\

i

PENENTUAN KETERULANGAN BIOSENSOR

ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK Deinococcus radiodurans

DAN PERBANDINGAN METODE ELEKTROKIMIA

DENGAN SPEKTROFOTOMETRI

NIKE NURJANAH FERINDA

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

ii

\

iii

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER

INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Penentuan

Keterulangan Biosensor Antioksidan dari Ekstrak Deinococcus radiodurans dan

Perbandingan Metode Elektrokimia dengan Spektrofotometri adalah karya saya

dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun

kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip

dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah

disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir

skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, September 2014

Nike Nurjanah Ferinda

NIM G44100012

iv

\

v

ABSTRAK

NIKE NURJANAH FERINDA. Penentuan Keterulangan Biosensor Antioksidan

dari Ekstrak Deinococcus radiodurans dan Perbandingan Metode Elektrokimia

dengan Spektrofotometri. Dibimbing oleh DYAH ISWANTINI PRADONO,

NOVIK NURHIDAYAT, dan DEDEN SAPRUDIN.

Metode elektrokimia biosensor antioksidan merupakan metode alternatif

dalam pengukuran kapasitas antioksidan. Metode ini memiliki sensitivitas yang

lebih tinggi, biaya yang lebih murah, dan instrumentasi lebih sederhana

dibandingkan metode spektrofotometri. Penelitian ini bertujuan melakukan

optimisasi aktivitas superoksida dismutase (SOD) dari ekstrak Deinococcus

radiodurans terimobilisasi zeolit, uji keterulangan, dan perbandingan limit

deteksi metode elektrokimia dengan spektrofotometri. Kondisi optimum aktivitas

antioksidan SOD dari ekstrak D. radiodurans adalah suhu 31 °C, pH 9, dan zeolit

137.5 mg. Arus optimum yang diperoleh dari keterulangan sebesar 1.749 µA

dengan simpangan baku 0.01 dan koefisien keragaman sebesar 0.59%. Nilai limit

deteksi untuk biosensor elektrokimia sebesar 1.76 ppm. Nilai tersebut lebih

rendah dibandingkan limit deteksi untuk spektrofotometri, yaitu 2.01 ppm.

Metode elektrokimia dapat mendeteksi analit dengan konsentrasi yang lebih

rendah.

Kata kunci : biosensor antioksidan, D. radiodurans, keterulangan, limit deteksi,

superoksida dismutase

ABSTRACT

NIKE NURJANAH FERINDA. Determination of Antioxidant Biosensor

Repeatability from Deinococcus radiodurans Extract and The Comparison

Methods between Electrochemical and Spectrophotometry. Supervised by DYAH

ISWANTINI PRADONO, NOVIK NURHIDAYAT, and DEDEN SAPRUDIN.

Biosensor electrochemical method for antioxidant is an alternative method

in measuring the capacity of antioxidant. This method has higher sensitivity,

lower cost and simple instrumentation compare to spectrophotometry. The

objective of this research was to optimize the activity of SOD extract of

immobilized zeolite-Deinococcus radiodurans, repeatabillity, and the comparison

of detection limit between electrochemical and spectrophotometry method. The

optimum condition of SOD antioxidant activity of D. radiodurans extract was

obtained at temperature of 31 °C, pH 9, and zeolites 137.5 mg. The optimum

current obtained from the repeatibility was 1.749 µA with standard deviation of

0.01, and coefficient of variation of 0.59%. Detection limit of electrochemical

biosensor was 1.76 ppm, while spectrophotometry has lower detection limit with

value of 2.01 ppm. Electrochemical method can be used to detect lower

concentrations analytes.

vi

Key words : antioxidant biosensor, D. radiodurans, repeatibility, limit of

detection, superokside dismutase

\

vii

NIKE NURJANAH FERINDA

Skipsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains

pada

Program Studi Kimia

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

PENENTUAN KETERULANGAN BIOSENSOR

ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK Deinococcus radiodurans

DAN PERBANDINGAN METODE ELEKTROKIMIA

DENGAN SPEKTROFOTOMETRI

viii

\

ix

Judul Skripsi : Penentuan Keterulangan Biosensor Antioksidan dari Ekstrak

Deinococcus radiodurans dan Perbandingan Metode

Elektrokimia dengan Spektrofotometri

Nama : Nike Nurjanah Ferinda

NIM : G44100012

Disetujui oleh

Dr Novik Nurhidayat Dr Deden Saprudin, MSi

Pembimbing II Pembimbing III

Diketahui oleh

Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS

Ketua Departemen

Prof Dr Dyah Iswantini Pradono, MSc Agr

Pembimbing I

x

Tanggal Lulus :

\

xi

xii

PRAKATA

Puji syukur saya panjatkan ke hadirat Allah SWT karena berkat izin-Nya

saya dapat menyelesaikan proposal penelitian ini. Shalawat serta salam saya

curahkan kepada Nabi besar Muhammad SAW, sahabat, dan pengikutya hingga

akhir zaman. Ucapan terima kasih yang sebesarnya kepada ayahanda dan ibunda

tercinta, Ceprison dan Afrida, kepada uda Rindo Ferindo, uni Fika Ferinda, uni

Wulan dari, dan uda Riko Putra yang dengan kesabaran dan keikhlasan telah

memberikan dorongan moral, material, dan doa yang tulus.

Penulis mengucapkan rasa terima kasih yang tulus kepada Prof Dr Dyah

Iswantini Pradono MSc Agr, Dr Novik Nurhidayat, dan Dr Deden Saprudin MSi

selaku komisi pembimbing. Terima kasih saya ucapkan juga untuk Bu Neri, Mbak

Ratih, pak Acun di PUSLIT Biologi LIPI Cibinong, Bu Ai, Pak Mail staf laboran

Kimia Fisik, Pak Eman dari Kimia Analitik. Ungkapan terima kasih juga

disampaikan kepada Kak Aji yang mengarahkan dalam proses penelitian,

sahabatku Ana, Uci, dan Dina yang memberikan semangatnya, Mita, Ali, Kinan,

Asri, dan teman-teman seperjuangan di Kimia.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, September 2014

Nike Nurjanah Ferinda

\

xiii

xiv

DAFTAR ISI

DAFTAR GAMBAR xv

DAFTAR LAMPIRAN xv

PENDAHULUAN 1

BAHAN DAN METODE 3

Alat dan Bahan 3

Metode 3

HASIL DAN PEMBAHASAN 6

Penumbuhan Sel Deinococcus radiodurans dan Ekstraksi Enzim SOD 6

Pengukuran Arus Elektrode Pasta Karbon 6

Aktivasi Zeolit 7

Imobilisasi Enzim 7

Pengoptimuman Aktivitas SOD Terimobilisasi 9

Limit Deteksi dan Limit Kuantitatif dengan Metode Elektrokimia dan

Spektrofotometri 10

SIMPULAN DAN SARAN 13

Simpulan 13

Saran 13

DAFTAR PUSTAKA 13

RIWAYAT HIDUP 29

\

xv

DAFTAR GAMBAR

1 Voltamogram siklik pada pengukuran larutan K3Fe (CN)6 0.01M 7

2 Voltamogram siklik pada suhu 20 °C, bufer fosfat pH 9, dan zeolit

137.5 mg 8

3 Mekanisme pengukuran biosensor antioksidan 9

4 Alur kontur hubungan antara suhu dan pH (a), suhu dan zeolit (b),

dan pH dan zeolit (c) terhadap aktivitas antioksidan D. radiodurans. 10

5 Hubungan penurunan arus terhadap penambahan vitamin C 11

6 Hubungan penurunan arus terhadap penambahan ekstrak daun jambu

biji 11

7 Hubungan absorban terhadap penambahan vitamin C metode DPPH 12

8 Hubungan absorban terhadap penambahan ekstrak daun jambu biji

metode DPPH 12

DAFTAR LAMPIRAN

1 Bagan alir penelitian 16

2 Ekstraksi SOD 16

3 Kombinasi faktor-faktor peubah bebas bakteri D. radiodurans dengan

penambahan zeolit 18

4 Hasil optimasi bakteri D. radiodurans dengan penambahan zeolit 19

5 Keterulangan pengukuran hasil atioksidan D. radiodurans kondisi

optimum 20

6 Penentuan limit deteksi dan limit kuantitatif metode elektrokimia 21

7 Penentuan limit deteksi dan limit kuantitatif metode elektrokimia

menggunakan ekstrak daun jambu biji 23

8 Penentuan limit deteksi dan limit kuantitatif metode DPPH 25

9 Penentuan limit deteksi dan limit kuantitatif metode DPPH

menggunakan ekstrak daun jambu biji 27

PENDAHULUAN

Radikal bebas merupakan molekul yang pada orbit terluarnya mempunyai

satu atau lebih elektron tak berpasangan, sifatnya sangat labil, dan sangat reaktif

sehingga diperlukan suatu senyawa untuk menangkap radikal bebas tersebut.

