KULIAH PENGANTAR DASAR2 IMUNOASAI

Jusak Nugraha2015

PENGANTAR IMUNOASAI (SEROLOGI) DASAR Imunologi mempelajari reaksi tubuh terhadap masuknya Ag & efek dari Ab yang terbentuk / telah ada pd Ag tsb. Perkembangan Imunologi membutuhkan sarana untuk mengukur derajat imunitas / [Ab] dalam tubuh.

Reverse Serologi : Bila Ab diket untuk menentukan Ag yang tak diketahui.

Uji serologi (Imunoasai).

IMUNOASAI: UJI SEROLOGI + Reverse Serologi

1. Konsep Dasar Imunoasai

Reaksi Ag dan Ab ; terdiri dari beberapa tahap

a. Tahap awal : Ag + Ab Ag-Ab

b. Tahap Desosiasi : Ag-Ab Ag + Ab

c. Tahap keseimbangan ( equilibrium ): Ag + Ab <=> Ag- Ab

Afinitas Ab thd Ag ukuran kekuatan ikatan Ag-Ab Makin besar afinitasnya, makin banyak ikatan Ag-Ab pada saat equilibrium.

-S-S--S-S--S-S-

Regio variabel

L H L H

Fc

Fab

Gambar 1. Struktur dasar dari molekul antibodi L = Light Chain H = Heavy chain

2. Komponen yg terpenting dalam serologi yaitu ANTIBODI

Beberapa Istilah penting dlm Imunoasai

Ikatan Ab-Ag adalah spesifik seperti kunci-anak kunci. Reaksi silang dapat terjadi dengan struktur mol Ag lain yang mirip dengan Ag pasangannya tergantung dari :

- profil spesifitas Ab-nya &- kemurnian Ag-nya

Ab yang amat spes. = Ab dengan binding sites yang hanya dapat mengikat Ag dengan struktur molekul yang unik saja.

a. Spesifitas dari Ab

x

y

z

x

y

z

Antigen I Antibodi I

Antigen II

v

w

x v

w

x

X

Y

Z

X

Y

Z

V

W

X

X

Y

Z

Gambar 2. Kompleks dua antigen yang memiliki satu epitop yang sama (X) dan berbagai macam antibodi

yang mungkin terbentuk

Antibodi II

b. Ukuran kuantitas Ab

Ada beberapa cara tentukan konsentrasi Ab dalam serum.

- Kualitatif pos. /neg. adanya perubahan fisik dari bahan pemeriksaan.

- Semi kuantitatif ; ditentukan dengan pengenceran serum secara progresif Titer

- Kuantitatif ; ditentukan dengan menggunakan beberapa sera baku kurva baku. Akurasi dicek dengan serum kontrol. Hasilnya diinterpolasi ke dalam kurva baku.

Gambar 3. Kurva baku uji ELISA

0Kadar Bahan

X

OD

5 g/dl

VALIDITAS KLINIS (NILAI DIAGNOSTIK) IMUNOASAI.

SENSITIVITAS Dx = FN TP

TP

Pd. Pend. Peny. TTT

SPESIFISITAS Dx = FP TN

TN

Pd. Bukan Pend. Peny. Tsb.

EFISIENSI Dx = N

TN TP N = Pend. + Bukan Pend.

NRN Dx =

NRP Dx =

FN TN

TN

FP TP

TP

FAKTOR-2 DASAR YG MEMPENGARUHI IMUNOASAI

Sifat dari Ag. Ab diberi nama sesuai dengan cara penentuan yang paling sens. Mis : aglutinin, presipitin dll

Elektrolit dan pH2

1

Waktu dan suhu. Reaksi Ag-Ab terjadi dalam 2 tahapa. Ikatan spesifik Ab dg Ag/Hapten yang sesuaib. Terjadi reaksi yg dapat dilihat (presipitasi dll)

3

Mekanisme Daya Tahan NonspesifikBahan yg normal/abnormal terdapat dalam sekret/cairan tubuh.

