Pembentukan sistem pencernaan di ikan zebra. II. Pankreas morfogenesis

abstrakPenelitian terbaru menunjukkan bahwa pankreas ikan zebra berkembang dari anlage pankreas tunggal, terletak pada aspek dorsal mengembangkan usus. Namun, dengan menggunakan garis ikan zebra transgenik yang mengekspresikan GFP seluruh endoderm, kami melaporkan bahwa, pada kenyataannya, dua anlagen pankreas bergabung untuk membentuk pankreas. Satu anlage terletak pada aspek dorsal usus berkembang dan hadir dengan 24 jam postfertilization (hpf), yang anlage kedua terletak pada aspek ventral dari usus berkembang dalam anterior posisi ke anlage dorsal dan hadir dengan 40 hpf. Kedua tunas bergabung dengan 52 hpf untuk membentuk pankreas. Menggunakan jantung dan mutan jiwa embrio, di mana pankreas yang anlagen paling sering tidak sekering, kita menunjukkan bahwa tunas posterior hanya menghasilkan jaringan endokrin, sedangkan tunas anterior menimbulkan ke pankreas saluran dan eksokrin sel. Menariknya, pada tahap kemudian, kuncup anterior juga menimbulkan sejumlah kecil sel endokrin biasanya menyajikan dekat saluran pankreas. Secara keseluruhan, studi ini menunjukkan bahwa pada ikan zebra, seperti pada model sistem lainnya dianalisis sampai saat ini, pankreas muncul dari beberapa tunas. Untuk menganalisis apakah fitur lain dari pengembangan pankreas dilestarikan dan menyelidiki pengaruh jaringan sekitarnya pada pengembangan pankreas, kami meneliti peran pembuluh darah dalam proses ini. Bertentangan dengan laporan dalam model lainnya sistem, kita menemukan bahwa, meskipun endotelium pembuluh darah berada dalam kontak dengan bud posterior seluruh pengembangan pankreas, ketiadaan dalam embrio mutan cloche tidak muncul untuk mempengaruhi morfogenesis awal atau diferensiasi pankreas.

pengenalanPankreas terdiri dari dua jenis jaringan kelenjar yang melaksanakan fungsi fisiologis penting. endokrin jaringan melepaskan hormon insulin, somatostatin, Pankreas polipeptida, dan Glukagon langsung ke dalam darah sungai, sedangkan jaringan eksokrin menghasilkan enzim pencernaan, seperti tripsin, amilase dan Carboxypeptidase A, yang disampaikan pada saluran pencernaan melalui jaringan saluran. Morfogenesis pankreas berkembang telah dijelaskan dalam sejumlah organisme. Dalam cewek (Kim et al., 1997), Xenopus laevis (Kelly dan Melton, 2000), dan teleost ikan Medaka (Assouline et al., 2002), pankreas berkembang dari tiga tunas yang muncul dari tabung usus, dua dari aspek ventral nya, dan satu dari aspek dorsal. Di mouse, meskipun ada awalnya tiga tunas yang muncul dari tabung usus pada titik kontak antara endoderm dan pembuluh darah (Lammert et al., 2001), pankreas berkembang dari hanya dua tunas ini, satu punggung dan satu ventral (Slack, 1995; Edlund, 2002;. Lammert et al, 2003).Sejauh ini, semua studi telah menunjukkan bahwa pembangunan pankreas di ikan zebra terjadi berbeda dari pada vertebrata lainnya bahwa ada anlage pankreas tunggal (Argenton et al., 1999; Biemar et al., 2001; Huang et al., 2001). Studi mengikuti pola ekspresi penanda pankreas awal, seperti insulin (ins) dan pankreas homeoboks duodenum 1 (Pdx1), telah menunjukkan dua populasi sel yang menyatu di garis tengah antara tahap 14- dan 18-somite untuk membentuk bud tunggal jaringan pankreas pada tingkat somite keempat (Biemar et al., 2001). Ekspresi banyak endokrin gen telah terdeteksi dalam kelompok garis tengah sel (Argenton et al, 1999;.. Biemar et al, 2001).Beberapa penanda diferensiasi sel eksokrin telah kloning di ikan zebra. Dari mereka, yang paling awal menyatakan adalah tripsin (try), yang muncul pada 48 hpf di sel mengelilingi islet pankreas tunggal (Biemar et al., 2001). Kurangnya penanda eksokrin sebelumnya

