spektrofotometri uv-vis
TRANSCRIPT
A. Radiasi Elektromagnetik
Radiasi elektromagnetik, yang mana sinar ultraviolet dan sinar tampak
merupakan salah satunya, dapat dianggap sebagai energi yang merambat dalam
bentuk gelombang. Beberapa istilah dan hubungan digunakan untuk menggambarkan
gelombang ini. Panjang gelombang ke titik yang bersebelahan pada panjang
gelombang yang berdekatan. DImensi panjang gelombang adalah panjang (L) yang
dapat dinyatakan dalam centimeter (cm) atau angstrom.
Gambar 1.Suatu panjang gelombang yang merupakan jarak dalam arah perambatan antara 2 titik yang
besesuaian
Frekuensi merupakan banyaknya gelombang yang melewati suatu titik
tertentu dalam satuan waktu. Dimensi frekuensi adalah seper waktu. Frekuensi biasa
disimbolkan dengan huruf latin nu (v). Bilangan panjang gelombang (1/λ) sehingga
satuannya adalah 1/panjang. Jika panjang gelombang dinyatakan dengan cm.
hubungan antara energi yang dimiliki radiasi elektromagnetik, frekuensi, dan panjang
gelombang yang bersangkutan.
E = h.v
V = Cλ
, dengan menggabungkan kedua persamaan diatas.
E = h . c
λ
Yang mana :
E = Energi radiasi cahaya
h = tetapan planck, 6,626x10-34 joule
c = kecepatan cahaya yang harganya 2,998x1010 joule
λ = panjang gelombang
Kisaran panjang gelombang frekuensi, dan spektrum elektromanetik. Sinar
ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, sementara sinar
tampak mempunyai panjang gelombang 400-750 nm.
Gambar 2.Kisaran panjang gelombang, frekuensi, dan spektrum elektromagnetiknya
Warna sinar tampak dapat dihubungkan dengan panjang gelombangnya. Sinar
putih mengandung radiasi pada semua panjang gelombang di daerah sinar tampak.
Sinar pada panjang gelombang tunggal (radiasi monokromatik) dapat dipilih dari
sinar putih (sebagai contoh dengan alat prisma). Warna-warna yang dihubungkan
dengan panjang gelombang diringkas pada tabel.1. pada kolom ketiga disebutkan
juga warna komplementer, yang mempunyai makna jika salah satu komponen warna
putih dihilangkan maka sinar yang dihasilkan akan nampak sebagai komplemen
warna yang diserap tadi.
Tabel.1Panjang gelombang Warna yang diserap Warna yang diamati/
Warna komlementer
400 - 435 nm Ungu Hijau kekuningan
450 – 480 nm Biru Kuning
480 – 490 nm Biru kehijauan Orange
490 – 500 nm Hijau kebiruan Merah
500 – 560 nm Hijau Merah anggur
560 – 580 nm Hijau kekuningan Ungu
580 – 595 nm Kuning Biru
595 – 610 nm Orange Biru keunguan
610 – 750 nm Merah Hijau kebiruan
B. Penyerapan Radiasi oleh molekul
Semua molekul mempunyai energi yang dapat digambarkan menjadi beberapa
fenomena. (1) Molekul secara keseluruhan dapat bergerak yang kejadian ini disebut
dengan translasi; energi yang berhubungan dengan translasi tersebut disebut energi
translasional, Etrans, (2) bagian molekul (atom atau sekelompok atom) dapat bergerak
karena berkenaan satu sama lain. Gerakan ini disebut dengan vibrasi dan energinya
dinamakan dengan energi vibrasional, Evib, (3) molekul dapat berotasi pada sumbunya
dan rotasi ini dikarakterisasi dengan energi rotasional, Erot; (4) di samping bentuk
gerakan-gerakan tersebut suatu molekul memiliki konfigurasi elektronik, dan
energinya (energi elektronik, Eelek) tergantung pada keadaaan elektronik molekul.
Energi suatu molekul merupakan jumlah dari komponen-komponen energi
translasional, vibrasional, rotasional, dan elektronik.