4

Rasio Ag dan Ab5

Prozone,Tak ada presipitasi

Equivalent zone,Presipitasi

Post zone,Tak ada presipitasi

Gambar 4. Berbagai macam rasio Ag – Ab dan implikasinya

= ANTIBODI

= ANTIGEN

BAHAN PEMERIKSAAN UTK IMUNOASAI

MACAM BAHAN : serum , plasma, css Usahakan jangan hemolisis

Inaktivasi C 56°C, 30 menit

Ag untuk Imunoasai. Sebaiknya dibuat sendiri dari strain lokal, lebih baik yang multistrains.

IMUNOASAI

KADAR BAHANKADAR BAHAN

RENDAH ( ng/ml, pg/ml ) TINGGI (mg/ml,ug/ml)

Hasil reaksi tak tampak

FAKTOR PENGUAT (LABEL)

IF RIA EIA

Homogen Heterogen = ELISA

Hasil reaksi DAPAT DILIHAT

RID

UJI AGLUTINASI

ICA

UJI PRESIPTASI UJI AGLUTINASI UJI FIKSASI KOMPLEMEN UJI NETRALISASI TOKSIN

I. IMUNOASAI TAK BERLABEL

Ada 2 jenis imunoasai.I. IMUNOASAI TAK BERLABELII. IMUNOASAI BERLABEL

JENIS IMUNOASAI

Ag yang larut Antibodi

PRESIPITASI

Gambar 5. Prinsip dasar uji presipitasi

UJI PRESIPITASI

Ag.

Serum dengan Ab

Inkubasi

Presipitasi

Gambar 6. Uji presipitasi tabung

Serum dengan Ab

Ag

Aplikasi : Uji VDRL Mikro

Rotasi

(dengan rotator)

Presipitasi (+)

Tak ada Presipitasi (-)

Gambar 7. Uji presipitasi lempeng (Slide)

1 2Agar

Ag. dlm sumur 1

Ab. dlm sumur 2

Gambar 8 . DIFUSI GANDA SEDERHANA

1 2

Garis presipitasi

Ag. dlm sumur 1

Ab. dlm sumur 2

GAMBAR 9. Uji ELEK

Antisera dalam agar

GAMBAR 10. R.I.D

1

3

4

5

6

7

8 2

Sera baku

Tes serum

Tes serum

Tes serum

Tes serum

Tes serum

APLIKASI KLINIS UJI PRESIPITASI

Uji Tabung : VDRL - Makro

Uji Slide : VDRL - Mikro

Uji Tabung Kapiler : Penentuan CRP

Uji Difusi Ganda Sederhana : Uji ELEK

RID : Penentuan kelas Ig

Ag. pada permukaan sel

Ab.Aglutinasi

Gambar 11. Prinsip dasar reaksi aglutinasi

UJI AGLUTINASI

Tak larut

+ -Gambar 12. Uji Aglutinasi Slide

Gambar 13. Uji Aglutinasi tabung

Serum ( Ab )

Susp. Ag

Inkubasi

Aglutinasi

AGLUTINASI TAK LANGSUNG

A. AGLUTINASI PASIF

B. Ab TAK LENGKAP

a. Ab Monovalen

b. Lokasi Tersembunyi / Ukuran Terlalu Kecil ( Ig. G )

+ +Ag Larut

PartikelPartikel disalut Ag

Ab dalam serum

AglutinasiGambar 14. Uji aglutinasi pasif

APLIKASI KLINIS UJI AGLUTINASI

¨ Uji Slide (lempeng): uji Widal slide

Uji Tabung : uji Widal tabung

Aglutinasi Tak Langsung: uji Rose-Waaler

III. UJI HEMAGLUTINASI : KULIAH Bank Drh

IV. UJI LISIS IMUN & FIKSASI KOMPLEMEN

Hampir sama dengan uji aglut. tak langsung,

Hanya Anti – Ig diganti C Lisis Imun

Komplemen

Sensitized cell

AbAg pada permukaan sel

= Komplemen

Gambar 15 . Prinsip dasar uji lisis imun

Uji Lisis Imun

Gambar 16 . Uji Fiksasi Komplemen

A.