menyatakan telah dicegah pemeriksaan apakah ada sel tunggal populasi yang menimbulkan kedua jenis sel pankreas, atau apakah eksokrin dan endokrin sel berasal dari lokasi yang berbeda.Dalam studi ini, kami menggunakan garis zebra transgenik di yang GFP dinyatakan seluruh endoderm (Field et al., 2003), bersama-sama dengan analisis ekspresi in, pdx1 (Milewski et al., 1998), mencoba (Biemar et al., 2001), Somatostatin (Sst), dan Islet-1 (Isl1) untuk memeriksa pankreas morfogenesis dan lokasi beberapa sel pankreas jenis dalam sistem pencernaan berkembang. Kami menyediakan bukti adanya dua pankreas yang berbeda anlagen-bud anterior ventral dan dorsal posterior tunas-yang bergabung untuk membentuk pankreas definitif. Kami lanjut menunjukkan bahwa tunas dorsal posterior menimbulkan hanya untuk sel endokrin, sedangkan tunas anterior ventral menimbulkan ke sel eksokrin, saluran pankreas, dan kecil tapi pasokan direproduksi sel endokrin. Selain itu, kami menggunakan cloche (CLO) embrio mutan yang kekurangan endotel sel dari tahap awal (Stainier et al, 1995;.. Liao et al, 1997; Thompson et al., 1998), untuk menyelidiki peran pembuluh darah dalam pengembangan pankreas ikan zebra.

Bahan dan metodeKultur embrio dan saham ikan zebra Ikan dan embrio dipertahankan, dikumpulkan, dan dipentaskan seperti yang dijelaskan (Westerfield, 1995). endodermal Ekspresi GFP dicapai dengan menggunakan embrio homozigot untuk transgen gutGFP (Field et al., 2003). embrio homozigot untuk mutasi hasm567 (Stainier et al., 1996; Horne-Badovinac et al., 2001) dan mutasi clos5 (Wayne Liao dan DYRS, pengamatan tidak diterbitkan) dikumpulkan bersama dengan saudara wildtype sebagai kontrol. Embrio homozigot untuk mutasi clom378 (Stainier et al., 1996) dan wildtype embrio, baik homozigot atau heterozigot untuk-FLK 1: transgen GFP (DB, Jau-Nian Chen, DYRS, pengamatan tidak diterbitkan), digunakan dalam analisis kami dari peran vaskular endotelium dalam pengembangan pankreas.

Fig. 1. Two anlagen make up the pancreas. (A–D) Two-dimensional projections of confocal stacks. (E–H) Whole-mount in situ hybridization with pdx1. Ventral views, anterior to the top. The posterior anlage (arrowhead) is clearly visible at 34 hpf (A), and 40 hpf (B), but is obscured by the anterior bud (arrow) at 44 hpf (C) and 52 hpf (D). pdx1 expression is found in both structures before (E, F) and after (G, H) they come into contact. At 52 hpf, (D, H) the pancreas appears as a single structure. L, liver. Scale bar, 50 µm.

Gambar. 1. Dua anlagen membuat pankreas. (A-D) proyeksi dua dimensi dari tumpukan confocal. (E-H) Whole-gunung hibridisasi in situ dengan pdx1. Pandangan ventral, anterior

ke atas. Posterior anlage (panah) terlihat jelas di 34 hpf (A), dan 40 hpf (B), tapi dikaburkan oleh bud anterior (panah) pada 44 hpf (C) dan 52 hpf (D). Ekspresi pdx1 ditemukan di kedua struktur sebelumnya (E, F) dan setelah (G, H) mereka datang ke dalam kontak. Pada 52 hpf, (D, H) pankreas muncul sebagai struktur tunggal. L, hati. Skala bar, 50 pM.

