat morfologi bakteri B. licheniformis HSA3-1a tersebut berbentuk

batang, berspora, merupakan bakteri gram positif dan tidak bersifat motil. Sifat uji

fisiologi bakteri tersebut positif terhadap uji katalase, oksidase, gelatin, inositol,

voges proskaver, dan beberapa uji karbohidrat (Natsir dkk., 2010).

Gambar 2. Bentuk sel dari bakteri B. licheniformis HSA3-1a (Natsir dkk., 2010)

11

2.2 Uraian Umum Tentang Enzim

Enzim merupakan unit fungsional dari metabolisme sel yang bekerja

dengan urutan-urutan yang teratur. Enzim memiliki tenaga katalik yang luar biasa

jauh lebih besar dari katalisator sintetik, selain itu spesifisitasnya amat tinggi

terhadap substratnya. Enzim berperan dalam mempercepat reaksi kimia spesifik

tanpa membentuk produk sampingan (Lehninger, 1982).

Enzim adalah suatu protein dan dihasilkan oleh sel hidup. Enzim adalah

protein yang mempunyai fungsi khusus. Enzim bekerja dalam mengkatalisis

reaksi kimia (biokimia) yang berlangsung di dalam sel itu sendiri. Fungsi utama

suatu enzim ialah mengurangi hambatan energi reaksi pada suatu reaksi kimiawi.

Enzim bergabung dengan substansinya (substrat) membentuk suatu status transisi

yang membutuhkan energi aktivasi lebih kecil untuk berlangsungnya reaksi kimia

tersebut (Pelczar, 1986).

Menurut (Poedjiadi, 1994), fungsi suatu enzim ialah sebagai katalis untuk

proses biokimia yang terjadi dalam sel maupun di luar sel. Suatu enzim dapat

mempercepat reaksi 108 sampai 1011 kali lebih cepat daripada apabila reaksi

tersebut dilakukan tanpa katalis. Jadi enzim dapat berfungsi sebagai katalis yang

sangat efisien dan mempunyai derajat spesifitas yang tinggi. Seperti juga katalis

lainnya, maka enzim dapat menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia.

Kelebihan enzim dibandingkan katalis biasa adalah (1) dapat

meningkatkan produk beribu kali lebih tinggi; (2) bekerja pada pH yang relatif

netral dan suhu yang relatif rendah; dan (3) bersifat spesifik dan selektif terhadap

subtrat tertentu. Sifat-sifat tersebut menyebabkan penggunaan enzim semakin

meningkat dari tahun ke tahun, diperkirakan peningkatan mencapai 10–15%

12

setiap tahun. Aplikasi enzim pada beberapa industri menghendaki enzim-enzim

yang dalam beraktivitas tahan terhadap panas (termostabil) (Rahayu, 2004).

Suatu enzim mempunyai ukuran yang lebih besar daripada substrat. Oleh

karena itu tidak seluruh bagian enzim dapat berhubugan dengan substrat

(Poedjiadi, 1994). Enzim bekerja dengan dua cara, yaitu menurut teori kunci-

gembok (Lock and Key Theory) dan teori kecocokan induksi (Induced Fit

Theory), seperti terlihat pada Gambar 3. Menurut teori kunci-gembok, reaksi

antara substrat dengan enzim terjadi karena adanya kesesuaian bentuk ruang

antara substrat dengan situs aktif (active site) dari enzim, sehingga sisi aktif enzim

cenderung kaku. Substrat berperan sebagai kunci masuk ke dalam situs aktif, yang

berperan sebagai gembok, sehingga terjadi kompleks enzim-substrat. Pada saat

ikatan kompleks enzim-substrat terputus, produk hasil reaksi akan dilepas dan

enzim akan kembali pada konfigurasi semula. Berbeda dengan teori kunci

gembok, menurut teori kecocokan induksi reaksi antara enzim dengan substrat

berlangsung karena adanya induksi substrat terhadap situs aktif enzim sedemikian

rupa sehingga keduanya merupakan struktur yang komplemen atau saling

melengkapi. Menurut teori ini situs aktif tidak bersifat kaku, tetapi lebih fleksibel

(Mulia, 2007).

Gambar 3. Teori kunci gembok dan teori kecocokan induksi (Mulia, 2007)

13

2.2.1 Penggolangan Enzim

Enzim digolongkan menurut reaksi yang diikutinya, sedangkan masing-

masing enzim diberi nama menurut nama substratnya, misalnya urease, arginase

dan lain-lain. Disamping itu ada pula beberapa enzim yang dikenal dengan nama

lama misalnya pepsin, tripsin dan lain-lain. Oleh Commision on Enzymes of the

internasional Union of Biochemistry, enzim dibagi dalam enam golongan besar.

Penggolongan ini didasarkan atas reaksi kimia dimana enzim memegang peranan.

Enam golongan tersebut adalah (Poedjiadi, 1994):

a) Oksidoreduktase

Enzim-enzim yang termasuk dalam golongan ini dapat dibagi dalam dua

bagian yaitu dehidrogenase dan oksidase. Dehidrogenase bekerja pada reaksi-

reaksi dehidrogenasi, yaitu reaksi pengambilan atom hidrogen dari suatu senyawa

(donor) dan diterima oleh senyawa lain (akseptor), sementara enzim-enzim

oksidase juga bekerja sebagai katalis pada reaksi pengambilan hidrogen dari

substrat. Dalam reaksi ini yang bertindak sebagai akseptor hidrogen adalah

oksigen. Contoh enzim dehidrogenase adalah alkohol dehidrogenase, glutamat

dehidrogenase dan lain-lain. Contoh enzim oksidase adalah xantin oksidase, glisin

oksidase dan lain-lain.

b) Transferase

Enzim yang termasuk golongan ini bekerja sebagai katalis pada reaksi

pemindahan suatu gugus dari suatu senyawa kepada senyawa lain. Beberapa

contoh enzim yang termasuk golongan ini ialah metiltransferasi,

hidroksimetiltransferase, karboksiltransfrasi dan lain-lain.

14

c) Hidrolase

Enzim yang termasuk dalam kelompok ini bekerja sebagai katalis pada

reaksi hidrolisis. Ada tiga jenis hidrolase yaitu yang memecah ikatan ester,

memecah ikatan glikosida, dan yang memecah ikatan peptida. Beberapa contoh

enzim ini adalah esterase, amilase, peptidase dan lain-lain.

d) Liase

Enzim yang termasuk dalam golongan ini mempunyai peran penting

dalam reaksi pemisahan suatu gugus dari suatu substrat atau sebaliknya tapi bukan

dengan cara hidrolisis. Contoh enzim golongan ini adalah dekarboksilase,

aldolase, dan hidratase dan lain-lain.

e) Isomerase

Enzim yang termasuk golongan ini bekerja pada reaksi perubahan

intramolekular misalnya reaksi perubahan glukosa menjadi fruktosa, senyawa cis

menjadi senyawa trans dan lain-lain. Contoh enzim yang termasuk golongan

isomerase adalah ribulosafosfat epimerase dan glukosafosfat isomerase.

f) Ligase

Enzim yang termasuk golongan ini bekerja pada reaksi-reaksi

pengabungan dua molekul. Oleh karenanya enzim-enzim tersebut juga dinamakan

sintetase. Ikatan yang terbentuk dari penggabungan tersebut adalah ikatan C-O, C-

S, C-N, atau C-C. Contoh enzim golongan ini antara lain ialah glutamin sintetase

dan piruvat karboksilase.