C CTak ada

Lisis

Komplemen Komplemen

Terikat

Sensitized SDM

B.

C C Lisis

Komplemen Komplemen

Bebas

Serum dgn. Ab

Serum tanpa Ab

Uji Positif

Uji Negatif

A.

Gambar 17. Uji Netralisasi Toksin Contoh : Uji ASO

Tak hemolisisSDM

Kompleks SO-ASO

SO ASO

SOB.

Reaksi Positif

Serum tanpa ASO

SOSDM

Reaksi Negatif

Hemolisis

II. IMUNOASAI BERLABEL

1. CAT FLUORESENS: IF

2. RADIOISOTOP: RIA

3. ENZIM: IMUNOASAI ENZIM ( EIA )

A. EIA HOMOGEN

B. EIA HETEROGEN (ELISA)

C. UJI IMUNO-PEROKSIDASE

4. EMAS KOLOIDAL:ASAI IMUNOKROMATOGRAFIK (ICA)

CUCI

Mikroskop Fluoresens

Ab diket berlabel cat fluoresensAg tak diket.

Fiksasi pada slide

Kompleks Ag-Ab Berfluoresensi

Gambar 18. Prinsip dasar uji imunofluoresens langsung.

1. IMUNOASAI FLUORESENS (IF)

CuciAg diket.

Ab tak diket

Cuci

Mikroskop Fluoresens

Kompleks Ag – Ab tak tampak

AHG dilabel Fluorescein

Kompleks Ag – Ab – AHG berfluoresensi

Gambar 19. Prinsip dasar uji imunofluoresens tak langsung.

KELEMAHAN UJI IF

Peralatan canggih dan mahal

Perlu tenaga terlatih

Per hari maks 25 slide / analis

Sukar dibuat otomatis

Pelaksanaan agak kompleks & membosankan

Gambar 20. Prinsip dasar Uji RIA R = label radioisotop

R

RRR

RR

R

R

R

Radiation Counter

2. Uji RIA

PEMISAHAN Ag / Ab BERLABEL yg TERIKAT drp yg BEBAS

Paper Electrophoresis

Presipitasi

Adsorbsi

IMOBILISASI pd FASE PADAT

Gambar 21. Prinsip dasar Uji RIA kompetitif

R

R

R

R

R

R R

RADIATION COUNTER

Cuci

KELEMAHAN UJI RIA

Butuh alat mahal & tenaga terlatih

Waktu paruh reagens amat pendek ( 1,5 – 2 bln )

Perlu perlindungan khusus pd petugas lab.

Perlu tempat pembuangan reagens yang khusus

BERBAGAI MACAM EIA :

A. EIA yang HOMOGEN; label berbeda sifat tergantung pada keadaan reagensianya TERIKAT/TIDAK pada lawan reaksinya TAK MEMBUTUHKAN PEMISAHAAN

B. EIA yang HETEROGEN; label TAK berbeda sifat baik reagensinya dalam keadaan terikat maupun BEBAS pada lawan reaksinya PERLU PEMISAHAAN bag. terikat dari yang bebas

