PENANAMAN

Kalanchoe pinnata,

Kultur jaringan merupakan salah satu tekhnik memperbanyak suatu tanaman dengan cara menanam sebagian kecil jaringan pada medium yang sudah dalam keadaan steril. Teknik kultur jaringan bukan hanya digunakan untuk beberapa tujuan seperti mendapatkan produksi metabolit sekunder, mendapatkan keragaman seleksi dan pemuliaan tanaman.

Proses pelaksanaan kultur jaringan yang dapat

dikatakan proses terakhir yaitu penanaman

eksplan. Syarat pertama kultur jaringan juga

masih digunakan pada pelaksanaan ini yaitu

kondisi yang aseptic. Pada pross penanaman

eksplan, lingkungan yang digunakan haruslah

benar-benar dalam kondisi yang aseptic. Oleh

karenanya penanaman biasanya dilakukan di

Enkas, sebuah kotak dengan tepi yang

transparan dan terdapat lubang untuk tangan,

atau dengan menggunakan LAF (Laminar Air

Flow).

Penanaman eksplan harus dilakukan pada

ruangan yang harus steril, dan eksplan juga

dalam keadaan yang steril pula.  Penanaman

dapat dilakukan pada ruangan tertutup atau

ruangan penabur  dalam Laminair Air Flow

(LAF). Ruangan digunakan, setelah dilakukan

sterilisasi dengan menggunakan larutan

alkohol 96 % pada lantai dan dinding ruangan,

dan membiarkan ruangan selama 30 menit

dengan sinar UV yang menyala.

Sterilisasi eksplan dapat dilakukan atau

dilaksanakan dengan dua cara yaitu secara

mekanik dan secara kimia.

a.       Sterilisasi eksplan secara mekanis. Cara ini

digunakan untuk eksaplan yang keras atau

berdaging, yaitu dengan membakar eksplan

tersebut diatas lampu spirtus sebanyak tiga

kali. Eksplan keras yang disterilkan dengan

cara ini adalah tebu, biki salak, bung, buah

anggrek, akapulaga dan sebagainya. Sterilisasi

eksplan dengan cara kimiawi.

b.      Sterilisasi secara kimiawi digunakan untuk

eksplan yang lunak seperti daun, tangkai daun,

dan sebagainya. Bahan kimia yang sering

dipakai untuk disinfestasi adalah alkohol

seperti etil, metil, atau isopropyl-alkohol

dengan konsentrasi 70-80%, Ca-hipoklorit

atau Na- hipoklorit.

Macam-macam bahan untuk sterilisasi dan

fungsinya:

1. Deterjen (Membershkan kotora/debu dari

eksplan)

2. Fungisida (Memberihkan jamur/cendawan)

3. Bakterisida (Membersihkan bakteri)

4. Alkohol 70% dan 95%

5. Sodium hipoklorik dengan nama dagang

clorox atau bayclin

6. Mercury chlorit dengan nama dagang

sublima 0,05 %

7. Tween -20 (Agen pembasah)

8. Antibiotik

9. Iodine/betadine Antiseptik

Satu hal yang penting dalam sterilisasi

permukaan eksplan adalah mengkompromikan

antara usaha untuk mendapatkan eksplan yang

steril dan menjaga agar jaringan eksplan tidak

rusak akibat tingginya konsentrasi disinfektan.

Untuk meminimalkan tingkat kontaminasi dan

mendapatkan pertumbuhan eksplan yang

cepat, beberapa perlakuan (threatment)

terhadap tanaman induk sumber eksplan dapat

diterapkan sebagai berikut:

Eksplan atau bahan tanam ialah bagian

kecil jaringan atau organ yang diambil dari

tanaman induk kemudian dikulturkan

ketepatan dalam dalam menyiapkan eksplan

salah satu faktor yang dapat mempengaruhi

inisiasi eksplan.

a)      Syarat Bagian Tanaman Sebagai Bahan

Eksplan

Bagian tanaman yang yang dapat

dijadikan eksplan adalah akar, pucuk, daun,

bunga, buah muda, dan tepung sari. Faktor

yang dimiliki oleh eksplan itu sendiri yaitu:

ukuran, umurnya, sumber genotip dan sterilitas

eksplan.