E = Etrans + Evibr + Erot + Eelek
Menurut teori mekanika kuantum, komponen-komponen energi tersebut dpat
dianggap hanya memiliki nilai tertentu pada suatu molekul tetentu; dan energi-energi
ini dikatakan terkuantitasi Level energi energi tersebut berhubungan erat dengan
struktur molekulnya. Kita dapat mengharapkan bahwa tidak ada 2 molekul yang
mempunyai energi vibrasonal, rotasional, dan elektronik yang identik,
Jika suatu molekul bergerak dari suatu tingkat energi ke tingkat energ yang
lebih rendah maka beberapa energi akan dilepaskan. Energi ini dapat hilang sebagai
radiasi dan dapat dikatakan telah terjadi emisi radiasi. Jika suatu molekul dikenai
suatu radiasi elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai sehingga energi molekul
tersebut ditingkatkan ke level yang lebih tinggi, maka terjadi peristiwa penyerapan
(absorpsi) energi oleh molekul. Supaya terjadi absorpsi, perbedaan energi antara dua
tingkat energi harus setara dengan energi foton yang diserap. Secara matematis,
pernyataan ini dapat diekspresikan dengan :
E2-E1 = hv
Yang mana :
E = energi pada tingkat yang lebih rendah
E = energi pada tingkat yang lebih tinggi
V = frekuensi foton yang diabsorpsi.
Suatu grafik yang menggambarkan proses ini dapat dilihat pada gambar 2.
Energi ini yang melompat dari suatu tingkat ke tingkat lain disebut dengan transisi,
dan komponen energi yang terlibat dalam proses penyerapan dapat dikatakan dengan
transisi rotasional, vibrasional, elektronik.
Gambar 3.Penyerapan (absorpsi) frekuensi (v) radiasi yang menyebabkan transisi dari tingkat energi 1
(rendah) ketingkat 2 (rendah).
Secara eksperimental, sangat mudah untuk mengukur banyaknya radiasi yang
diserap oleh suatu molekul secara fungsi frekuensi radiasi. Suatu grafik yang
menghubungkan antara banyaknya sinar yang diserap dengan frekuensi sinar
merupakan spektrum abbsorpsi. Transisi yang dibolehkan untuk suatu molekul
dengan struktur kimia yang berbeda adalah tidak sama sehingga spektra absorpsinya
juga berbeda. Dengan demikian, spektra dapat digunakan sebagai bahan informasi
yang bermanfaat untuk analisis kualitatif. Banyaknya sinar yang diabsorpsi pada
panjang gelombang tertentu sebanding dengan banyaknya molekul yang menyerap
radiasi, sehingga spektra absorpsi juga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.
Sinar ultraviolet dan sinar tampak memberikan energi yang cukup untuk
terjadinya transisi elektronik. Dengan demikian, spektra ultraviolet dan spektra
tampak dikatakan sebagai spektra elektronik keadaan energi yang paling rendah
disebut dengan keadaan dasar. Transisi-transisi elektronik akan meningkatkan energi
molekuler dari keadaan dasar ke satu atau lebih tingkat energi tereksitasi.
Jika suatu molekul sederhana dikenakan radiasi elektromagnetik maka
molekul tersebut akan menyerap radiasi elektromagnetik ini akan meningkatkan
energi potensial elektron pada tingkat keadaan tereksitasi, Apabila pada molekul yang
sederhana tadi hanya terjadi transisi elektronik pada satu macam gugus yang terdapat
pada molekul, maka hanya akan terjadi satu absorpsi yang merupakan garis spektrum
sebagaimana dalam gambar 4.
Pada kenyataannya, spektrum UV-Vus merupakan korelasi antara absorbansi
(sebagai ordinat) dan panjang gelombang (sebagai absis) bukan merupakan garis
spektrum akan tetapi merupakan suatu pita spketrum. Terbentuknya pita spektrum
UV-Vis tersebut disebabkan oleh terjadinya eksitasi elektronik lebih dari satu macam
pada gugus molekul yang sangat kompleks. Gambar 5 menggambarkan prinsip dasar
terbentuknya pita spektrum UV-Vis diberikan oleh molekul dengan struktur yang
lebih kompleks karena terjadi beberapa transisi. Sehingga mempunyai lebih dari satu
panjang gelombang maksimal.