3. Imunoasai Enzim (EIA)

SUBSTRAT BERKROMOGEN

PRODUK berwarna

Ab pada Fase padat

Ag berlabel enzim

Gambar 22. Prinsip dasar uji ELISA kompetitif

Uji ELISA

Ag dlm serum

SUBSTRAT berkromogen

PRODUK berwarna

Ag

Ab I pada Fase padat

Ab II berlabel enzim

Gambar 23. Prinsip dasar double antibody sandwich ELISA

Gambar 24. Prinsip dasar uji ELISA tak langsung

Ab

PRODUK berwarna

SUBSTRAT berkromogen

Ag pada Fase padat

Anti –Ig berlabel enzim

4. ICA / Uji Aliran Samping ( lateral flow test ) atau uji strip Asai Berlabel Spt IFA, RIA & EIA

BEDA DENGAN IFA & RIATak perlu alat canggih Dibaca dg mata

telanjang Amat praktis

BEDA DENGAN EIA / DOT EIA Tak perlu substrat berkromogen* Waktu pemeriksaan <

* Konjugat dg label colloidal gold Amat sensitif

Waktu pemeriksaan << 90 det – 15 men

* Bantalan Abs Aliran reagen ke lateral > cepat

Jadi : ICA Sarana lab yang Praktis

Andal

Amat dibutuhkan di negara sedang berkembang

DASARNYA : Tiap legan yang dapat diikat pada partikel padat berwarna (mikrosfer) dapat dipakai untuk uji ICA

Contoh : tes kehamilan, Strepthroat, Chlamydia & ICT-TB

PRINSIP DASAR ICA (UJI STRIP)

Dapat dipakai untuk melacak analit maupun Ab.

I. ICA untuk melacak analit.

Ada 2 cara pendekatan utama yaitu :

• NON- KOMPETITIF (Langsung) &

• KOMPETITIF / HAMBATAN KOMPETITIF

GAMBAR 25

Bila sampel berisi analit ikatan analit-konjugat ikut aliran lateral ditangkap oleh Ab ke 2 pd grs pengikat

warna. Syarat: 1. Mol. analit cukup besar ( 2 epitope)

2. [analit] < [Ab pengikat] atau [Ab pelacak]

Sisa konjugat bergerak terus ( diisap oleh bantalan Abs)

ditangkap oleh Ab spec. spes. pada garis kontrol warna

Gambar 26

= emas koloidal= Ag/analit= Ab pelacak (konjugat)= Ab pengikat (Ab ke 2)= Ab spesies spesifik pd grs kontrol

Sample Flow

II. ICA untuk melacak antibodi

Dipakai 2 prinsip dasar asai tak langsung (indirect assay)

1. Ab (serum) Ag (capture line) kompleks Ag-Ab konjugat Ag-Ab-Konj (di garis pengikat)

2. Ab konjugat diikat Ag pada garis pengikat (capture line) sisa konjugat dihisap oleh absorben pad diikat oleh antikonjugat (contol line)

AbAH Glob berlabel coloidal gold Ag Antikonjugat

Gambar 28

Sample pad(bantalan sampel)

Conjugate pad(bantalan konjugat)

Capture line (garis pengikat)Mengandung Ag1 epitop protektif2 epitop infeksi berat

Garis kontrol/control line(mengikat sisa konjugat)

Absorbance pad(bantalan absorban)

1 2

1 2 Kontrol

TB aktif

1 2 Kontrol

1 2 Kontrol

Tertular tidak sakit

Teknik salah/reagens rusak

Contoh aplikasi ICT-TB.

Session I selesai..!!

PENENTUAN C-REAKTIF PROTEIN

(CRP)

Dr. Jusak Nugraha, dr, MS, SpPK (KGH,K-Im,KT-I)

Dr. Jusak Nugraha, dr, MS, SpPK (KGH,K-Im,KT-I)

Bagian Patologi KlinikFK UNAIR / RSUD Dr. Soetomo, Surabaya

APA ??? - Tergolong dalam Protein Fase Akut - Serum normal; jumlah kecil

- Radang /nekrosis ; dapat sampai 1000 X

INDIKASI PEMERIKSAAN.

1. Membantu menegakkan Dx kead. penyakit radang/ nekrosis

2. Mengikuti hasil Tx peny. radang akut/nekrosis.

Gambar 43. Sintesis dan aktivitas biologis dari CRP

HEPAR

IL-1, IL-6 PGE1

CRP

Mengikat bakteria presipitasi

Aktivitas & motilitas fagosit

Aktivasi C ( klasik & alternatif )

Menghambat agregasi trombosit (Adrenalin, ADP maupun kolagen)

Mempunyai daya ikat selektif terhadap Limfosit T.

