IDENTIFIKASI ISOLAT BAKTERI LOKAL KNG.RT1

PENGHASIL FITOHORMON AUKSIN DAN JGEA7

PENGHASIL FITOHORMON SITOKININ

NURUL KHOIRIAH

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF

HIDAYATULLAH

JAKARTA

2012 M/ 1433 H

IDENTIFIKASI ISOLAT BAKTERI LOKAL KNG.RT1

PENGHASIL FITOHORMON AUKSIN DAN JGEA7

PENGHASIL FITOHORMON SITOKININ

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains

Pada Program Studi BIologi Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta

NURUL KHOIRIAH

106095003213

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

2012 M/ 1433 H

PERNYATAAN

DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI BENAR-

BENAR HASIL KARYA SENDIRI YANG BELUM PERNAH DIAJUKAN

SEBAGAI SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN ATAU

LEMBAGA MANAPUN.

Jakarta, Oktober 2012

Nurul Khoiriah

ABSTRAK

Nurul Khoiriah. Identifikasi Isolat Bakteri Lokal KNG.RT1 penghasil

fitohormon Auksin dan JGEA7 Penghasil Fitohormon Sitokinin. Skripsi

S1.program Studi Biologi. Fakultas Sains dan Teknologi. Universitas Islam

Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Identifikasi merupakan hal yang penting untuk mengetahui jenis serta

karakteristik suatu bakteri. Isolat KNG.RT1 dan JGEA7 adalah isolat bakteri lokal

penghasil fitohormon auksin dan sitokinin yang diisolasi dari daerah sekitar

rizosfer dan endofit tanaman di kab. Tangerang dan kab. Bogor. Tujuan penelitian

ini adalah untuk mengidentifikasi isolat bakteri lokal KNG.RT1 penghasil

fitohormon auksin dan JGEA7 penghasil fitohormon sitokinin. Dalam penelitian

ini dilakukan pengamatan sifat morfologi koloni bakteri, pengamatan morfologi

sel, pengujian fisiologi dengan reaksi kimia, lalu bakteri diidentifikasi dengan

analisis molekuler dari amplifikasi gen pengkode 16S rRNA kemudian ditentukan

urutan nukleotida dengan sekuensing. Pada tahap akhir, dilakukan komparasi

dengan data base GenBank. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat

KNG.RT1 bersifat Gram negatif, berbentuk batang pendek, tidak berspora, motil,

dapat menghidrolisis pati, mampu menghasilkan enzim triptonase, mampu

menfermentasikan asam campuran dan dapat mereduksi nitrat menjadi nitrit.

Sedangkan isolat bakteri JGEA7 bersifat Gram positif, berbentuk batang pendek,

membentuk endospora, dapat menghidrolisis pati, mampu menghasilkan enzim

triptonase, dapat memfermentasikan asam campuran dan dapat mereduksi nitrat

menjadi nitrit. Hasil analisis data sekuensing pada isolat KNG.RT1 menunjukkan

adanya homology sebesar 98% dengan Pseudomonas stutzeri 16S ribosomal RNA

gene, partial sequence dan pada isolat JGEA7 menunjukkan adanya homology

sebesar 98% dengan Bacillus sp. TSH22w gene for 16S ribosomal RNA, partial

sequence.

Kata Kunci: Bakteri Penghasil Auksin, Bakteri Penghasil Sitokinin, Identifikasi

bakteri, Pseudomonas stutzeri, Bacillus sp.

ABSTRACT

Nurul Khoiriah. The Identifications of Local Bactery Isolate KNG.RT1

Producing of Fitohormon Auxine and JGEA7 Producing of Fitohormon

Sitokinine. Thesis. Departement of Biology. Faculty of Science and

Technology. State Islamic University of Jakarta.

Identification is an important thing to know the variety and the characteristics of

bactery. KNGR.RT1 and JGEA7 localy bacteria isolate produce fitohormone

auxine and sitokinine isolated from region around rhizosfer and endofit plant in

Tangerang and Bogor. The purpose of this research is to identificate local bactery

isolate KNG.RT1 that produce auxin and JGEA7 that produce sitokinin. In this

research, the characteristic of colonial bactery morphology was observe a cell

morphology and examined the physiology using chemistry reaction, and

identificated by using moleculer analysis from the implication of oncode gene 16s

rRNA and then it is determined sequence nucleotida by sequencing. At the last

step, the result was compared by Gen Bank data base. This research show that

KNG.RT1 isolation has some characteristic such as: negative gram, short root

shape, no spora, motil, it can hydrolysis of starch, producing tryptonase enzyme,

fermenting mixed acid, and reducing nitrat become a nitrit. JGEA7 bactery

isolation has some characteristic such as: positive Gram, short root shape, forming

endospore, it can hydrolysis a starch, producing tryptonase enzyme, fermenting

mixed acid, and reducing nitrat become a nitrit. The result of isolate KNG.RT1

show the homology about 98% with Pseudomonas stutzeri 16S ribosomal RNA

gene, partial sequence and isolate JGEA7 show the homology about 98% with

Bacillus sp. TSH22w gene for 16S ribosomal RNA, partial sequence.

Keyword : the producing of phytohormone auxine bactery, the producing of

phytohormone sytokinine, identification of bactery, Pseudomonas

stuszery, Bacillus sp.

i

KATA PENGANTAR

Dengan mengucap puji syukur kehadirat Allah SWT, atas segala rahmat

dan karunia-Nya yang telah memberi nikmat Iman dan Islam hingga saat ini.