2.2.2 Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim

Reaksi enzimatik yang terjadi dapat dipengaruhi oleh kondisi fisiologi

serta kandungan protoplasma sel (in vivo). Pengaruh ini agak berbeda dengan

15

reaksi enzimatik yang terjadi secara in vitro, selain itu ada beberapa faktor lain

yang mempengaruhi aktivitas enzim yaitu: kosentrasi substrat, konsentrasi enzim,

pH, suhu, inhibitor (Page, 1989).

a. Konsentrasi Substrat

jika konsentrasi substrat rendah maka kecepatan reaksinya juga rendah,

tetapi kecepatan reaski akan meningkat dengan meningkatnya konsentrasi substrat

(Lehninger, 1982).

b. Konsentrasi Enzim

Kecepatan reaksi suatu enzim tergantung pada konsentrasi substratnya,

kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim selama

konsentrasi enzim jauh lebih sedikit daripada konsentrasi substrat (Poedjiadi,

1994).

c. pH

Enzim mempunyai gugus aktif yang bermuatan positif (+) dan bermuatan

negatif (-). Jika salah satu gugus aktifnya dipengaruhi maka aktivitas enzimnya

juga akan berkurang, sebaliknya aktivitasnya akan optimum bila terdapat

kesetimbangan antara kedua gugus aktifnya, dimana pH optimum untuk kegiatan

suatu enzim tidak selalu sama tapi tergantung kepada kemurnian enzim, asal

enzim, suhu, dan lain-lain. Enzim yang berassal dari sumber yang berbeda

mempunyai pH optimum yang berbeda pula. Umumnya enzim memperlihatkan

aktivitas maksimum pada pH optimum, yang lazimnya berkisar antara pH 4,5

samapai 8,0 (Winarno, 1986).

16

d. Suhu

Suhu dapat berpengaruh terhadap kecepatan reaksi enzim, naiknya suhu

akan menaikkan kecepatan reaksi dampai kecepatan maksimum. Setelah itu

kecepatan akan turun karena terjadi denaturasi termal terhadap enzim tersebut.

Hal ini terjadi karena Enzim adalah suatu protein, maka kenaikan suhu dapat

menyebabkan terjadinya proses denaturasi (Wirahadikusumah dan Madayanti,

1990).

e. Kofaktor

Bailey dan Ollis (1988), menyatakan bahwa salah satu karakteristik

pembeda enzim dengan katalis sintetik adalah seringnya enzim memerlukan

kofaktor. Kofaktor bisa berupa molekul anorganik, seperti ion Fe2+, Mn2+, Zn2+,

Na+, Mg2+, Cu2+, Ca2+ atau juga suatu molekul organik komplek yang disebut

koenzim seperti tiamin pirofosfat, FAD, serta koenzim A.

Ion Mg2+ dan Ca2+ sedikit meningkatkan aktivitas enzim protease dari B.

stearothermopillus. Ion logam seperti Ca2+, Co2+, Mg2+, Sr2+, dan Zn2+, dapat

melindungi protease asam dari Paecilomyces terhadap inaktivasi oleh panas.

Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim protease dapat diurutkan dari yang

kecil ke yang besar sebagai berikut: Hg+< Ag+< Fe2+< Li+< Ca2+< Mg2+< Zn2+<

NH4+< Na+< K+< Ba2+ (Sukarno, dkk., 1995).

Gambar 4. Kalsium (Ca) (Anonim, 2012a)

17

Kalsium adalah sebuah elemen kimia dengan simbol Ca dan nomor atom

20. Mempunyai massa atom 40.078 berwarna putih perak, yang agak lunak

(Gambar 4). Kalsium melebur pada 845°C. Kalsium membentuk kation

kalsium(II), Ca2+, dalam larutan air. Kalsium pertama kali diisolasi oleh Sir

Humphry Davy, seorang kimiawan Inggris, yang melalui elektrolisis campuran

CaO dan HgO pada tahun 1808 (Svehla, 1979).

2.3 Enzim Protease

Protease, disebut juga peptidase atau proteinase, merupakan enzim

golongan hidrolase yang akan memecah protein menjadi molekul yang lebih

sederhana, seperti menjadi oligopeptida pendek atau asam amino dengan reaksi

hidrolisis pada ikatan peptida. Protease bersumber dari hewan, tumbuhan dan

mikroorganisme. Saat ini protease dibutuhkan dalam skala tinggi yaitu meliputi

dua per tiga dari enzim pasar dan banyak dimanfaatkan pada industri pangan

maupun non pangan. (Smith 1995).

Gambar 5. Struktur Enzim Protease (Anonim, 2011b)

18

Uchikoba dkk. (2000) menemukan adanya macluralisin, serin protease dari

tanaman keluarga mulberry yang telah diisolasi dari buah Cudrania tricuspidata.

Menurut Moriyama dkk.(1998), berbagai jenis Bacillus menghasilkan sejumlah

protease ekstraselullar, dan protease alkalis disajikan dalam bentuk subtilisin

yang memiliki hubungan evolusioner dengan enzim yang telah dikarakterisasi

dengan sejumlah kemampuan umum dan struktur yang istimewa.

2.3.1 Mekanisme Kerja Enzim Protease

Berdasarkan mekanisme reaksinya, enzim protease dibagi menjadi 4

kategori (Walsh, 2002):

a. Protease Serin

Golongan protease serin memiliki residu serin pada pusat aktif enzim,

menghidrolisis substrat peptida atau ester sintetik melalui mekanisme

pembentukan senyawa antara asilenzim seperti pada persamaan reaksi berikut:

Gambar 6. Mekanisme pembentukan senyawa antara asilenzim (Fersht, 1985)

Enzim dan substrat mula-mula bergabung membentuk kompleks enzim-

substrat. Gugus hidroksil Ser-195 berikatan dengan substrat membentuk senyawa

antara tetrahedral. Senyawa antara ini bersifat tidak stabil, kemudian luruh

(collapse) membentuk asilenzim dengan melepaskan amina atau alkohol.

19

Kemudian asilenzim terhidrolisis membentuk kompleks enzim-produk (Fersht,

1985).

b. Metaloprotease

Metaloprotease merupakan nama dari protease yang dicirikan oleh

ketergantungan pada ion logam bivalen untuk aktivitasnya. Mekanisme katalitik

protease logam dengan menghidrolisis asam amino pada ujung C dari substrat

polipeptida (Fersht, 1985).

c. Protease sistein

Berdasarkan spesifitas rantai samping, enzim ini dibedakan menjadi 4

kelompok yaitu protease serupa papain, dan yang serupa tripsin yang memotong

protein pada residu arginin. Kelompok ketiga adalah protease yang spesifik

memotong pada residu asam glutamat dan kelompok ke empat diluar kelompok

kelompok ketiga tersebut di atas (Rao dkk., 1998).

d. Protease aspartat

Sebagian besar protease aspartat memiliki aktivitas maksimum pada pH 3

dan 4 serta memiliki titik isoelektrik antara 3 dan 4,5. Secara umum berat

molekulnya 30-45 kD, yang termasuk protease ini adalah pepsin, renin

(chymosin) dan protease aspartat mikroba (Walsh, 2002).

Gambar 7. Mekanisme reaksi protease aspartat pada reaksi pemutusan ikatan peptida (Ming, 2001).

20

Mekanisme reaksi dari protease aspartat yang menunjukkan dua gugus

aspartat yang terlibat dalam reaksi katalisis. Pada proteolisis dibutuhkan molekul

air yang teraktivasi. R dan R' mewakili sisi ikatan asam amino. Gugus hidroksil

terlibat pada transisi tetrahidril.

