PRAKTIKUM IV

1. JUDUL :

PEMBIAKAN BAKTERI DENGAN METODE MPN

2. TUJUAN : - Diharapkan dapat Mengetahui perbedaan antara tabung positif dengan

tabung negatif

- Diharapkan dapat Mengetahui uji apa saja yang akan dilakukan dalam

metode MPN ini

- Diharapkan dapat Mengetahui ada tidaknya pertumbuhan bakteri pada

sampel

3. DASAR TEORI Metode hitungan cawan dengan menggunakan media padat, tetapi pada metode

MPN dengan menggunakan medium cair didalam tabung reaksi. Perhitungan MPN

berdasarkan pada jumlah tabung reaksi yang positif, yakni yang di tambahi oleh mikroba

setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat

dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas didalam tabung

kecil (durham) yang diletakan pada posisi terbalik yaitu untuk jasad renik yang

membentuk gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya dengan menggunakan 3 atau 5

seri tabung, lebih banyak tabung yang digunakan menunjukan ketelitian yang lebih

tinggi, tetapi alat gelas (tabung reaksi) yang digunakan juga lebih banyak (Waluyo,

2004).

Dalam metode MPN pengenceran sampel harus lebih tinggi dari pada pengenceran

hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinkubasi

dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung 1 jasad renik beberapa tabung

mungkin mendukung lebih dari 1 sel. Sedangkan tabung yang lain tidak mengandung sel

sama sekali. Dengan demikian setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada

beberapa tabung, yang dinyatakan sebagai tabung positif. Sedangkan tabung yang lainnya

negatif (Waluyo, 2004).

Pertumbuhan secara umum dapat didefinisikan sebagai pertambahan secara teratur

semua komponen didalam sel hidup. Perbanyakan sel adalah konsekuensi pertumbuhan-

pertumbuhan makhluk hidup dapat juga ditinjau dari dua sudut, yakni pertumbuhan sel

dan pertumbuhan koloni sebagai satu populasi . Pada mikroorganisme, pertumbuhan

individu (sel) dapat berubah langsung menjadi pertumbuhan populasi, sehingga batas

antara pertumbuhan sel pertumbuhan populasi, serta sebagai satu kesatuan populasi yang

kemudian terjadi, kadang-kadang karena telah cepat perubahannya, sulit untuk diamati

dan dibedakan (Dwidjoseputro, 2005).

Umur sel jasad renik ditentukan segera setelah proses pembelahan sel selesai,

sedangkan umur kultur ditentukan dari waktu atau lamanya inkubasi ukuran sel

tergantung dari kecepatan pertumbuhannya. Semakin baik zat nutrisi didalam substrat

tempat tumbuhnya mengakibatkan pertumbuhan sel semakin cepat dan ukuran sel

semakin besar (Dwidjoseputro, 2005).

Dalam metode MPN, pengenceran sampel harus lebih tinggi dari pada hitungan

cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinkubasi dengan

larutan hasil pengenceran tersebut mengandung satu jasad renik, beberapa tabung

mungkin mengandung lebih dari 1 sel, sedangkan yang lain tidak mengandung sel sama

sekali. Dengan demikian, setelah diinkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada

beberapa tabung, yang dinyatakan sebagai tabung, yang dinyatakan sebagai tabung

positif. Sedangkan tabung lainnya negatif (Dwidjoseputro, 2005).

Tabel yang digunakan untuk menentukan nilai MPN dari 3 seri tabung berbeda

dengan tabel untuk 5 seri tabung, kombinasi yang diambil terdiri dari pengenceran

tertinggi yang masih menghasilkan semua tabung positif. Sedangkan pada pengenceran

yang berikutnya ada tabung yang negatif, kombinasi yang diambil terdiri dari 3

pengenceran (Dwidjoseputro, 2005).

Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba tertentu yang

terdapat diantara campuran mikroba lain, misalnya jika digunakan untuk media kaldu

laktosa ditunjukan dengan terbentuknya MPN kelompok bakteri koliform, termasuk juga

bakteri-bakteri yang dapat memfermentasikan laktosa (Dwidjoseputro, 2005).