Fig. 2. Morphogenesis of the anterior and posterior buds. [In all sections, dorsal is to the top, and right is to the reader’s left to maintain orientation with the ventral views shown throughout the paper.] (A–D) The anterior pancreatic bud initiates morphogenesis adjacent to the lateral plate mesoderm and the yolk cell. Transverse sections of wildtype gutGFP embryos showing pdx1 expression in purple (A, C), endodermal GFP expression (green), and actin staining (red) (B, D). The A/P level of the these sections was determined by using landmarks such as the nephron primordia (outlined by solid yellow lines) and the posterior end of the developing swim bladder. The first sign of anterior bud morphogenesis occurs by 34 hpf (A, B) as a ridge (arrow) of tissue on the ventral right side of the intestinal bulb primordium (ib). (C, D) At the same A/P level at 38 hpf, the anterior pancreatic bud has stretched to the embryo’s right (toward the embryonic midline) and is still in contact ventrally with the yolk cell. The lateral and dorsal edges of the anterior pancreatic bud are in contact with the surrounding mesodermal cells, outlined by red actin staining. (E–H) The posterior bud is the pancreatic islet. Transverse sections through wildtype gutGFP embryos at 24 hpf. Endodermal GFP expression shown in green (E), Sst in red (F), and actin in blue (G). (H) Overlay. The posterior structure (arrow) contains Sst–positive cells clustered on the dorsal side of the endodermal rod (e). The hypochord and endothelial cells (Fig. 5) separate the pancreatic islet from the notochord (*, outlined by a dashed yellow line) at this stage. s, somite; nt, neural tube; e, endodermal rod; *, notochord; ib, intestinal bulb primordium; y, yolk. Scale bars, 25 µm.

Gambar. 2. Morfogenesis dari anterior dan posterior tunas. [Dalam semua bagian, punggung adalah ke atas, dan kanan adalah untuk pembaca tersisa untuk mempertahankan orientasi dengan pandangan ventral ditampilkan di seluruh kertas.] (A-D) The bud pankreas anterior

memulai morfogenesis berdekatan dengan lempeng mesoderm dan lateral sel kuning. Bagian melintang wildtype embrio gutGFP menunjukkan ekspresi pdx1 ungu (A, C), ekspresi endodermal GFP (green), dan aktin pewarnaan (merah) (B, D). The Tingkat / P dari bagian ini ditentukan dengan menggunakan landmark seperti primordia nefron (digariskan oleh garis kuning padat) dan ujung posterior kandung kemih berenang berkembang. Tanda pertama dari tunas anterior morfogenesis terjadi oleh 34 hpf (A, B) sebagai ridge (panah) dari jaringan di sisi kanan ventral bola primordial usus (ib). (C, D) Pada tingkat A / P sama pada 38 hpf, tunas pankreas anterior telah membentang ke kanan embrio (ke arah garis tengah embrio) dan masih dalam kontak bagian perut dengan sel kuning. Tepi lateral dan dorsal tunas pankreas anterior berada dalam kontak dengan sel mesoderm sekitarnya, digariskan oleh aktin pewarnaan merah. (E-H) posterior bud adalah islet pankreas. Bagian melintang melalui wildtype embrio gutGFP pada 24 hpf. Ekspresi endodermal GFP ditampilkan dalam warna hijau (E), Sst merah (F), dan aktin warna biru (G). (H) Overlay. Struktur posterior (tanda panah) mengandung Sst-positif sel berkerumun di sisi dorsal batang endodermal (e). The hypochord dan sel endotel (Gbr. 5) memisahkan pulau pankreas dari notochord (*, diuraikan oleh garis kuning putus-putus) pada tahap ini. s, somite; nt, neural tube; e, batang endodermal; *, Notochord; ib, usus bola primordial; y, kuning. Bar skala, 25 m.