Shalawat dan salam marilah kita selalu limpahkan kepada baginda alam,

Habibana wa nabiyana Muhammad SAW, Uswatun Hasanah yang telah

membawa kita dari jaman jahiliyyah menuju jaman yang penuh dengan teknologi

dan sains, yang menghantarkan penulis dalam menyelesaikan skripsi ini yang

berjudul “ Identifikasi Isolat Bakteri Lokal KNG.RT1 Penghasil Fitohormon

Auksin dan JGEA7 Penghasil Fitohormon Sitokinin“. Sebagai salah satu

syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biologi

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-

besarnya atas bimbingan dan saran-saran serta motivasi kepada :

1. Kedua orangtua tercinta, Abah dan Umi yang selalu memberikan kasih

sayang sepanjang masanya, memanjatkan do,a yang tiada henti, serta

pengorbanan yang tak terkira untuk penulis.

2. Dr. rer.nat Abu Amar dan Dra. Nani Radiastuti, M. Si, selaku pembimbing I

dan Pembimbing II, yang dengan sabar memberikan pengarahan dan

bimbingan sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan

skripsi ini.

3. Dr. Lily Surraya Eka Putri, M.Env.Stud selaku Ketua Program Studi Biologi

Fakultas Sains dan Teknologi.

4. Dr. Sopiansyah Jaya Putra, M.Sis, selaku Dekan Fakultas Sains dan

Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Dosen-dosen Program Studi Biologi yang telah memberikan ilmu

pengetahuan selama penuls menuntut ilmu di Prodi Biologi Fakultas Sains

dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

6. Ibu Lilis selaku Kepala Laboratorium Bioteknologi LIPI-Cibinong.

ii

7. Ir. Darti, M. Si, selaku Kepala Laboratorium Mikrobiologi Institut Teknologi

Indonesia (ITI) Serpong

8. Kak Tika dan kak Mira, Laboran Bioteknologi, LIPI-Cibinong.

9. Pak Saryadi, Laboran Mikrobiologi Institut Teknologi Indonesia ITI Serpong

10. Kakak-kakak tercinta yang telah memberikan motovasi untuk tetap

bersemangat dalam menyelesaikan skripsi ini.

11. Keponakan-keponakan tersayang yang telah memberikan keceriaan untuk

penulis.

12. Isti’anah, Hizkia Botulini Sebayang dan Gama Aditya Putra sebagai temen

seperjuangan penelitian.

13. Sahabat-sahabat Biologi angkatan 2006 yang selalu memberikan canda tawa

nya dalam suka dan duka serta persahabat yang tiada akhir.

Harapan penulis semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi penulis

khususnya dan pembaca umumnya untuk melengkapi ilmu pengetahuan. Akhir

kata

Jakarta, Oktober 2012

Penulis

iii

DAFTAR ISI

HALAMAN

KATA PENGANTAR ...................................................................................... i

DAFTAR ISI ................................................................................................... iii

DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... vi

DAFTAR TABEL ......................................................................................... vii

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ viii

BAB I. PENDAHULUAN ............................................................................... 1

1.1. Latar Belakang ............................................................................. 1

1.2. Perumusan Masalah ..................................................................... 3

1.3. Hipotesis ...................................................................................... 4

1.4. Tujuan Penelitian ......................................................................... 4

1.5. Manfaat Penelitian ....................................................................... 4

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................... 6

2.1. Identifikasi dan Karakterisasi Bakteri .......................................... 6

2.1.1. Karakterisasi Morfologi Bakteri ...................................... 7

2.1.2. Pengujian Fisiologis dengan Reaksi Biokimia ............... 11

2.1.3. Analisis Molekular ......................................................... 13

2.2. Empat Kategori Besar Bakteri ................................................ ... 13

2.3. Gen 16s rRNA ........................................................................ .... 18

2.4. Bakteri Penghasil Fitohormon Ausin ........................................... 19

2.5. Bakteri Penghasil Fitohormon Sitokinin ...................................... 20

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ..................................................... 22

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ...................................................... 22

3.2. Alat dan Bahan ............................................................................. 22

3.3. Cara Kerja .................................................................................... 23

3.3.1. Pembuatan Media ............................................................. 23

3.3.1.1. Pembuatan Media Nutrient Agar (NA) ............. 23

iv

3.3.1.2. Pembuatan Media Nutrient Broth (NB) ............ 23

3.3.1.3. Pembuatan Media Agar Semisolid .................... 23

3.3.1.4. Pembuatan Media Trypton Broth ...................... 24

3.3.1.5. Pembuatan Media MR-VP ................................ 24

3.3.1.6. Pembuatan Media Agar Pati .............................. 24

3.3.1.7. Pembuatan Media Nitrat .................................... 24

3.3.1.8. Pembuatan Media Fermentasi Karbohidrat ........ 25

3.3.2. Peremajaan Bakteri .......................................................... 25

3.3.3. Identifikasi Isolat Bakteri KNG.RT1 dan JGEA7 ........... 25

3.3.3.1. Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri .............. 25

