Pewarnaan ini merupakan pewarnaan yang di gunakan untuk melihat secara tidak langsung, karena yang diwarnai adalah latar belakangnya, sedangkan bakterinya sendiri tidak mengalami pewarnaan. Pada pewarnaan ini tidak di lakukan fiksasi karena itu dapat digunakan untuk melihat bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya dan untuk menentukan ukuran bakteri, karena bakteri praktis tidak mengalami perubahan.Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objekdengan menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan., gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan alkohol. Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram A (methylene blue) sebanyak 1-2 tetes dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan menggunakan tissue untuk mengeringkan bagian bawah ojek gelas. Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari methylen blue.Kemudian ditambahkan larutan gram B yang merupakan cat mordan, larutan ini mengandung yodium dan kalium yodida, Gram B merupakan larutan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram, penambahan larutan mordan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks. Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan biru dari komplek methylen blue dan KI pada gram negatif, karena mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap mempertahankan warna biru karena mengandung peptidoglikan. Larutan ini juga berfungsi untuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan methylene blue. Perlakuan ini dilakukan tidak membutuhkan waktu yang lama atau secepat mungkin untuk melakukan pembilasan dengan aquades. Kemudian dilakukan pengeringan. Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin (gram D) sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 30 detik. Gram D merupakan cat yang terdiri dari campuran safranin 0, 25 gram , etil alkohol 95% 10 ml, dan akuades 90 ml. Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena persenyawaan kompleks methylene blue tetap terikat pada dinding sel. Pada bakteri gram negatif menjadi merah karena warna biru yang dihasilkan oleh methylene blue telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay, 1994). Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan, Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Kemudian preparat dikeringkan dengan cara diangin-anginkan lalu dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.Perbedaan respon terhadap mekanis pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna biru.Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).Berdasarkan hasil pengamatan di bawah mikroskop, diidentifikasi bakteri jenis termofilik yang mempunyai bentuk coccus (bulat) dan berwarna biru, bakteri ini digolongkan ke dalam bakteri gram positif karena ciri-cirinya menunjukkan ciri bakteri gram positif. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.