2.3.2 Aplikasi Enzim Protease

Peptidase atau protease merupakan salah satu jenis enzim yang banyak

digunakan dalam berbagai bidang seperti :

a. Bidang pangan

Penggunaan enzim protease di bidang pangan seperti pada pembuatan roti,

daging, dan keju. Rennet merupakan enzim golongan peptidase yang digunakan

dalam mengkoagulasikan protein susu dalam pembuatan keju. Jenis peptidase

lain, seperti papain dan bromelain, banyak digunakan dalam mengempukkan

tekstur daging (Anonim b, 2011).

b. Bidang industri

penggunaan enzim protease dibidang industri yaitu sebagai bahan dasar

pembuatan detergen dan saat ini penggunaannya lebih disukai dibandingkan

dengan bahan sintesis konvensional lainnya, hal ini dapat dilihat dari

kelebihannya dalam proses pencucian, dimana enzim protease dapat digunakan

pada temperatur rendah dan mengurangi bahaya akan polusi (Krik dkk, 2002).

Selain itu, Protease telah diformulasikan dalam detergen untuk

memperbaiki proses pencucian dengan kemampuan menghidrolisis protein tanah

yang melekat. Subtilisin Carlsberg, alkalin serin protease yang secara komersil

dikenal sebagai alkalase telah digunakan sejak tahun 1960, dan optimalisasi

21

aktivitas protease pada kondisi pencucian yang spesifik juga telah dikembangkan

(Ikeda dkk, 2002)

c. Bidang Kesehatan

Aplikasi Enzim Protease dalam bidang kesehatan adalah digunakan

meniadakan atau mengurangi cairan luka, nanah dan jaringan nekrosa yang timbul

pada kasus luka bakar, luka operasi, maupun jenis luka lainnya. Hal ini penting

didalam proses penyembuhan dan pembersihan luka atau pengeringannya dari

lapisan lendir. Dalam hal ini substrat bagi enzim adalah jaringan fibrin, lapisan

mukoprotein, kolagen, dan sebagainya. Jadi protease bekerja menguraikan

jaringan ini sehingga bekas luka menjadi bersih (Suhartono, 1989).

Aplikasi protease telah dilakukan oleh beberapa peneliti yang terlihat pada

Tabel 3.

Tabel 3. Aplikasi protease dari berbagai sumber

Protease dan Sumbernya

Aplikasi Pustaka

Protease alkalin dari Aspergillus clavatus

Pemutih pakaian Hajji dkk. (2007) dalam Devi dkk.

(2008)

Protease serin (subtilisin Carlsberg)

dari Bacillus licheniformis

Komposisi dari detergen

yang berfungsi sebagai

penghilang noda

Takagi (1992) dalam Tobe dkk. (2006)

Protease Bio-40 dari Bacillus subtilis

Detergen enzimatik (Ward, 1983)

22

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah isolat B.

licheniformis HAS3-1a, bakto agar, ekstrak khamir, NaCl, bakto pepton, kasein, ,

K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCl2.4H2O, buffer sitrat (C6H8O7.H2O dan

C6H5O7Na3.2H2O), buffer fosfat (NaH2PO4 dan Na2HPO4), spiritus, alkohol 70%,

aquades, aluminium foil, kertas pH universal, reagen Lowry A (asam fosfo-

tungstat-fosfo-molibdat (folin) dan aquades), Lowry B (natrium karbonat, NaOH,

CuSO4, natrium-kalium-tartrat), BSA (Bovine Serum Albumin), TCA (Tri

Cloroacetic Acid) p.a., ammonium molibdat, H2SO4 pekat, Na2HAsO4.7H2O, dan

etanol.

3.2 Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik

(Ohaus), magnetic stirrer (Model 8000-DSE Napco), inkubator (Memmert),

shaker water bath incubator (Thermo Scientific MaxQ 7000 Benchtop Water

Bath Shakers Model N0. SHKA 7000, di laboratorium kimia, Universitas Islam

Negeri, Samata-Gowa), oven (Memmert), waterbath (Memmert), mikropipet 100 -

1000 µL (Finnipipette Campus), Spektronik 20D+, sentrifuse (Sentrifuse

Universal 320 R Hettich Zentrifugen), cawan petri, jarum ose, erlenmeyer, dan

alat-alat gelas yang umum digunakan di Laboratorium.

23

3.3 Metode Penelitian

Metode penelitian yang akan dilakukan terdiri atas beberapa tahap yang

meliputi: pembuatan medium padat, pembuatan medium inokulum, pembutan

medium produksi, peremajaan bakteri B. licheniformis HSA3-1a, penentuan

waktu produksi enzim optimum, produksi enzim protease, uji aktivitas protease,

pengukuran kadar protein dengan metode Lowry, Penentuan senyawa kofaktor

terhadap aktivitas enzim dan stabilitas protease.

3.3.1 Pembuatan Medium Padat

Medium padat dibuat dengan komposisi sebagai berikut: yeast ekstrak

0,05%, NaCl 0,1%, bakto agar 1,5%, kasein 0,5%, bakto pepton 0,01% dilarutkan

dalam aquades 100 mL. Kemudian dihomogenisasi dengan magnetic stirrer,

dipanaskan sampai larut lalu disterilkan dalam autoclave selama 30 menit,

didinginkan kemudian dituang dalam cawan petri steril.

3.3.2 Pembuatan Medium Inokulum

Medium inokulum dibuat dengan komposisi sebagai berikut: yeast ekstrak

0,05%, pepton 0,01%, KH2PO4 0,01%, NaCl 0,1%, MgSO4.7H2O 0,01% dan

kasein 0,5%, dilarutkan dalam aquades 100 mL, dihomogenisasi dengan magnetic

stirrer, disterilkan dalam autoclave selama 30 menit, didinginkan kemudian

dituang dalam cawan petri steril.

3.3.3 Pembuatan Medium Produksi

Medium produksi dibuat dengan komposisi sebagai berikut: yeast ekstrak

0,05%, bakto pepton 0,01%, NaCl 0,1%, KH2PO4 0,01%, MgSO4.7H2O 0,01%,

CaCl2 pada berbagai konsentrasi (0,005%; 0,01%; 0,015%; 0,02%; 0,025%),

24

kasein 0,5% dilarutkan dalam aquades 130 mL lalu dihomogenisasi dengan

magnetic stirrer, disterilkan dalam autoclave selama 30 menit, didinginkan

kemudian dituang dalam cawan petri steril.

3.3.4 Peremajaan Mikroba Isolat B. licheniformis HAS3-1a

Isolat bakteri B. licheniformis HSA3-1a dikulturkan pada beberapa

medium LA pada cawan petri selama 2-3 hari pada suhu 50°C. Indikasi bahwa

mikroba dapat mendegradasi kasein dengan baik ditunjukkan melalui isolat yang

tumbuh dengan baik dan memiliki zona bening sekitar koloni. Isolat hasil

peremajaan ini digunakan dalam produksi enzim protease.

3.3.5 Penyiapan Inokulum

Isolat B. licheniformis HSA3-1a yang telah ditumbuhkan pada medium

diambil 2-3 ose ditanam ke dalam medium inokulum yang telah disiapkan. Biakan

tersebut kemudian dimasukkan ke dalam shaker pada suhu 50°C, 180 rpm selama

20-24 jam.