Ukuran eksplan yang terlalu kecil

mempunyai daya tahan kurang dibandingkan

dengan ukuran yang lebih besar, ukuran

ekspalan yang baik adalah 0,5-1 cm tetapi ini

tidak mutlak untuk setiap eksplan karena

tergantung pada material tanaman dan jenis

tanamannya.

Umur fisiologis pun berpengaruh

terhadap kemampuanya untuk beregenerasi

jaringan tanaman yang masih muda yang

meristematik (sel-sel masih aktif membelah)

lebih mudah beregenerasi dibandingkan yang

lebih tua. Yang termasuk jaringan merismatik

adalah pucuk apikal, pucuk lateral, dan pucuk

axial.

b)      Karakter Bahan Tanaman Sebagai Eksplan

Pada dasarnya setiap bagian tanaman

dapat dijadiakn sebagai bahan eksplan, tetapi

dalam memilih bagian tanaman yang akan

dikulturkan harus mempertimbangkan faktor

kemudahan beregenerasi dan tingkat

kontaminasinya.

Bagian tanaman yang mengandung

persediaan makanan serta bahan-bahan lain

untuk pertumbuhan, seperti umbi adalah lebih

mudah untuk beregenerasi dibanding dengan

bagian tanaman yang kurang mengandung

bahan makanan. Bagian yang berasal dari akar

yang tumbuh didalam tanah, tingkat

kontaminannya lebih tinggi di bandingkan

dengan bagian bagian tanaman yang ada diatas

permukaan tanah seperti pucuk atau daun.

Laminar air flow ialah alat yang digunakan dalam pekerjaan mempersiapkan bahan tanaman, penanaman, dan pemindahan tanaman dari suatu botol ke botol lain dalam kultur jaringan. Laminar air flow meniupkan udara steril secara kontinyu melewati tempat kerja, sehingga tempat kerja bebas debu dan spora yang mungkin jatuh kedalam media sewaktu pelaksanaan penanaman. Aliran udara yang berasal dari udara ruangan ditarik kedalam melalui filter pertama (pre filter: pori-pori 5µm) yang kemudiaan ditiupkan keluar melelui filter yang sangat halus yang disebut HEBA (High Eficiency Particulate Air Filter) pori–pori 0,3µm dengan menggunakan blower.

Sterilisasi sangat penting karena :

a)      Jasad renik yang terbawa eksplan akan

tumbuh menutupi eksplan dan media sehingga

dapat menghancurkan jaringan yang akan

ditanam.

b)      Adanya jasad renik akan mengubah

lingkungan karena hilangnya zat makanan di

media dan dilepaskan produk metabolit

tambahan ke dalam media dan dilepaskannya

produk metabolit tambahan ke dalam media,

sehingga dapat menghancurkan eksplan yang

akan ditanam.

Melakukan Sub Kultur (Inokulum)

Sub kultur dalam perbanyakan tanaman

secara kultur jaringan di perlukan agar

diperoleh pucuk atau anakan yang banyak.

Satu pucuk inokulum dapat di perbanyak

menjadi 20 pucuk yang dapat di pisahkan

menjadi 20 propagul. Sedangkan 20 propagul

tersebut masing–masing telah membentuk

sejumlah pucuk dan seterusnya. Kelebihan

kultur ini adalah pucuk atau hasil perbanyakan

pertama dapat langsung di pegunakan untuk

perbanyakan selanjutnya.

Kegiatan sub kultur harus dilakukan

terhadap inokulum disebabkan oleh beberapa

hal, diantaranya:

1.      Tumbuhnya eksplan cukup cepat dan telah

memenuhi botol kultur

2.      Media tumbuh telah mengering yang di

tandai dengan mengurangnya volume agar-

agar atau media cairnya sudah habis

3.      Eksplan lebih perlu di perbanyak lagi untuk

tujuan perbanyakan tahapan selanjutnya

4.      Eksplan memerlukan media yang susunannya

baru agar mengalami diperensiasi lebih lanjut

Eksplan atau kalus yang sudah waktunya

di pindahkan ke dalam media kultur yang baru

harus segera di laksanakan dan tidak boleh

terlambat. Sub kultur yang terlambat dapat

menyebabkan pertumbuhan eksplan atau kalus

tersebut akan terhenti atau mengalami

pengcoklatan atau bahkan akan

terkontaminasi oleh bakteri atau virus.

