biosensor berbasis sel dan protein untuk deteksi bioavailibilitas
TRANSCRIPT
Biosensor Berbasis Sel dan Protein untuk Deteksi Bioavailibilitas Logam Berat pada Sampel Lingkungan
Maryanna I. Pratiwi
Anis Balqis N
Aruna Pradipta
Dian Cahyana Putra
Ibnu Nur Fikri
1. Pendahuluan
Pendeteksi ion logam dalam sampel dilakukan dengan metode lama seperti :
1.ICP/AES
2.ICP/MS
3.FIAAS
4.Metode Elektrokimia
5.Polarografi
6.Elektroda voltametrik
Sampel yang diambil dari lingkungan perlu dilakukan:
1.Dilarutkan dalam suhu tinggi
2.Tekanan
3.Kondisi asam
Untuk membebaskan ion logam dalam larutan sebagai prasyarat
semua metode yang telah di sebutkan
Meskipun jumlah total sampel logam yang tedeteksi setelah
beberapa ekstraksi menggunakan metode diatas tidak selalu
terkait dengan toksisitas sampel.Sebab ketersediaan biologis ion
logam tidak di perhitungkan.Oleh karena itu dilakukan
pengukuran pendekatan secara biologis
Perlu Dilakukan pendekatan:
1.Pendekatan pertama dengan menggunakan bakteri tanah yang
secara genetik telah di modifikasi sehingga dapat memberikan
sinyal jika terjadi kontak dengan ion logam dalam sampel
sehingga dapat di ukur kadarnya.
2.Pendekatan kedua
Interaksi antara ion logam dan protein pengikat logam spesifik
dengan merekam kapasitansinya
2. Cara Kerja
Experimental
Pembuatan promotor cassettes yang diinduksi logam berat
Immobilisasi dari biosensor tembaga
Pengukuran bioluminescence
Overekspresi dan purifikasi dari protein logam berat
Imobilisasi protein dan pengukuran kapasitansi
2.1 Pembuatan promotor cassettes yang diinduksi logam berat
Dua klon yang mengandung promotor copSRA dikonstruksi di plasmid pUC18/SfiI
Cassete SfiI yang mengandung elemen yang responsif terhadap merkuri dibentuk
Cassete SfiI yang mengandung elemen yang responsif terhadap chromate dibentuk
2.2 Immobilisasi dari biosensor tembaga
Imobilisasi strain AE1239 pada sodium alginat:
50mL kultur bakteri dipanen menggunakan sentrifugasi pada 6000 rpm
Pellet tersuspensi pada 20mL 0.9% NaCl dan ditambahkan 20mL 4% sodium alginat
Dimasukkan ke dalam 200mL 0.2 M CaCl2 agar membentuk alginat “beads”
Imobilisasi keseluruhan biosensor tembaga:
Pellet disuspensi pada 9mL 0.9% NaCl
2.22 gr Agarosa dilarutkan didalam 100mL 0.9 NaCl dengan pemanasan, lalu didinginkan pada suhu 30 derajat Celsius dan ditambahkan 5mL suspensi bakteri
2.3 Pengukuran bioluminescence
25 mL kultur bakteri LB disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 10.000 rpm dan di resuspensasi pada cryoprotectant dingin
150 mikroliter suspensi sel didispensasi pada tabung vial dan didinginkan pada air es sebelum dimasukan freezer dengan suhu -40 derajat celsius
Didapat sel viabel setelah rekonstitusi pada medium rekonstitusi (MR)
Larutan “metal salt” 20mL ditambahkan kedalam suspensi sel bakteri 180mL dan bioluminescence dihitung dalam waktu lima jam pada 23 derajat celsius menggunakan Lucy1 Microtitre plate luminometer
2.4 overekspresi dan purifikasi
Protein MerR dicangkok di E. coli dan dioverekspresikan.
Setelah induksi selama 3 hari, dilakukan sonikasi, kemudian MerR dipurifikasi dengan LC
GST-SmtA ditanam di E. coli dengan vektor dan di-overekspresikan
GST-SmtA dipurifikasi dengan Glutathine Sepharose 4B.
2.5 immobilisasi protein dan pengukuran kapasitansi
GST dan MerR dicampur buffer fosfat, lalu ditempelkan ke plate emas dengan EDC mediated coupling
Biosensor disusun dengan 3 elektroda yang dihubungkan dengan potensiostat yang responsif.
Elektroda : foil platina, kabel platina, dan Ag/AgCl.
Buffer dimasukkan dalam sel dengan pompa peristaltik, sampel dimasukkan lewat sampel loop.
3. Hasil dan Pembahasan
3.1 Pengembangan tools genetika baru
Sejumlah tools genetic baru serta pengetahuan dasar untuk produksi
strain yang responsive terhadap logam telah dikembangkan
Pengetahuan dasar yang penting adalah bahwa mekanisme aktivasi
regulator/ promoter sensor berdasarkan aktivasi daerah
operator/promoter yang diinduksi logam
Pada biosensor, sinyal akan diterima Ppotein membran luar sel LamB
LamB merupakan peptida heterolog metal-binding metalothionein
pada permukaan luar membran sel gram negative.
