LAPORAN BUKTI KEGIATAN

BUTIR KEGIATAN : Pembuatan skala lab sistem/proses/model

JUDUL KEGIATAN : Pembuatan Bacillus transformant dengan protoplast transformation

PELAKSANA : Dr. Is Helianti, M.Sc

PENDAHULUAN Kegiatan ini bertujuan untuk membuat Bacillus rekombinan yang kode genetiknya telah dimodifikasi sehingga memiliki dua gen penyandi xilanase. gandaggumpulkan, memahami, menganalisa, lalu memilih media fermentasi yang cost effective yang dapat digunakan dalam proses fermentasi enzim skala besar. Data-data dikumpulkan baik melalui study literatur ataupun eksperimen. Dari hasil pengumpulan data tentang jenis-jenis medium yang digunakan dalam fermentasi ini diharapkan dapat ditetapkan medium yang paling murah untuk mengurangi ongkos produksi enzim dalam industri.

MATERIAL ATAU BAHAN-BAHAN YANG DIPERLUKANBakteri yang akan menjadi host dari plasmid DNA target, yaitu Bacillus subtilis DB104 dan Bacillus subtilis strain AQ1Larutan SMMP Larutan SMMMedium DM3

PROSEDUR/PROSES1. Preparasi Protoplast

a. Inokulasi koloni tunggal di media Penasay broth 20 ml. Inkubasi pada suhu 37 oC sampai mencapai fase midlog. Kira-kira pada OD600 0.4-0.6 (atau sekitar 4-4.5 jam). Sentrifus pada 6000 rpm 20 menit 4 C. Resuspend dengan larutan SMMP 2 ml.

b. Tambahkan lysozyme dengan konsentrasi akhir 2 mg/ml (0.4 ml). Inkubasi dengan shaking perlahan pada 37 C (100 rpm) selama 2 jam.

c. Sentrifus dengan rotor horizontal 2900 rpm, 15 menit, 4 C. Ambil peletnyad. Resuspend dengan larutan SMMP 2 ml. Sentrifus kembali (dengan rotor horizontal).

Ambil pellet.e. Tambahkan 1 ml larutan SMMPf. Preparasi awal ini stabil pada suhu ruang selama 5 jam. Ketika diplating di media

regenerasi efisiensi akan mencapai 10-25% dari cfu awal.

2. Transformasia. 1-5 pg DNA plasmid dalam 50 micro l TE Buffer ditambah ke dalam 2XSMM larutan

dengan perbandingan volume yang sama (50 micro L DNA dan 50 micro L SMM solution) di tube 1.5 ml.

b. Tambahkan 0.5 ml protoplas dan segera tambahkan 1.5 ml PEG 40% solution. Campurkan perlahan (di falkon tube 50 ml)

c. Setelah 2 menit tambahkan 5 ml SMMP solutiond. Sentrifus 2900 rpm 10 menit 4 C (dengan rotol horizontal) ambil pellet.e. Resuspend dengan 1 ml SMMP solution. Inkubasi 1.5 jam pada suhu 30 C dengan

shake perlahanf. Bagi mashing-masing 0.2 ml. Spread ke dalam DM3 regenerasi yang memakai

antibiotic. Sel akan tumbuh dalam waktu sekitar 2 hari pada suhu inkubasi 37 C

3. Isolasi Plasmid untuk verfikasi

Is Helianti, 680004015

a. 5-10 ml kultur di sentrifus pada 10000 rpm selama 5 menit, supernatant dibuang.b. Pellet disuspensi dengan cara divortex atau dipipet dalam 200 microL SET buffer dan 5

mg lysozyme per ml SET buffer. Pindahkan suspense sel ke dalam microcentrifuge tube, inkubasi pada 37 C selama 10 menit

c. Tambahkan 350 microL larutan NaOH-SDS segar ke dalam suspense pellet, eppi tube lalu dibolak-balik hingga suspense menjadi jernih.

d. Tambahkan 350 microL 3-5 M larutan Kalium acetat dingin, segera vortex pada kecepatan medium selama 10 detik. Suspensi kemudian disentrifus pada kecepatan maksimal selama 5 menit.

e. Pipet 750 micro Lsupernatant ke dalam eppi bau kemudian ekstraksi dengan 650 microL larutan phenol:chloroform: isoamylalcohol (25:24:1) dingin dengan cara vortexing selama 1 menit. Sentrifus selama 5 menit.

f. Pipet 620 micro L aqueous phase ke dalam eppi baru kemudian ekstraksi dengan 620 microL larutan chloroform: isoamylalcohol (24:1) dengan cara vortexing selama 30 detik. Sentrifus selama 5 menit.

g. Pipet 550 micro L aqueous phase ke dalam eppi baru, presipitasi dengan menambahkan 550 microL isopropanol dingin (-20C), bolak-balik eppi beberapa kali. Sentrifus selama 5 menit, buang supernatant

h. Cuci pellet DNA dengan 1 ml ethanol 70% sentrifus selama 2 menit buang supernatant.i. Keringkan pellet dengan vacuum evaporator selama 5 menitj. Larutkan DNA dalam 50 microL ddH2O mengandung DNase-free RNAse (20 microg/ml)

HASIL UJI1. Pada kasus Bacillus subtilis AQ1 tidak dapat menghasilkan transformant atau

Bacillus subtilis AQ1 yang tahan erythromycin.2. Pada kasus Bacillus subtilis DB104 dapat menghasilkan transformant atau

Bacillus subtilis DB 104 yang tahan erythromycin, dengan hasil verifikasi plasmid sbb:

Hasil verifikasi plasmid

UNJUK KERJA Perbedaan aktivitas Bacillus subtilis DB104 yang rekombinan data terus tumbuh dan berkembang biak pada medium LB cair yang mengandung erythromycin. Jadi prosedur di atas dapat digunakan untuk membuat Bacillus subtilis DB104 transformant. Sedangkan untuk kasus Bacillu subtilis AQ1 harus dipikirkan prosedur atau metode lain agar menghasilkan galur rekombinan.

Menyetujui, Serpong, Oktober 2009

Pemberi Tugas, Pelapor.Direktur Pusat Teknologi Bioindustri

( Dr. Witono Basuki ) ( Dr. Is Helianti, M.Sc)NIP: 195703231982101002 NIP: 197011262003122004

Is Helianti, 680004015