Antioksidan merupakan zat yang dapat menghambat reaksi oksidasi oleh radikal

bebas yang menyebabkan kerusakan. Substansi antioksidan dalam melindungi

tubuh dari serangan radikal bebas berfungsi menstabilkan radikal bebas dengan

melengkapi kekurangan elektron dari radikal bebas sehingga menghambat

terjadinya reaksi berantai (Windono dan Soediatmoko 2001). Oleh karena itu,

diperlukan metode atau teknik yang tepat dalam pengukuran sifat antioksidan.

Metode atau teknik yang dapat digunakan dalam menentukan sifat-sifat

antioksidan adalah teknik spektrofotometri, fluoresensi, kromatografi gas atau cair,

dan sebagainya (Campanella et al. 2000). Metode spektrofotometri telah

dikembangkan sebelumnya tetapi memiliki beberapa kelemahan diantaranya biaya

yang mahal karena menggunakan bahan kimia yang bermacam-macam dalam

jumlah yang banyak, waktu yang lama dalam preparasi sampel, dan kurang

sensitif terutama dalam menguji sampel berwarna serta sangat dipengaruhi oleh

kekeruhan atau turbiditas.

Metode alternatif yang dikembangkan dalam mengukur sifat-sifat

antioksidan adalah biosensor antioksidan. Metode ini memiliki kelebihan yaitu

waktu analisis cepat, biaya instrumen yang tidak mahal, dan operasi yang

sederhana yang tidak tergantung pada konsentrasi analat. Biosensor antioksidan

ada dua jenis yaitu biosensor amperometri untuk menguji kapasitas antioksidan

mono dan polifenol berbasis enzim tirosinase, laktase atau peroksidase dan

biosensor untuk pengujian kapasitas antioksidan berdasarkan penangkapan radikal

bebas. Berdasarkan aktivitas penangkapan radikal bebas tipe biosensor

dikembangkan menggunakan sitokrom c, dan enzim superoksida dismutase

(SOD) (Prieto-Simon et al. 2008). Biosensor antioksidan berbasis SOD lebih

sensitif dan spesifik, telah terbukti dapat mengukur kapasitas antioksidan berbagai

jenis bahan alam, produk makanan dan minuman, serta farmasi. Penggunaan SOD

murni memiliki kekurangan, yaitu harga yang mahal dan kestabilan enzim yang

rendah. Solusi dari kekurangan tersebut adalah penggunaan bakteri yang

menghasilkan SOD sebagai sensor. Bakteri yang digunakan adalah Deinococcus

radiodurans. Bakteri ini bersifat resisten terhadap radiasi ultraviolet, ionisasi,

desikasi, dan adanya ROS atau spesi oksigen reaktif. Bakteri D. radiodurans

menghasilkan enzim yang dapat diinduksi untuk meningkatkan aktivitasnya yaitu

Mn-SOD.

Biosensor berbasis SOD telah terbukti dapat mengukur kapasitas

antioksidan pada anggur merah dan anggur putih (Campanella et al. 2004), teh

(Gil 2011), dan minyak zaitun (Coban 2008). Pengukuran kapasitas antioksidan

anggur merah dan anggur putih yang dilakukan oleh Campanella et al. (2000)

menunjukkan metode biosensor lebih sensitif dibandingkan metode fluorimetri

dan spektrofotometri yang menghasilkan perbedaan kapasitas antioksidan yang

besar. Metode biosensor amperometri lebih teliti dengan nilai RSD = 7.9%.

Penelitian yang dilakukan oleh Safrizal (2011) membuat biosensor berbasis SOD

dan menghasilkan nilai r = 0.9761 dan R² = 95.28% pada rentang konsentrasi

2

xantina 0.200­0.275 mM. Kondisi optimum aktivitas SOD murni yang diperoleh

pada konsentrasi 10 unit dengan waktu respons 4 detik dan elektrode stabil

disimpan dalam larutan bufer pH 11 pada suhu 20 oC selama 72 jam.

Kestabilan enzim perlu dijaga untuk menghasilkan kerja yang maksimum,

salah satu caranya dengan melakukan imobilisasi pada nanomaterial.

Shumyantseva et al. (2005) menggunakan nanopartikel emas yang menghasilkan

sensitivitas yang tinggi dari biosensor kolesterol dengan sitokrom P450scc. Wang

(2009) membuat elektroda karbon dengan nanopartikel platinum untuk

menentukan kadar glukosa dan menghasilkan respon arus yang lebih besar

dibandingkan elektroda tanpa nanopartikel platinum. Esumi et al. (2003) juga

telah membuat biosensor antioksidan dari nanopartikel emas dengan kitosan yang

menunjukkan stablitas baik.

Imobilisasi enzim dapat dilakukan dengan menggunakan bahan anorganik

seperti tanah liat, alumina berpori, silika (Bhatia et al. 2000), dan zeolit (Balal et

al. (2009), Kirdeciler et al. (2011), Goriushkina et al. (2010) juga dapat digunakan

sebagai matriks imobilisasi enzim. Zeolit banyak terdapat di Indonesia yang

berpotensi sebagai matriks imobilisasi SOD. Zeolit alam merupakan senyawa

alumina silikat terhidrasi yang secara fisik dan kimia mempunyai kemampuan

sebagai penjerap, penukar kation, dan sebagai katalis. Karakteristik zeolit unik,

yaitu memiliki kemampuan katalitik yang dapat membantu mempercepat reaksi,

stabil pada suhu tinggi, tahan terhadap pelarut organik, dan sifat yang keras

membuat zeolit lebih stabil terhadap tekanan mekanik yang tinggi, sehingga

enzim yang terjerap lebih stabil. Rangka dan pori dari struktur zeolit yang

seragam menyebabkan selektivitas dan reprodusibilitas yang dihasilkan tinggi

(Valdes et al. 2006).

Penggunaan nanopartikel emas pada amina yang terfungsionalisasi pada

zeolit Na-Y untuk mengimobilisasi pepsin telah dilakukan Mukhopadhyay et al.

(2003) yang menghasilkan aktivitas katalitik baik, di atas tujuh kali penggunaan

kembali. Balal et al. (2009) menggunakan nanopartikel berupa zeolit

termodifikasi FeCl3 pada elektroda pasta karbon sebagai biosensor untuk

mengukur dopamine dan triptopan yang menghasilkan arus lebih tinggi

dibandingkan elektroda pasta karbon dengan mediator FeCl3 tanpa penambahan

zeolit. Gia (2012) melakukan imobilisasi enzim pada zeolit yang meningkatkan

aktivitas GDH pada biosensor glukosa berdasarkan nilai Imaks-nya. Selain itu,

Liyonawati (2012) juga menggunakan zeolit sebagai matriks untuk

mengimobilisasi ekstrak E.coli yang menghasilkan hasil lebih baik pada biosensor

antioksidan. Penelitian yang dilakukan oleh Iswantini et al. (2013) memaparkan

bahwa penggunaan zeolit sebagai matriks imobilisasi ekstrak D. radiodurans

meningkatkan aktivitasnya dalam biosensor antioksidan, tetapi masih perlu

ditingkatkan agar penggunaan biosensor dapat digunakan dalam jangka waktu

yang lama. Oleh karena itu, pada penelitian ini akan dibuat biosensor antioksidan

berbasis SOD dari bakteri D. radiodurans yang diimobilisasi pada zeolit dan

dilakukan optimasi campuran zeolit dengan enzim, suhu, dan pH dalam

pembuatan elektroda agar aktivitas dan stabilitasnya lebih baik. Penelitian ini

bertujuan melakukan optimasi aktivitas SOD ekstrak D. radiodurans

terimobilisasi zeolit, uji keterulangan, dan perbandingan limit deteksi metode

elektrokimia dengan spektrofotometri.

\

3

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan antara lain pipet mikro, pinset, batang gelas, sel

elektrokimia, neraca analitik, pH meter, oven, tanur, potensiostat-galvanostat

eDAQ yang dilengkapi dengan perangkat lunak Echem v2.1.0 dan Minitab 14,

laminar air flow, incubator, High Speed Refrigerated Centrifuge KUBOTA 6500,

Centrifuge 5415 R, autoklaf, Ultrasonic Homogenizer UH-150, spektrofotometer

ultraviolet tampak (berkas ganda), dan alat-alat gelas lainnya. Bahan-bahan yang

digunakan adalah media LB untuk pertumbuhan Deinococcus radiodurans, sel D.

radiodurans, grafit, ferosena, parafin cair, zeolit alam Bayah, xantina oksidase

(XO), xantina, dimetil sulfoksida (DMSO), bufer fosfat, HCl 3M, asam askorbat,

etanol 95%, ekstrak daun jambu biji, DPPH, AgNO3, membran dialisis, jaring

nilon, dan parafilm.