Imunofluoresensi dan RNA di lokalisasi in situ

Analisis imunofluoresensi ekspresi protein dilakukan dengan antibodi kelinci percobaan anti-Insulin (tidak ada pengenceran; Biomeda), kelinci antibodi anti-somatostatin (1: 100; ICN Biomedicals, Inc.), dan mouse antibodi anti-Islet (8: 100; hibridoma 39.4D5). Antibodi anti-Islet, dikembangkan oleh Thomas M. Jessell, diperoleh dari Studi Pembangunan Hybridoma Bank dikembangkan di bawah naungan NICHD dan dikelola oleh University of Iowa, Departemen Ilmu Biologi, Iowa City, IA 52242. Embrio tetap selama 2 jam pada suhu kamar dengan 3,7% formalin dalam PEM (0,1 M Pipa, 1,0 mM MgSO4, 2 mM EGTA, pH 7 denganNaOH), dicuci di PBS, manual deyolked, dan diinkubasi semalam pada suhu 4 ° C di antibodi primer diencerkan dengan 0,3% Triton X dan 2% serum domba di PBS. Setelah penghapusan antibodi primer, embrio yang dipasang di 4% agarose SeaPlaque (Aplikasi BioWhittaker Molekuler) di PBS. Antibodi terikat terdeteksi pada melintang bagian vibratome (150? m tebal untuk melintang dan 200? m tebal untuk tampilan ventral) dengan menggunakan Alexa Fluor-647 atau Alexa Fluor-594 terkonjugasi baik kambing IgG anti-mouse atau kambing anti-kelinci percobaan antibodi IgG (1: 200; Molecular Probe). Untuk memvisualisasikan aktin, melintang bagian vibratome diinkubasi di rhodamine-label Phalloidin (1: 100; Molecular Probe).Gambar confocal diperoleh dengan menggunakan Leica TCS NT confocal mikroskop. Gambar overlay yang dirakit dengan menggunakan Adobe Photoshop 5.0 LE. Dua dimensi proyeksi yang dihasilkan dengan menggunakan Scion versi Gambar 4.0.2. Dimensi tiga film rotasi yang dihasilkan dengan menggunakan Scion Gambar versi 4.0.2 dan versi QuickTime 5.0.2.Dalam hibridisasi in situ dilakukan dengan digoxigeninlabeled Probe RNA untuk ins, pdx1 (Milewski et al., 1998), dan mencoba (Biemar et al., 2001). Whole-gunung di situ hibridisasidilakukan seperti yang dijelaskan (Field et al., 2003). In situ hibridisasi embrio yang dipasang di JB-4 Embedding Menengah (Polysciences, Inc) dan 5? M tebal bagian yang diperoleh sectioning mikrotom. Gambar yang diperoleh dengan menggunakan Zeiss Axioplan, dilengkapi dengan Warna Zeiss AxioCam kamera digital berjalan AxioVision.

HasilDua tunas berkontribusi pankreas berkembang

Sementara menganalisa garis transgenik gutGFP yang mengekspresikan GFP seluruh endoderm (Field et al., 2003), kami melihat struktur didokumentasikan sebelumnya berasal dari aspek ventral dari bola primordial usus hanya posterior ke hati yang baru lahir. Struktur ini tidak jelas dalam seluruh gunung persiapan di 34 hpf (Gbr. 1A), tetapi dengan 40 hpf jelas memproyeksikan bagian perut dari usus primordial bola ke arah kanan embrio (Gambar. 1B). Saya T tetap bud diskrit sekitar 4 jam, setelah itu menjadi disandingkan dengan agregasi posterior lebih dorsal sel, sedikit ke kanan garis tengah (Gambar. 1C). Oleh 52 hpf, dua tunas tersebut telah menyatu, dan tunas posterior tidak lagi bersentuhan langsung dengan usus (Gambar. 1D). Kuncup anterior mempertahankan hubungannya dengan pencernaan yang kanal hanya posterior esofagus, dan ini koneksi membentuk saluran pankreas. Morphogenetic ini Perubahan disajikan sebagai rekonstruksi tiga dimensi bagian optik confocal (melihat data tambahan).

Untuk menentukan apakah struktur anterior ini memiliki pankreas identitas, pertama kita diperiksa ekspresi pdx1 pada 34, 40, 44, dan 52 hpf (Gbr. 1E-H). ekspresi pdx1 di pankreas baik dilestarikan di seluruh spesies (Ulasan di Slack, 1995; Edlund, 2002), meskipun juga dinyatakan dalam nonpancreatic jaringan. Kami menemukan bahwa pdx1 dinyatakan baik dalam anterior dan posterior tunas pada semua tahap dianalisis serta dalam bola primordial usus awal, dan pada 52 hpf, di kerongkongan dan usus bola. Fakta bahwa anterior bud mengungkapkan pdx1 bersama-sama dengan data morfologi disajikan di atas menunjukkan bahwa kontribusi untuk pengembangan yang pankreas.

Untuk lebih mencirikan perkembangan anterior ini bud, kami menganalisis lokasi sehubungan dengan sekitarnya jaringan. Bagian melintang dari garis gutGFP, serta embrio bernoda untuk ekspresi pdx1, mengungkapkan punggung bukit bersama sisi ventral dari bola primordial usus pada 34 hpf (Gbr. 2A dan B). Tidak ada gen saat ini diketahui khusus untuk tunas pankreas anterior, sehingga kami tidak dapat mengkonfirmasi identitas punggungan ini molekuler. Namun, Lokasi bukit ini konsisten dengan anterior bud pankreas, yang pada 40 hpf meluas ke embrio kanan (Gbr. 2C dan D). Kami menggunakan landmark seperti primordia nefron (Drummond et al., 1998), dan caudalmost yang akhir kandung kemih berenang berkembang untuk mengkonfirmasi kita bahwa yang memvisualisasikan usus di Tingkat / P yang sama. The ventral ridge, dan kemudian tunas pankreas anterior, secara langsung berdekatan dengan kuning telur bagian perut, dan lempeng mesoderm lateral yang dorsolaterally (Gambar 2A-D.), dengan koneksi ke primordial bola usus terletak sekitar di tingkat somite ketiga.