COLCHICIN

NEKROSIS JARINGAN

Gambar 44. Perubahan kadar CRP-serum setelah suatu operasi tanpa penyulit

Jam setelah operasi

PRINSIP DASAR PENENTUAN CRP

Merupakan reverse serology.Ada 2 prinsip dasar dari berbagai cara yg dipakai

1. UJI PRESIPITASI

CRP Ag yang akan ditentukan, dg anti – CRP yang diketahui.

2. UJI AGLUTINASI PASIF

Merupakan reverse passive agglutination test

Anti – CRP pada partikel

CRP dalam serum

AGLUTINASI

Gambar 45. Prinsip dasar REVERSE PASSIVE AGGLUTINATION TEST

CARA PEMERIKSAAN.

1. CARA PRESIPITASI KAPILER

Tinggi presipitat diukur dalam mm; 1 mm = + , 2 mm=++.

2. CARA AGLUTINASI LATEKSPos. 0,5 mg/dl. Neg encerkan 1:10

3. R.I.D : Ukur diameter cincin presipitasi. Tentukan kadar CRP dg kurva baku.

HARGA NORMAL : RIA 1,3 mg/1 ( 0,068-8,2 mg/1 )

4. Nephelometris : Amat sensitif. (Tes hs-. CRP)

Positif

NegatifGambar 47. Uji aglutinasi slide / lempeng

NILAI KLINIS/FISIOPATOLOGIS.

Liniaritas & aselaritasnya amat baik .

PENGGUNAAN KLINIS.

1. Uji penyaring peny. organik ; pada radang / nekrosis CRP

2. Penentuan aktivitas peny. radang ; punya kelebihan daripada indikator nonspesifik lain ( LED, pyrexia dll ).3. Membantu Dx & evaluasi hasil Tx dr peny. infeksi. ( Septikemis pada anak, SLE disertai infeksi )

Session II Selesai..!!

PENENTUAN FAKTOR RHEMATOID( RHEUMATOID FACTOR )

UJI ROSE – WAALER DAN MODIFIKASINYA

Dr. Jusak Nugraha, dr, MS SpPK

(KGH, K-Im,KT-I)

Dr. Jusak Nugraha, dr, MS SpPK

(KGH, K-Im,KT-I)

Bagian Patologi KlinikFK UNAIR / RSUD Dr. Soetomo, Surabaya

Apa ???Faktor rhematoid ( RF )= otoantibodi (Ig M, Ig G, Ig A ) yang ditujukan thd Ig G (anti-Ig G) & terbentuk dalam stadia agak lanjut dari penyakit artritis rhematoid ( RA )UJI ROSE-WAALER / AGLUT. LATEKS.Hanya Ig M anti-Ig G yg dapat ditentukan.INDIKASI PEMERIKSAAN.Membantu menegakkan Dx & menentukan prognosis penyakit RA

Ag X ( EBV ) SENDI

SEL-2 IMUNOKOMPETEN Limfosit -- B

T- Suppressor ( terganggu )

T-Helper

Sel Plasma

RF ( Anti-Ig G ) Ig M, Ig G & Ig A

Anti X – Ab (terut. Ig G)

IMUNOPATOGENESIS ARTRITIS REMATOID

Gangguan glikosilasi

IgG

+ +Ag Larut

Partikel

Partikel disalut Ag

Ab dalam serum

AglutinasiGambar 48. Aglutinasi pasif

UJI ROSE-WAALER.

SERUM * Waterbath 50°C, ½ jam

Encerkan secara serial ( 1/32 – 1/1792 )

Tambahkan susp SDM ( 5 % ) yg sensitized

INKUBASI 4°C 18 jam

Baca adanya aglutinasi (HN 1:32)

* Untuk hilangkan aglutinin nonspesifik (Ab heterofil), serum & SDM domba yang dipadatkan ( 4 : 1 ), inkubasi 40 men, 2 kali.

Gambar 49. Uji Rose-Waaler

Gambar 50. Uji Rose-Waaler. Untuk memastikan hasil positif atau negatif

NILAI KLINIS/FISIOPATOLOGIS .