Keadaaan eksplan kemungkinan untuk di

selamatkan kecil sekali karena spora jamur

atau bakteri dapat menyebar dengan sangat

cepat sekali.

Tahap sub kultur inokulum tujuannya

agar perbanyakan eksplan selanjutnya dapat

diperbanyak dengan beberapa cara.

Perbanyakan stek dengan perbanyakan buku

yang di lanjutkan sub kultur berkali kali dari

buku ke tunas yang di hasilkan, diikuti dengan

perakaran tunas, misalnya pada tanaman

kentang dan jati. Metode lain yang mendorong

perbanyakan tunas samping dan eksplan tunas

pucuk atau stek satu buku untuk membentuk

tunas majemuk seperti pada tunas pisang,

vanili, nanas dan stroberi. Perbanyakan

dengan metode perbanyakan tunas samping

sering di gunakan karena relatif sederhana,

penyimpangan generatif relatif kacil,

perbanyakan berlangsung cepat dan tanaman

yang di hasilkan tumbuh baik karna terjadi

rejuvenasi.

Faktor-faktor yang mempengaruhi

keberhasilan mikropropagasi

1)    Genotif Tanaman

Salah satu faktor yang mempengaruhi

pertumbuhan dan morfologis eksplan dalam

kultur in-vitro adalah genotip tanaman asal

eksplan diisolasi. Pengaruh genotif ini

umumnya berhubungan erat dengan faktor-

faktor lain yang erat hubungannya dengan

pertumbuhan eksplan seperti kebutuhan

nutrisi, zat pengatur tumbuh, lingkungan

kultur dan lain-lain. Oleh karena itu komposisi

media, zat pengatur tumbuh dan linggkungan

pertumbuhan yang dibutuhkan oleh masing-

masing tanaman bervariasi meskipun tehnik

kultur jaringan yang di terapkan sama.

Perbedaan respon genotif tanaman

tersebut dapat diamati pada perbedaan eksplan

masing-masing varietas untuk tumbuh dan

beregenerasi.

2)    Media Kultur

Perbedaan komposisi media, komposisi

zat pengatur tumbuh dan zat media yang

digunakan akan sangat berpengaruh terhadap

pertumbuhan dan regenerasi eksplan yang

akan dikulturkan.

a.     Komposisi Media

Perbedaan komposisi media, seperti jenis

dan komposisi garam-garam an-organik,

senyawa organik, zat pengatur tumbuh sangat

mempengaruhi eksplan saat dikulturkan.

Tanaman dapat tumbuh dengan baik pada suhu

optimumnya, pada suhu ruang kultur di bawah

optimum, pertumbuhan eksplan lebih lambat,

namun pada suhu diatas optimum

pertumbuhan tanaman juga akan terhambat

akibat tingginya pertumbuhan eksplan.

b.    Kelembaban Relatif

Kelembaban relatif dalam botol kultur

dengan mulut botol yang ditutup pada

umumnya cukup tinggi, yaitu berkisar antara

80-99%. Jika mulut botol ditutup agak longgar

maka kelembaban relatif dalam botol relatif

rendah, sedangkan kelembaban pada kultur

jaringan relatifnya adalah 70%. Jika

kelembaban relatif ruang kultur di bawah 70%

maka akan menyebabkan media dalam botol

kultur akan cepat menguap dan kering eksplan

yang di kultur kan akan cepat habis medianya,

maka sebaliknya jika kelembaban tinggi

tanaman akan tumbuh abnormal yaitu daun

lemah, mudah patah tanaman kecil namun

terlampau sukulen, tanaman tesebut di

namakan “vitrifikasi”

c.     Cahaya

Seperti halnya pertumbuhan tanaman

dalam kondisi in-vitro kuantitas dan kualitas

cahaya,yaitu intensitas cahaya, lama

penyinaran dan gelombang cahaya

mempengaruhi pertumbuhan eksplan dalam

kultur in-vitro. Pertumbuhan organ atau

jaringan tanaman dalam kultur in-vitro

umumnya tidak dihambat oleh cahaya, namun

pertumbuhan kalus petumbuhan kalus

dipengaruhi oleh cahaya.

