High Performance Liquid Chromatography(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik

untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif. HPLC paling sering digunakan untuk

penetapan kadar senyawa-senyawa tertentu, menentukan senyawa aktif obat,

memurnikan senyawa dalam suatu campuran, memisahkan polimer dan

menentukan distribusi berat molekul dalam suatu campuran. Keterbatasan metode

HPLC adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan

spektrometer masa (MS). Keterbatasan lain adalah jika sampel sangat kompleks,

maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Gholib, 2011).

PRINSIP KERJA

Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut : dengan bantuan pompa fasa

gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam

aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan

komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara

solute-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan

fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat

berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom

dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram

kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan

konsentrasi komponen dalam campuran. Computer dapat digunakan untuk

mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil

pengukuran HPLC (Gholib, 2011).

INSTRUMENTASI

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa,

alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah

penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.

Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Fase gerak atau eluen

biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara

keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini

ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat

komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada

fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),

kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut (Gholib,2011).

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk

menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak

juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain

terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis

(Gholib,2011).

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap

selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah

selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas.

Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang

kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas

(Gholib,2011).

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase

terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan

asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering

digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang

terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan

fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik (Gholib,2011).

Fasa gerak HPLC harus memenuhibeberapa persyaratan berikut :

1) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang

akandianalisis.

2) Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yangdapat

mengganggu interpretasi kromatogram.

3) Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbata pada

kolom.Biasanya pelarut disaring dengan saringan nilon berukuran

diameter 0,45µm. Pompa vakum biasanya digunakan untuk menyaring

partikel kotoransekaligus menghilangkan gas dari pelarut karena gas dapat

mengganggu base line.

4) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun.

5) Zat cair tidak kental. Umumnya keketalan tidak melebihi 0,5 cP

(centiPoise).

6) Sesuai dengan detektor.

Tabel 1. Properties of HPLC mobile phase

2. Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang

mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus

inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah

gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Untuk tujuan preparatif,

pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan

kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran

fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak

berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.

Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan :

1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi.

2. Kelluara bebas pulsa

3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit.

4. Bahan tahan korosi.

Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan

dan kerugian yaitu pompa reciprocating, displacement  dan pneumatic.

 Gambar Pompa

Pompa reciprocating

Jenis pompa ini sekarang paling banyak dipakai. Popa ini terdiri dari

ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang

dijalankan oleh motor. Piston berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut.

Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk,

sebaliknya ketika piston maju bola bawah menutup saluran pelarut danpelarut yang

telah berada diruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.Gerakan piston mundur dan

maju terjadi secara terus menerus sehinggamemeberikan aliran eluen konstan. Pompa ini

menghasilkan pulsa yang dapatmengganggu base-line kromatogram, karena itu

dipasang peredam pulsa untuk menghilangkan gangguan base-line sedangkan

keuntungan pompa ini adalah memiliki volume internal yang kecil. Untu

mengurangi bond broadening. Selain itu, pompa ini menghasilkan tekanan tinggi,

kecepatan alir konstan yang tidak brgantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut

(Hendayana, 2006).

Pompa displacement  

Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung

yangdilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini jugamenghasilkan aliran

yang cenderung tidakbergantung tekanan balik klom danvisikositas pelarut. Selain itu,

keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan tetapipompa ini keterbatasan kapasitas pelarit dan

tidak mudah untu mealkukanpergantian pelarut (Hendayana, 2006).

Pompa pneumatic

Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis

murah dan bebeas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasab kapasitasdan tekanan yang

dihasilkan serta kecepatan alir bergantung pada viskositaspelarut dan tekanan balik

kolom (Hendayana, 2006).

3. Tempat penyuntikan sampel

Kebanyakan pemasukan cuplikan ke dalam kolom dapat

menyebabkanband broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukan harus sekecil

mungkin, beberapa puluh miroliter. Teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem

HPLC melalui injeksi srynge, injeksi “stop-flow”, dan kran cuplikan

(Hendayana, 2006).

