PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DALAM TABLET DENGAN MENGGUNAKAN HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY(HPLC)

I. TUJUANMenentukan kadar parasetamol dalam tablet dengan metode analisis HPLC

II. DASAR TEORI2.1 Parasetamol

Parasetamol (C8H9NO2) atau asetaminofen berupa serbuk hablur, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit. Mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari 101,0 % C8H9NO2, dihitung terhadap zat anhidrat. Kelarutannya larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N serta mudah larut dalam etanol. BM parasetamol adalah 151,16. Parasetamol memiliki khasiat sebagai analgetikum dan antipiretikum (Depkes RI, 1995).

Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti methanol/ air.

Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan antipiretik.

Gambar Rumus Struktur Parasetamol

Absorbansi parasetamol pada max 245 nm dalam larutan asam adalah sebesar 668a sedangkan dalam larutan alkali atau basa absorbansinya sebesar 715a pada max 257 nm. (Moffat et al., 2005).

2.2 High Performance Liquid Chromatography HPLCHigh performance liquid chromatography (HPLC) atau yang sering disebut kromatografi cair kinerja

tinggi (KCKT) adalah jenis kromatografi yang penggunaannya paling luas. Prinsip kerja dari HPLC adalah memisahkan suatu senyawa berdasarkan kepolarannya yang dimana terdapat dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Pemisahan bagian dari suatu sampel yang kemudian dilakukan suatu analisis kuantitatif dan kualitatif.

HPLC dilakukan dengan menginjeksi sebagian kecil dari sampel cairan ke dalam aliran cairan bergerak (disebut fasa gerak) yang melewati kolom dengan partikel dari fasa diam. Seperti halnya kromatografi gas, pemisahan campuran kedalam komponennya bergantung pada waktu retensi dari setiap komponen dalam kolom.  Kadar komponen yang terpisahkan bergantung pada perbandingan fasa gerak dan fasa diam nya. Berbagai teknik pemisahan HPLC dengan memvariasikan fasa diam dan gerak telah dilakukan.

Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan dan pemurnian senyawa obat serta untuk analisis kuantitatif senyawa obat dalam sediaan farmasetika. Disamping itu, HPLC juga digunakan untuk identifikasi kualitatif senyawa obat berdasarkan pada parameter waktu retensi senyawa obat standar serta senyawa obat dalam sampel. Kegunaan HPLC antara lain:

- Untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis- Analisis ketidakmurnian (impurities)- Analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non volatile)- Penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion- Isolasi dan pemurnian senyawa- Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama- Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah yang sekelumit (trace element), dalam jumlah

banyak, dan dalam skala proses industri.

2.3 Parameter HPLCParameter yang dapat digunakan untuk mengetahui kualitas suatu kromatogram adalah Resolusi (R s),

Faktor Retensi (k), Faktor selektifitas (α), Efisiensi dan jumlah lempeng teoritis (N).- Resolusi (Rs)

Hal yang terpenting dari HPLC adalah mengoptimasi resolusi dalam waktu yang minimum. Nilai resolusi yang melebihi 1,5 diantara dua puncak akan memberikan nilai pemisahan yang baik. Resolusi dipengaruhi oleh beberapa parameter diantaranya: Selectivity, Effieciency, dan Retention.

- Faktor Retensi (k)Faktor retensi adalah waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom

kromatografi. Nilai k yang tinggi mengindikasikan sampel memerlukan waktu dalam berinteraksi dengan fase diam terlebih dahulu hingga keluar dari kolom saat tepat dalam konsentrasi maksimum.