3.3.6 Penentuan Konsentrasi Optimum CaCl2 serta Waktu Produksi

Optimum Enzim

Sebelum produksi enzim terlebih dahulu dilakukan penentuan konsentrasi

optimum CaCl2 serta waktu produksi optimum enzim protease. Isolat murni yang

telah diremajakan dikultivasi dalam medium fermentasi/produksi untuk

melakukan pengujian aktivitas enzim protease. Proses ini dimulai dengan

pembuatan inokulum kemudian dilanjutkan dengan proses fermentasi (produksi

enzim). Inokulum yang telah diinkubasi selama 20-24 jam pada suhu 50°C; 180

rpm, diambil sebanyak 10% untuk diinokulasikan ke dalam 30 mL medium

25

produksi. Setiap 12 jam dilakukan sampling, selanjutnya dilakukan pengukuran

aktivitas enzim protease serta analisis kadar proteinnya.

3.3.7 Produksi Enzim Protease Ekstraseluler

Setelah diketahui konsentrasi optimum CaCl2 serta waktu produksi enzim

yang optimum, maka produksi enzim dilakukan dalam jumlah (volume) besar

sekitar 1500 mL pada kondisi optimum. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan

3500 rpm pada suhu 4°C selama 30 menit. Supernatan diambil dan dianalisis

kadar protein dan pengujian aktivitas protease terhadap pengaruh pH dan suhu.

3.3.8 Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Lowry

Komposisi reagen Lowry B adalah Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 N :

CuSO4 1% : Natriun-kalium-Tartrat (100 : 1 :1) dan reagen Lowry A adalah

larutan asam phospho-tungstic-phospho-molybdic (folin) : aquades (1 : 1). Kadar

protein diukur dengan menggunakan BSA (Bovine Serum Albumin) sebagai

standar dan diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang

gelombang maksimum.

Sebanyak 1 mL enzim protease ditambah 2,5 mL larutan Lowry B,

diinkubasi pada suhu 50°C selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan 0,25 mL

Lowry A dan diinkubasi kembali pada 50°C selama 30 menit dengan sesekali

dikocok, kemudian absorbansi diukur pada λ maksimum BSA yang telah

ditentukan dengan spektrofotometer UV-Vis.

3.3.9 Uji Aktivitas Protease

Prosedur untuk mengukur aktifitas protease adalah metode Walter (1984)

yang telah dimodifikasi. Ada tiga perlakuan yaitu untuk blanko, standar dan

26

sampel. Sebanyak 0,1 mL larutan enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang

berisi 0,5 mL kasein 2% b/v dan 0,5 mL bufer fosfat pH 7. Perlakuan pada blanko

dan standar, enzim diganti dengan akuades dan tirosin 0,1 mM. Larutan tersebut

diinkubasi pada suhu 50°C selama 10 menit. Reaksi hidrolisis dihentikan dengan

cara penambahan 1 mL TCA (asam trikloroasetat) 0,1 M. Pada blanko dan standar

ditambahkan 0,1 mL larutan enzim, sedangkan pada sampel ditambahkan 0,1 mL

akuades. Selanjutnya larutan diinkubasi kembali pada suhu 50°C selam 10 menit,

dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 10 menit.

Sebanyak 0,75 mL supernatan ditambahkan ke dalam tabung reaksi yang

berisi 2,5 mL Na2CO3 0,4 M kemudian ditambahkan 0,5 mL pereaksi folin

Ciocalteau (1:2) dan diinkubasi pada suhu 50°C selama 20 menit. Hasil inkubasi

diukur dengan spektrofotometer pada λ = 665 nm (λ maksimum). Aktivitas enzim

protease dapat dihitung dengan rumus :

Keterangan: UA = Unit aktivitas enzim (U/mL) Asp = Nilai absorbansi sampel Ast = Nilai absorbansi standart Abl = Nilai absorbansi blanko P = Faktor pengenceran T = Waktu inkubasi (menit)

3.3.10 Penentuan pH Optimum

27

Protease diuji aktivitasnya pada berbagai variasi pH buffer yaitu pH 5,0 ;

6,0; 7,0 dan 8,0 menggunakan bufer fosfat-sitrat 0,2 M dengan metode Walter

(1984).

3.3.11 Penentuan Suhu Optimum

Penentuan suhu optimum dilakukan dengan aktivitas protease diuji pada

berbagai suhu inkubasi yaitu 30ºC, 40ºC, 50ºC dan 60ºC. Pengujian dilakukan pada

pH optimum yang telah ditentukan dengan metode Walter.

3.3.12 Penentuan Pengaruh Senyawa Kofaktor terhadap Aktivitas Enzim

Campuran buffer fosfat-sitrat pH 7 (pH optimum) yang divariasi, dan 0,1

mL enzim (sampel), setelah itu dilakukan penambahan ion logam dari senyawa

CaCl2 dengan variasi konsentrasi 0,01%, 0,015%, 0,02%, 0,025% dan 0,03%

kemudian ditambahkan 0,5 mL kasein 2%. Setelah itu diinkubasi selama 10 menit

dengan suhu 50°C (suhu optimum yang diperoleh). Uji aktivitas protease

dilakukan dengan metode Walter (1984).

28

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penentuan Konsentrasi Optimum CaCl2 dan Waktu Optimum Produksi Enzim Protease dari Bacillus licheniformis HSA3-1a.

Protese merupakan enzim yang banyak dimanfaatkan dalam berbagai

bidang sehingga dibutuhkan dalam jumlah yang tidak sedikit. Untuk

meningkatkan produksi enzim protease salah satu caranya yaitu dengan

penambahan logam, oleh karena itu pada tahap peremajaan bakteri Bacillus

licheniformis HSA3-1a, ke dalam media NA (nurtien agar) ditambahkan CaCl2

dengan konsentrasi 0,01% dan sebagai media pembandingnya adalah tanpa

penambahan logam CaCl2. Setelah dibandingkan, ternyata pertumbuhan bakteri B.

licheniformis HSA3-1a pada media NA yang ditambah logam CaCl2 lebih bagus

(Lampiran 4) dibanding media NA tanpa penambahan logam (Lampiran 5).

Logam CaCl2 berfungsi sebagai nutrisi untuk pertumbahan bakteri, adapun

peremajaan ini dilakukan supaya bakteri yang akan ditumbuhkan dalam media

NA tumbuh dengan baik, stok bakteri kemudian diuji zona hidrolisisnya

(Lampiran 6) untuk melihat kemampuan bakteri dalam menghidrolisi substrat.

Penentuan konsentrasi optimum CaCl2 dan waktu optimum produksi enzim

protease dari B. licheniformis HSA3-1a menggunakan CaCl2 0,005%, 0,01%,

0,015%, 0,02% dan 0,025% dengan pH medium7,0. Hal ini dilakukan untuk

mengetahui pada konsentrasi CaCl2 berapa persen dan waktu fermentasi sehingga

diperoleh enzim protease maksimum. Enzim ekstrak ekstraseluler dipisahkan dari

sel bakteri dengan metode sentrifugasi, dimana sel bakteri akan mengendap dan

enzim terlarut dalam supernatan atau filtrate. Proses sentrifugasi ini dilakukan

29

pada suhu 4ºC dengan kecepatan 3500 rpm selama 30 menit. Penggunaan suhu

dingin disini adalah untuk menghindari proses denaturasi protein. Selanjutnya

menentukan aktivitas enzimnya dengan mengukur absorbansinya pada panjang

gelombang 665 nm yang merupakan panjang gelombang maksimum. Besarnya

aktivitas protease ditentukan berdasarkan jumlah tirosin yang dihasilkan dari

hidrolisis kasein yang diukur pada panjang gelombang maksimum yaitu 665 nm.