Pada perbanyakan tanaman pada in-vitro

kultur pada umumnya diinkubasi pada ruang

penyimpanan dengan penyinaran. Tunas-tunas

pada umumnya diransang pertumbuhannya

dengan penyinaran,kecuali pada teknik

perbanyakan yang diawali dengan

pertumbuhan kalus. Sumber cahaya pada

ruang kultur ini umumnya adalah lampu

flaurescen. Hal ini disebabkan karena lampu

TL menghasilkan cahaya warna putih, selain

itu warna putih tidak meningkatkan suhu

ruangan kultur secara drastis, hanya meningkat

sedikit. Intensits cahaya yang di gunakan pada

ruangan kultur umumnya jauh lebih rendah

dari intensitas cahaya yang dibutuhkan oleh

tanaman dalam keadaan normal.

Selain intensitas cahaya, lama penyinaran

atau photoperiodisitas juga mempengaruhi

pertumbuhan eksplan yang di kulturkan, lama

penyinaran biasanya disesuaikan dengan

kebutuhan tanaman sesuai dengan kondisi

alaminya. Periode terang dan gelapnya

umumnya diatur pada kisaran 8-16 jam terang

dan 16-8 jam gelap tergantung varietas

tanaman yang dikulturkan .

1.    Kondisi Eksplan

Pertumbuhan dan morfogenesis dalam

kultur jaringan sangat di pengaruhi oleh

jaringan tanaman yang di gunakan sebagai

eksplan. Selain faktor genetis eksplan yang

telah disebut di atas, kondisi eksplan yang

mempengaruhi keberuntungan kultur adalah

jenis eksplan, ukuran, umur dan fase jaringan

fisiologis jaringan yang digunakan sebagai

eksplan. Meskipun masing-masing sel

tanaman memiliki kemampuan totipotensi,

namun masing-masing jaringan memiliki

kemampuan yang berbeda-beda untuk tumbuh

dan beregenerasi dalam kultur jaringan, oleh

karena itu eksplan yang digunakan untuk

masing-masing kultur berbeda-beda

tergantung tujuannya,. Umur eksplan sangat

berpengaruh terhadap kemampuan eksplan

tersebut untuk tumbuh dan beregenarasi.

Umumnya eksplan yang berasal dari jaringan

tanaman yang masih muda lebih mudah

tumbuh dan beregenerasi dibandingkan dengan

jaringan yang telah diverensiasi lanjut.

Jaringan muda umumnya memiliki sel-sel

yang aktif membelah dengan dinding sel yang

belum komplek sehingga lebih mudah

dimodifikasi dalam kultur dibandingkan

jaringan tua oleh karena itu, inisiasi kultur

biasanya di lakukan dengan menggunakan

pucuk muda, kuncup-kuncup muda, hipokotil,

inflorenscence, yang belum dewasa. Jika

eksplan di ambil dari tanaman dewasa,

rejupenilisisasi tanaman induk melalui

pemangkasan atau pemupukan dapat

membantu untuk memperoleh eksplan muda

agar kultur berhasil. Ukuran eksplan juga

mempengaruhi keberhasilan kultur. Eksplan

dengan ukuran kecil lebih mudah disterilisasi

dan tidak membutuhkan ruang serta media

yang banyak, namun kemampuannya untuk

beregenerasi juga lebih kecil sehingga

dibutuhkan media yang lebih kompleks untuk

pertumbuhan dan regenerasi sebaliknya

semakin besar eksplan maka semakin besar

kemungkinannya membawa penyakit dan

makin sulit untuk di sterilkan. Membutuhkan

ruang dan media kultur yang lebih banyak.

Ukuran eksplan yang sesuai sangaat

tergantung dari jenis tanaman yang di

kulturnya, teknik dan tujuan pengulturannya.

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam

kegiatan inisiasi/penanaman yakni sebagai

berikut : ( Hawaauriz, 2009 ).