3.3.3.2. Pengamatan Morfologi Sel Bakteri ................... 25

3.3.3.3. Pengujian Fisiologis dengan Reaksi Biokimia .. 27

3.3.3.4. Analisis Molekular ............................................ 29

3.3.3.4.1. Isolasi DNA ....................................... 29

3.3.3.4.2. PCR .................................................... 31

3.3.3.4.3. Elektroforesis .................................... 32

3.3.3.4.4. Purifikasi ........................................... 33

3.3.3.4.5. Sekuensing ........................................ 35

3.4. Analisis Data ................................................................................ 35

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................ 36

4.1. Karakteristik Morfologi Koloni Isolat Bakteri Lokal

KNG.RT1 dan JGEA7 ................................................................ 36

4.2. Karakteristik Morfologi Sel Isolat Bakteri Lokal

KNG.RT1 dan JGEA7 ............................................................... 37

4.3. Pengujian Fisiologis dengan Reaksi Biokimia

pada Isolat Bakteri Lokal KNG.RT1 dan JGEA7 ....................... 41

4.4. Analisis Molekular ...................................................................... 49

4.4.1. Amplifikasi Gen 16s rRNA .............................................. 49

4.4.2. Sikuen Gen 16S rRNA pada Isolat Bakteri Lokal

KNG.RT1 dan JGEA7 .................................................... 51

v

4.4.3. Analisis Bioinformatika Sikuen Gen 16S rRNA

pada Isolat Bakteri Lokal KNG.RT1 dan JGEA7 .......... 59

4.5. Karakteristik Bakteri Pseudomonas stutzeri ............................... 63

4.6. Karakteristik Bakteri Bacillus sp. ............................................... 64

BAB V. PENUTUP ......................................................................................... 66

5.1. Kesimpulan ................................................................................. 66

5.2. Saran ........................................................................................... 66

DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 67

LAMPIRAN ...................................................................................................... 72

DAFTAR GAMBAR

HALAMAN

vi

Gambar 1. Perbedaan Dinding Sel Bakteri Gram negatif dan Gram positif ...... 9

Gambar 2. Morfologi Koloni pada Isolat Bakteri Lokal

KNG.RT1 dan JGEA7...................................................................... 36

Gambar 3. Hasil Pewarnaan Gram dan Bentuk Sel isolat Bakteri Lokal

KNG.RT1 dan JGEA7 ..................................................................... 37

Gambar 4. Hasil Pewarnaan Spora pada Isolat Bakteri Lokal KNG.RT1 ......... 39

Gambar 5. Hasil Pewarnaan Spora pada Isolat Bakteri Lokal JGEA7 .............. 39

Gambar 6. Hasil Uji Fermentasi Karbohidrat .................................................... 43

Gambar 7. Hasil Uji Hidrolisis Pati ................................................................... 44

Gambar 8. Hasil Uji MR-VP .............................................................................. 45

Gambar 9. Hasil Uji Indol .................................................................................. 46

Gambar 10. Hasil Uji Reduksi Nitrat ................................................................. 47

Gambar 11. Hasil Purifikasi PCR Produk dalam Gel Agarosa 1% ................... 50

DAFTAR TABEL

HALAMAN

vii

Tabel 1. Proses PCR dalam Amplifikasi DNA ................................................. 32

Tabel 2. Hasil Pengamatan Uji Sifat Biokimia

pada Isolat Bakteri Lokal KNG.RT1 dan JGEA7 ................................ 42

Tabel 3. Urutan nukleotida gen 16s rRNA isolat bakteri Lokal KNG.RT1

dalam format FASTA Hasil Sikuen gen 16s rRNA ............................. 51

Tabel 4. Urutan nukleotida gen 16s rRNA isolat bakteri JGEA7

dalam format FASTA Hasil Sikuen gen 16s rRNA ............................. 54

Tabel 5. Hasil Urutan sikuen parsial gen 16s rRNA isolat bakteri KNG.RT1

dan JGEA7 hasil contig menggunakan program BioEdit dalam

format FASTA ..................................................................................... 56

Tabel 6. Hasil Analisis Bioinformatika Gen 16s rRNA pada Isolat

Bakteri Lokal KNG.RT1 ....................................................................... 61

Tabel 7. Hasil Analisis Bioinformatika Gen 16s rRNA pada Isolat

Bakteri Lokal JGEA7 ........................................................................... 62

DAFTAR LAMPIRAN

HALAMAN

viii

Lampiran 1. Kerangka Berpikir ......................................................................... 72

Lampiran 2. Bagan Kerja ................................................................................... 73

Lampiran 3. Komposisi Media ............................................................................ 74

Lampiran 4. Reagen dan Indikator ..................................................................... 76

Lampiran 5. Elektroforegram Hail Sikuensing Parsial Gen 16S rRNA ............. 77

Lampiran 6. Hasil Analisis Bioinformatika pada “GeneBank” NCBI

menggunakan program BLASTN ................................................. 84

Lampiran 7. Perbandingan Karakteristik Isolat Bakteri Lokal KNG.RT1

dengan Pseudomonas stutzeri ....................................................... 88

Lampiran 8. Perbandingan Karakteristik Isolat Bakteri Lokal KNG.RT1

dengan Bacillus sp. ....................................................................... 89

Lampiran 9. Perangkat Alat dan bahan saat Penelitian ...................................... 90

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Pertanian modern sangat bergantung pada penggunaan bahan-bahan kimia

diantaranya pupuk sintetis, fungisida dan pestisida. Bahan-bahan kimia tersebut

baik disadari maupun tidak telah mengakibatkan tekanan pada lingkungan.