Metode

Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap percobaan, yaitu penumbuhan sel

Deinococus radiodurans dan ektraksi SOD, aktivasi zeolit, pembuatan elektroda,

imobilisasi enzim, optimasi aktivitas antioksidan ekstrak D. radiodurans,

pengukuran keterulangan, penentuan limit deteksi (LOD) dan limit kuantisasi

(LOQ). Bagan alir penelitian secara umum dilampirkan pada Lampiran 1.

Penumbuhan sel Deinococcus radiodurans dan ekstraksi protein sitoplasma D.

radiodurans

Bakteri Deinococcus radiodurans ditumbuhkan pada media LB (Luria

Bertani) yang mengandung tripton 1% (b/v) , yeast extract 0.5% (b/v), glukosa 0.2%

(b/v), NaCl 0.5% (b/v), dan alcohol. Selanjutnya diinkubasi selama 48 jam pada

300C. Sel dipanen dengan sentrifugasi kecepatan 7000 rpm selama 10 menit untuk

memisahkan sel bakteri dengan media. Sel (pelet) dicuci beberapa kali dengan larutan

buffer posfat pH 9.0 dan disuspensikan kembali dalam larutan bufer fosfat pH 9.0.

Suspensi sel di sonikasi dengan pulsa 50% dan output 5 untuk memecahkan sel

bakteri yaitu dengan interval 2 × 10 menit dan interval berhenti 1 menit. Selama

sonikasi suspensi sel didinginkan dalam penangas es. Selanjutnya disentrifugasi

10000 rpm selama 30 menit untuk memisahkan supernatan dan pelet. Ekstrak kasar

(crude extract) enzim berada disupernatan. Ekstrak selanjutnya diukur nilai

serapannya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm untuk mengetahui

konsentrasi protein yang dihitung melalui persamaan :

[Enzim]= (1.55 × Absorban λ 280 nm) - (0.76 × Absorban λ 260 nm) × 1000 × FP

(Wilfinger et al. 1997)

Pembuatan Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi Ferosena

Elektroda dibuat dengan cara melarutkan 3 mg ferosena dalam 1 mL DMSO

dan ke dalam larutan tersebut ditambahkan 100 mg grafit. Campuran didiamkan

selama 2 jam kemudian pelarut diuapkan menggunakan pengering vakum

sehingga diperoleh grafit termodifikasi mediator ferosena. Grafit kemudian

4

dicampur dengan 35 μL parafin cair hingga membentuk pasta. Pasta karbon

dimasukkan ke dalam badan elektroda hingga padat sampai permukaan.

Permukaan elektroda dihaluskan dan dibersihkan dengan amplas dan kertas

minyak (Trivadila 2011).

Aktivasi Zeolit

Sebanyak 50 gram zeolit Bayah dicuci dengan akuades sampai pH netral,

kemudian disaring dengan ayakan ukuran 50 mesh dan dikeringkan dalam oven

pada 105 °C selama 3 jam. Zeolit yang telah kering diaktivasi dengan

menambahkan 250 mL HCl 3 M ke dalam gelas piala dan diaduk selama 1 jam.

Zeolit yang telah diaktivasi disaring, kemudian dicuci menggunakan akuades

sampai pH netral. Larutan hasil saringan diuji kandungan klorida dengan AgNO3

dan dicuci kembali dengan akuades sampai tidak mengandung klorin. Setelah pH

netral dan bebas klorin, zeolit dikeringkan pada suhu 300 °C selama 3 jam. Zeolit

kemudian dihaluskan dan diayak dengan ayakan 100 mesh (Arif 2011).

Optimasi aktivitas SOD dari Bakteri Deinococcus Radiodurans terimobilisasi

Optimasi yang dilakukan adalah optimasi suhu (20-40 °C), pH (7-11), dan

konsentrasi zeolit (25-250 mg). Metode yang digunakan untuk pengoptimuman

aktivitas SOD adalah Response Surface Method. Metode ini dilakukan dengan

cara memasukkan kombinasi faktor-faktor peubah bebas pada perangkat lunak

statistika Minitab. Selanjutnya percobaan dilakukan sesuai dengan kombinasi

yang dihasilkan untuk mendapatkan nilai aktivitas optimumnya.

Imobilisasi Ekstrak Deinococcus radiodurans

Sebanyak 30 mg zeolit Bayah dicampur dengan 10 mL akuades dengan alat

vortex sehingga membentuk suspensi 3 mg/mL. sebanyak 20 μL ekstrak

Deinococcus radiodurans dalam bufer fosfat pH 9.0 dicampur dengan 10 μL

suspensi zeolit dan didiamkan selama 10 menit lalu diteteskan 10 μL pada

permukaan elektroda, didiamkan hingga pelarutnya menguap, dilapisi dengan

membran dialisis, ditutup dengan jaring nilon, dan diikat dengan parafilm.

Elektroda dapat langsung digunakan untuk pengukuran aktivitas antioksidan

ekstrak D. radiodurans dengan metode voltametri siklik. Elektroda direndam

dalam bufer fosfat pH 9.0 pada suhu 4 °C ketika tidak digunakan untuk

memberikan keadaan yang sama dengan lingkungan sebenarnya (Dai et al. 2004).

Pengukuran Elektrokimia

Pengukuran elektrokimia dilakukan dengan metode voltametri siklik dengan

menggunakan eDAQ potensiostat galvanostat yang dilengkapi perangkat lunak

Echem v2.1.0. Elektroda yang digunakan adalah elektroda Ag/AgCl sebagai

elektroda rujukan, platina sebagai counter dan elektroda pasta karbon dan zeolit

sebagai elektroda kerja. Parameter pengukuran dibuat sebagai berikut :

Mode : Cyclic

Initial : 0 mV

Final : 0 mV

Rate : 125 mV/s

Step W : 20 ms

Upper E : 1000 mV

\

5

Lower E : -500 mV

Range : 5 V

Larutan bufer fosfat sebanyak 1.9 mL ditambahkan kedalam sel pengukuran

dan puncak arus anoda yang terbentuk diamati sebagai blanko. Kemudian

ditambahkan 100 μL larutan XO 0.1 U/mLdan 1 mL larutan xantina 2.1 mM.

Selanjutnya diukur kembali perubahan atau kenaikkan puncak arus anoda yang

terjadi.

Pengukuran keterulangan elektrode pasta karbonsecara voltametri siklik

(A0AC 2002)

Keterulangan pengukuran ditentukan dengan melakukan pengukuran pada

enzim SOD pada konsentrasi optimum selama 10 kali, kemudian dihitung

simpangan baku (SB) menggunakan persamaan berikut:

SB = 𝑥−𝑥𝑖 2

𝑛−1

Persen RSD yang menunjukkan kesalahan pengukuran arus dihitung dengan

persamaan berikut:

%RSD = 𝑆𝐵

𝑥× 100%

Perbandinganlimit deteksi dan limit kuantisasi dengan metode elektrokimia

dengan Spektrofotometri.

Pengukuran dilakukan pada kondisi optimum. Elektrode ditempatkan dalam

sel pengukuran yang mengandung enzim 100 μL xantin oksidase 0.1 Unit/mL,

kemudian 1 mL xantinaditambahkan secara bertahap dan setiap penambahan

diukur perubahan arus yang dihasilkan. Selanjutnya pengukuran diulang dengan

penambahan 0.5 mL vitamin C dengan variasi konsentrasi 1.25; 2.5; 5; 10; dan 20

ppm. Data kemudian diplot dalam kurva dengan sumbu-x adalah konsentrasi

vitamin C dan respon arus (mA) pada sumbu-y, sehingga diperoleh persamaan

redresi dengan kemiringan tertentu.

Perbandingan metode elektrokimia dengan metode spektrofotometri

dilakukan dengan melihat hasil yang diperoleh dari pengukuran menggunakan

spektrofotometer dan biosensor antioksidan. Spektrofofotometri dengan metode

DPPH dilakukan pengukuran kapasitas antioksidan vitamin C. Vitamin C dibuat

dengan konsentrasi 1.25; 2.5; 5; 10; dan 20 ppm. Sebanyak 4 mL DPPH 125 μM

ditambahkan kedalam 2 mL masing-masing sampel tersebut. Selanjutnya,

dilakukan inkubasi selama 30 menit dalam suhu ruang. Diukur pada panjang

gelombang 517 nm. Nilai limit deteksi (LOD) dan (LOQ) hasil pengukuran

dengan metode elektrokimia dibandingkan dengan hasil yang diperoleh dari

spektrofotometri. Penentuan LOD dan LOQ :

LOD = 3 × 𝑆𝑑

𝑏 LOQ =

10 × 𝑆𝑑

𝑏

dengan sd adalah standar deviasi dan b adalah slope dari persamaan garis linear.