1.    Alat dan bahan yang dimasukkan dalam

laminar harus dipastikan dalam keadaan steril

sehingga perlu dilakukan penyemprotan

dengan alkohol 70 %.

2.    Untuk mengurangi masuknya

mikroorganisme yang tidak diinginkan,

sebelum membuka tabung kultur sebaiknya

mulut tabung digarang pada api terlebih

dahulu

3.    Kegiatan penanaman diusahakan dilakukan

dengan cepat, karena semakin cepat dilakukan

penanaman maka eksplan tidak akan terlalu

lama berikatan dengan oksigen sehingga

kemungkinan untuk browning semakin kecil.

PENGAMATAN

Eksplan atau kultur dapat terkontaminasi oleh

berbagai mikrooganisme seperti jamur,

bakteri, serangga atau virus. Namun, sumber

utama kontaminan adalah spora jamur dan

bakteri yang membentuk bagian alami dari

atmosfer. Banyak yang bersifat non-patogenik,

artinya mereka tidak menyebabkan bahaya

bagi tanaman inang pada kondisi normal.

Kontaminasi permukaan dapat diatasi dengan

cara pencucian menggunakan berbagai

perlakuan bahan kimia. Keterbatasan utama

adalah untuk memberikan perlakuan yang

cukup kuat untuk mengeliminasi kontaminasi

tanpa merusak jaringan tanaman. Ini biasanya

dicapai dengan menambahkan detergen,

agitasi (digoyang –goyang), atau

membenamkan eksplan dengan sedikit tekanan

untuk mengilangkan gelembung udara yang

mungkin mengandung mikroorganisme

(Hendaryono, 1994).

Kontaminasi yang disebabkan oleh

mikroorganisme endofilik (organisme yang

hidup di dalam sel atau ruang antar sel

tanaman) yang sering merupakan biote dari

tanaman sumber eksplan, sulit diatasi dengan

sterilisasi permukaan. Keadaan ini disebabkan

oleh koloni baktri sering tidak muncul pada

saat eksplan baru dikulturkan pertama kali,

tetapi beberapa minggu kemudian muncul

koloni bakteri. Bakteri tersebut tetap ada

setelah disubkulturkan berkali-kali, karena

hidupnya memang secara epifit di dalam

jaringan tanaman.

Eksudasi dari eksplan merupakan tipe

kontaminasi yang lain, bukan dari organisme

lain. Ketika jaringan tanaman terluka, dengan

cara pemotongan atau perlakuan bahan kimia

seperti larutan klorin, reaksi fisiologis terjadi

pada sel sekitar luka. Salah satu prosesnya

adalah produksi bahan biokimia apakah

sebagai produk pecahan atau sintesa sebagai

mekanisme perlindungan. Keluarnya substansi

dari jaringan akan terjadi. Bahan kimia ini

mungkin atau mungkin tidak memberi

pengaruh mematikan pada pertumbuhan kultur

(Imron, 2007).

Sebagai sumber utama kontaminan, eksplan

memiliki perlakuan khusus pada proses

sterilisasinya. Diantranya adalah pencucian

dengan menggunakan deterjen ditujukan untuk

menghilangkan sisia-sisa tanah pada umbi

eksplan. Selanjutnya di rendam dalah alcohol

untuk menghilangkan atau membunuh kuman.

Selanjutnya dicelupkan pada larutan klorok

untuk membunuh mikroba terutama yang ada

di bagian dalam eksplan. Digunakan pula

fungisida untuk membunuh spora ataupun

cendawan yang diperkirakan ada pada eksplan.

Praktikum kultur jaringan kali ini, eksplan

yang digunakan adalah daun bunga begonia

dan ditanam pada media yang telah dibuat

sebelumnya yaitu Media MS. Setelah dilkukan

penanaman, eksplan tersebut diamati selama

kurang lebih 2 minggu, untuk mengetahui

apakah terjadi kontaminasi pada eksplan

ataupun media.