Analisis sebelumnya telah menunjukkan bahwa, dengan 24 hpf, sel-sel islet pankreas terletak di cluster pada tingkat somite keempat, dan pdx1 mengungkapkan, ins, glukagon (glu), somatostatin (Sst), dan pulau-1 (isl1) (Biemar et al, 2001;. Argenton et al., 1999; Huang et al., 2001). Lokasi dan morfologi dorsal posterior agregasi sel di garis transgenik gutGFP menunjukkan bahwa struktur ini sesuai ke anlage pankreas dijelaskan sebelumnya. Data dari ekspresi protein analisis dalam transgenik gutGFP baris setuju dengan hipotesis ini. Sst ekspresi (Gambar. 2E-H), serta Ins dan Isl1 (data tidak ditampilkan) berada di posterior tunas mengkonfirmasikan bahwa tunas dorsal posterior adalah anlage pankreas dijelaskan sebelumnya.

Data morfologi dikombinasikan dengan ekspresi gen Analisis sangat menyarankan bahwa anterior baru ditemukan bud merupakan bagian dari pankreas yang matang, namun identitas jaringan yang berasal dari tunas ini tidak jelas. Pada 52 hpf, ekspresi pdx1 menunjukkan

pankreas sebagai struktur tunggal dengan bulat "kepala" yang melekat pada saluran pencernaan oleh saluran pankreas pada posisi antara kerongkongan dan bola usus (Gambar. 3A). Sekelompok tunggal insexpressing sel terletak di kepala pankreas (Gbr.3B) dikelilingi oleh sel-sel mengekspresikan coba (Gambar. 3C). Pankreas yang duct mengungkapkan pdx1 (Gbr. 3A), tetapi tidak memiliki mencoba ekspresi (Gambar. 3C). Sejak ekspresi gen eksokrin yang pertama kali terdeteksi setelah anterior dan posterior anlagen telah bergabung, Analisis ekspresi gen eksokrin pada embrio wildtype adalah tidak informatif sehubungan dengan asal-usul ini mencoba-positif sel eksokrin.

Untuk menentukan jenis sel yang berasal dari bud pankreas anterior, kami menganalisis ekspresi gen pankreas di memiliki embrio mutan (Stainier et al., 1996). memiliki mengkodekan aPKC ?, protein persimpangan ketat diperlukan untuk pembentukan dan pemeliharaan sejumlah epitel di embrio ikan zebra (Horne-Badovinac et al., 2001). Satu dari fenotip dilaporkan memiliki embrio mutan adalah pankreas diposisikan simetris sehubungan dengan nonlooping sebuah usus (Horne-Badovinac et al., 2001). Menemukan bahwa ada tidak satu tapi dua anlagen pankreas mendorong kita untuk menguji kembali fenotip mutan pankreas memiliki. Kami menemukan bahwa, pada 52 hpf, struktur digandakan mengungkapkan pdx1 dan melekat pada saluran pencernaan antara kerongkongan dan bola usus (Gambar. 3D), sedangkan tunas pankreas posterior, yang menyatakan pdx1 (Gambar. 3D) dan in (Gambar. 3E), sisa-sisa struktur dorsal garis tengah terpisah dari anterior digandakan struktur. Karena struktur pankreas digandakan memiliki saluran pankreas yang jelas menghubungkan mereka ke ventral yang aspek dari saluran pencernaan, kami menyimpulkan bahwa mereka merupakan duplikasi dari anlage pankreas anterior, sedangkan posterior bud tunggal tetap terpisah, garis tengah struktur. Isolasi anterior dan posterior tunasdari satu sama lain selama pengembangan pankreas di memiliki embrio mutan menyediakan sistem di mana untuk belajar mereka komponen seluler masing-masing.

Untuk mengidentifikasi lokasi komponen eksokrin dari pankreas, kami menganalisis ekspresi try di 52 hpf. Dalam memiliki embrio mutan, coba ekspresi hadir dalam bilateral patch yang sesuai dengan kepala anterior digandakan tunas, tetapi secara konsisten absen dari garis tengah bud posterior (n? 28, Gambar. 3F). Data ini menunjukkan bahwa sel eksokrin, serta pankreas saluran-diidentifikasi oleh morfologi (data tidak ditampilkan) dan dengan adanya ekspresi pdx1 tetapi tidak adanya try ekspresi-yang berkembang dari tunas pankreas anterior. Konsisten tidak adanya mencoba dari tunas posterior menunjukkan bahwa memberikan naik hanya untuk islet pankreas.