Gambar 4Garis spektrum dengan model yang sederhana
Gambar 5.Gambaran terjadinya pita spektrum UV-Vis
C. Penyerapan Sinar Ultraviolet dan Sinar Tampak oleh Molekul
Penyerapan radiasi sinar ultraviolet dan sinar tampak oleh spesies atom atau
molekul (M) dapat dipertimbangkan sebagai proses 2 langkah; yang pertama adalah
melibatkan eksitasi sebagaimana ditunjukkan oleh persamaan berikut :
M + hv M*
Hasil reaksi antara M dengan foton (hv) merupakan partikel yang terkesitasi
secara elektronik yang disimbolkan dengan M*. Waktu hidup M* sangat pendek, dan
keberadaanya dapat diakhiri dengan berbagai relaksasi. Kebanyakan tipe relaksasi
melibatkan konversi energi eksitasi manjadi panas, sesuai dengan persamaan berikut :
M* M + panas
Relaksasi juga terjadi dekomposisi M* membentuk spesies baru, sebagaimana
suatu proses yang disebut dengan reaksi fotokimia, ALternatifnya, relaksasi juga
melibatkan emisi radiasi kembali yang dikenal dengan fluoresensi dan fosforesensi.
Penyerapan (absorpsi) sinar UV dan sinar tampak pada umumnya dihasilkan oleh
eksitasi elektron-elektron ikatan, akibatnya panjang gelombang pita yang
mengabsorpsi dapat dihubungkan dengan ikatan yang mungkin ada dalam suatu
molekul.
Ada tiga macam proses penyerapan energi ultraviolet dan sinar tampak yaitu :
(1) penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan elektron anti ikatan, (2) penyerapan
oleh transisi elektron d dan f dari molekul kompleks; dan (3) penyerapan oleh
perpindahan muatan.
D. Aspek Kualitatif dan kuantitatif Spektrofotometri UV-Vis
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan sekaligus dapat
digunakan untuk analisis kuantitatif.
1. Aspek Kualitatif
Data spectra UV-Vis secara tersendiri tidak dapat digunakan untuk identifikasi
kualitatif obat atau metabolitnya. Akan tetapi jika digabung dengan cara lain seperti
spektroskopi infra merah, resonansi magnet inti, dan spektroskopi massa, maka dapat
digunakan untuk maksud identifikasi/analisis kualitatif suatu senyawa tersebut. Data
yang diperoleh dari spektroskopi UV dan Vis adalah panjang gelombang maksimal,
intensitas, efek PH, dan pelarut, dan kesemuanya itu dapat diperbandingkan dengan
data yang sudah dipublikasikan (Published data). Dari spectra yan diperoleh dapat
dilihat, misalnya :
Serapan (absorbansi) berubah atau tidak karena perubahan pH. Jika berubah,
bagaimana perubahannya apakah batokromik ke hipokromik atau sebaliknya.
Obat – obat yang netral misalnya kefein, kloramfenikol, atau obat-obat yang
berisi ausokrom yang tidak terkonjugasi sepeti amfetamin, siklizin dan
pensiklidin.
2. Aspek Kuantitatif
Dalam aspek kuantitatif, suatu berkas radiasi dikenakan pada cuplikan (larutan
sampel) dan itensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya. Radiasi yang
diserap oleh cuplikan ditentukan dengan membandingkan intensitas yang diteruskan
dengan intensitas sinar yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya.
Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui
satu satuan luas penampang perdetik. Serapan dapat terjadi jika foton/radiasi yang
mengenai cupikan memiliki energy yang sama dengan energy yang dibutuhkan untuk
menyebabkan terjadi perubahan tenaga. Kekuatan radiasi juga mengalami penurunan
dengan adanya penhamburan dan pemantuan cahaya, akan tetapi penurunan karena
hal ini sangat kecil dibandingkan dengan proses penyerapan.
Perhatikan suatu larutan encer senyawa yang mampu menyerap sinar pada
panjang gelombang terpilih untuk suatu percobaan dengan menggunakan pelarut yang
tidak menyerap sinar pada panjang gelombang yang terpilih tersebut. Perlu dicatat
bahwa jika sinar monokromatik dilewatkan melalui suatu lapisan larutan dengan
ketebalan db, maka penurunan intensitas sinar (dl) karena melewati lapisan larutan
tersebut berbanding langsung dengan intensitas radiasi (I), konsentrasi spesies yang
menyerap (c) dan dengan ketebalan lapisan larutan (db), secara matematis,
pernyataan ini dapat dituliskan :
-dl = KIcdb
Persamaan di atas dapat disusun ulang dan diintegritas dengan batas Io (intensitas
sinar mula-mula) dan I ( intensitas sinar setelah melalui larutan dengan ketebalan b).