6

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penumbuhan sel Deinococcus radiodurans dan ekstraksi enzim SOD

Pertumbuhan bakteri merupakan pertambahan jumlah volume, ukuran sel,

volume, dan ukuran sel serta bertambahnya jumlah sel. Pertumbuhan sel bakteri

mengikuti suatu pola tertentu berupa kurva pertumbuhan sigmoid yang

menunjukkan empat fase pertumbuhan, yaitu fase log (fase lambat), fase

eksponensial (fase cepat), fase stasioner (fase statis), dan fase kematian populasi.

Pada fase eksponensial komposisi sel dan konsentrasi metabolit relatif konstan.

Pertumbuhan bakteri memerlukan media nutrisi untuk memenuhi kebutuhan

energi, sebagai bahan pembangun sel, untuk sintesis protoplasma, dan bagian-

bagian sel lainnya. Media pertumbuhan yang digunakan pada penelitian adalah

media LB (Luria Bertani). Media ini mengandung campuran zat-zat makanan

(nutrisi) berupa tripton, NaCl, dan ekstrak khamir yang diperlukan bagi

pertumbuhan D. radiodurans. Penambahan tripton sebagai vitamin, NaCl sebagai

sumber mineral, dan ekstrak khamir sebagai nutrisi makanan bakteri.

Bakteri D. radiodurans ditumbuhkan dalam media LB cair selama 48 jam

dengan suhu 30 °C. Setelah tumbuh, bakteri dipindahkan ke dalam media LB cair

dan diinkubasi. Selanjutnya bakteri dipisahkan dari media tumbuhnya dengan cara

di sentrifugasi dan direndam dengan larutan NaCl 0.85% (b/v). Larutan NaCl

0.85% (b/v) berfungsi sebagai pelarut yang disamakan dengan habitat hidup

bakteri. Sel bakteri dipecah untuk mengekstrak protein sitoplasma yang

mengandung enzim SOD dengan menggunakan ultrasonic homogenizer. Protein

yang terkestrak memiliki konsentrasi sebesar 2141.67 μg/ml (Lampiran 2).

Pengukuran Arus Elektrode Pasta Karbon

Elektrode pasta karbon yang telah dibuat harus seragam panjang kawat Cu,

besar diameter batang elektrode, dan tinggi grafit pasta karbon pada elektrode.

Elektrode pasta karbon tersebut dikarakterisasi dengan larutan K3[Fe(CN)6]

dengan larutan elektrolit pendukung KCl 0.1 M dengan teknik voltametrik siklik

untuk melihat adanya puncak dan arus oksidasi reduksi elektode yang dihasilkan.

Kelebihan teknik voltametri siklik adalah sensitifitasnya yang tinggi, limit deteksi

yang rendah, dan daerah linier yang lebar (Mulyani et al. 2012). Berikut adalah

reaksi redoks yang terjadi :

Reaksi oksidasi [Fe(CN)6]

4- [Fe(CN)

6]

3-

+ e- (i)

Reaksi reduksi [Fe(CN)6]

3-

+ e-

[Fe(CN)6]

4- (ii)

Arus oksidasi yang diperoleh sebesar 5.901 µA dengan potensial 0.585 V.

Elektrode pasta karbon yang menghasilkan puncak oksidasi dan reduksi

selanjutnya digunakan untuk pengukuran sebagai biosensor. Gambar 1 merupakan

bentuk voltamogram siklik elektroda pasta karbon. Garis pertama yang muncul

pada voltamogram menunjukan proses oksidasi dengan adanya puncak arus

oksidasi. Garis kedua menunjukan proses reduksi yang terjadi pada elektrode

pasta karbon. Elektrode yang memiliki puncak arus oksidasi-reduksi dan rentang

\

7

voltamogram yang cukup seragam digunakan untuk pengukuran optimasi,

keterulanagn, dan perbandingan aplikasi metode biosensor dengan

spektrofotometer.

Gambar 1 Voltamogram siklik pada pengukuran larutan K3Fe (CN)6 0.01M

Aktivasi Zeolit

Zeolit alam yang digunakan pada penelitian ini adalah zeolit Bayah yang

berasal dari Bayah, Jawa Barat. Zeolit Bayah adalah jenis klinoptilolit dengan

rumus molekul Na3K3[Al6Si30O72]24.H2O. Zeolit alam mempunyai bentuk kristal

teratur dan pori yang tersebar merata. Zeolit Bayah diaktivasi secara fisika dan

kimia untuk mengilangkan pengotor. Aktivasi secara fisika mencuci zeolit dengan

akuabides untuk menghilangkan pengotor seperti debu dan tanah yang masih

terdapat dalam zeolit. Selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu 105 °C

selama 3 jam membantu mengeluarkan pengotor dan menguapkan kotoran yang

masih tertahan di permukaan zeolit. Aktivasi secara kimia dilakukan dengan HCl

3 M untuk menghilangkan pengotor yang bersifat asam yang larut dalam HCl (Dai

et al. 2004). Selanjutnya dicuci sampai pH netral dan diuji AgNO3 untuk menguji

kandungan klorida pada zeolit hingga diperoleh zeolit Bayah ukuran 100 mesh.

Karakteristik zeolit yang stabil pada temperatur tinggi, tahan terhadap

pelarut organik, dan sifatnya yang keras sehingga lebih stabil terhadap tekanan

mekanik yang tinggi menyebabkan enzim yang terjerap akan lebih stabil. Rangka

dan pori dari struktur zeolit yang seragam menyebabkan selektivitas dan

reprodusibilitasnya yang dihasilkan tinggi (Valdes et al. 2006). Zeolit bersifat

hidrofilik dengan adanya gugus –OH disekitar pori sehingga cocok untuk

imobilisasi enzim yang menghasilkan arus yang kuat (Valdes et al. 2006). Zeolit

selain dapat digunakan sebagai material penyangga juga memiliki kemampuan

katalitik yang membantu mempercepat reaksi (Dai et al. 2004).

Imobilisasi Enzim

Imobilisasi enzim dilakukan pada permukaan material penyangga, yaitu

zeolit Bayah untuk menjaga fungsi katalitik enzim pada kondisi ekstrem. Enzim

-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

I(µ

A)

E (V vs Ag/AgCl)

Puncak oksidasi

Puncak

reduksi

8

dapat terdenaturasi oleh pH dan suhu yang ekstrem, pelarut organik, dan deterjen.

Enzim pada kondisi normal memiliki selektivitas dan sensitivitas yang tinggi.

Metode imobilisasi dilakukan untuk menghasilkan respon arus yang tinggi. Enzim

SOD diimobilisasi dengan zeolit yang diteteskan pada permukaan pasta karbon

termodifikasi ferosena.

Ferosena berfungsi meningkatkan arus yang dihasilkan karena bersifat stabil,

tidak bereaksi langsung dengan substrat enzim, potensial redoks yang lebih rendah

dari potensial oksidasi zat-zat pengganggu, tidak dipengaruhi oleh Ph dan efek

kekuatan ion pada media (Trivadila 2011). Penelitian ini, ferosena telah dicampur rata

dengan EPK (elektrode pasta karbon). Cara ini kurang efektif karena menghasilkan

arus yang lebih kecil daripada diteteskannnya ke dalam wadah pengukuran arus

elektrode. Gambar 2 merupakan salah satu contoh voltamogram siklik yang

dihasilkan

Gambar 2 Voltamogram siklik pada suhu 20 °C, bufer fosfat pH 9, dan zeolit

137.5 mg

Pada penelitian ini, penambahan substrat xantina akan menghasilkan reaksi

enzimatis xantina dengan xantina oksidase (XO) yang menghasilkan radikal

superoksida :

xantina + H2O + O2

𝑋𝑂 asam urat + 2H

++ 2O

2•- (iii)

Selanjutnya, radikal tersebut akan didismutasi membentuk O2 dengan katalis SOD

dengan reaksi :

2H+ + 2O

2•-

𝑆𝑂𝐷 O2 + H2O2 (iv)

Mekanisme pengukuran biosensor antioksidan menggunakan elektrokimia

adalah radikal bebas yang terikat dengan enzim SOD menghasilkan elektron-elektron.

Elektron-elektron tersebut selanjutnya ditangkap oleh mediator sehingga terjadi reaksi

bolak-balik yang menghasilkan elektron bebas. Elektron bebas kemudian akan

ditangkap permukaan elektrode dan dikirimkan kepada transduser untuk diolah

menjadi data dalam bentuk voltamogram.