Studi ekspresi gen dilakukan di 76 hpf menunjukkan dasarnya hasil yang sama seperti yang dijelaskan di atas: tunas anterior digandakan berisi coba-mengekspresikan pankreas sel eksokrin, dan tunas posterior tetap terpisah struktur garis tengah absen dari setiap ekspresi try (data tidak ditunjukkan). Namun, ada satu perbedaan yang mencolok: Pada 52 hpf, ekspresi in secara konsisten hanya ditemukan di posterior bud di memiliki embrio mutan (n? 22) (Gambar. 3E), tetapi pada 76 hpf, 84% dari embrio mutan memiliki dimiliki insexpressing (n? 32) sel di luar pulau (Gambar. 4B). Dalam semua kasus, sel-sel in-mengekspresikan berada pada tingkat, atau anterior, islet. Pengamatan ini tidak spesifik untuk memiliki mutan sebagai 83% dari embrio wildtype (n? 24) juga menunjukkan insexpressing Sel-sel di luar pulau (Gambar. 4A). Untuk menentukan lokasi ini liar in-mengekspresikan sel, kami menganalisis Ekspresi in di garis GFP usus pada 76 hpf. Kami menemukan bahwa, pada tahap ini, sel-Ins positif ditemukan di luar pulau yang biasanya terletak di atau dekat saluran pankreas baik wildtype dan memiliki embrio mutan (Gambar. 4C dan D). Sel

mengekspresikan Isl1 dan Glu atau Sst juga ditemukan di wilayah ini pankreas (data tidak ditampilkan).Peran endotelium pembuluh darah di pankreaspengembanganStudi yang dilakukan pada tikus dan Xenopus telah menunjukkan bahwa, dengan tidak adanya sel endotel vaskular, pdx1- endoderm positif gagal berdiferensiasi menjadi ins-memproduksi sel endokrin (Lammert et al., 2001). Untuk menilai peran endotel pembuluh darah dalam pengembangan pankreas ikan zebra, pertama kita menganalisis lokasi endotel vaskular terhadap anterior dan posterior oleh tunas pankreas menggunakan garis transgenik mengekspresikan GFP di bawah kendali promotor ikan zebra flk1 (DB, Jau-Nian Chen dan DYRS, pengamatan tidak diterbitkan). Kami mulai analisis kami pada tahap 18-somite di mana sel-sel endotel vaskular waktu flk1-positif sudah dalam hubungan erat dengan bud posterior (Gambar. 5A). Antara 24 dan 40 hpf, tunas posterior mempertahankan kontak dengan aorta dorsal dan vena kardinal posterior (Gambar 5B-D.), Sedangkan tunas anterior tidak tampak dalam kontak dengan sel endotel (Gbr. 5E). Sel endotel juga terlihat secara ekstensif seluruh pulau pankreas sekitar 52 hpf (Gambar. 5F).

Untuk mempelajari perkembangan pankreas dengan tidak adanya sel endotel vaskular, kami menguji pankreas embrio mutan clo, yang tampaknya kurang sel endotel yang paling (Stainier et al, 1995;. Liao et al, 1997;.. Thompson et al, 1998) . Pankreas umum morfologi dinilai dengan memeriksa ekspresi pdx1 di 52 hpf. clo tahap embrio mutan. Dalam embrio mutan clo, meskipun tingkat ekspresi pdx1 di bola usus berkurang dibandingkan dengan wildtype, ekspresi pdx1 pankreas muncul sebagian besar tidak terpengaruh (Gambar. 6A dan B). Dalam beberapa embrio mutan clo, morfologi pankreas tidak normal yang bisa disebabkan oleh edema berat. Untuk menilai diferensiasi jaringan pankreas dalam ketiadaan endotel vaskular, kami meneliti ekspresi gen seluk endokrin dan eksokrin gen mencoba. Kedua ins dan mencoba disajikan dalam 52 hpf embrio CLO mutan dalam pola yang diharapkan dari analisis morfologi dengan pdx1 (Gbr. 6C-F), dan pada tingkat yang sebanding dengan wildtype.