Tabel 4. Data hasil penentuan konsentrasi optimum CaCl2 dan waktu optimum produksi enzim protease dari Bacillus licheniformis HSA3-1a

No Waktu

Fermentasi

(Jam)

Aktivitas Protease

(U/mL)

[CaCl2]

0,005

[CaCl2]

0,01

[CaCl2]

0,015

[CaCl2]

0,02

[CaCl2]

0,025

1.

2.

3.

4.

5.

7.

8.

12

24

36

48

60

72

84

0

0

0

4,9.10-2

4,1.10-2

4,3.10-2

0

0

0,9.10-2

0,03.10-2

1,9.10-2

0,5.10-2

0

2,1.10-2

0,0124

1,1.10-2

0,3.10-2

1,2.10-2

5,6.10-2

4,6.10-2

1,1.10-2

0,0032

0,6.10-2

0

1,7.10-2

0,08.10-2

1,9.10-2

1,3.10-2

0

0

0

3,8.10-2

0

0

0,6.10-2

30

Gambar 8. Penentuan konsentrasi optimum CaCl2 serta waktu produksi optimum enzim protease dari Bacillus licheniformis HAS3-1a

Data hasil penelitian (Gambar 8) menunjukkan bahwa aktivitas enzim

protease yang memiliki peningkatan paling besar adalah pada konsentrasi CaCl2

0,015% dengan waktu produksi 60 jam. Waktu fermentasi 12 jam, 24 jam, dan 36

jam, enzim protease yang disekresikan masih sangat rendah untuk setiap

konsentrasi CaCl2. Hal ini kemungkinan disebabkan karena sel bakteri masih

dalam fase adaptasi terhadap lingkungannya (medium), sehingga enzim yang

disekresikan masih sedikit, sedangkan pada waktu fermentasi 72 jam dan 84 jam

aktivitas enzim protease menurun pada konsentrasi CaCl2 0,005%, 0,015%,

0,02%, dan 0, 025%, hal ini mungkin disebabkan karena habisnya nutrisi dalam

media. Berbeda dengan aktivitas enzim protease pada konsentrasi 0,01%, pada

waktu fermentasi 72 jam dan 84 jam aktivitas enzimnya semakin naik, ada

kemungkinan bahwa pada waktu ini masih ada protein yang dioproduksi namun

ini tidak efesien. Oleh karena itu, waktu produksi optimum yang digunakan untuk

memproduksi enzim protease dalam jumlah yang besar adalah 60 jam karena

31

merupakan waktu produksi yang paling cepat dengan nilai aktivitas tertinggi.

Berbeda dengan penelitian yang sebelumnya dilakukan oleh Indriyani (2010)

dimana waktu produksi optimum enzim protease dari bakteri isolat HMT-3 adalah

pada jam ke 108 dengan nilai aktivitas sebesar 0,059 U/mL pada suhu 37ºC. Hal

ini dapat terjadi karena adanya perbedaan mikroba yang digunakan dan suhu

pertumbuhan mikroba yang berbeda.

4.2 Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Lowry

Penentuan kadar protein dalam enzim ditentukan dengan menggunakan

metode Lowry. Larutan Lowry ada dua macam yaitu larutan Lowry A yang terdiri

dari fosfotungstat-fosfomolibdat dengan perbandingan 1:1. Fosfotungstat-

fosfomolibdat berperan memberikan warna biru, sedangkan larutan lowry B

terdiri atas Na2CO3 2% dalam larutan NaOH 0,1 N, Na-K-tartrat 2% dan

CuSO4.5H2O. Dalam hal ini, Na-K-tartrat bertindak mencegah terjadinya

pengendapan kupri oksida yang terdapat dalam reagen, sementara Na2CO3 sebagai

pemberi suasana alkalis pada reaksi, dimana reaksi hanya akan terjadi dalam

suasana alkalis. Adapun penggunaan CuSO4.5H2O adalah sebagai katalisator

untuk mempercepat proses destruksi protein menjadi unsur-unsurnya. Kekuatan

warna biru ini bergantung pada kandungan residu triptopan dan tirosinnya. Kadar

protein ini diukur dengan menggunakan BSA (Bovine Serum Albumin) yaitu

larutan yang mengandung protein sebagai standar kemudian diukur pada panjang

gelombang maksimum yaitu pada panjang gelombang 670 nm. Selanjutnya

diperoleh kurva standar (Lampiran 8). Dari kurva standar ini kemudian dibuat

persamaan garis lurus untuk mengitung kadar protein protease.

32

Tabel 5. Data pengukuran kadar protein protease pada panjang gelombang 670 nm

No Waktu fermentasi

(jam)

Kadar protein

(mg/mL)

Aktivitas Protease

(U/mL)

1 12 0,8790 0,0124

2 24 1,5098 0,0124

3 36 1,6236 0,003

4 48 2,0165 0,012

5 60 1,4685 0,056

6 72 1,4373 0,046

7 84 1,4168 0,011

Gambar 9. Kadar protein protease dari Bacillus licheniformis HSA3-1a selama

waktu fermentasi

Nilai kadar protein dapat dilihat pada Tabel 5 dan Gambar 9, dimana nilai

kadar yang tertinggi diperoleh pada waktu produksi protease yang ke 48 jam

sebesar 2,0165 mg/mL. Sedangkan kadar protein yang paling rendah diperoleh

pada waktu produksi protease yang ke 12 jam dengan nilai kadar 0,8790 mg/mL.

33

4.3 Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Protease dari Bacillus licheniformis HSA3-1a

Aktivitas enzim protease dipengaruhi oleh beberapa faktor salah satunya

yaitu pH. Suatu enzim akan bekerja dengan baik pada pH tertentu. Perubahan pH

yang ekstrim, enzim dapat mengalami denaturasi akibat gangguan terhadap

berbagai interaksi non kovalen yang menjaga kestabilan struktur 3 dimensi enzim

sehingga keaktifan enzim pun terganggu (Suhartono, 1989). Perubahan keaktifan

enzim diakibatkan oleh gugus ionik enzim pada sisi aktif atau sisi lain. Gugus

ionik enzim berperan dalam menjaga konformasi sisi aktif dalam mengikat

substrat enzim dan mengubah substrat menjadi produk. Aktivitas enzim akan

optimum jika terdapat keseimbangan antara kedua muatannya. Pada keadaan

asam, muatannya cenderung positif dan pada keadaan basa muatannya cenderung

negatif sehingga aktivitas enzimnya menjadi berkurang dan bahkan menjadi tidak

aktif (Putranto 2006).

Gambar 10. pH Optimum Enzim Protease dari Bacillus licheniformis HSA3-1a pada pada [S] = 2,0%; 50ºC

34

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh (Gambar 10), menunjukkan

bahwa aktivitas enzim protease mencapai maksimum pada pH 7,0 dengan

aktivitas sebesar 0,0104 U/mL setelah sebelumnya diperoleh nilai aktivitas 0

U/mL pada pH 5,0; pada pH 6,0 sebanyak 0,0099 U/mL dan kembali menurun

aktivitasnya pada pH di atas 8,0 yaitu 0,0064 U/mL.

Beberapa penelitian sebelumnya seperti Putranto (2006) menunjukkan

protease dari bakteri Lactobacillus acidophilus memiliki aktivitas optimum pada

kondisi pH 5,5 dan suhu 37°C, selain itu menurut penelitian Olajuyigbe dan Ajele

(2008), protease yang diperoleh dari B. licheniformis Lbbl-11 memiliki aktivitas

optimum pada suhu 50°C dengan pH optimum 7. Vazquez et al. (2008)

melaporkan protease Psudoalteromonas sp strain P96-47 yang berasal dari laut

Antartik memiliki pH optimum 7-9. Hal ini menunjukkan bahwa setiap enzim

memiliki pH optimum yang berbeda disebabkan karena komposisi asam amino

penyusunnya berbeda pula.