Beberapa uji yang digunakan dalam metode MPN :

1. Uji Dugaan

Didalam medium cair tersebut lebih dulu di letakan tabung durham dalam posisi

terbalik. Jika dalam waktu 48 jam tabung-tabung durham mengandung gas,

dinyatakan positif. Sebaliknya jika setelah 48 jam tidak ada gas, dinyatakan negatif,

ini berarti air umum untuk diminum (Waluyo, 2004).

2. Uji Kepastian

Kepada medium diinkubasi sejumlah ml air yang mengandung bakteri yang

menghasilkan gas. Hijau berlian berguna untuk menghambat pertumbuhan bakteri

gram positif dan menggiatkan pertambahan bakteri golongan koloni. Jika timbul gas

sebelum 48 jam berarti tes ini positif (Waluyo, 2004).

3. Uji Kesempurnaan

Di inggris penyajian air minum didasarkan atas ada tidaknya clostridium

perfringes, sedangkan dibeberapa tempat di amerika serikat penyucian itu didasarkan

atas ada tidaknya streptococcus fedcals yaitu suatu species yang biasa terdapat dalam

usus manusia (Waluyo, 2004).

Pertumbuhan dalam keadaan kesadaran kesetimbangan bila terjadi secara

teratur pada kondisi spontan/konstan. Sehingga jumlah pertambahan komponen kimia

juga konstan. Misalnya pertambahan jumlah massa sel sebanyak dua kali dalam

keadaan kesetimbangan akan mengakibatkan penambahan jumlah komponen sel

seperti air, protein, ARN, dan ADN sebanyak dua kali pula (Waluyo, 2004).

Dalam perhitungan bakteri secara tidak langsung ada beberapa metode yaitu :

A. Penentuan Volume Total

Cara ini adalah semacam modifikasi penentuan hemolokrit pada pengukuran

volume total butir-butir darah. Organisme didapatkan dengan sentrifius pada

kecepatan baku dan waktu yang tepat menurut aturannya dan kemudian volume

totalnya dapat dibaca pada skala silinder itu dengan mengetahui volume rata-rata

masing-masing sel secara perbiakan dapat ditentukan jumlah sel (Dwidjoseputro.

2005).

B. Metode Turbidometri

Teknik ini sudah dipakai sebagai cara mengukur suspensi atas dasar

penyerapan dan pemencaran cahaya yang diuntaskan. Sehingga yang

mengandung lebih dari 107-10

8 sel per milimeter tampak keruh oleh mata

telanjang. Suatu volume biakan yang telah ditakar diletakan pada tabung khusus

yang jernih dengan diameter tertentu. Tabung ini diletakan antara suatu satuan

sumber cahaya dan satuan fotoelektrik yang disambung dengan galvanometer.

Apa yang terbaca pada galvano meter tergantung pada lintasan dari satuan sumber

cahaya melalui biakan itu. Kelemahan cara ini ialah dapat terjadi kesalahan

karena variasi dalam ukuran. Serta penggumpalan sel-sel. Tetapi cara ini adalah

salah satu cara yang tercepat dan paling sederhana serta cukup teliti. Kekeruhan

dapat dibekukan dalam sebutan jumlah sel dengan perhitungan dalam

hemashometer dengan jumlah suspensi bakteri (Dwidjoseputro. 2005).

Metode hitungan cawan dengan menggunakan medium padat, tetapi pada

metode MPN dengan menggunakan medium cair didalam tabung reaksi.

Perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah tabung reaksi yang positif dapat

dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas didalam

tabung kecil (tabung durham) yang diletakan pada posisi terbalik, yaitu untuk

jasad renik yang membentuk gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya

dengan menggunakan zat atau 5 seri tabung. Lebih banyak tabung yang

digunakan menunjukan ketelitian yang lebih tinggi, tetapialat gelas (tabung

reaksi) yang digunakan jauh lebih banyak (Dwidjoseputro, 2005).