Karena itu secara resmi kemungkinan bahwa sel-sel positif in-lihat di embrio mutan CLO di 52 hpf berasal dari tunas anterior yang, tidak seperti kuncup posterior, biasanya tidak kontak dengan endotel vaskular, kami menganalisis bud posterior embrio mutan CLO untuk kehadiran sel endokrin dibedakan pada 24 hpf. Atas dasar-FLK 1: ekspresi GFP, kami diurutkan embrio CLO mutan dan saudara wildtype mereka di 24 hpf dan diperiksa bagian melintang. Anehnya, kita melihat tidak ada perbedaan dalam jumlah atau posisi Isl1- atau sel Ins-positif dalam embrio mutan clo, meskipun tidak jelas sel endotel di wilayah ini (Gambar. 6G dan H).

Fig. 3. Pancreatic duct and exocrine tissue develop from the anterior bud. (A–F) Whole- mount in situ hybridization of wildtype (A–C) and has mutant embryos (D–F) at 52 hpf. Ventral views, anterior to the top. (A) In wildtype embryos, pdx1 expression is found throughout the entire pancreas, including the pancreatic duct (bracket), as well as in the oesophagus (o) and intestinal bulb (ib). (B) ins expression is found in a cluster of cells sitting at the center of the try expression domain (C). (D) In has mutant embryos, the anterior pancreatic bud is duplicated, as seen with pdx1 expression. The islet (outlined in yellow) remains separate from the anterior structures. (E) Examination of ins expression reveals that only the posterior islet contains ins-positive cells at this time. (F) try expression is found only in the duplicated anterior structures. o, oesophagus; ib, intestinal bulb.

Gambar. 3. saluran pankreas dan jaringan eksokrin berkembang dari tunas anterior. (A-F) Whole gunung in situ hibridisasi wildtype (A-C) dan memiliki embrio mutan (D-F) pada 52 hpf. Pandangan ventral, anterior ke atas. (A) Dalam embrio wildtype, ekspresi pdx1 ditemukan di seluruh pankreas, termasuk saluran pankreas (bracket), serta dalam esofagus (o) dan bola usus (ib). (B) ins ekspresi ditemukan dalam cluster sel duduk di tengah domain ekspresi try (C). (D) memiliki embrio mutan, tunas pankreas anterior diduplikasi, seperti yang terlihat dengan ekspresi pdx1. The pulau (diuraikan dalam kuning) tetap terpisah dari struktur anterior. (E) Pemeriksaan ekspresi ins mengungkapkan bahwa hanya pulau posterior mengandung sel in-positif saat ini. (F) mencoba ekspresi hanya ditemukan di struktur anterior digandakan. o, kerongkongan; ib, bola usus.

Fig. 4. Insulin-positive cells arise within the anterior pancreatic bud. (A, B) Whole- mount in situ hybridization at 76 hpf. (C–F) Two-dimensional projections of confocal stacks showing Ins (red) expression and GFP expression in the endoderm. Ventral views, anterior to the top. At 76 hpf, both wildtype (A) and has mutant embryos (B) exhibit ins- expressing cells (arrowheads) outside of the major islet structure (circled). Ins staining in the gutGFP line shows these Ins-positive cells situated near the pancreatic duct in both wildtype (C) and has mutant embryos (D) [areas outlined in (C, D) are cropped and enlarged in (E, F)]. L, liver; gb, gall bladder; pd, pancreatic duct; ib, intestinal bulb.

Gambar. 4. sel insulin-positif muncul dalam tunas pankreas anterior. (A, B) Whole gunung hibridisasi in situ pada 76 hpf. (C-F) proyeksi dua dimensi dari tumpukan confocal menunjukkan Ins (merah) ekspresi dan ekspresi GFP dalam endoderm. Pandangan ventral, anterior ke atas. Pada 76 hpf, baik wildtype (A) dan memiliki embrio mutan (B) pameran ins- mengekspresikan sel (panah) di luar struktur pulau utama (dilingkari). Ins pewarnaan di garis gutGFP menunjukkan sel-sel positif Ins-ini terletak di dekat saluran pankreas di kedua wildtype (C) dan memiliki embrio mutan (D) [daerah diuraikan dalam (C, D) yang dipotong dan diperbesar dalam (E, F)] . L, hati; gb, kandung empedu; pd, saluran pankreas; ib, bola usus.