4.4 Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Protease dari Bacillus licheniformis

HSA3-1a Suhu merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi reaksi enzimatis.

Menurut Kosim dan Putra (2010), peningkatan suhu menyebabkan aktivitas enzim

meningkat. Hal ini disebabkan oleh suhu yang makin tinggi akan meningkatkan

energi kinetik, sehingga menambah intensitas tumbukan antara substrat dan

enzim. Pada suhu optimum, tumbukan antara enzim dan substrat sangat efektif,

sehingga pembentukan kompleks enzim-substrat makin mudah sehingga dapat

meningkatkan aktivitas enzim, namun peningkatan suhu lebih lanjut akan

menurunkan aktivitas enzim. Hal ini disebabkan karena enzim mengalami

35

denaturasi. Denaturasi menyebabkan struktur lipatan enzim membuka pada bagian

permukaannya sehingga sisi aktif enzim berubah dan mengakibatkan terjadi

penurunan aktivitas enzim. Enzim mengalami perubahan konformasi pada suhu

terlalu tinggi, sehingga substrat terhambat dalam memasuki sisi aktif enzim.

Gambar 11. Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease dari Bacillus licheniformis HSA3-1a pada [S] = 2,0%; pH 7

Penentuan suhu optimum protease dilakukan dengan mengukur aktivitas

protease pada berbagai suhu inkubasi yaitu pada rentang suhu antara 40-60°C.

Pada Gambar 11 menunjukkn aktivitas protease semakin meningkat dengan

bertambahnya suhu sampai suhu optimum tercapai yaitu pada suhu 50°C dengan

nilai aktivitas sebesar 0,012 U/mL, setelah itu kenaikan suhu lebih lanjut akan

menyebabkan aktivitas protease menurun. Pada suhu yang lebih rendah dari suhu

optimum, aktivitas enzim juga rendah, hal ini disebabkan rendahnya energi

aktivasi yang tersedia. Energi tersebut dibutuhkan untuk menciptakan kondisi

tingkat kompleks aktif, baik dari molekul enzim maupun dari molekul substrat.

Peningkatan suhu juga berpengaruh terhadap perubahan konformasi substrat

sehingga sisi aktif substrat mengalami hambatan untuk memasuki sisi aktif enzim

36

dan menyebabkan turunnya aktivitas enzim. Dibandingkan dengan penelitian yang

telah dilakukan sebelumnya, dapat diketahui bahwa suhu optimum enzim protease

bervariasi bergantung pada spesies bakteri yang menghasilkannya. Enzim protease

yang telah diisolasi dari B. licheniformis Lbbl-11 memiliki aktivitas tertinggi pada

pH 7 dan suhu 50°C (Olajuyigbe dan Ajele, 2008), sementara menurut hasil

penelitian Kuddus dan Ramteke (2008), enzim protease yang telah diisolasi dari

Curtbacterium luteum memiliki aktivitas tertinggi pada pH 7 dan suhu 20°C.

4.5 Pengaruh Senyawa Kofaktor terhadap Aktivitas Enzim Protease dari Bacillus licheniformis HSA3-1a.

Menurut Bailey dan Ollis (1998), salah satu karakteristik enzim yaitu

memerlukan kofaktor. Kofaktor berupa molekul anorganik. Kofaktor ini terbagi

dua, dimana salah satunya bisa sebagai pengaktif yang dikenal sebagai aktivator

dan ada juga yang berfungsi sebagai penghambat atau yang dikenal sebagai

inhibitor. Salah satu kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim adalah logam yang

dapat mendukung efisiensi katalitik enzim. Logam tersebut membantu reaksi

katalitik dengan cara mengikat substrat pada sisi pemotongan. Selain berperan

dalam pengikatan enzim dengan substrat, beberapa logam juga dapat mengikat

enzim secara langsung untuk menstabilkan konformasi aktifnya atau menginduksi

formasi situs pengikatan atau situs aktif suatu enzim. Menurut hasil penelitian yag

dilakukan oleh Elvi (2002), bahwa ion Ca2+ merupakan aktivator yang dapat

meningkatkan aktivitas enzim protease yang di produksi dari Bacillus subtilis

1012M15. Ion Ca2+ merupakan modulator positif yang menyebabkan perubahan

konformasi sisi katalitik enzim, yang akan mempermudah interaksi dengan

substrat sehingga meningkatkan aktivitas katalitik enzim. Berdasarkan penelitian

37

sebelumnya maka pada penelitian ini dilakukan penambahan senyawa CaCl2

dengan variasi konsentrasi yang berbeda yaitu 0,01 M, 0,015 M, 0,02 M, 0,025 M,

dan 0,03 M dan tanpa penambahan CaCl2 sebagai kontrol untuk mengetahui

kosentrasi optimum CaCl2 yang dapat bersifat aktivator dan inhibitor.

Gambar 12. Pengaruh senyawa kofaktor CaCl2 terhadap aktivitas protease dari B.

licheniformis HSA3-1a pada [S] = 2,0%; pH 7; suhu 50ºC

Data hasil penelitian (Gambar 12) menunjukkan bahwa nilai aktivitas

enzim protease tertinggi pada konsentrasi CaCl2 0,015 M yaitu 0,002, dengan

aktivitas relatif 100% ini menunjukkan bahwa pada kosentrasi 0,015 M CaCl2

bersifat sebagai aktivator sedangkan pada konsentrasi 0,01 M, 0,02 M, 0,025 M

dan 0,03 M, CaCl2 bersifat sebagi inhibitor atau penghambat. Menurut Suhartono

(1989), Adanya penghambatan ion logam terhadap aktivitas protease pada

konsentrasi tertentu berkaitan dengan kekuatan ion, dimana kekuatan ion itu

sendiri mempengaruhi konformasi atau struktur tiga dimensi dari protein enzim

atau protein substrat.

38

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka dapat

disimpulkan bahwa enzim protease memiliki aktivitas sebesar 0,0561 U/mL

dengan waktu produksi optimum 60 jam pada konsentrasi CaCl2 0,015% dan

kadar ptotein 2,0165 mg/mL pada waktu produksi 48 jam.

Enzim protease dari B. licheniformis HSA3-1a tersebut bekerja optimum

pada kondisi pH 7,0 dan suhu 50ºC dengan nilai aktivitas sebesar 0,0104 U/mL

dan 0,012 U/mL, serta mengalami peningkatan aktivitas pada penambahan CaCl2

0,015 M dengan aktivitas relatif 100%

5.2 Saran

Enzim protease merupakan enzim yang memiliki banyak kegunaan baik

itu dalam analisis klinik, di bidang industri, dan pangan sehingga tentunya akan

dibutuhkan dalam jumlah yang besar, maka dari itu perlu dilakukan penelitian

lebih lanjut mengenai senyawa kofaktor lainnya yang dapat mempengaruhi

produksi enzim protease.

39

DAFTAR PUSTAKA

Ali, A., 2005, Mikrobiologi Dasar, Badan Penerbit Universitas Negeri Makassar, Makassar.

