Deteksi DNA dan Protein

Deteksi DNADeteksi DNA (Elektroforesis gel agarosa)• Prinsip : migrasi partikel DNA pada medan

listrik• Pemisahan berdasarkan ukuran (massa

molekul) DNA atau compactness• Gel Agarosa digunakan sebagai media

pergerakan (running) DNA

gumilar

Parameter yang mempengaruhilaju migrasi DNA• Ukuran molekul : Mr ∼ 1/log (Mw) g ( )• Konsentrasi agarosa : log (Mr) ∼ 1/[gel]• Konformasi DNA :

l d i l DNA (f I) t i ll– closed circular DNA (form-I) - typically supercoiled (plg cepat)

– nicked circular (form-II) – linear DNA (form-III) (plg lambat)

• Voltase yang diterapkan (biasanya 5 volt per cm panjang gel

gumilar

panjang gel

Komponen elektroforesis gel agarosa• Sampel DNA

A ( l) li k id k l k di k t k• Agarosa (gel): polisakarida komplek yang diekstrakdari rumput laut. Konsentrasi: 0.5 sd 2%

• Etbr : agen pengkhelat DNAEtbr : agen pengkhelat DNA• Loading buffer, mengandung pemberat ex : gliserol• Running Buffer: memfasilitasi hantaran arus,

biasanya TAE atau TBE• Marker (penanda DNA)

gumilar

PerlengkapanPerlengkapan •Alat elektroforesis (chamber)( )

•Power suppy

•Gel casting trays

•Transilluminator (an ultraviolet lightbox),

gumilar

Prosedur elektroforesisProsedur elektroforesis• Simpan gel pada alat elektroforesis, lalu

tuangkan buffertuangkan buffer• Mix sampel dengan loading buffer, lalu

masukkan ke ‘sumur’ yang ada pada gel (hal y g p g (yg sama dilakukan untuk marker)

• Set voltase • Running • Periksa dibawah lampu uv

gumilar

p

Contoh hasil elektroforesis

Deteksi Protein

gumilar

PAGEPAGE• PolyAcrylamide Gel Electrophoresis• Cara termudah untuk menguji kemurnian protein• Pada PAGE protein dijaga dalam bentuk native dan

ktifaktif• Pemisahan didasarkan pada muatan dan ukuran

proteinprotein

gumilar

A lik i PAGEAplikasi PAGE• PAGE sangat sensitif thd proses-proses yangPAGE sangat sensitif thd proses proses yang

mempengaruhi konformasi dan muatan dari protein. Sehingga native PAGE dapat dimanfaatkan sbg alat

t k d t k iuntuk mendeteksi:– Perubahan muatan akibat degradasi kimia (ex: deaminasi)– Unfolded atau peristiwa perubahan konformasi lainnya– Oligomer atau agregat– Binding event (protein-protein atau protein ligan)

gumilar

SDS PAGESDS-PAGE• SDS:

• Protein terdenaturasi selama proseselektroforesis

gumilar• Pemisahan berdasarkan ukuran (BM)

Penentuan berat molekul protein dengan SDS-PAGE