Kesadaran akan dampak negatif dari penggunaan bahan-bahan kimia tersebut,

ditunjang dengan adanya perkembangan di bidang bioteknologi, telah mendorong

berkembangnya produk-produk alternatif yang ramah lingkungan, termasuk di

dalamnya produk mikroba penghasil senyawa yang dapat meningkatkan

pertumbuhan tanaman (fitohormon)

Secara Alamiah, tanaman dapat memenuhi kebutuhan hormon melalui

kemampuannya dalam mensintesis fitohormon atau mendapatkannya dari mikroba

yang hidup di rhizosfer (Hindersah et al., 2003) maupun mikroba endofit

(Hallmann, 2001). Fitohormon dibagi menjadi 6 golongan yaitu auksin, sitokinin,

giberelin (GA), etilen, brasinosteroid, dan absisat (Teale et al., 2006).

Berbagai hasil penelitian melaporkan bahwa beberapa kelompok mikroba

mampu menghasilkan senyawa yang dapat mempercepat pertumbuhan tanaman.

Sebagai contoh, bakteri Rhizobium yang terseleksi mampu menstimulasi

pertumbuhan, baik pada tanaman Leguminoceae (tanaman kacang-kacangan)

maupun yang bukan Legumonoceae pada skala lapangan. Bakteri tersebut terbukti

mampu memproduksi fitohormon yaitu sitokinin dan auksin (Hoflich,1995). Hasil

2

penelitian lain menyebutkan bahwa Streptomyces griseoviridis juga mampu

memprodukasi auksin yaitu IAA (Indol-3-Acetic Acid) secara in vitro. Metabolit

ini dapat berperan sebagai stimulator pertumbuhan tanaman, tetapi pada skala

lapangan produksi IAA ini perlu dikaji lebih lanjut (Hindersah dan Simarmata,

2004).

Penelitian lain menyebutkan bahwa Pseudomonas fluorescens mampu

merangsang pertumbuhan akar jagung pada kondisi hidroponik dengan

menghasilkan IAA. Spesies dari genus Pseudomonas lainnya yaitu Pseudomonas

putida juga dilaporkan mampu mempercepat pertumbuhan tanaman. Bakteri

Rhizobium yang terseleksi mampu menstimulasi pertumbuhan, baik pada tanaman

Leguminoceace (tanaman kacang-kacangan) maupun yang bukan Legumonoceace

pada skala lapangan. Bakteri tersebut mampu memproduksi fitohormon yaitu

sitokonin dan auksin (Hoflich, 1995). Ahmad et al. (2005) mengisolasi

Pseudomonas sp. dan Azotobacter sp. dari tanaman Sesbania aculeate dan Vigna

radiate. Hasil tersebut melaporkan bahwa Pseudomonas sp. diketahui dapat

menghasilkan auksin sebanyak 53,2 μg/ml sedangkan Azotobacter sp.

menghasilkan 32,8 μg/ml.

Pada tahun 2008 Hidayat melakukan penelitian tentang “Isolasi dan

seleksi Bakteri Penghasil Fitohormon Auksin”. Hidayat mengisolasi 53 isolat

murni bakteri yang terdiri dari 34 bakteri rhizosfer dan 19 isolat bakteri endofit,

hasil penelitian tersebut melaporkan dari 53 isolat murni didapatkan 24 isolat

bakteri yang positif menghasilkan fitohormon auksin. Dimana konsentrasi

fitohormon tertinggi dihasilkan oleh isolat dengan kode KNG.RT1 yang di isolasi

3

dari rizosfer tanaman kangkung dengan konsentrasi 10.998 ppm. Pada tahun yang

sama, Theresiawati juga melakukan penelitian tentang “Isolasi dan Seleksi Bakteri

Penghasil Fitohormon Sitokinin”. Theresiawati mengisolasi 56 isolat murni

bakteri yang terdiri dari 40 bakteri rhizosfer dan 16 isolat bakteri endofit, hasil

penelitian tersebut melaporkan dari 56 isolat murni didapatkan 16 isolat bakteri

yang positif menghasilkan fitohormon Sitokinin. Salah satunya adalah isolat

dengan kode JGEA7 yang di isolasi dari endofit akar jagung dengan konsentrasi

3,894 ppm. Isolat ini di duga tidak hanya menghasilkan sitokinin semata, akan

tetapi dapat menghasilkan fitohormon auksin.

Kedua isolat dalam penelitian di atas belum teridentifikasi jenisnya, oleh

karena itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai identifikasi bakteri,

dimana bakteri yang telah teridentifikasi nanti akan dijadikan inokulum cair

dengan formula tertentu yang kemudian akan digunakan untuk berbagai keperluan

riset maupun diproses lebih lanjut oleh para pengembang agrobioteknologi.

Di masa mendatang, industri-industri pertanian semakin dituntut untuk

menggunakan sistem organik (hayati) dalam setiap aktivitasnya, sehingga produk

mikroba penghasil hormon pertumbuhan tanaman yang ramah lingkungan

memiliki peluang pasar yang menjanjikan.

1.2. Rumusan Masalah

1. Spesies apakah Isolat Bakteri Lokal KNG.RT1 yang memiliki kemampuan

menghasilkan fitohormon auksin dan isolat bakteri lokal JGEA7 yang

memiliki kemampuan menghasilkan fitohormon sitokinin?

4

2. Apakah karakteristik dari isolat bakteri lokal KNG.RT1 berbeda dengan

isolat bakteri lokal JGEA7?