-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

I (µ

A)

E (V Vs Ag/AgCl)

Bufer

Bufer + XO + Xantina

\

9

Gambar 3 Mekanisme pengukuran biosensor antioksidan

Pengoptimuman Aktivitas SOD Terimobilisasi

Optimasi aktivitas SOD dari bakteri D. radioduransdilakukan menggunakan

metode RSM (response surface method) pada minitab. Faktor kombinasi yang

dilakukan optimasi suhu pada rentang (20 ̵ 40 °C), pH (7 ̵ 11), dan zeolit (25 ̵250

mg) (Lampiran 3). Hasil analisis RSM menunjukkan plot kontur yang baik dengan

bulatan sempurna pada bulatan lebih gelap yang menjelaskan nilai arus tertinggi.

Kontur merupakan garis-garis yang menunjukan nilai ekspektasi respon aktivitas

berupa arus minimum hingga maksimum. Plot kontur menunjukan hold values

yang akan digunakan sebagai starting value pada response optimizer. Response

optimizer berfungsi untuk menganalisis kondisi optimum aktivitas antioksidan

dari sel bakteri. Hasil optimum yang diperoleh untuk sel bakteri dengan zeolit,

yaitu suhu 30 oC, pH 9, dan zeolit 137.5 mg (Lampiran 4).

Gambar 4 menunjukkan plot kontur hubungan parameter dengan respon

berupa arus. Dari kontur dapat terlihat suhu, pH, dan zeolit pada awalnya

meningkatkan arus, tetapi arus turun pada kondisi tertentu. Ini disebabkan karena

enzim bekerja optimal pada suhu dan pH tertentu. Suhu terlalu tinggi

menyebabkan enzim terdenaturasi sehingga rusak dan tidak dapat berfungsi lagi,

sedangkan suhu yang rendah menyebabkan enzim tidak dapat bekerja dengan

optimal. Ketika pH terlalu tinggi atau terlalu rendah dapat menyebabkan

penurunan kinerja enzim yang menyebabkan arus juga turun. Penggunaan zeolit

yang banyak menyebabkan sulitnya interaksi antara substrat dengan enzim karena

terhalangi oleh partikel-partikel zeolit sehingga arus menjadi turun. Penggunaan

zeolit yang terlalu sedikit juga akan memberikan respon arus yang kecil.

(a) (b)

pH

Su

hu

1110987

40

35

30

25

20

>

–

–

–

–

–

–

< 0,00

0,00 0,25

0,25 0,50

0,50 0,75

0,75 1,00

1,00 1,25

1,25 1,50

1,50

I (µA)

Contour Plot of I (µA) vs Suhu; pH

[Zeolit]mg

Su

hu

25020015010050

40

35

30

25

20

>

–

–

–

–

–

–

< 0,00

0,00 0,25

0,25 0,50

0,50 0,75

0,75 1,00

1,00 1,25

1,25 1,50

1,50

I (µA)

Contour Plot of I (µA) vs Suhu; [Zeolit]mg

10

(c)

Gambar 4 Alur kontur hubungan antara suhu dan pH (a), suhu dan zeolit (b), dan

pH dan zeolit (c) terhadap aktivitas antioksidan D. radiodurans.

Hasil ini sedikit berbeda dengan penelitian yang telah dilakukan Trivadila

(2011) dimana daerah optimum ekstrak enzim SOD adalah pH 9, suhu 27.50C.

Weniarti (2011) dan Atmadi (2014) melakukan optimasi aktivitas SOD D.

radiodurans terimobilisasi menghasilkan daerah optimum pada pH 9, shu 30 °C, dan

zeolit 156.8 mg. Sedangkan Campanella et al. (2000) mengimobilisasi SOD pada

permukaan elektrode oksigen di antara membran dialisis dan membran selulosa

triasetat pada pH 7 dan suhu 20 °C. Proses imobilisasi yang berbeda akan

mempengaruhi pada suhu dan pH berapa daerah optimumnya.

Hasil uji keterulangan elektrode pasta karbon secara voltametri siklik

diperoleh nilai rerata arusnya 1.749 µA dengan standar deviasi 0.01 dan persen

RSD 0.59 (Lampiran 5). Hasil ini menunjukkan bahwa hasil yang diperoleh cukup

baik .

Limit Deteksi dan Limit Kuantitatif dengan metode elektrokimia dan

spektrofotometri

Penentuan limit deteksi (LOD) dan limit kuantitatif (LOQ) menggunakan

metode elektrokimia dan spektrofotometri. Limit deteksi dan limit kuantitatif

dilakukan dengan mengukur puncak arus yang dihasilkan dengan penambahan

vitamin C dengan berbagai konsentrasi. Penentuan limit deteksi dilakukan dengan

vitamin C sebagai standar dan sebagai contoh juga dilakukan menggunakan

sampel ekstrak daun jambu biji. Pengukuran ini dilakukan pada kondisi optimum

yaitu, suhu 30 ᵒC, pH 7 dengan zeolit 137.5 mg. Dibawah ini merupakan kurva

hubungan penurunan arus yang dihasilkan dengan penambahan vitamin C.

Semakin besar konsentrasi vitamin C yang ditambahkan maka arus yang

dihasilkan akan semakin kecil karena sifatnya antioksidan. Hubungan penurunan

arus terhadap penambahan vitamin C terlihat pada Gambar 5

[Zeolit]mg

pH

25020015010050

11

10

9

8

7

>

–

–

–

–

–

–

< 0,00

0,00 0,25

0,25 0,50

0,50 0,75

0,75 1,00

1,00 1,25

1,25 1,50

1,50

I (µA)

Contour Plot of I (µA) vs pH; [Zeolit]mg

\

11

Gambar 5 Hubungan penurunan arus terhadap penambahan vitamin C

Nilai LOD dan LOQ rerata yang diperoleh dari pengukuran tersebut sebesar 1.76

ppm dan 5.88 ppm (Lampiran 6). Di bawah ini hubungan arus yang dihasilkan

terhadap penambahan ekstrak daun jambu biji dapat dilihat pada Gambar 6

Gambar 6 Hubungan penurunan arus terhadap penambahan ekstrak daun jambu

biji

Nilai LOD dan LOQ rerata yang diperoleh dari pengukuran menggunakan sampel

ekstrak daun jambu biji sebesar 0.66 ppm dan 2.19 ppm (Lampiran 7).

Metode kedua untuk menentukan LOD dan LOQ adalah metode

penangkapan radikal bebas DPPH menggunakan spektrofotometri. Vitamin C dan

ekstrak daun jambu biji masing-masing dibuat kurva standar sehingga diperoleh

persamaan regresi linear. Nilai LOD dan LOQ ditentukan dari hubungan

absorbansi terhadap penambahan vitamin C/ekstrak daun jambu biji menggunakan

spektrofotometri. Gambar 7 menunjukkan hubungan absorban terhadap

penambahan vitamin C

y = 0.109x + 1.35R² = 0.938

y = 0.118x + 1.241R² = 0.913

y = 0.107x + 1.325R² = 0.878

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

0,00 10,00 20,00 30,00

∆I

(µ

A)

[Vitamin C] ppm

Ulangan 1

Ulangan 2

Ulangan 3

y = 0.014x + 1.78R² = 0.994

y = 0.017x + 1.63R² = 0.966

y = 0.014x + 1.84R² = 0.970

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

0,00 50,00 100,00 150,00

∆I

(µ

A)

[Ekstrak daun jambu biji] ppm

Ulangan 1

Ulangan 2

Ulangan 3

12

Gambar 7 Hubungan absorban yang dihasilkan dengan penambahan vitamin C

Nilai LOD dan LOQ rerata yang diperoleh dari pengukuran menggunakan vitamin

C sebesar 2.01 ppm dan 6.70 ppm (Lampiran 8). Di bawah ini merupakan

hubungan absorban yang dihasilkan terhadap penambahan ekstrak daun jambu biji

dapat dilihat pada Gambar 8

Gambar 8 Hubungan absorban yang dihasilkan dengan penambahan ekstrak daun

jambu biji

Nilai LOD dan LOQ rerata yang diperoleh dari pengukuran menggunakan sampel

ekstrak daun jambu biji sebesar 1.21 ppm dan 8.35 ppm (Lampiran 9).