Adapun kontaminasi yang sering terjadi pada

kultur jaringan tanaman terdiri atas dua jenis

yaitu kontamiasi oleh bakteri dan kontaminasi

oleh jamur. Untuk membedakan kedua jenis

kontaminasi ini, dapat dilihat dari ciri-ciri fisik

yang muncul pada eksplan maupun media

kultur. Bila terkena kontaminasi bakteri maka

tanaman akan basah atau menyebabkan adanya

lendir, hal ini dikarenakan bakteri langsung

menyerang terhadap jaringan dari tubuh

tumbuhan itu sendiri. Sedangkan bila

terkontaminasi oleh jamur, tanaman akan lebih

kering dan akan muncul hifa jamur pada

tanaman yang terserang dan biasanya dapat

dicirikan dengan adanya garis – garis (seperti

benang) yang berwarna putih sampai abu –

abu.

Penyebab terjadinya kontaminasi bisa

diakibatkan karena kesalahan pada saat

penanaman, saat sterilisasi media dan eksplan

atau bahkan pada saat pembuatan media.

Berdasarkan pengamatan dilakukan selama 2

minggu (3 kali pengamatan) ternyata ketiga

eksplan terkontaminasi. Adapun pada

pengamatan pertama (2 hari setelah

penanaman) kondisi eksplan dan media

tumbuh kultur masih dalam keadaan baik.

Sedangkan pada pengamatan kedua, eksplan

dan media kultur telah terkontaminasi oleh

jamur. Hal ini ditunjukkan dengan adanya

kontaminan yang berwarna putih dan

membentuk seperti benang (hifa). Begitupun

pada pengamatan selanjutnya, kontaminasi

yang terjadi oleh jamur makin jelas dan

terlihat begitu nyata karena hampir seluruh

bagian permukaan eksplan dan media kultur

ditumbuhi oleh jamur. Kontaminasi bisa

terjadi dikarenakan adanya kesalahan atupun

kurang optimalnya dalam penanaman maupun

melakukan hal lain yang dapat mendukung

keberhasilan kultur jaringan tersebut, terutama

dalam hal sterilisasi.

Pada penelitian ini terdapat juga eksplan jati

yang mengalami pencoklatan atau browning.

Pencoklatan salah satunya disebabkan oleh

sintesis metabolit sekunder. Fitriani (dalam

Nisa

dan Rodinah, 2005) mendapatkan bahwa

warna

coklat kalus menandakan sintesis senyawa

fenolik. Pencoklatan ini sering membuat tidak

terjadinya pertumbuhan dan perkembangan

eksplan. Peristiwa pencoklatan sesungguhnya

merupakan peristiwa alamiah yang biasanya

sering terjadi. Pencoklatan umumnya

merupakan

suatu tanda-tanda kemunduran fisiologis

eksplan

dan tidak jarang berakhir pada kematian

eksplan,

SIMPULANBerdasarkan hasil pengamatan dan

pelaksanaan praktikum kultur jaringan

tanaman acara Penanaman Eksplan dapat

diperoleh beberapa simpulan sebagai berikut :

1. Penanaman eksplan dilakukan di LAF

(Laminar Air Flow). Penggunaan alat

sebelumnya sudah dalam keadaan steril.

Penanaman dilakukan dengan cara

mencelupkan scalpel dan pinset ke dalam

alcohol 96% lalu dibakar pada nyala api

Bunsen. Setelah itu alat baru bisa digunakan

untuk menanam. Pada setiap botol kultur, diisi

1 potong eksplan.

2. Pada eksplan daun begonia terjadi kontaminasi

oleh jamur, hal ini ditunjukkan dengan adanya

kontaminan yang berwarna putih dan

membentuk seperti benang (hifa).

3. Kontaminasi bisa terjadi dikarenakan adanya

kesalahan atupun kurang optimalnya dalam

penanaman maupun melakukan hal lain yang

dapat mendukung keberhasilan kultur jaringan

tersebut, terutama dalam hal sterilisasi.

Gunawan, L.W. 1988. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: Laboratorium Kultur Jaringan, PAU Bioteknologi, IPB.

Rahardja, P. C. 1995. Kultur Jaringan : Teknik Perbanyakan Tanaman Secara Modern. Penerbit Swadaya, Jakarta.

Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2002. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Kanisius, Yogyakarta.