- Faktor selektifitas (α)

Selektifitas merupakan kemampuan instrumen dalam mengenali senyawa-senyawa dalam campuran untuk mendapat selektifitas yang maksimum diperlukan interaksi yang sesuai (partisi, adsorpsi, size exclusion, atau ion exchange). Apabila kedua senyawa memiliki k atau nilai α = 1 kedua senyawa tidak dapat dipisahkan. akibat waktu retensinya identik. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai selektivitas (α) harus lebih besar daripada 1, semakin besar nilai α maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai α dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa gerak (misalnya dengan memperbesar polaritas), mengubah fasa diam, mengubah temperatur karena pada umumnya kenaikan temperatur akan memperkecil waktu retensi, dan mengubah bentuk komponen

- EfisiensiEfisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan  dengan

memuaskan dan dalam waktu yang singkat. Hasil yang idel kolom yang efisien akan menghasilkan puncak yang tajam. Efisiensi sangat dipengaruhi oleh kapasitas dari kolom.

- Lempeng teoritis (N)Merupakan parameter yang menghitung efisiensi kromatografi. Menyatakan jumlah peristiwa partisi

yang dialami oleh analit pada setiap saat yang dibawa oleh fase gerak selama elusi. Dimana semakin besar harga N akan memberikan puncak yang lebih efisien.

2.4 Instrumen

Gambar 1. Skema Alat HPLC

a. Pompa (Pump)Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

b. Injektor (Injector) Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan:

Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.

Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada Kromatografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μL dan dilakukan dengan cara otomatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih

kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi load, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfer, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.Syarat injektor :

Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin Mudah digunakan Keberulangn tinggi Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

c. Kolom (Column) Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat diklasifikasikan menjadi dua kelompok, yaitu :

1) Kolom analitik: Diameter dalam 2 - 6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 - 100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 - 30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

2) Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm

d. DetektorDetektor dapat dibagi menjadi beberapa macam, yaitu sebagai berikut:

1) Detektor spektrofotometri UV-VisDetektor jenis ini merupakan detektor yang paling banyak digunakan dan sangat berguna

untuk analisis di bidang farmasi karena kebanyakan senyawa obat mempunyai struktur yang dapat menyerap sinar UV-Vis. Detektor ini didasarkan pada adanya penyerapan radiasi UV dan sinar tampak pada kisaran panjang gelombang 190-800 nm oleh spesies solut yang mempunyai struktur atau gugus kromoforik. Sel detektor umumnya berupa tabung dengan diameter 1 mm dan panjang celah optiknya 10 mm, serta diatur sedemikian rupa sehingga mampu menghilangkan pengaruh indeks bias yang dapat mengubah absorbansi yang terukur.

2) Detektor Indeks BiasDetektor indeks bias atau refraktometer diferensial adalah suatu detektor universal yang

memberi tanggap pada setiap zat terlarut, asalkan indeks biasnya jauh berbeda dengan indeks bias fase gerak. Kelemahan utamanya adalah bahwa indeks bias ini peka terhadap suhu. Karena itu suhu fase gerak, kolom, dan detektor harus dikendalikan dengan seksama, bila pengukuran yang cermat dilakukan pada kepekaan tinggi.

3) Detektor ElektrokimiaBanyak molekul organik, termasuk obat, dapat dioksidasi atau direduksi secara elektrokimia

pada elektrode yang cocok. Arus yang dihasilkan pada proses ini dapat diperkuat untuk menghasilkan tenaga yang sesuai. Meskipun detektor elektrokimia cukup peka, namun ada pula kelemahannya. Adanya timbrungan listrik dan goncangan arus juga harus diperhatikan.

4) Detektor Photodiode-Array (PDA)Detektor PDA merupakan detektor UV-Vis dengan berbagai keistimewaan. Detektor ini

mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yang berbeda dalam sekali proses (single run). Selama proses berjalan, suatu kromatogram pada panjang gelombang yang diinginkan (biasanya antara 190-400) dapat ditampilkan. Dengan demikian, PDA memberikan banyak lebih banyak informasi komposisi sampel disbanding dengan detector UV-Vis. Dengan detektor ini, juga diperoleh spectrum UV tiap puncak yang terpisah sehingga dapat dijadikan sebagai alat yang penting untuk memilih panjang gelombang maksimal untuk sistem KCKT yang digunakan. Dan akhirnya dengan detektor ini pula, dapat dilakukan uji kemurnian puncak dengan membandingkan antara spectra analit dengan spectra senyawa yang sudah diketahui.

Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan pada detektor PDA ini dapat ditampilkan sebagai plot 3 dimensi absorbansi, panjang gelombang, dan waktu sehingga data ini dapat dimanipulasi dan diplotkan kembali pada layar (monitor) lalu dibandingkan dengan data 3 dimensi senyawa lain dari perpustakaan data yang ada di sistem komputernya sehingga bisa digunakan untuk tujuan identifikasi (Gandjar dan Rohman, 2007).

III. ALAT DAN BAHAN3.1. Alat

a. Timbangan analitikb. Batang pengadukc. Sendok tandukd. Beaker glasse. Erlenmeyer

f. Labu ukurg. Pipet ukurh. Mortir dan stamperi. Botol vialj. Bulb fillerk. Pipet tetesl. Kertas perkamenm. Membran filtern. Alat ultrasoniko. Syringe p. HPLC dengan kolom reversed phase C18

3.2. Bahana. Tablet sampel (Pamol)b. Serbuk baku parasetamolc. Metanol dan air (70:30 v/v)

IV. CARA KERJA4.1 Pengkondisian Kolom HPLC

4.2 Pembuatan Larutan Stok Parasetamol 100 µg/mL

4.3 Pembuatan Seri Larutan Standar Parasetamol 5 µg/mL; 10 µg/mL; 15 µg/mL; 20 µg/mL; 25 µg/mL

Larutan pencuci kolom (metanol dan air (70:30 v/v)) difiltrasi melalui membran

Metanol dan air (70:30 v/v) difiltrasi.

Diinjeksikan metanol dan air (70:30 v/v) sebanyak 10 L ke alat melalui selang pelarut dengan kecepatan alir 1 mL/menit.

Ditimbang parasetamol menggunakan beaker glass sebanyak 50 mg.

Dilarutkan dengan sedikit metanol dan air (70:30 v/v), dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL.

Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) sampai tanda batas, dikocok hingga homogen.

Dipipet sebanyak 1 mL, dimasukan kedalam labu ukur 10 mL.

Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) sampai tanda batas.

Dikocok hingga homogen.

Larutan stok parasetamol 100 µg/mLdipipet 0,5 mL; 1 mL; 1,5 mL; 2 mL; 2,5 mL dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL.

Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) hingga tanda batas.

4.4 Pembuatan Larutan Sampel 1 mg/mL

4.4.1 Pengenceran Larutan Sampel 1 mg/mL menjadi 100 µg/mL

4.4.2 Pengenceran Larutan Sampel 100 µg menjadi 15 µg/mL

4.5 Pembuatan Kurva Kalibrasi

Dikocok hingga homogen.

Digerus tablet parasetamol sebanyak 3 buah menggunakan stamper dan mortir.

Ditimbang serbuk mengandung sebanyak 100 mg parasetamol.

Dimasukan ke dalam beaker glass, setelah itu serbuk ini dilarutkan dengan metanol dan

air (70:30 v/v), dimasukan kedalam labu ukur 100 mL.

Ditambahkan pelarut hingga tanda batas kemudian dikocok hingga homogen.

Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) ke dalam labu ukur sampai tanda batas.

Dikocok hingga homogen.

Dipipet larutan parasetamol 1 mg/mL sebanyak 10 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL.

Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) hingga tanda batas.

Dikocok hingga homogen.

Dipipet larutan sampel 100 µg/mL sebanyak 1,5 mL, dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL.

Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) sampai tanda batas.

Dikocok hingga homogen.

Diulangi sebanyak 2 kali.

Diinjeksikan larutan seri parasetamol konsentrasi terendah diinjeksikan ke membran (difiltrasi) sebanyak 20 L pada injektor HPLC.

Larutan seri di-scan pada panjang gelombang 200 nm-300 nm.