A = abc
Keterangan :
A = absorbansi
a = absorpsi
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi
Persamaan diatas dikenal juga sebagai hokum lambert-Beer. Kualitas
spektroskopi yan diukur biasanya adalah Transmitans (T) = I/Io, dan absorbansi (A);
yang mana
A= log 1/T.
Absorpsitivitas (a) merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada
konsentrasi, tabel kuvet, dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel.
Absorptivitas tergantung pada satuan a ditentukan oleh satuan-satuan b dan c. Jika
satuan c dalam molar (M) maka absorptivitas disebut dengan absorptivitas molar dan
disimbolkan dengan ε dengan satuan M-1cm-1 atau liter.mol.-1.cm-1. Jika c dinyatakan
dengan persen berat/volume (g/100 ml) maka absorptivitas dapat ditulis dengan E1 cm1 %
dan juga seringkali ditulis dengan A1cm1% .
Hubungan antara lain nilai E1 cm1 % dengan absorptivitas molar (ε) adalah sebagai
berikut :
Ε = E1 cm1 % X
BM10
Penamaan spektroskopi absorbs dapat membingungkan karena banyaknya istilah
sinonim. Istilah – istilah spektroskopik dan simbol-simbol diringkas dalam tabel.1.
Penting juga untuk memahami penamaan yang lebih digunakan, karena istilah ini
juga digunakan di beberapa literatur. Istilah-istilah yang lebih dulu digunakan ini juga
diringkas pada tabel 1.
Tabel. 1Penamaan spektroskopik
Istilah Simbol Istilah yang lebih dulu
digunakan
Transmittan T Transmisi
Persen transmitan %T Persen transmisi
Absorban A Ekstinsi, E, Densitas, D,
Densitas optik, OD,
Absorbansi
Absorptivitas a Koefisien ekstingsi, indeks
absorbansi, ekstingsi spesifik
E1 cm1 %
Absorptivitas ε Koefisien ekstingsi molar
Tebal kuvet B I,d
Konsentrasi C
Hukum lambert-beer menyatakan bahwa intensitas yang diteruskan oleh larutan
zat penyerap berbanding lurus dengan tebal dan konsentrasi larutan. Dalam hukum
Lambert-Beer tersebut ada beberapa pembatasan yaitu :
Sinar yang digunakan monokromatis
Penyerapan yang terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang luas
yang sama
Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang
lain dalam larutan tersebut.
Terjadi peristiwa fluoresensi atau fosforisensi
Indeks bias tidak tergantung pada konsenstrasi larutan.
Analsis kuantitatif dengan metode spektroskopi UV-Vis dapat digolonkan atas
tiga macam pelaksanaan pekerjaan, yaitu : (1). Analisis zat tunggal satu komponen;
(2) analisis kuantitatif campuran dua atau tiga macam zat atau analisis dua komponen
dan (3) analisis kuantitatif campuran tiga macam zat atau lebih (analisis multi
komponen)
a. Analisis Komponen Tunggal
Jika absorbansi suatu seri konsentrasi larutan diukur pada panjang gelombang, suhu,
kondisi pelarut yang sama, dan absorbansi masing-masing larutan diplotkan
terhadapn konsentrasinya maka suatu garis lurus akan teramati sesuai dengan
persamaan A = abc. Grafik ini disebut dengan plot hukum Lambert-Beer dan jika
garis yang dihasilkan merupakan suatu garis lurus maka dapat dikatakan bahwa
hukum lambeert-beer dipenuhi pada kisaran konsentrasi yang diamati.
Cara lain untuk menetapkan kadar sampel adalah dengan menggunakan
perbandingan absorbansi sampel dengan absorbansi baku, atau dengan menggunakan
persamaa regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi baku dengan
absorbansinya. Persamaan kurva baku selanjutnya digunakan untuk menghitung
kadar dalam sampel.
b. Analisis 2 campuran secara bersama-sama
Bila diinginkan pengukuran 2 buah senyawa secara bersama-sama secara
spektrofotometri, maka dapat dilakukan pada 2 panjang gelombang yang mana
masing-masing komponen tidak saling mengganggu atau gangguan dari komponen
lain paling kecil. Dua buah kromofor yang berbeda akan mempunyai kekuatan
absorbansi cahaya yang berbeda pua pada satu daerah panjang gelombang.