Anonim, 2011b, Protease, (Online), (http://id.wikipedia.org/wiki/Protease, diakses

12 Maret 2012). Anonim, 2012a, Kalsium, (Online), (http://id.wikipedia.org/wiki/Kalsium, diakses

12 Maret 2012). Baehaki, A., Rinto., dan Budiman, A., 2011, Isolasi dan Karakterisasi Protease

dari Bakteri Tanah Rawa Indralaya Sumatera Selatan, Fakultas Pertania, Universitas Sriwijaya, 12(1)

Bailey,J.E dan D.F Ollis, 1988, Biochemical Engineering Fundamental, 2nd

Edition, Mc Graw-Hill Book Company, New York. Devi, M.K. dkk., 2008, Purification and Characterization of Alkaline Protease

Enzyme from Native Isolate Aspergillus niger and Its Compatibility with Commercial Detergen, Indian Journal of Science and Technology, 1(7).

Djide, M.N., dan Sartini, 2005, Mikrobiologi Farmasi Dasar, Laboratorium

Mikrobiologi Farmasi Universitas Hasanuddin, Makassar. Dwidjoseputro, D., 1998, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Djambatan, Jakarta.

Falch, E.A. 1991. Industrial enzyrres developments inproduction and application. Biotech. Adv. 9:643-658.

Fersht, A., 1985, Enzyme Structure and Mechanism, 2nd ed., W.H. Freeman and

Company, New York. Fuad, A.M., Rahmawati, R., dan Mubarik, N.R., 2004, Produksi dan

Karakterisasi Parsial Protease Alkali Termostabil Bacillus thermoglucosidasius AF-01, Jurnal Mikrobiologi Indonesia, 9(1): 29–35.

Handayani, N. C, 2009, Pengaruh Penambahan NaCl terhadap Aktivitas Protease

Ekstraseluler Bakteri Halofilik Isolat Bittern Tambak Garam Madura pada Berbagai pH, Skripsi S1 Kimia, FMIPA, UNDIP, Semarang.

Hidayat, N., Padaga, M.C., dan Suhartini, S., 2006, Mikrobiologi Industri, Andi,

Yogyakarta. Ikeda, S., M. Sharyou and R. Kurosaka, 2002, Recent Advanced Technology of

Detergent Enzymes, Fragrance Journal, 30:61-67

40

Karadzic, I., A. Masui, and N. Fujiwara, 2004, Purification and characterization of a Protease from Pseudomonas aeruginosa Grown in Cutting Oil, Journal of Bioscience and Bioengineering, 98(3):145-152.

Kenneth, T., 2009, Nutrition and Growth of Bacteria, University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology.

Kocabiyik, S. and I. Ozdemir, 2006, Purification and Characterization of An Intracellular Chymotrypsin-Like Serin Protease from Thermoplasma Volcanium, Biosci. Biotechnol. Biochem, 70(1):126-134.

Kosim, M., dan Putra, S.R., 2010, Pengaruh Suhu Pada Protease Dari Bacillus

subtilis, Prosiding Skripsi Semester Genap 2009-2010, Jurusan Kimia FMIPA ITS, Surabaya.

Kuddus, M. dan P.W. Ramteke, 2008, A Cold-Active Extracelullar

Metalloprotease from Curtobacterium luteum (MTCC 7529): Enzyme Production and Characterization, J. Gen. Appl. Microbiol., 54:385-392.

Lehninger, A. L., 1982, Dasar-Dasar Biokimia, terjemahan oleh Maggy

Thenawijaya, Erlangga, jakarta. Mao, S.S., dkk., 2008, A Time-Resolved, Internally Quenched Fluorescence

Assay to Characterize Inhibition of Hepatitis C Virus Nonstructural Protein 3–4a Protease at Low Enzyme Concentrations, Analytical Biochemistry, 373(1).

Ming, L, Y., 2001, γ-Secretase: A Catalyst of Alzheimer Disease and Signal

Transduction, Molecular interventions 1:4. Moon, S.H. and S.J. Parulekar. 1993. Some observation on protease producing in

continuous suspention cultures of Bacillus firmus. Biotech. Bioeng. 41:43-54.

Moriyama dkk., 1998, A Cystein-Dependent Serine Protease Associated With The

Dormant Spores of Bacillus Cereus: Purification of The Protein And Cloning of The Corresponding Gene, Biosci. Biotechnol. Biochem, 62(2): 268-274

Mukherjee, A.K., H. Adhikari, dan S.K. Rai, 2008, Production of Alkaline

Protease By a Thermophilic Bacillus Subtilis Under Solid-State Fermentation (SSF) Condition Using Imperata Cylindrica Grass And Potato Peel As Low-Cost Medium: Characterization and Application of Enzyme In Detergent Formulation, Biochemical Engineering Journal, 39(2):353–361

Mulia, I., 2007, Enzim, (Online), (http://metabolismelink. freehostia.com/

enzim.htm, diakses 2 Maret 2012)

41

Natsir, H., Patong, A. R., Suhartono, M. T., dan Ahmad, A., 2010, Production and

Characterization of Chitinase Enzymes from Hot Spring in South Sulawesi, Bacillus sp. HSA3-1a, Indo. J. of Chem, 10(2), 256-260.

Olajuyigbe, M., F., and Ajele, O., J, 2008, Some Properties of Extracellular Protease

from Bacillus licheniformis Lbbl-11 Isolated from “iru”, A Traditionally Fermented African Locust Bean Condiment, Department of Chemical Sciences, University of Trieste, Via Giorgieri, 1, Trieste 34127, Trieste, Italy, 3 (1): 42-46,

Page, D.S., 1989, Prinsip-Prinsip Biokimia, Erlangga, Jakarta. Pelczar, M.J., dan Chan, E.C.S., 1986, Dasar-dasar Mikrobiologi, UI-Press,

Jakarta. Poedjiadi, A., 1994, Dasar-Dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta.

Prasetyo, R. J., 2010, Kurva Pertumbuhan Mikroba, (Online), (http://www.try4know.co.cc/2009/12/kurva-pertumbuhan-mikroba.html, diakses 2 Maret 2012).

Putranto, W.S., 2006, Purifikasi dan Karakterisasi Protease Yang Dihasilkan

Lactobacillus acidophilus dalam Fermentasi Susu Sapi Perah, Makalah disajikan dalam Seminar Nasional Bioteknologi “ Capturing Opportunities through Biotechnology” Pusat Penelitian Bioteknologi – LIPI, Bandung, 15-16 November.

Rachdie, 2006, Prinsip Pertumbuhan Bakteri, (Online), (http://rachdie.blogsome.com/2006/10/14/prinsip-pertumbuhan-bakteri/, diakses 2 Maret 2012).

Rahayu, S., 2004, Karakteristik Biokimiawi Enzim Termostabil Penghidrolisis Kitin (Online), (http://www.rudyct.com/PPS702-ipb/09145/sri, diakses 5 Maret 2012).

Ren, S., dkk., 2004, Isolation of a Cadmium-Releasing Bacterium and

Characterization of Its Novel Protease, Biosci. Biotechnol. Biochem, 68(8):1627-1633.

Rao, M.M., A.M. Tanksale, M.S. Gatge, V.V. Desphande, 1998, Molekular And

Biotechnological Aspect Of Microbial Protease, Mikrobiol. And Mol. Biol. Rev., 62(3):597-635.

Saeki dkk., 2007, Detergent Alkali Proteases: Enzymatic Properties, Genes, and

Crystal Structures, Journal of Bioscience and Bioengineering, 103(6):501-508.

42

Siswanto, Suharyanto, S., dan Yoharmus., 2009, Penggunaan Enzim Protease pada Pengolahan Lateks Pekat DPNR sebagai Bahan Pembuatan Sphygmomanometer, Menara Perkebunan., 77(2), 67-78.

Setyorini, dkk., 2006, Purification and Characterization of Two Novel

Halotolerant Extracelullar Proteases from Bacillus subtilis Strain FP-133, Biosci. Biotechnol. Biochem., 70(2):433-440.