4.6 Penetapan Kadar Parasetamol

V. HASIL PENGAMATAN5.1 Bobot Masing-Masing Tablet

5.1.1 Sampel Tablet Bobot

Tablet 1Tablet 2Tablet 3Bobot total

0,7254 gram0,7222 gram0,7265 gram2,1741gram

5.2 Data AUC dan waktu retensiBahan AUC Waktu Retensi

Standar 1 (5 µg/ml)Standar 2 (10 µg/ml)Standar 3 (15 µg/ml)Standar 4 (20 µg/ml)Standar 5 (25µg/ml)

Sampel

63936812140101734344233225527084781737360

1,5691,5811,5791,5861,5811,571

Ditentukan panjang gelombang maksimumnya.

Larutan standar lain diukur pada panjang gelombang maksimum.

Dibuat kurva kalibrasi standar parasetamol dan persamaan regresi linier y = bx + a, y = AUC dan x = kadar sampel (µg/mL).

Setiap larutan sampel parasetamol di-degassing dan difiltrasi.

Diinjeksikan sebanyak 20 L larutan sampel pada injektor HPLC.

Larutan discan pada panjang gelombang maksimum parasetamol yang sudah diperoleh sebelumnya.

Masing-masing AUC yang akan didapat dicatat sebagai bahan penetapan kadar dengan cara mensubstitusikan nilai AUC ke dalam kurva kalibrasi parasetamol yang sudah

diperoleh sebelumnya.

Ditentukan nilai perolehan kembali kadar parasetamol terhadap kadar pada kemasan sampel.

5.3 Spektrum5.3.1 Standar 1 (5 µg/ml)

5.3.2 Standar 2 (10 µg/ml)

5.3.3 Standar 3 (15 µg/ml)

5.3.4 Standar 4 (20 µg/ml)

5.3.5 Standar 5 (25µg/ml)

5.3.6 Sampel

VI. ANALISIS DATA6.1 Larutan Standar

Bahan AUC Waktu RetensiStandar 1 (5 µg/ml)Standar 2 (10 µg/ml)Standar 3 (15 µg/ml)Standar 4 (20 µg/ml)Standar 5 (25µg/ml)

Sampel

63936812140101734344233225527084781737360

1,5691,5811,5791,5861,5811,571

Dari data diatas, dapat ditentukan persamaan regresi linear dari larutan standar seri konsentrasi.

Regresi linear yang diperoleh:y = 105129,3x + 148751,5 R² = 0,997

Perhitungan kadar sampel:Diketahui : y = 105129,3x + 148751,5

AUC = 1737360Ditanya : Konsentrasi= ......μg/mL(x)Jawab:

y = 105129,3x + 148751,51737360 = 105129,3x + 148751,5105129,3x = 1588608,5x = 15,11 μg/mL

6.2 Perhitungan Konversi Sampel dan Kadar Paracetamol dalam SampelDiketahui : Kadar sampel = 15,11 μg/mL

Kadar sampel primer = 1 mg/mL Volume sampel primer = 100 mL Kadar sampel sekunder = 15 μg /mL

Ditanya : kadar sampel= ......mgJawab :

Konversi dari kadar sampel (µg/ml) sebanding 1000 µg/ml

15,11 µg/mL15 µg/ml

x1000 μ g/ml= 1007,3 µg/ml = 1,0073 mg/ml

Konversi sebanding 100 mg sampel1,0073 mg/ml 100 ml = 100,73 mg

Kadar sampel 15,11 μg/mL setara 100,73 mgKadar paracetamol dalam sampel = 100,73 mg

6.3 Perhitungan Kadar Paracetamol dalam TabletDiketahui : Kandungan parasetamol 1 tablet yang diambil (ka)= 100 mg

Kandungan paracetamol diperoleh (ks) =100,73 mgKandungan parasetamol 3 tablet secara teoritis= 1500 mgKandungan parasetamol 1 tablet secara teoritis= 500 mg

Ditanya : Kandungan parasetamol 1 tablet dari analisis = ...?Jawab :

0 5 10 15 20 25 300

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

f(x) = 105129.3 x + 148751.5R² = 0.995411119168314

Series2Linear (Series2)

Kandungan parasetamol 3 tablet =

k s

ka

×1500 mg

=

100,73 mg100 mg

×1500 mg

= 1510,95 mg

Kandungan parasetamol 1 tablet =

1510,95 mg3

= 503,65 mg

VII. PEMBAHASANPrinsip dari metode HPLC pada umumnya sama dengan metode kromatografi, yaitu didasarkan pada

perbedaan kecepatan migrasi solut yang dipengaruhi oleh perbedaan afinitas solut terhadap fase gerak dan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2007). Metode HPLC ideal untuk analisis beragam obat dalam sediaan dan cairan biologi, karena sederhana, dan kepekaannya tinggi (Munson, 1984).