2.3. Hipotesis

1. Bakteri yang umum memiliki kemampuan menghasilkan fitohormon

auksin dan sitokinin adalah bakteri dari genus Pseudomoas, Azotobacter,

Bacillus dan Rhizobium.

2. Karakteristik dari isolat bakteri lokal KNG.RT1 berbeda dengan isolat

bakteri lokal JGEA7.

2.4. Tujuan Penelitian

1. Mengidentifikasi jenis bakteri dari isolat bakteri lokal KNG.RT1 yang

memiliki kemampuan menghasilkan fitohormon auksin dan JGEA7 yang

memiliki kemampuan menghasilkan fitohormon sitokinin.

2. Mengetahui karakteristik isolat bakteri lokal KNG.RT1 yang memiliki

kemampuan menghasilkan fitohormon auksin dan isolat bakteri lokal

JGEA7 yang memiliki kemampuan menghasilkan fitohormon sitokinin.

2.5. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada tiga

sasaran utama yakni:

a. Peneliti

Isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7 yang telah diidentifikasi memiliki

kemampuan menghasilkan fitohormon dari golongan auksin dan sitokinin

diharapkan dapat dijadikan kultur koleksi yang sewaktu-waktu dapat

digunakan untuk keperluan riset.

5

b. Pengembang Agrobioteknologi

Isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7 yang telah diidentifikasi memiliki

kemampuan menghasilkan fitohormon dari golongan auksin dan sitokinin

diharapkan dapat diproses lebih lanjut dengan produksi skala besar untuk

produk siap pakai oleh petani.

c. Petani

Isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7 yang telah diidentifikasi dan diproses

lebih lanjut oleh pengembang agrobioteknologi diharapkan dapat berguna

untuk petani sehingga petani mudah menggunakan hasil produksi tersebut.

6

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Identifikasi dan Karakterisasi Bakteri

Identifikasi adalah penggunaan kriteria yang ditetapkan untuk klasifikasi

dan nomenklatur untuk mengidentifikasi mikroorganisme dengan

membandingkan ciri-ciri yang belum diketahui jenisnya dengan ciri-ciri yang

sudah diketahui jenisnya. Identifikasi mikroorganisme yang telah diisolasi perlu

pencirian, deskripsi, dan perbandingan yang cukup dengan deskripsi yang telah

dipublikasikan untuk mikroorganisme lain yang serupa (Pelczar dan Chan, 1986).

Teknik identifikasi mikroba merupakan langkah lanjutan dari hasil isolasi.

Untuk identifikasi dan determinasi hasil biakan murni ditentukan berdasarkan

morfologi individu, sifat pewarnaan, morfologi koloni, sifat-sifat biokimia

(fisiologis), patogenitas, dan serologinya. Akan tetapi, pada mikroba tertentu

terkadang tidak diperlukan pengujian lengkap seperti di atas. (Waluyo, 2008).

Proses awal identifikasi mikroba yakni dengan mengamati morfologi individu

secara mikroskopik dan pertumbuhannya pada berbagai macam medium. Karena

suatu mikroba tidak dapat dideterminasi hanya dengan berdasarkan sifat-sifat

morfologinya saja, maka perlu dilihat sifat-sifat biokimia dan faktor-faktor yang

mempengaruhi pertumbuhannya. Mikroba yang morfologinya sama mungkin saja

berbeda kebutuhan nutrisinya dan persyaratan ekologi lainnya. Demikian juga

patogenisitas dapat dipakai untuk membantu identifikasi dan determinasi mikroba

7

tersebut. Bila suatu mikroba memiliki sifat-sifat yang hampir sama, maka

dilanjutkan uji serologinya (Fardiaz, 1992).

Karakterisasi dilakukan pada isolat bakteri yang telah lolos seleksi dengan

cara melakukan berbagai pemeriksaan laboratoris agar isolat bakteri tersebut dapat

dikelompokkan dalam suatu golongan (Feliatra, 1999). Karakterisasi yang

umumnya dilakukan meliputi :

2.1.1. Karakterisasi Morfologi Bakteri

Karakterisasi morfologi bertujuan untuk mengamati baik morfologi koloni

maupun morfologi sel bakteri pada isolat bakteri yang telah lolos seleksi. Ketika

ditumbuhkan dalam media yang bervariasi, mikroorganisme akan menunjukkan

penampakan makroskopis yang berbeda-beda pada pertumbuhannya. Perbedaan

ini disebut dengan karakteristik kultur, yang digunakan sebagai dasar untuk

memisahkan mikroorganisme dalam kelompok taksonomik (Capuccino dan

Sherman, 1992). Isolat bakteri yang diperoleh diamati morfologi koloni dengan

melihat bentuk koloni, warna, tepian dan elevasi pada medium agar lempeng, agar

tegak dan agar miring. Sedangkan morfologi sel ditentukan dengan melihat olesan

biakan yang sudah diwarnai dibawah mikroskop dan melihat bagaimana bentuk

sel, sifat gram dan kemampuan membentuk spora dari bakteri tersebut (Pelczar

dan Chan, 2006).