Injeksi syringe

Alat yang paling dulu ada dan paling paling mudah untuk memasukkancuplikan

adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) danuntuk ini

dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapiketerulangan injeksi

syringe ini sedikit labih baik dari2-3% dan sering lebih jelek (Hendayana, 2006).

Injeksi ‘stop-flow’

Injeksi stop-flow adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini

aliranpelarut dihentikan sementara, asambungan pada ujung kolom dibuka

dancuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah

menyambungkankembali kolom maka pelarut dialirkan kembali (Hendayana, 2006).

Kran cuplikan

Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk

memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dualangkah :

1. Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi “load”,

cuplikan masih berada dalam loop.

2. Kran diputar untuk mengubah cuplikan “load” menjadi posisi “injeksi”dan fasa

gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-ganti dan

tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500 µL. Dengansistem

pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukan cuplikan padatekanan 7000 psi

denga ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia denganvolume 0,5 hingga

5µL.

Gambar Tipe injector katup putaran

(Hendayana, 2006).

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.

Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk

berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3

keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil

dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor

kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor

lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,

karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas

misal sampel klinis.

(Hendayana, 2006).

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom

konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Kebanyakan fase diam

pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak

dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika

adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika

dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti

klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan

menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS

atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu

memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun

tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang

polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai

pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan

memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan

air yang digunakan (Hendayana, 2006).

Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat

dari gelas berdinding tebal. Kolom utma berisi fasa diam, tepat terjadinya

pemisahan campuran menjadi komonen-komponennya. Bergantung keperluannya

kolom utama dapat digunkan untuk analisis atau preparatif. Untuk keperluan

preparatif, setiap komponen yang keluar kolom ditampung pada tabung yang

berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector. Selain kolom

utama dikenal pula kolom pengaman (guard kolom) (Hendayana, 2006).

Kolom utama berisi fasa diam dan jenisnya bervariasi bergantungkeperluan,

misalnya dikenal kolom C-18, C-8, cyanopropyl, penularan ion.Kolom jenis C-18 dan C-8

paling banyak dipakai dalam HPLC. Fasa diam jenisterikat ini dapat dibuat dengan

mereaksikan silika dengan alkilklorosilana yangdikenal dengan reaksi silanisasi

(Hendayana, 2006).

Fasa Diam

Dalam kromatografi cair-cair, fasa diam adalah cairan film yang

dilapiskan padamaterial kemasan yang terdiri dari partikel silica berpori 3-10 .

fasa diammungkin sebagian akan larut dalam fasa gerak. Untuk mencegah hilangnya fasadiam

ini, maka fasa diam diikat secara kovalen pada partikel silica. Ikatan fasadiam diperoleh

dengan mereaksikan partikel silica dengan organochlorosilanedengan bentukumu Si

(CH3)2RCl dimana R adalah alkil atau alkil yang tersubstitusi.

Untuk mencegah interaksi antara zat terlarut dengan gugus – SiOH, silicasering

direaksikan dengan Si(CH3)3Cl. Sifat dari fasa diam ditentukan oleh sifat

organosilane‟s gugus alkil. Jika R adalah gugus fungsional polar, maka fasadiam akan

polar. Contoh fasa diam polar, dimana R terdiri dari cyano (-C2H4CN), diol (-

C3H6OCH2CHOHCH2OH), atau amino (-C3H6NH2). Karenafasa diam polar, fasa

bergerak adalah nonpolar atau pelarut yang cukup polar.Kombinasi dari fasa diam polar

dan fasa gerak non polar disebut kromatografifasa normal. Dalam kromatografi

fasa terbalik, sering ditemui dalam HPLC, fasadiam non-polar dan fasa gerak

polar. Fasa diam non-polar paling umummenggunakan organochlorosilane dengan R

adalah n-octyl (C8) atau n-octyldecyl (C18) rantai hidrokarbon (Gholib, 2011).

5. Detektor HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor

universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan

tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri

massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit

secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan

elektrokimia (Gholib, 2011).

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada

kadar yang sangat kecil.

3. Stabil dalam pengopersiannya.

4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita.

5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada

kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).

6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

(Gholib, 2011).