Tidak begitu baik. Faktor2 yang perlu diperhatikan 1. Pos pada 70 – 80 % pend RA ( 6 – 12 bl )

2. Pos. stad dini/titer amat tinggi prog. jelek3. 20 – 30% kasus RA tes tetap neg prog. baik4. Korelasi pos. dg nod subcutan, arthritis pergelangan tangan asimetris dg deformitas & manifestasi viseral RA

5. Hasil pos terdapat juga pada :a. SLE ( 30 – 50 % )b. Scleroderma ( 30% )c. Sjörgen’s syndrome ( 75% )d. Endocarditis lentae. Hepatitis menahun & agresiff. Beberapa peny. virus (Herpes zoster,

influenza A, Viral hepatitis)g. Orang normal : 4 - 6%

6. Peny. Sendi dg hasil tes yg negatif :Gout, Artrosis, Demam rhematik, Ankylosing spondylitis, Reiter’s disease & psoriatic arthritis

Session V selesai…!!

PENENTUAN ANTISTREPTOLISIN O (ASO)

Dr. JusakNugraha, dr, MS, SpPK (KGH,KIm,KT-I)

Dr. JusakNugraha, dr, MS, SpPK (KGH,KIm,KT-I)

Bagian Patologi KlinikFK UNAIR / RSUD Dr. Soetomo, Surabaya

ASO ??? Ab thd enzim proteolitik SO.

SO ??? Produk ekstra-seluler dr -hemolitik streptococcus group A,C humanus & G dari Lancefield

Aktivitas biologik ; merusak dinding SDM

INDIKASI PEMERIKSAAN.

1. Bantu menegakkan Dx demam rhematik & glomerulonephritis akut.

2. Meramalkan, relapse pada demam rhematik

Streptolisin O, S Streptokinase

Hyaluronidase Diphosphopyridine nucleotidase

Desoxyribonuclease A, B, C, a

b

c

d

Gambar 56. Struktur antigen -hemolitik streptococcus group A dari Lancefield. a = kapsul, b= komponen permukaan dari dinding sel (CSMA) , c= dinding sel, d= komponen intraseluler.

-hemolitik streptococcus group A

CSMA

SO SS STREPTOKINASEHyaluronidase

DNAse

SEL - SEL IMUNOKOMPETEN

Anti

CSMAASO (Spesifik)

ASS (tak spesifik)

REAKSI SILANG DG ENDOCARD & GBM DEMAM RHEMATIK

ANTIBODI

A. Tak ada hemolisisSDM

Kompleks SO-ASOSO ASO

SOB.

Reaksi Positif

Serum tanpa ASO

SOSDM

Reaksi Negatif

Hemolisis

Gambar 57. Prinsip dasar uji Antistreptolisin O

Gambar 58. Prinsip dasar uji aglutinasi lateks ASO

AGLUTINASI (POSITIF)

SO, JUMLAH TERTENTU ASO

SO pd LATEKS

Serum pend. (ASO > 200 iu)

HARGA NORMAL :

Batas atas ; 200 iu/ml. Pd 20 % orang normal>200 iu/ml

Dipengaruhi usia & geografi/iklim.

- Bayi baru lahir ; > tinggi daripada Ibunya dengan tajam dalam beberapa minggu

- Usia sekolah ; titer mulai sp titer usia dewasa

- Usia lanjut ; titer lagi.

- Titer normal bila makin dekat katulistiwa

NILAI KLINIS/ FISIOPATOLOGIS .

- Kurang baik ; 20 % orang normal ASO 200 iu- Periksa 1X tak punya arti DX yang penting.- ASO pos ada/pernah infeksi dengan Streptococcus, dan tak berarti penderita suatu peny. tertentu ( demam rhematik ). - Penyakit-2 hepar, ginjal & hyperlipidemia pos. semu o.k. inhibator nonspesifik absorbsi/LAT

TERIMA KASIH ATAS PERHATIAN ANDA