Dalam metode MPN, pengenceran sampel harus lebih tinggi dari pada

hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang

diinokulasikan dengan larutanhasil pengenceran tersebut mengandung jasad renik,

beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari satu sel, sedangkan tabung yang

lain tidak mengandung sel sama sekali. Dengan demikian setelah inkubasi

diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung, yang dinyatakan sebagai

tabung positif, sedangkan tabung lainnya negatif. Metode MPN biasanya

digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam sampel yang berbentuk cair,

meskipun dapat juga digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam sampel

yang berbentuk cair, meskipun dapat juga digunakan untuk sampel yang

berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1 : 10 dari sampel

tersebut. Kelompok jasad renik yang dapat dihitung dengan metode MPN juga

bervariasi tergantung dari medium yang digunakan untuk pertumbuhan

(Dwidjoseputro, 2005).

Lebih lanjut mengenai metode MPN, dari setiap pengenceran masing-

masing dimasukan 1 ml kedalam tabung reaksi yang berisi medium, dimana untuk

setiap pengenceran digunakan 3 atau 5 seri tabung. Setelah inkubasi pada suhu

dan waktu tertentu, dihitung jumlah tabung yang positif. Kriteria tabung positif

atau tidak ditandai dengan timbulnya kekeruhan atau gas pada tabung durham.

Misalnya, pada pengenceran pertama 3 tabung menghasilkan pertumbuhan positif,

pada pengenceran kedua tabung positif. Pada pengenceran ketiga 1 tabung positif,

dan pengenceran terakhir tidak ada tabung yang positif, kombinasi menjadi

3,2,1,0 dan jika diambil 3 pengenceran pertama kombinasinya menjadi 3,2,1.

Angka kommbinasiini kemudian dicocokan dengan tabel MPN, kemudian nilai

MPN sampel dapat dihitung (Dwidjoseputro, 2005).

Tabel yang digunakan untuk menentukan nilai MPN dari 3 seri tabung

berbeda dengan tabel untuk 5 seri tabung berbeda dengan tabel untuk 5 seri

tabung. Kombinasi dipilih dimulai dari pengenceran tertinggi yang masih

menghasilkan semua tabung gas yang negatif, kombinasi yang diambil dari 3

pengenceran. Jika pada pengenceran yang keempat dan seterusnya masih

ditemukan tabung yang positif tersebut ditambahkan pada angka kombinasi

ketiga mencapai jumlah maksimum. Metode MPN dapat digunakan untuk

menghitung jumlah mikroba tertentu yang terdapat diantara campuran campuran

mikroba lain. Misalnya, jika digunakan medium kaldu laktosa, ditunjukan dengan

terbentuknya gas dalam tabung durham. Cara ini dapat digunakan untuk

menentukan MPN kelompok bakteri koliform, termasuk juga bakteri-bakteri yang

dapat memfermentasikan laktosa (Dwidjoseputro, 2005).

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel tingkat tertentu

sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas atau sesuai dan jika

ditanam dalam tabung menghasilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif

kadang-kadang tetapi tidak selalu. Semakin besar jumlah sampel yang di

masukan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin rendah

tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukan

(semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin jarang tabung positif

yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan

tabung positif yang dihasilkan sangat memepengaruhi metode ini. Frekuensi

positif atau negatif ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel

sebelum diencerkan. Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah. 1)

bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel, 2) sel bakteri terpisah-pisah secara

individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan (bakteri coliform termasuk

ecoli terpisah sempurna tiap selnya dan termasuk rantai, 3) media yang dipilih

telah sesuai dengan untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu

inkubasi tertentu sehingga minimal 1 sel hidup mampu menghasilkan tabung

positif selama masa inkubasi tersebut, 4) jumlah yang didapatkan

menggambarkan bakteri yang hidup. Sel yang terkena dan tidak mampu

menghasilkan tabung positif tidak terdeteksi (Hadioetomo, 1990).