Smith, J.E., 1995, Bioteknologi, Edisi Kedua, Terjemahan A. Hartono, Penerbit

Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Sofa, P., 2008, Mikroorganisme, Bakteri dan Virus, (Online), (http://massofa.

wordpress.com/2008/02/05/mikroorganisme-bakteri-dan-virus/, diakses 5 Maret 2012).

Suhartono, M.T., 1989, Enzim dan Bioteknologi, Pusat Antar Universitas

Bioteknologi IPB-Depdikbud, Bogor. Susanto, J.P., dan Sopiah, N., 2003, Pengaruh Logam dan Konsentrasi Substrat

terhadap Pertumbuhan dan Aktivitas Bakteri Proteolitik pada Proses Deproteinasi Cangkang Rajungan, Balai Teknologi Lingkungan BPPT-Puspitek.

Svehla, G., 1979, Vogel Buku Teks Anorganik Kualitatif Makro dan Semi Mikro,

PT. Kalman Media Pustaka, Jakarta. Tobe, S. dkk., 2006, Expression of Bacillus Protease (Protease BYA) from

Bacillus sp. Y in Bacillus subtilis and Enhancement of Its Specific Activity by Site-Directed Mutagenesis—Improvement in Productivity of Detergent Enzyme, Biol. Pharm. Bull., 29(1) 26—33.

Uchikoba, T., dkk., 2000, Isolation and Some Properties of A Serine Protease

from The Fruits of Cudrania cochinchinensis (Lour.) Kudo et Masam, Biosci. Biotechnol. Biochem., 64(3):623-624.

Vázquez SC, Hernández E, Cormack WPM. 2008. Extracellularproteases from the

Antarctic marine Pseudoalteromonas sp. P96-47 strain. Revista Argentina de Microbiologia 40:63-71.

Walsh, G., 2002, Proteins Biochemistry and Biotechnology, John Wiley and Sons,

Canada. Ward, O.P., 1985, Protgeolytic enzymes. In Young, M.M. (Ed.). Comprehensive

Biotechnology: The principles, Applications, and Regulations of Biotechnology in Industry, Agriculture and Medicine, Vol. 3, Pergamon Press, Oxford.

43

Wiradikusumah, M., Madayanti, Fida., 1990, Teknologi Enzim, Pusat Antar Universitas Biokteknologi, Institut Teknologi Bandung, Bandung.

Winarno, F.G., 1986, Enzim Pangan, PT. Gramedia, Jakarta.

44

Lampiran 1. Skema Isolasi Protease dari B. licheniformis HSA3-1a

- Dikulturkan pada medium NA suhu 500C, pH 7 selama 2-3 hari

- Diambil 2 – 3 ose, lalu ditanam ke dalam media inokulum.

- Diinkubasi pada suhu 500C, 180 rpm, selama 16-20 jam

- Dishaker pada suhu 370C, selama 1-7 hari

(dilakukan sampling setiap 12 jam) - Disentrifugasi 3500 rpm pada suhu 40C

selama 30 menit.

- Analisis Kadar Protein - Uji Aktivitas Enzim Protease

Stok Kultur Isolat B.

licheniformis HSA3-1a

Biakan B. licheniformis HSA3-1a

Inokulum B. licheniformis HSA3-1a

Medium Fermentasi

(Produksi Enzim)

Debris sel Enzim Ekstrak Kasar (Crude)

Data

45

Lampiran 2. Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry

- ditambahkan 2,5 mL Lowry B - diinkubasi pada suhu 250C selama 10 menit - ditambahkan 0,25 mL Lowry A - diinkubasi pada suhu 250C selama 30 menit

dengan sesekali dikocok - diukur absorbansi pada λ optimum BSA

dengan spektrofotometer UV-VIS

1 mL Enzim Ekstrak Kasar

Data Hasil

46

Lampiran 3. Skema Pengujian Aktivitas Enzim Protease

Pereaksi

Sampel (mL)

Blanko (mL)

Standard (mL)

Bufer (0,2 M), pH 7 Substrat kasein 1%, pH 7 Enzim Tirosin standar Akuades

0,5 0,5 0,1 - -

0,5 0,5 - -

0,1

0,5 0,5 -

0,1 -

Inkubasi pada suhu 500C selama 10 menit TCA (0,1 M) Akuades Enzim

1 0,1 -

1 -

0,1

1 -

0,1 Didiamkan pada suhu 500C selama 10 menit, dan disentrifuge 10.000 rpm selama 10 menit Filtrat Na2CO3 Folin (2:1)

0,75 2,5 0,5

0,75 2,5 0,5

0,75 2,5 0,5

Didiamkan selama 20 menit pada suhu 370C Diukur dengan spektrometer pada λ=670 nm

Keterangan:

- Penentuan aktivitas protease berdasarkan senyawa kofaktor digunakan variasi konsentrasi 0,01%; 0,015%; 0,02%; 0,025%; dan 0,03%.

47

Lampiran 4. Peremajaan Bakteri Bacillus licheniformis HSA3-1a dengan penambahan CaCl2

Lampiran 5. Peremajaan Bakteri Bacillus licheniformis HAS3-1a tanpa penambahan CaCl2.

48

Lampiran 6. Penentuan Zona Hidrolisis Bacillus licheniformis HSA3-1a

Lampiran 7. Penyiapan Medium Produksi Enzim Protease dari Bacillus

licheniformis HSA3-1a

Medium produksi Inokulat

49

Lampiran 8. Kurva standar Bovin Serum Albumin pada λ 670 nm

No [BSA]

(mg/mL) Absorban

1 0.02 0.152 2 0.04 0.275 3 0.06 0.38 4 0.08 0.478 5 0.1 0.534

50

Lampiran 9. Data pengukuran Kadar Protein dari Enzim Protease

Kode Absorban fp Konsentrasi Kadar protein

(nilai y) protein (x) ( x X fp) mg/mL

12 jam 0,158 50 0,0176 0,8790

24 jam 0,219 50 0,0337 1,5098

36 jam 0,230 50 0,0325 1,6236

48 jam 0,268 50 0,0403 2,0165

60 jam 0,215 50 0,0294 1,4685

72 jam 0,212 50 0,0341 1,4374

84 jam 0,210 50 0,0283 1,4168

Contoh perhitungan penentuan kadar protein:

Data absorban yang diperoleh disubstitusikan ke dalam persamaan standar

y = 4,835x + 0,073 dimana y adalah absorbansi protein untuk enzim protease.

Diketahui y = 0,268

0,268 = 4,853x + 0,073

4,835x = 0,268 – 0,073

4,835x = 0,195

x = 0,0403 mg/mL

51

Lampiran 10. Data Penentuan pH Optimum Enzim Protease dari B. licheniformis HSA3-1a

No pH Aktivitas Enzim (U/mL)

1 5 0

2 6 0,0099

3 7 0,0104

4 8 0,0064

Lampiran 11. Data pengukuran aktivitas protease dari B. licheniformis HSA3-1a terhadap pengaruh suhu

No Suhu (°C)

Aktivitas Enzim (U/mL)

1

40 0,0083

2

45 0,0092

3 50 0,012

4

55 0,0054

5

60 0,0012

52

Lampiran 12. Data pengaruh kofaktor (CaCl2) terhadap aktivitas protease dari B.licheniformis HSA3-1a

No [CaCl2] (M)

Aktivitas Enzim (U/mL)

1

Kontrol 0,001

2

0,01 0,0001

3

0,015 0,002

4

0,02 0,001

5

0,025 0,001

6

0,03 0,0001