Tabel 1 Perbandingan nilai LOD dan LOQ yang diperoleh dengan kedua metode

Nilai Metode Elektrokimia Metode Spektrofotometri

Vitamin

C

Ekstrak daun

jambu biji

Vitamin

C

Ekstrak daun

jambu biji

LOD (ppm) 1.76 0.66 2.01 1.21

LOQ (ppm) 5.88 2.19 6.70 8.35

Pengukuran kapasitas antioksidan menggunakan kedua metode

tersebutterlihat bahwa menggunakan biosensor jauh lebih sensitif dan tepat

dibandingkan dengan metode spektrofotometri. Limit deteksi yang dihasilkan

y = 0.030x + 0.261R² = 0.992

y = 0.025x + 0.266R² = 0.996

y = 0,031x + 0,240R² = 0.995

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00

Abso

rban

[Vitamin C] ppm

Ulangan 1

Ulangan 2

Ulangan 3

y = 0.006x + 0.070R² = 0.998

y = 0.007x + 0.073R² = 0.997

y = 0.007x + 0.049R² = 0.998

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

0 50 100 150

Abso

rban

[Ekstrak daun jambu biji] ppm

Ulangan 1

Ulangan 2

Ulangan 3

\

13

metode elektrokimia lebih kecil daripada menggunakan spektrofotometri. Metode

spektrofotometeri sangat dipengaruhi oleh kekeruhan larutan. Hal ini berbeda

dengan biosensor yang tidak dipengaruhi oleh kekeruhan larutan, sehingga tidak

diperlukan pengenceran berkali-kali yang dapat menyebabkan berkurangnya

ketelitian. Selain itu, ketika ekstrak daun jambu biji direaksikan dengan DPPH

harus diinkubasi selama 30 menit terlebih dahulu agar bereaksi sempurna. Metode

pengukuran dengan spektrofotometri memerlukan bahan kimia yang bermacam-

macam dan jumlah yang banyak. Menggunakan biosensor tidak diperlukan

inkubasi karena radikal adalah senyawa yang tidak stabil yang harus segera diukur.

Penggunaan biosensor lebih cepat, akurat dan menghasilkan limit deteksi yang

baik dibandingkan dengan spektrofotometri.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Kondisi optimum bagi aktivitas SOD imobilisasi adalah pada pH 9, suhu 30 °C, dan zeolit 137.5 mg. Hasil keterulangan optimasi pengukuran elektrode pasta

karbon diperoleh arus sebesar 1.749 µA dengan standar deviasi 0.01 dan RSD

0.59%. Hasil pengukuran LOD dan LOQ menggunakan metode elektrokimia lebih

kecil dibandingkan dengan spektrofotometri, sehingga dengan menggunakan

biosensor dapat mendeteksi suatu analit dengan konsentrasi yang lebih kecil.

Selain itu dengan menggunakan metode elektrokimia tidak memerlukan waktu

yang lama, jumlah bahan kimia yang digunakan juga lebih sedikit dibandingkan

metode spektrofotometri.

Saran

Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk meningkatkan untuk melihat

parameter sensitivitas, linearitas, stabilitas, dan ketelitian. Perlu dilakukan juga

penentuan kapasitas antioksidan dari berbagai sampel seperti kedawung, ekstrak

buah, dan sebagainya.

DAFTAR PUSTAKA

[AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 2002. AOAC Guidelines

for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary

Supplements and Botanicals. [Internet]. [diunduh pada 2013 10 Juli].

Tersedia pada: http://www.aoac.org/Official_Methods/slv_guidelines.pdf.

Arif Z. 2011. Karakterisasi dan modifikasi zeolit alam sebagai bahan media

pendeteksi. [tesis]. Bogor: FMIPA, IPB.

Atmadi Waskitho. 2014. Aktivitas dan stabilitas superoksida dismutase dari

ekstrak D. radiodurans yang diimobilisasi pada zeolit alam sebagai

14

biosensor antioksidan. 2014. [skripsi]. Bogor: Program Sarjana, Institut

Pertanian Bogor.

Balal K, Mohammad H, Bahareh , Ali B.Maryam H, Mozhgan Z. 2009. Zeolite

nanoparticle modified carbon paste electrode as a biosensor for

simultaneous determination of dopamine and tryptophan. J Chin Chem. 56 :

789-796.

Bhatia R, Gupta AK, Anup KS, Brinker CJ. 2000. Aqueous sol-gel process for

protein encapsulation. Chem Mater. 12: 2434-2441.

Campanella L, Favero G,Persi L, Tommaseti M. 2000. New biosensor for

superoxide radical used to evidence molecules of biomedical and

pharmaceutical interest having radical scavenging properties. J Pharm

BiomAn. 23: 69-76.

Coban S. 2008. Development of biosensors for determination of the total

antioxidant capacity. [thesis]. Izmir: Department of Chemical Engineering,

Izmir Institute of Technology.

Dai Z, Liu S, Ju H. 2004. Direct electron transfer of cytochrome c immobilized on

a NaY zeolite matrix and its application in biosensing. Electro Acta. 49 :

2139–2144.

Esumi K, Takei N & Yoshimura T. 2003. Antioxidant-potentiality of gold

chitosan nanocomposites. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 32 (2):

117–125.

Gil DM de Albuquerque. 2011. Biosensor evaluation of the antioxidant activity of

wines and teas, interference studies and comparison with other methods.

[thesis]. Lisbon: Chemical/Biochemical Department, Lisbon University.

Goriushkina TB, Kurç BA, Sacco A, Dzyadevych SV. 2010. Application of

zeolites for glucose oxidase in amperometric biosensors. Sens Elect &

Microsys Tech 1: 36-42.

Iswantini D, Nurhidayat N, Trivadila. 2013. Antioxidant biosensor using microbe.

Engineering and Technology 78: 232-246. DOI: 10.5454/mi.5.1.2

Kirdeciler SK, Soy E, Ozturk S, Kucherenko I, Soldatkin O, Dzyadevych S, Akata

B. 2011. A novel urea conductometric biosensor based on zeolite

immobilized urease. Talanta 85: 1435–1441.

Liyonawati. 2012. Aktivitas dan stabilitas superoksida dismutase dari ekstrak

Escherichia coli diimobilisasi pada zeolit alam sebagai biosensor

antioksidan. [skripsi]. Bogor: Program Sarjana, Institut Pertanian Bogor.

Mukhopadhyay K, Phadtare S, Vinod VP, Kumar A, Rao M, Chaudhari RV, and

Sastry M. 2003. Gold nanoparticles assembled on amine-functionalized

Na−Y zeolite: a biocompatible surface for enzyme immobilization.

Langmuir. 19 (9): 3858-3863.

Mulyani R, Buchari, Noviandri Indra, Ciptati. 2012. Studi voltametri siklikk

sodium dedocyl benzen sulfonat dalam berbagai elektroda dan elektrolit

pendukung. Journal of Waste Management Technology. 15: 131-144.

Prieto-Simon B, Cortina M, Campas M, Calas-Blanchard C. 2008.

Electrochemical biosensor as a tool for antioxidant capacity assessment.

SensActuators B 129: 459–466.

Safrizal BT. 2011. Penentuan konsentrasi optimum superoksida dismutase,

linearitas, dan stabilitas biosensor antioksidan menggunakan elektrode pasta

karbon. [skripsi]. Bogor: Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor.

\

15

Shumyantseva VV, Carrara S, Bavastrello V, Riley DJ, Bulko TV, Skryabin KG,

Archakov AI, & Nicolini C. 2005. Direct electron transfer between

cytochrome P450scc and gold nanoparticles on screen-printed rhodium–

graphite electrodes. Biosensors and Bioelectronics. 21: 217–22.

Trivadilla. 2011. Biosensor antioksidan menggunakan superoksida dismutase

Deinococcus radiodurans yang diimobilisasi pada permukaan elektrode

pasta karbon dan parameter kinetikanya [tesis]. Sekolah Pascasarjana,

Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Valdes MG, Perez-Cordoves AI, Diaz-Garcia ME. 2006. Zeolites and zeolite

based materials in analytical chemistry. J Trends Anal Chem 25: 24-30.

Wang K. 2009. Direct Electrochemistry and Electrocatalysis of Glucose Oxidase

Immobilized on Glassy Carbon Electrode Modified by Nafion and Ordered

Mesoporous. Journal of molecularCatalysis B: Enzymatic 58: 194–198

Weniarti. 2011. Biosensor antioksidan berbasis superoksida dismutase

Deinococcus radiodurans diimobilisasi pada nanokomposit zeolit alam

Indonesia.[tesis]. Bogor: Program Pacasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Wilfinger, W.W., Mackey, K. and Chomczynski, P. 1997. Effect of pH and ionic

strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.

Biotechniques 22: 474-481.

Windono T, Soediatmoko SS. 2001. Uji Peredaman Radikal Bebas terhadap

DPPH dari Ekstrak Kulit Buah dan Biji Anggur (Vitis venifera L.)

Probolinggo Biru dan Bali. Surabaya (ID) : Artocarpus.

16

Lampiran 1 Bagan alir penelitian

Inkubasi 48 jam dan

suhu 30 °C

Sentrifugasi 7000

rpm, waktu 10 menit

Bakteri D.