8

2.1.1.1. Morfologi Koloni Bakteri

Karakterisasi morfologi bertujuan untuk mengamati baik morfologi koloni

maupun morfologi sel bakteri pada isolat bakteri yang telah lolos seleksi. Ketika

ditumbuhkan dalam media yang bervariasi, mikroorganisme akan menunjukkan

penampakan makroskopis yang berbeda-beda pada pertumbuhannya. Perbedaan

ini disebut dengan karakteristik kultur, yang digunakan sebagai dasar untuk

memisahkan mikroorganisme dalam kelompok taksonomik (Capuccino dan

Sherman, 1992). Menurut Fardiaz (1992), pengamatan morfologi koloni yang

tumbuh pada agar cawan dapat dibedakan dalam besarnya, warna,

penampakannya apakah keruh (opaque) atau bening, bentuk penyebarannya,

bentuk kemunculan di atas pagar, dan bentuk permukaan.

2.1.1.2. Morfologi Sel Bakteri

a) Pewarnaan Gram

Sifat terhadap pewarnaan Gram adalah suatu yang fundamental untuk

identifikasi bakteri, karena reaksi gram dihubungkan dengan banyaknya sifat-sifat

morfologi bakteri tersebut (Jawetz, et.al., 2005). Penyebab perbedaan bakteri

dalam pewarnaan Gram adalah struktur dinding sel dan komposisi dinding sel

bakteri Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram negatif memiliki kandungan

lipid dalam persentase lebih tinggi dibandingkan kandungan lipid yang dimiliki

bakteri Gram positif. Dinding sel bakteri Gram negatif mempunyai dinding sel

yang lebih tipis dibandingkan dinding sel bakteri Gram positif, perlakuan dengan

alkohol terhadap bakteri Gram negatif menyebabkan larutnya lipid/lemak oleh

9

larutan pemucat (alkohol) atau dengan kata lain lipid terekstraksi sehingga

memperbesar daya rembes atau permeabilitas dinding sel Gram negatif. Kompleks

kristal violet-iodium yang telah memasuki dinding sel selama langkah awal dalam

proses pewarnaan, dapat terekstraksi dari dinding sel bakteri. Sedangkan pada

bakteri Gram positif kandungan lipidnya lebih rendah dan dinding sel bakteri yang

lebih tebal akan menyusut oleh perlakuan larutan pemucat (alkohol) karena

terjadinya dehidrasi, hal ini menyebabkan pori-pori mengecil, permeabilitasnya

berkurang sehingga kompleks kristal violet-iodium tidak dapat tereksitasi dari

dalam dinding sel (Pelczar dan Chan, 2006).

Gambar 1. Perbedaan struktur dinding sel bakteri gram negatif dan positif

Dinding sel bakteri Gram negatif mengandung peptidoglikan jauh lebih

sedikit dan peptidoglikan ini mempunyai ikatan silang peptide antara unit-unit

glikan dan peptida yang bersifat kurang fleksibel dibandingkan dengan yang

dijumpai pada bakteri Gram positif, maka pori-pori pada petidoglikan bakteri

10

Gram negatif tetap cukup besar sekalipun setelah diberi larutan pemucat (alkohol),

sehingga memungkinkan ekstraksi komplek kristal violet-iodium. Sedangkan pada

dinding sel bakteri Gram positif mengandung lapisan peptidoglikan yang lebih

banyak sehingga dengan diberi larutan pemucat (alkohol) akan mengurangi

diameter pori-pori pada lapisan peptidoglikan dan menyebabkan kompleks kristal

violet-iodium terperangkap di dalam dinding sel bakteri Gram positif (Waluyo,

2008).

b) Pewarnaan Spora

Letak spora di dalam sel serta ukurannya selama pembentukkan tidaklah

sama bagi setiap spesies, hal ini penting pada proses identifikasi. Ada spora yang

dibentuk di tengah-tengah sel (sentral), terminal yaitu spora yang dibentuk di

ujung sel, dan subterminal yaitu dibentuk dekat ujung sel (Prescott et al., 2002).

Diameter spora dapat lebih besar atau lebih kecil dari diameter sel vegetatifnya.

Karena itu, adanya, letak serta ukuran endospora sangat bermanfaat didalam

pencirian dan identifikasi bakteri (Pelczar, 1986).

Bakteri dari genus Bacillus mampu bertahan hidup dalam tanah dalam

jangka waktu yang lama karena kemampuannya membentuk endospora

(Schaechter, 2004). Fase endospora dibentuk ketika kondisi lingkungan kurang

mendukung pertumbuhannya, misalnya kekurangan karbon, nitrogen, fosfat

(Waluyo, 2008). Struktur ini merupakan bentuk kehidupan yang paling resisten,

tahan terhadap desikasi, pemanasan, sinar UV, radiasi gamma, bahan kimia toksik

dan kekeringan serta perubahan kondisi lingkungan (Constantin, 2008).

11

c) Uji Motilitas

Motalitas merupakan salah satu ciri penting pengkarakterisasian bakteri.

Sifat ini diakibatkan oleh adanya alat cambuk yang disebut flagella sehingga sel

bakteri dapat berenang didalam lingkungan air (Indawrati et al., 2002). Untuk

mengetahui kemampuan bakteri dalam pergerakannya biasanya dilakukan uji

motilitas yakni dengn menanam bakteri pada media agar semi solid dengan

menusukkannya dengan ose tegak lurus pada media tersebut.