Pengukuran dilakukan pada masing-masing larutan pada 2 panjang gelombang,
sehingga diperoleh dua persamaan hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi
pada dua panjan gelombang, akibatnya konsentrasi masing-masing komponen dapat
dihitung.
E. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektrofotometri UV-Vis
Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spekrofotometri
UV-Vis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis
dengan spektrosfotometri visibel karena senyawa tersebut harus diubah terlebih
dahulu menjadi senyawa yang berwarna. Berikut adalah tahapan-tahapan yang harus
diperhatikan.
a. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis
Hal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah
tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubah menjadi senyawa lain atau
direaksikan dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi
beberapa persyaratan yaitu :
Reaksinya selektif dan sensitif
Reaksinya cepat, kuantitatif, dan reprodusibel
Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama
Keselektifan dapat dinaikkan dengan mengatur pH, pemakaian maskin agent, atau
penggunaan teknik ekstraksi.
b. Waktu operasional
Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna.
Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran stabil. Waktu operasional
ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu dengan absorbansi larutan.
Pada awal terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna ini meningkat
sampai waktu tertentu hingga diperoleh abdorbansi stabil Semakin lama waktu
pengukuran, maka ada kemungkinan senyawa yang berwarna tersebut menjadi rusak
atau terurai sehingga intensitas warnanya turun akibatnya absorbansinya juga turun.
Karena alasan inilah, maka untuk pengukuran senyawa berwarna (hasil suatu reaksi
kimia) harus dilakukan pada saat waktu operasional.
c. Pemilihan panjang gelombang
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang
gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Untuk memilih panjang
gelombang maksimal, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi
dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu.
Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan pada panjang gelombang
maksimal, yaitu :
Pada panjang gelombang maksimal, kepekaan juga maksimal karena pada
panjang gelombang maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan
konsentrasi adalah yang palin besar.
Disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar dan pada
kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi.
Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh
pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan
panjang gelombang maksimal.
d. Pembuatan kurva baku
Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai
konsenstrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi diukur,
kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi (y) dengan
konsentrasi (X). Bila hukum Lambert-Beer terpenuhi, maka kurva baku berupa garis
lurus. Kemiringan (a). Kurva baku sebaiknya sering diperiksa ulang. Penyimpanan
dari garis lurus biasanya dapat disebabkan oleh kekuatan ion yan tinggi, perubahan
suhu, reaksi ikutan yan terjadi.
e. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan
Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometri hendaknya 0,2 sampai 0,8 atau
15% sampai 70% jika di baca sebaai transmitrans. Anjuran ini didasarkan anggapan
bahwa kesalahan dalam pembacaan T adalah 0,005 atau 0,5%.
F. Instrumentasi Spektroskopi UV-Vis
Spektrofotometri yang sesuai untuk pengukuran di daerah spektrum ultraviolet
dan sinar tampak terdiri atas suatu sistem optik dengan kemampuan menghasilkan
sinar monokromatis dalam jangkauan panjang gelombang 200-800 nm.
Suatu diagram sederhana spektrofotometri UV-Vis ditunjukkan oleh gambar 1.
Dengan komponen-komponennya meliputi sumber-sumber sinar, monokromator, dan
sistem optik.
i. Sumber-sumber lampu, lampu deuterium digunakan untuk daerah UV pada panjan
gelombang dari 190-350 nm, sementara lampu halogen, kuarsa atau lampu
tungsten digunakan untuk daerah visibel (pada panjang gelombang antara 350-900
nm)
ii. Monokromator, digunakan untuk mendispersikan sinar ke dalam komponen-
komponen panjang gelombangnya yang selanjutnya akan dipilih oleh celah(slit).
Monokromator berputar sedemikian rupa sehingga kisaran panjang gelombang
dilewatkan pada sampel sebagai scan instrumen melewati spektrum.
iii.Optik-optik; dapat didesain untuk memecah sumber sinar sehingga sumber sinar
melewati 2 kompartemen, dan sebagaimana dalam spektrofotometer berkas ganda,
suatu larutan blanko dapat digunakan dalam satu kompartemen untuk mengoreksi
pembacaan atau spektrum sampel. Yang paling sering digunakan sebagai blanko
dalam spektrofotometri adalah semua pelarut yang digunakan untuk melarutkan
sampel dan pereaksi