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik

detektor seperti berikut :

Detektor Sensitifitas

(g/ml)

Kisaran

linier

Karakteristik

Absorbansi Uv-

vis

Fotometer filter

Spektrofotometer

spektrometer

photo-diode

array

5 x 10-10

5 x 10-10

> 2 x 10-10

104

105

105

Sensitivitas bagus, paling

sering digunakan, selektif

terhadap gugus-gugus dan

struktur-struktur yang

tidak jenuh.

Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus,

selektif, Tidak peka

terhadap perubahan suhu

dan kecepatan alir fase

gerak.

Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal

akan tetapi sensitivitasnya

sedang. Sangat sensitif

terhadap suhu, dan tidak

dapat digunakan pada

elusi bergradien

Elektrokimia

Konduktimetri

Amperometri

10-8

10-12

104

105

Peka terhadap perubahan

suhu dan kecepatan alir

fase gerak, tidak dapat

digunakan pada elusi

bergradien. Hanya

mendeteksi solut-solut

ionik. Sensitifitas sangat

bagus, selektif tetapi

timbul masalah dengan

adanya kontaminasi

elektroda.

(Hendayana, 2006).

6.  Rekorder

Untuk mencetak hasil percobaan pada lembaran kertas berupa kumpulan puncak

(kromatogram). Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai

puncak-puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram (Gholib,

2011).

INTERPRETASI HASIL

Sistem HPLC memberikan dua tipe data. Pertama, dikenal dengan

kromatogram, dan yang lain disebut spectrum. Kromatogram adalah grafik yang

merekam signal dari detector selama waktu pengukuran. Pada saat senyawa

dideteksi oleh instrument, signal meningkat dan kromatogram menampilkan

puncak-puncak (peak) (Clark, 2007).

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-

masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor

dan menerap sinar UV. Sepanjang kondisi kolom tetap terkontrol, waktu retensi

dapat digunakan untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh.

Dimana, senyawa murni dari komponen yang akan dianalisis sudah diukur dalam

kondisi yang sama (Clark, 2007).

Hasil pengukuran dari detektor disebut Liquid Chromatogram

Gambar 1. Contoh kromatogram dari sejumlah kecil volume sampel yang

diekstraksi dari kapsul vitamin E yang dilarutkan dalam pelarut organic.

Setiap puncak pada kromatogram mengindikasikan adanya senyawa kimia

di dalam sampel. Setiap puncak dilabel oleh waktu retensi (retention time). Waktu

retensi adalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui

kolom menuju detektor. Waktu retensi diukur dari waktu dimana sampel

diinjeksikan sampai titik dimana layar menunjukan ketinggian puncak maksimum

untuk senyawa itu. Senyawa berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk

beberapa senyawa, waktu retensi akan bervariasi tergantung pada tekanan yang

digunakan (karena mempengaruhi laju alir pelarut), sifat fase diam, komposisi

pelarut, dan suhu kolom (Clark, 2007).

Kuantitas senyawa dapat diperoleh dengan mengukur tinggi peak kromatogram

dari dasar, serta mengukur luas peak.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah komponen A yang

melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar

computer (Clark, 2007).

Jika terdapat dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan

Y). Maka tidak dapat ditentukan jumlah relatifnya, jika menggunakan serapan UV

sebagai metode pendeteksinya (Clark, 2007).

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area

dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X,

tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih

sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi

jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil (Clark, 2007).

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan

mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak

saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan

perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini

dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap

diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya

jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample

ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja (Clark, 2007).

DAFTAR PUSTAKA

Clark, J. 2007. High Performance Liquid Chromatography. [Online]. Tersedia

online di: http://www.chem-is-try.org (diakses tanggal 2 Januari 2013)

Hendayana, S. 2006. Kimia Pemisahan. Bandung: PT. Remaja Rosdakarya Offset

Gholib, Ibnu. 2011.Kimia Farmasi Analisis.Yogyakarta: Pustaka Pelajar

Note: Karena nggak tahu batasan segimana yg harus dicari ttg HPLC, jadi semuanya aku masukin. Kalo sekiranya gak perlu, mangga hapus aja