2.1.2. Pengujian fisiologis dengan reaksi biokimia

a) Uji kebutuhan oksigen dengan medium NB

Uji kebutuhan oksigen dilakukan untuk mengetahui sifat pertumbuhan

bakteri dengan menggunakan medium NB. Sifat pertumbuhan yang diamati

adalah aerob, anaerob, fakultatif atau mikroaerofil.

b) Uji Katalase

Uji katalase ini dilakukan untuk membedakan mikroorganisme yang memiliki

enzim katalase yang digunakan untuk mendegredasi hidrogen peroksida yang

bersifat toksik (Lay, 1994).

c) Uji fermentasi karbohidrat

Uji fermentasi karbohidrat bertujuan untuk mengetahui kemampuan isolat

bakteri dalam menghidrolisis karbohidrat dengan menggunakan tiga jenis gula,

yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa (Lay, 1994).

12

d) Uji hidrolisis pati

Uji hidrolisis pati untuk melihat kemampuan bakteri dalam menghidrolisis

pati dengan cara menghasilkan enzim amilase. Pati merupakan polisakarida yang

memiliki berat molekul yang tinggi, karena ukurannya yang besar, polisakarida

tidak mampu diserap oleh membran sel (Capuccino dan Sherman, 1992).

e) Uji indol

Uji indol digunakan untuk mengetahui apakah dalam proses pertumbuhannya

bakteri dapat membentuk indol dari asam amino essential triptofan (Lay, 1994).

f) Uji fermentasi gula, H2S, dan gas dengan TSIA

Uji ini menggunakan medium TSIA yang mengandung glukosa, laktosa dan

ferosulfat.

g) Uji MR-VR

Uji MR bertujuan untuk menentukan kemampuan mikroorganisme untuk

mengoksidasi glukosa dan menstabilkan konsentrasi asam yang tinggi sebagai

produk akhir. Sedangkan uji VP untuk membedakan kemampuan mikroorganisme

untuk menghasilkan produk akhir non-asam atau netral seperti asetilmetilkarbonil

dari asam organik yang dihasilkan dari metabolisme glukosa (Lay, 1994).

13

h) Uji Sitrat

Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme untuk

menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi (Capuccino

dan Sherman, 1992).

i) Uji hidrolisis urea

Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menghidrolisis

urea dengan menggunakan enzim urease dan mengubah pH media dari pH netral

menjadi basa (Lay, 1994).

2.1.3. Analisis Molekular

Dengan prosedur laboratorium yang telah tersedia, kita dapat menentukan

komposisi basa (kandungan guanin + sitokinin atau GS) DNA suatu

mikroorganisme tertentu dan kemudian membandingkannya dengan komposisi

basa DNA pada mikroorganisme lainnya. Derajat kekerabatan atau kesamaan

DNA pada berbagai mikroorganisme dapat ditentukan pula dengan percobaan

hibridisasi. Dalam teknik ini utasan tunggal DNA mikroorganisme dipertemukan

dengan utasan tunggal DNA mikroorganisme yang lain. Derajat penyatuan

kembali utasan-utasan tunggal ini mencerminkan derajat kesamaannya (Pelczar,

1986).

2.2. Empat Kategori Besar Bakteri

Untuk identifikasi mikroba, meskipun ada skema klasifikasi yang diakui

secara internasional, namun skema klasifikasi yang paling terkenal dan paling

14

umum digunakan yakni mengacu pada “Bergey’s Manual of Determinative

Bacteriology” (Holt et al., 1994).

Secara garis besar kelompok bakteri dapat digolongkan menjadi 4 kategori

besar, yakni :

1. Kategori Besar I : Eubacteria Gram Negatif dengan Dinding Sel, yang

terdiri 16 Grup

Prokariota memiliki struktur dinding sel yang kompleks (tipe Gram

Negatif) baik pada susunan dinding luar maupun dinding dalam, dengan lapisan

peptidoglikan yang tipis (yang terdiri dari asam muramat) dan komplemen yang

bervariasi di bagian luar dan antara lapisan-lapisan itu. Biasanya organisme

tersebut jika diwarnai menunjukkan Gram negatif. Bentuk sel biasanya berbentuk

oval, lurus, melengkung, batang, heliks atau filament, beberapa yang lain

berbentuk kapsul atau selubung (Holt et al., 1994). Reproduksi dengan

pembelahan biner, tetapi beberapa kelompok dengan pertunasan, pembelahan

ganda (pleurocapsales). Myxobacteria membentuk badan buah dan mikrospora.

Beberapa yang lain bergerak dengan cara berenang, meluncur, dan tidak bergerak.

Anggota dari kategori ini bakteri fototropik atau nonfototopik (lithotrofik dan

heteritrofik) dan bersifat aerobik, anarobik, anaerob fakultatif, dan mikroaerofilik;

beberapa anggotanya merupakan parasit obligat interseluler.

15

2. Kategori Besar II : Eubacteria Gram Positif dengan Dinding Sel, yang

terdiri 6 Grup

Kategori ini merupakan prokariot dengan susunan dinding sel tipe Gram

positif. Sel dapat berbentuk sphere, batang, atau filament; batang dan filament

tidak bercabang, tetapi beberapa menunjukkan percabangan. Reproduksi secara

umum dengan pembelahan biner; beberapa memproduksi endospora atau spora

pada hifa. Kategori tersebut tidak bersifat fotosintetik; umumnya kemosintetik

heterotrofik dan bersifat aerob, anaerob, anaerob fakultatif, dan mikroaerofil.

Anggota kategori ini bakteri asporogenous dan sporogenous, seperti pada

actinomycetes (Pelczar dan Chan,1986).