Diskusi

Pengembangan spatiotemporal pankreas ikan zebra Dalam semua vertebrata di mana telah diperiksa secara detail, pankreas berkembang dari dua atau tiga endodermal anlagen yang tunas independen dari usus dan bergabung untuk membentuk pankreas definitif (Slack, 1995;. Kim et al, 1997 ; Kelly dan Melton, 2000; Assouline et al, 2002;. Edlund, 2002; Lammert et al, 2003).. Namun, dalam ikan zebra, studi sebelumnya telah menyarankan bahwa pankreas berkembang dari satu struktur yang timbul punggung pada usus berkembang (Argenton et al, 1999;.. Biemar et al, 2001;. Huang et al, 2001). Menggunakan garis gutGFP untuk mengamati endoderm morfogenesis, kami telah mengidentifikasi anlage pankreas kedua yang terletak bagian perut dan anterior ke tunas pankreas dorsal dijelaskan sebelumnya.

Analisis Sebelumnya ekspresi gen-endokrin tertentu telah dijelaskan pengembangan pankreas ikan zebra mulai pada tahap 10-somite, waktu ketika sel-sel pdx1-positif pertama kali terdeteksi (Biemar et al., 2001). Dua populasi bilateral sel pdx1-mengekspresikan berkumpul untuk garis tengah dengan tahap 18-somite dengan waktu yang subset dari sel-sel ini mengungkapkan in, isl1, sst, dan pax6.2. Berdasarkan lokasi dan gerakan dari endoderm antara tahap 10- dan 18-somite (Ober et al., 2003), kami mengusulkan bahwa 2 patch yang berkumpul di garis tengah tidak mewakili bentuk yang lebih leluhur 2 tunas mamalia, seperti yang telah disarankan ( Biemar et al., 2001), melainkan bahwa sel-sel ini mengambil identitas pankreas sebelum endoderm telah bersatu di garis tengah. Dalam model ini, pergerakan patch ini untuk garis tengah tidak spesifik untuk pankreas morfogenesis tetapi umumnya mencerminkan awal endoderm morfogenesis. Setelah di garis tengah, subset sel pdx1-mengekspresikan yang juga mengungkapkan in, sst, dan glutathione menjalani morfogenesis sebagai anlage punggung tunggal (Biemar et al., 2001). Kondensasi bud pankreas ini kemungkinan merupakan langkah awal dalam pankreas morfogenesis. Perlu dicatat bahwa, meskipun kita lihat anlage pankreas ini sebagai tunas pankreas, tidak ada data sampai saat ini menunjukkan apakah sel-sel ini diintegrasikan ke dalam usus berkembang dan kemudian tunas untuk membentuk struktur yang terpisah, atau apakah mereka tetap terpisah dari batang dari endoderm, duduk punggung dan berdekatan dengan, tapi tidak dimasukkan dalam, primordial usus.

Data yang disajikan di sini menggambarkan peristiwa morphogenetic berikutnya di pankreas organogenesis, yang tunas dari anlage pankreas anterior ventral oleh 40 hpf. Sebelum struktur ini adalah jelas, pelat mesoderm lateral yang terletak di samping bola primordial usus pada tingkat di mana tunas pankreas anterior berkembang, membuat piring lateral yang mesoderm sumber potensial untuk molekul sinyal untuk merangsang morfogenesis, dan mungkin membantu menentukan identitas eksokrin dari bud pankreas anterior. Selain dekat dengan lempeng mesoderm lateral, daerah primordial bola usus yang menimbulkan tunas pankreas anterior juga berdekatan dengan sel kuning. Oleh karena itu, lapisan kuning syncytial juga harus dianggap sebagai sumber calon sinyal mengatur pengembangan tunas pankreas anterior. Seperti pada tikus, sel-sel yang berkontribusi terhadap anterior bud kebohongan pankreas dekat dengan hati, meskipun dalam ikan zebra, morfogenesis hati dimulai beberapa jam sebelum inisiasi tunas pankreas anterior. Juga, di mouse tunas pankreas ventral muncul di mana pembuluh darah vitelline menghubungi endoderm (Lammert et al., 2001), sementara di ikan zebra ada tidak muncul untuk menjadi asosiasi endotelium vaskular dengan tunas pankreas anterior. Ini akan menarik untuk mengidentifikasi sinyal yang mengatur perkembangan tunas pankreas anterior dan menentukan apakah asam retinoat dan Hedgehog sinyal, yang telah ditunjukkan dalam pengembangan tunas pankreas posterior (Roy et al,

2001;.. Dilorio et al, 2002; Stafford dan Prince, 2002), juga terlibat dalam pengembangan tunas pankreas anterior.