Sebelum dilakukan penginjeksian sampel, terlebih dahulu dilakukan penginjeksian larutan standar eksternal parasetamol dengan kosentrasi 5 µg/mL; 10 µg/mL; 15 µg/mL; 20 µg/mL; 25 µg/mL. Berdasarkan hasil pengamatan terhadap nilai AUC, diperoleh data yang menunjukan bahwa pada larutan standar parasetamol 5 µg/mL diperoleh nilai AUC sebesar 639368 dengan waktu retensi 1,569. Pada larutan standar parasetamol 10 µg/mL diperoleh nilai AUC sebesar 1214010 dengan waktu retensi 1,581. Pada larutan standar parasetamol 15 µg/mL diperoleh nilai AUC sebesar 1734344 dengan waktu retensi 1,579. Pada larutan standar parasetamol 20 µg/mL diperoleh nilai AUC sebesar 2332255 dengan waktu retensi 1,586. Pada larutan standar parasetamol 25 µg/mL diperoleh nilai AUC sebesar 2708478 dengan waktu retensi 1,581. Larutan standar ini digunakan untuk membuat persamaan regresi linier dan dapat dibuat kurva kalibrasi sebagai berikut :

0 5 10 15 20 25 300

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

f(x) = 105129.3 x + 148751.5R² = 0.995411119168314

Series1Linear (Series1)

Dari semua larutan standar yang diukur diperoleh persamaan regresi dengan menggunakan kelima larutan standar yaitu konsentrasi diperoleh nilai korelasi (R2) yang cukup tinggi yaitu sebesar 0,997. Persamaan regresi y = 105129,3 + 148751,5 dengan y = AUC dan x = kadar sampel (µg/ml). Persamaan ini sudah memenuhi parameter linieritas sehingga dengan persamaan linier ini, maka dapat digunakan untuk menentukan kadar parasetamol sampel.

Setelah diperoleh persamaan regresi linier dari larutan standar eksternal parasetamol. Selanjutnya dilakukan penginjeksian sampel. Elusi dari masing-masing berkisar antara 1,582 menit. Penginjeksian sampel dilakukan sebanyak 3 kali untuk memperoleh keseksamaan atau kesalahan yang minimal.

Uji kualiatif adanya parasetamol dalam tablet dilakukan dengan mencocokan batas spektrum yang diperoleh dengan spektrum standar parasetamol awal. Berikut spektrum dari ketiga sampel yang diinjeksikan :

Gambar 2. Spektrum sampel ASecara kuantitatif berdasarkan perhitungan diperoleh kadar sampel rata-rata dari 3 kali penyuntikan

adalah 107,08 mg. Kadar yang diperoleh dari hasil analsis adalah 535,41 mg dengan perolehan kembali sebesar 107,08%.

Hasil yang diperoleh melebihi 100 % dari kadar sebenarnya. Hal ini kemungkinan karena ketidaktepatan pemipetan pada saat pembuatan larutan sampel.

VIII. KESIMPULAN

Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan dan pemurnian senyawa obat serta untuk analisis kuantitatif senyawa obat dalam sediaan farmasetika.

Parameter yang dapat digunakan untuk mengetahui kualitas suatu kromatogram adalah Resolusi (R s), Faktor Retensi (k), Faktor selektifitas (α), Efisiensi dan jumlah lempeng teoritis (N).

Kadar parasetamol yang diperoleh 535,41 mg dengan perolehan kembali sebesar 107,08%.