Alcaligenes euthropus dipakai sebagai chassis karena
kemampuannya sintas di lingkungan keras
Feasibilitas pendekatan biosensor logam yang dibahas antara lain
promoter yang responsif terhadap Cu2+ ; Hg2+ ; Cr6+/3+ ; Pb2+
• Biosensor logam Cu
menggunakan operon resisten
Cu pMOL30
• Dipakai pula gen copSR yang
mengkode dua komponen
regulator system
• Berbeda dengan operon
resisten Cu pada E. coli, gen
regulator copSR ditranskripsi
pada arah berlawanan dengan
copABCD
Daerah regulator mer (merR dan
moter mer , PmerTPAD dari
transposon Tn501 dipakai untuk
biosensor merkuri
Daerah promoter copSRA
digunakan sebagai promoter
biosensor Cu
Ketika dikloning dalam A.
euthrophus untuk
mengekspresikan LamB atau
sistem reporter GFP, konsentrasi
1 µM Cu2+ atau 0,01 µM HgCl2
dapat mudah dideteksi
Vektor ekspresi promoterless Vibrio fischeri
luxCDABE seperti pMOL877 digunakan untuk
biosensor Cr.
Promoter chrA pada vector ini lebih mudah
diinduksi oleh ion Cr6+ daripada Cr3+
Namun Ni, Zn, Co, Al, Cd, Mn, AsO4, MoO4, WoO4,
SeO3 dan SeO4 tidak menginduksi bioluminesen
dan tidak bersifat toksik hingga 100 µM
vektor pMOL877 dan promoter chrA
menunjukkan dapat digunakan sebagai biosensor
Hg dan Cr
Operon resisten timbal plasmid
pMOL30 mengandung 2 gen
Ketika dikloning pbrR terlihat
sangat spesifik terinduksi oleh ion
timbal
1. pbrRA untuk meregulasi dan
karesistensi timbal
2. pbrR sebagi regulator
operon resisten merkuri
3.2 Imobilisasi sensor bakteri
Selanjutnya dilakukan imobilisasi biosensor yang diinduksi logam pada matriks padat yang berbeda
• Sensor Cu AEI1239 diimobilisasi di gel alginate dan gel agarose dengan penambahan konsentrasi ion Cu2+ di medium LB
Kedua matriks imobilisasi memiliki karakteristik sama namun sinyal relatif lebih tinggi pada agarose karena overgrown kultur bakteri
Secara umum imobilisasi pada gel alginate lebih stabil daripada pada gel agarosa
Kapasitas afinitas sensor terhadap ion logam spesifik
Self Assembled Monolayer(SAM) – pembentukan molekul yang digunakan untuk mengkonstruksi sensor yang sangat sensitif dan spesifik terhadap ion logam.
Konstruksi over ekspresi broader-spectrum MerR dari transposon Tn501 Bacillus yang dapat merespon adanya ion merkuri serta organomerkuri.
Produksi protein fusi synechococcal GST-SmtA metallothione
Karakteristik terjadinya pengikatan Zink (Zn) pada fusi protein dilihat berdasarkan atomic adsorption spectroscopy
Fusi protein juga dapat mengikat ion Cd, Cu, dan Hg pada pH sedang.
pembuatan sebuah sensor afinitas didasarkan pada pengukuran kapasitas,keberadaan lapisan immobilisasi
Penelitian yang dilakukan ini difokuskan pada penentuan optimalisasi immobilisasi
Ada 3, antara lain :
-EDC-coupling
-PEGDGE-entrapment
-GA-crossin
Sejauh ini, EDC-coupling menunjukan sensitivitas yang paling tinggi.
Grafik 3.3.5
Grafik 3.3.7
4. Kesimpulan
Penelitian ini menghasilkan petunjuk feasibilitas teknologi untuk mendeteksi ion
logam berat berdasarkan whole cell biosensor dan protein based biosensors
Telah dilakukan beberapa identifikasi dan penyusunan daerah promoter yang diinduksi
logam untuk mengaktivasi gen reporter lux atau GFP atau ekspresi epitope membran
luar yang dideteksi dengan imunochemistry
Telah dihasilkan gambaran kemungkinan penerapan teknologi whole cell biosensor
dengan imobilisasi. Adapun spesifitas biosensor yang tinggi terlihat pada ion Pb dan
Cr
Demo afinitas sensor berdasarkan protein juga dilakukan untuk memonitor ion logam
berat pada trace level.
Sensor kapasitansi spesifik ion memiliki sensitifitas exceptional, serta sistem yang
kurang baik karena berbagai jenis pengenalan elemen dapat diimobilisasi langsung
seluruhnya pada self assembling monolayer dan melapisi permukaan elektroda
pengukuran logam mulia
Dibandingkan sensor elektrokimia, protein based sensor lebih sensitif
Whole cell sensor hanya mampu bereaksi pada fraksi ion logam yang bioavailable,
sementara protein based sensor lebih aplikatif karena sensitif untuk ion logam.
PustakaCorbisiera, Philippe ., Daniel van der Leliea., Brigitte Borremansa., Ann Provoosta.,Victor de Lorenzob., Nigel L. Brownc., Jonathan R. Lloydc., Jonathan L. Hobmanc., Elisabeth CsoÈregid., Gillis Johanssond., Bo Mattiasson.1999. Whole cell- and protein-based biosensors for the detection of bioavailable heavy metals in environmental samples. Analytica Chimica Acta 387: 235-244