Radiodurans

Media

LB cair

Ekstrak

SOD

Zeolit

bayah

Supernatan Pelet

Pelet

Pelet Ekstrak kasar

(crude extract)

Diimobilisasi

zeolit

Aktivitas

optimum SOD

Keterulangan

LOD dan LOQ metode

elektrokimia

LOD dan LOQ metode

DPPH

Sentrifugasi 10000

rpm, waktu 10

menit

Sonikasi pulsa

50%, output 5

\

17

Lampiran 2 Ekstraksi SOD

EkstrakSOD Absorbans λ 260

nm

Absorban λ280

nm

[Enzim]

μg/ml

Ulangan 1 0.353 0.240 2074.4

Ulangan 2 0.358 0.248 2246.4

Ulangan 3 0.349 0.239 2104.2

Rerata

2141.667

[Enzim]= (1.55 × Absorban λ 280 nm) - (0.76 × Absorban λ 260 nm) × 1000 × FP

= (1.55 × 0.240) - (0.76 × 0.353) × 1000 × 20

= 2074.4 μg/ml

[Enzim]rerata = 𝑈𝑙𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 1+𝑈𝑙𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 2+𝑈𝑙𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 3

3

= 2074 .4 μg/ml +2246 .4 μg/ml +2104 .2 μg/ml

3

= 2141.667 μg/ml

18

Lampiran 3 Kombinasi faktor-faktor peubah bebas bakteri D. radiodurans dengan

penambahan zeolit

Suhu

(0C)

pH Zeolit

(mg)

35.95 10.19 204.39

30.00 9.00 137.50

35.95 7.81 204.39

30.00 9.00 25.00

24.05 10.19 204.39

30.00 9.00 137.50

24.05 7.81 70.61

30.00 9.00 137.50

20.00 9.00 137.50

30.00 11.00 137.50

24.05 10.19 70.61

40.00 9.00 137.50

35.95 7.81 70.61

30.00 7.00 137.50

30.00 9.00 137.50

30.00 9.00 137.50

30.00 9.00 137.50

24.05 7.81 204.39

35.95 10.19 70.61

30.00 9.00 250.00

\

19

Lampiran 4 Hasil optimasi bakteri D. radiodurans dengan penambahan zeolit

Suhu pH Zeolit

(mg)

I

(µA)

35.95 10.19 204.39 0.009

30.00 9.00 137.50 1.721

35.95 7.81 204.39 -0.084

30.00 9.00 25.00 0.347

24.05 10.19 204.39 0.047

30.00 9.00 137.50 1.742

24.05 7.81 70.61 0.065

30.00 9.00 137.50 1.739

20.00 9.00 137.50 0.043

30.00 11.00 137.50 0.510

24.05 10.19 70.61 0.369

40.00 9.00 137.50 0.231

35.95 7.81 70.61 -0.009

30.00 7.00 137.50 0.068

30.00 9.00 137.50 1.736

30.00 9.00 137.50 1.728

30.00 9.00 137.50 1.741

24.05 7.81 204.39 0.081

35.95 10.19 70.61 0.421

30.00 9.00 250.00 -0.005

Daerah Optimum : Suhu 30 °C, pH 9, zeolit 137.5 mg

20

Lampiran 5 Keterulangan pengukuran hasil atioksidan D. radiodurans kondisi

optimum

Elektrode I (µA)

1 1.738

2 1.751

3 1.734

4 1.740

5 1.749

6 1.745

7 1.761

8 1.748

9 1.767

10 1.755

Irerata (µA) 1.749

Sd 0.01

%RSD 0.59

I rerata (µA) = 𝐼(µA)

𝑛

= 1.749 (µA)

Sd = 𝒙𝒊−𝒙 𝟐

(𝒏−𝟏)

= 0.0102827

%RSD = 𝑠𝑑

𝑥

= 0.59

\

21

Lampiran 6 Penentuan LOD dan LOQ metode elektrokimia

Tabel 2 Data arus oksidasi terhadap konsentrasi vitamin C

Vitamin C

(ppm) Ulangan Xantina Vitamin C

Y

(µA)

1.25 1 5.1 3.9 1.2

2 4.8 3.8 1.0

3 5.0 4.0 1.0

2.50 1 5.3 3.6 1.7

2 5.2 3.4 1.8

3 5.3 3.5 1.8

5.00 1 5.6 3.4 2.2

2 5.6 3.5 2.1

3 5.5 3.3 2.2

10.00 1 5.4 3.0 2.4

2 5.4 3.1 2.3

3 5.3 2.9 2.4

20.00 1 5.9 2.4 3.5

2 6.1 2.5 3.6

3 6.0 2.6 3.4

Tabel 3 Perhitungan kuadrat selisih arus elektrode 1, 2, dan 3 vitamin C

Absorban Ulangan Vitamin C (ppm)

1.25 2.50 5.00 10.00 20.00

Y 1 1.2 1.7 2.2 2.4 3.5

2 1.0 1.8 2.1 2.3 3.6

3 1.0 1.8 2.2 2.4 3.4

Yi 1i 1.486 1.623 1.895 2.440 3.530

2i 1.389 1.536 1.831 2.421 3.601

3i 1.459 1.593 1.860 2.395 3.465

Yi-Y (1i-1) 0.286 -0.077 -0.305 0.040 0.030

(2i-2) 0.389 -0.264 -0.269 0.121 0.001

(3i-3) 0.459 -0.208 -0.340 -0.005 0.065

(Yi-Y)2 (1i-1)

2 8.19E-02 6.01E-03 9.30E-02 1.60E-03 9.00E-04

(2i-2)2 1.51E-01 6.97E-02 7.24E-02 1.46E-02 1.00E-06

(3i-3)2 2.10E-01 4.31E-02 1.16E-01 2.50E-05 4.22E-03

Contoh perhitungan:

Yi dari persamaan garis y = 0.109x + 1.35

Untuk x = 20 ppm, maka

Yi = 0.109(20) + 135

Yi= 1.486

22

Yi-Y = 1.486- 1.2= 0.286

∑(Yi-Y)2 = (0.286)

2 = 8.19E-02

Tabel 4 Perhitungan nilai LOD dan LOQ biosensor antioksidan dengan standar

vitamin C

Ulangan ∑(Yi-Y)2 Sd LOD LOQ

(ppm) (ppm)

1 1.83E-01 0.04656940 1.28 4.27

2 3.08E-01 0.05950032 1.51 5.04

3 3.73E-01 0.08894619 2.49 8.31

Rerata 1.76 5.88

Contoh perhitungan:

Sd = 𝒙𝒊−𝒙 𝟐

(𝒏−𝟏)

= 0.04656940

LOD = 3 SD b

= 3 × 0.04656940 0.109

= 1.28 ppm

Rerata LOD = 1.76 ppm

LOQ = 10 SD b

= 10 × 0.04656940 0.109

= 4.27 ppm

Rerata LOQ = 5.89 ppm

Gambar 9 Profil voltamogram EPK kapasitas antioksidan vitamin C elektode 1

-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

-15

-10

-5

0

5

10

I (µ

A)

E (V Vs Ag/AgCl)

20 ppm

40 ppm

60 ppm

80 ppm

100 ppm

\

23

Lampiran 7 Penentuan LOD dan LOQ metode Elektrokimia menggunakan

ekstrak daun jambu biji

Tabel 5 Data arus oksidasi terhadap konsentrasi ekstrak daun jambu biji

Vitamin C

(ppm) Ulangan Xantina Vitamin C

Y

(µA)

20 1 5.5 3.4 2.1

2 5.6 3.5 2.1

3 5.6 3.4 2.2

40 1 5.4 3.1 2.3

2 5.5 3.3 2.2

3 5.3 3.0 2.3

60 1 5.5 2.9 2.6

2 5.4 2.8 2.6

3 5.5 2.8 2.7

80 1 5.6 2.7 2.9

2 5.6 2.5 3.1

3 5.5 2.6 2.9

100 1 5.5 2.3 3.2

2 5.6 2.2 3.4

3 5.6 2.3 3.3

Tabel 6 Perhitungan kuadrat selisih arus elektrode 1, 2, dan 3 ekstrak daun jambu

biji

Absorban Ulangan Ekstrak daun jambu biji (ppm)

20 40 60 80 100

Y 1 2.1 2.3 2.6 2.9 3.2

2 2.1 2.2 2.6 3.1 3.4

3 2.2 2.3 2.7 2.9 3.3

Yi 1i 2.060 2.340 2.620 2.900 3.180

2i 1.970 2.310 2.650 2.990 3.330

3i 2.120 2.400 2.680 2.960 3.240

Yi-Y (1i-1) -0.040 0.040 0.020 0.000 -0.020

(2i-2) -0.130 0.110 0.050 -0.110 -0.070

(3i-3) -0.080 0.100 -0.020 0.060 -0.060

(Yi-Y)2 (1i-1)

2 1.60E-03 1.60E-03 4.00E-04 0.00E+00 4.00E-04

(2i-2)2 1.69E-02 1.21E-02 2.50E-03 1.21E-02 4.90E-03

(3i-3)2 6.40E-03 1.00E-02 4.00E-04 3.60E-03 3.60E-03

Contoh perhitungan:

Yi dari persamaan garis y = 0.014x + 1.78

24

Untuk x = 20 ppm, maka

Y = 0.014(20) + 1.78

Yi= 2.060

Yi-Y = 2.060- 2.1= -0.040

∑(Yi-Y)2 = (-0.040)

2 = 1.60E-03

Tabel 7 Perhitungan nilai LOD dan LOQ biosensor antioksidan dengan sampel

ekstrak daun jambu biji

Ulangan ∑(Yi-Y)2 Sd LOD LOQ

(ppm) (ppm)

1 4.00E-03 0.00074833 0.16 0.53

2 4.85E-02 0.00587878 1.04 3.46

3 2.40E-02 0.00360000 0.77 2.57

Rerata 0.66 2.19

Contoh perhitungan:

Sd = 𝑥𝑖−𝑥 2

(𝑛−1)

=0.00074833

LOD = 3 SD b

= 3 × 0.00074833 0.014

= 0.16 ppm

Rerata LOD = 0,66 ppm

LOQ =10 SD b

=10 × 0.00074833 0.014

= 0.53 ppm

Rerata LOQ = 2.19 ppm

Gambar 10 Profil voltamogram EPK kapasitas antioksidan ekstrak daun

jambu biji elektode 1

-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

-15

-10

-5

0

5

10

15

I (µ

A)

E (V Vs Ag/AgCl)

20 ppm

40 ppm

60 ppm

80 ppm

100 ppm

\

25

Lampiran 8 Penentuan LOD dan LOQ metode DPPH

Tabel 8 Data absorban terkoreksi terhadap konsentrasi vitamin C

Vitamin C

(ppm) Ulangan

Absorban Absorban

terkoreksi Vitamin C blanko

1.25 1 0.990 1.248 0.258

2 0.975 1.263 0.288

3 0.979 1.236 0.257

2.50 1 0.952 1.248 0.296

2 0.964 1.263 0.299

3 0.971 1.236 0.265

5.00 1 0.884 1.248 0.364

2 0.899 1.263 0.364

3 0.914 1.236 0.322

10.00 1 0.818 1.248 0.430

2 0.818 1.263 0.445

3 0.827 1.236 0.409

20.00 1 0.590 1.248 0.658

2 0.604 1.263 0.659

3 0.604 1.236 0.632

Tabel 9 Perhitungan kuadrat selisih pengukuran kapasitas antioksidan vitamin C

dengan spektrofotometri

Absorban Ulangan Vitamin C (ppm)

1.25 2.50 5.00 10.00 20.00

Y 1 0.258 0.296 0.364 0.430 0.658

2 0.288 0.299 0.364 0.455 0.659

3 0.257 0.265 0.322 0.409 0.632

Yi 1i 0.299 0.336 0.411 0.561 0.861

2i 0.297 0.329 0.391 0.516 0.860

3i 0.279 0.318 0.395 0.550 0.860

Yi-Y (1i-1) 0.041 0.040 0.047 0.131 0.203

(2i-2) 0.009 0.030 0.027 0.061 0.201

(3i-3) 0.022 0.053 0.073 0.141 0.228

(Yi-Y)2 (1i-1)

2 1.64E-03 1.60E-03 2.21E-03 1.72E-02 4.12E-02

(2i-2)2 8.56E-05 8.70E-04 7.29E-04 3.72E-03 4.04E-02

(3i-3)2 4.73E-04 2.76E-03 5.33E-03 1.99E-02 5.20E-02

Contoh perhitungan:

Yi dari persamaan garis y = 0.030x + 0.261

Untuk x = 20 ppm, maka

26

Y = 0.030 (20) + 0.261

Yi= 0.299

Yi-Y = 0.299- 0.258 = 0.041

∑(Yi-Y)2 = (0.041)

2 = 1.64E-03

Tabel 10 Nilai LOD dan LOQ vitamin C dengan spektrofotometri

Ulangan ∑(Yi-Y)

2 Sd LOD LOQ

(ppm) (ppm)

1 6.38E-02 0.01856129 1.86 6.19

2 4.58E-02 0.01751949 2.10 7.01

3 8.04E-02 0.02144894 2.08 6.92

Rerata 2.01 6.70

Contoh perhitungan:

Sd = 𝒙𝒊−𝒙 𝟐

(𝒏−𝟏)

= 0.01856129

LOD = 3 SD b

= 3 × 0.01856129 0.030

= 1.86 ppm

Rerata LOD = 2,01139ppm

LOQ = 10 SD b

=10 × 0.01856129 0.030

= 6.19 ppm

Rerata LOQ = 6.70 ppm

\

27

Lampiran 9 Penentuan LOD dan LOQ metode DPPH menggunakan ekstrak daun

jambu biji

Tabel 11 Data absorban terkoreksi terhadap konsentrasi ekstrak daun jambu biji

Ekstrak

(ppm) Ulangan

Absorban Absorban

terkoreksi Ekstrak Blanko

20 1 1.151 1.345 0.194

2 1.146 1.343 0.197

3 1.139 1.307 0.168

40 1 1.032 1.345 0.313

2 1.046 1.343 0.297

3 1.026 1.307 0.281

60 1 0.892 1.345 0.453

2 0.902 1.343 0.441

3 0.889 1.307 0.418

80 1 0.774 1.345 0.571

2 0.789 1.343 0.554

3 0.777 1.307 0.530

100 1 0.658 1.345 0.687

2 0.669 1.343 0.674

3 0.667 1.307 0.640

Tabel 12 Perhitungan kuadrat selisih pengukuran kapasitas antioksidan ekstrak

daun jambu biji dengan spektrofotometri

Absorban Ulangan Ekstrak (ppm)

20 40 60 80 100

Y 1 0.194 0.313 0.453 0.571 0.687

2 0.197 0.297 0.441 0.554 0.674

3 0.168 0.281 0.418 0.530 0.640

Yi 1i 0.190 0.310 0.430 0.550 0.670

2i 0.213 0.353 0.493 0.633 0.773

3i 0.189 0.329 0.469 0.609 0.749

Yi-Y (1i-1) -0.004 -0.003 -0.023 -0.021 -0.017

(2i-2) 0.016 0.056 0.052 0.079 0.099

(3i-3) 0.021 0.048 0.051 0.079 0.109

(Yi-Y)2 (1i-1)

2 1.60E-05 9.00E-06 5.29E-04 4.41E-04 2.89E-04

(2i-2)2 2.56E-04 3.14E-03 2.70E-03 6.24E-03 9.80E-03

(3i-3)2 4.41E-04 2.30E-03 2.60E-03 6.24E-03 1.19E-02

Contoh perhitungan:

Yi dari persamaan garis y = 0.006x + 0.070

28

Untuk x = 20 ppm, maka

Y = 0.006(20) + 0.070

Yi= 0.190

Yi-Y = 0.190- 0.194= -0.004

∑(Yi-Y)2 = (-0.004)

2 = 1.60E-05

Tabel 13 Nilai LOD dan LOQ dengan sampel ekstrak daun jambu biji

menggunakan spektrofotometri

Ulangan ∑(Yi-Y)2 Sd LOD LOQ

(ppm) (ppm)

1 2.89E-04 0.00023898 0.12 0.34

2 2.21E-02 0.00368114 1.56 5.26

3 2.35E-02 0.00453395 1.94 1.44

Rerata 1.21 8.35

Contoh perhitungan:

Sd = 𝒙𝒊−𝒙 𝟐

(𝒏−𝟏)

= 0.00023898

LOD = 3 SD b

= 3 × 0.00023898 0.006

= 0.12 ppm

Rerata LOD = 1.21 ppm

LOQ = 10 SD b

=10 × 0.00023898 0.006

= 0.34 ppm

Rerata LOQ = 8.35 ppm

\

29

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Payakumbuh, Sumatera Barat pada tanggal 27 Agustus

1992 dari pasangan Ceprison dan Afrida. Penulis merupakan anak ketiga dari tiga

bersaudara. Penulis menempuh pendidikan di SMA Negeri 1 Payakumbuh hingga

tahun 2010 dan pada tahun yang sama diterima melalui jalur Undangan Seleksi

Masuk IPB (USMI) di Departemen Kimia IPB. Selama aktif di perkuliahan

penulis bergabung ke dalam berbagai kepanitiaan. Penulis juga aktif sebagai

asisten praktikum Kimia Lingkungan (2011-2012) dan asisten mata kuliah PKF

(2013-2014).

Selama masa aktif penulis pernah mendapatkan beasiswa Bantuan Belajar

Mahasiswa (BBM) (2011-2014). Kegiatan Praktik Lapangan diikuti penulis di

Balai Riset dan Standardisasi Industri Padang dan menulis laporan yang berjudul

“Analisis Limbah Cair Pabrik Kelapa Sawit Menggunakan Aplikasi Lahan”

(2013).