4. ALAT DAN BAHAN

4.1 ALAT

- Tabung reaksi

- Rak tabung reaksi

- Dispo 1 cc

- Pembakar Bunsen

- Tabung durham

- Vortex

- Inkubasi

4.2 BAHAN

- Media Lactosa broth

- Kapas

- NaCl

- Ikan sardine

5. PROSEDUR KERJA

Dihaluskan di dalam lumpang

Dimasukkan secukupnya ke dalam tabung reaksi pertama yang berisi 10

ml larutan NaCl

Divortex

Dimasukkan 1 ml menggunakan dispo 1 cc ke dalam tabung reaksi 10-1

yang berisi 9 ml media LB dan tabung durham dan ke dalam tabung

reaksi ke dua yang berisi larutan NaCl

Divortex tabung reaksi ke dua

Dimasukkan 1 ml ke dalam tabung reaksi 10-2

yang berisi 9 ml media LB

dan tabung durham, dan ke dalam tabung reaksi ke tiga yang berisi

larutan NaCl

Divortex tabung reaksi ke tiga

Dimasukkan 1 ml ke dalam tabung reaksi 10-3

yang berisi 9 ml media LB

dan tabung durham

Diinkubasi

Ikan Sardine

Negatif Bakteri

6. HASIL PENGAMATAN

Setelah di inkubasi 9 tabung reaksi tersebut tidak mengalami perubahan warna

karena ikan sardine tersebut tidak mengandung bakteri sehingga tidak dilakukan

pengamatan selanjutnya.

7. PEMBAHASAN

Perhitungan bakteri hidup dilakukan dengan cara seri pengenceran cara ini secara

luas digunakan untuk menghitung bakteri hidup dalam berbagai cairan seperti air, susu,

biakan cair dan sebagainya . pengenceran dibuat untuk kemudian ditanam dalam medium

pembiakan biakan agar setelah dikonfersi sesuai dengan pengenceran dilakukan secara

lipat ganda atau secara desimal, maka yang diperoleh hanya angka yang biasa disebut

Most Probable Number (Koes, 2006).

Metode MPN merupakan uji deretan tabung yang menyebarkan pertumbuhan

koliform sehingga diperoleh nilai untuk menduga jumlah koliform dalam sampel yang

diuji. Jumlah koliform ini bukan perhitungan yang tepat namun merupakan angka yang

mendekati jumlah yang sebenarnya (Lay, 1994).

Media LB (Laktosa Broth) merupakan media yang berfungsi untuk melihat ada

tidaknya mikroba yang tumbuh pada tabung yang sudah diberi sampel air yang telah

diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu untuk mengetahui ada tidaknya mikroba pada

media LB dapat dilihat dengan cara, ada gelembung gas pada tabungdurham (Fardiaz,

1989).

Dalam percobaan ini, didapatkan data yaitu pada percobaan uji penduga dari

sampel didapatkan bahwa dari 3 seri tabung reaksi yaitu 10-1

, 10-2

dan 10-3

tidak terdapat

bakteri atau negatif bakteri sehingga tidak dilakukan uji penguat lagi.

8. KESIMPULAN

Dari percobaan metode MPN ini dapat ditari kesimpulan bahwa :

- Perbedaan tabung positif dan negatif adalah tabung positif adalah tabung durham

yang mengandung gas, sedangkan tabung negatif adalah tabung durham yang tidak

mengandung gas.

- Dalam metode MPN digunakan tiga macam uji, yaitu penduga, uji penegas, dan

uji pelengkap.

- Dalam percobaan ini yang menggunakan sampel ikan sardine didapatkan bahwa

tidak adanya bakteri, ini dengan bakteri tidak adanya gas pada tabung durham.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. D.2005. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Irianto, koes.2006. Mikrobiologi menguak Dunia Mikroorganisme. Bandung : Yrama Widya.

Waluyo, lud.2004. Mikrobiologi Umum. Bandung : Universitas Muhammadiyah.

.