3. Kategori Besar III : Eubacteria tanpa Dinding Sel, terdiri hanya 1 Grup

saja, yakni Mycoplasma atau Mollicula

Kategori ini tidak memiliki dinding sel dan tidak mensintesis prekursor

peptidoglikan. Organisme kategori ini tertutup oleh suatu unit membran, yakni

membran plasma. Sel bersifat sangat pleomorfik dan ukurannya bervariasi mulai

yang besar sampai yang sangat kecil (0,2 mikrometer). Umumnya berbentuk

filament bercabang. Reproduksi dengan pertunasan, fragmentasi, dan atau

pembelahan biner. Biasanya nonmotil, tetapi beberapa spesies dengan pergerakan

meluncur. Tidak berspora. Sel terwarnai menjadi Gram negatif. Banyak

memerlukan media kompleks untuk pertumbuhan (tekanan osmotik tinggi) dan

menembus permukaan medium padat membentuk koloni berbentuk “telur dadar”.

Kebanyakan spesies memerlukan kolesterol dan asam amino rantai panjang untuk

16

pertumbuhan. Komplek guanin dan sitosin dalam ARN ribosom 43-48 mol%

(lebih rendah 50-54 mol% dari dinding Eubacteria Gram positif dan Gram

negatif); guanin dan sitosin dari ADN 23-46 mol% dan ukuran genom

mycoplasma lebih sedikit daripada prokariotik yakni 0,5-0,1 x 109 dalton.

Mycoplasma bersifat saprofitik, parasitik, atau patogenik, dan bersifat patogen

penyebab penyakit pada binatang, tanaman, dan jaringan.

4. Kategori Besar IV : Archeobacteria, yang terdiri 5 Grup

Archaeobacteria dominan sebagai mikroba daratan dan akuatik, terdapat

secara anerob atau hipersalin atau hydrothermal dan geothermal; juga terdapat

bersimbiosis dengan saluran pencernaan pada binatang. Kategori bakteri ini terdiri

dari aerob, anaerob, dan aerob fakultatif yang dapat tumbuh secara

khemolithoototrof, organototrof, atau organototrof fakultatif. Archaeebacteria

dapat bersifat mesofil, atau thermofil yang dapat tumbuh pada suhu di atas 100ºC.

Archaeobacteria memiliki sifat unik secara biokimia yakni adanya eter

lemak, isopropyl gliserol. Ketiadaan murein pada dinding sel menyebabkan reaksi

terhadap antibiotika ß-laktam. Lengan umum dari tARNs terdiri pseudouridin

atau 1-metilpseudouridin. Sekuen 5S, 16S, dan 23S rARNs sangat berbeda antara

eubakteria dan eukariota.

Beberapa ciri molekuler Archaeobacteia: (a) perpanjangan faktor 2 (EF-

2) terdiri asam amino diftalmida dan ADP-ribosable oleh racun difteria, (b)

sekuens asam amino dari protein “A” ribosomal homolog dengan eukariotik

protein (L-7/L-12), (c) initiator tARN metionil bukan formilated, (d) beberapa

17

gen tARN berpasangan dengan basa “AU”, (f) ARN polymerase adalah

multikomponen enzim dan peka terhadap antibiotik rimfamisin dan streptolidigin,

(g) seperti halnya AND polymerase dari eukariot; replikasi AND Archaeobacteria

polymerase tidak dihambat oleh aphidicolin atau butilfenil-dGTP, dan sintesis

protein dihambat oleh anisomisin bukan oleh kloramfenikol. Archaeobacteria

otototrofik tidak dapat mengasimilasi karbon dioksida melalui siklus Calvin.

Archaeobacteria ototrof tidak dapat mengasimilasi karbon dioksida melalui siklus

Calvin. Pada Methanobacterium, CO2 diikat melalui jalur asetil CoA sedangkan

Acidianus dan Thermoproteus CO2 diikat melalui jalur reduksi asam

trikarboksilat.

Hasil pewarnaan Gram kemungkinan dapat Gram positif atau Gram

negatif. Spesies yang bersifat Gram positif pada dinding selnya memiliki

pseudomurein, metahanochondrotin, dan heteropolisakarida; sedangkan pada

Gram negatif karena memiliki lapisan permukaan (gliko-) protein. Sel nya

memiliki keragaman bentuk. Diameter sel antara 0,1-15 mikron dan panjang

filamen dapat mencapai 200 mikron. Perbanyakan sel dapat dengan pembelahan

biner, perkuncupan, fragmentasi dan mekanisme yang belum diketahui. Sel dapat

berwarna merah, ungu, jingga, coklat jeruk, kuning, hijau, hitam kekuningan dan

putih.

Secara umum Archaeobacteria terdiri (a) Archaeobacteria methanogenik,

(b) Archaeobacteria pereduksi sulfat, (c) Archaeobacteria halofilik ekstrem, (d)

Archaeobacteria tanpa dinding sel, dan (e) Thermofilik Sº-metaboliser.

18

Dari empat kategori besar di atas (Kategori I, Kategori II, Kategori III,

dan Kategori IV) dibagi menjadi 35 GRUP. Masing-masing grup adalah :

Kategori Besar I : Eubacteria Gram negatif, GRUP 1 sampai dengan

GRUP 16.

Kategori Besar II : Eubacteria Gram positif dengan dinding sel dari GRUP

17 samapi dengan GRUP 29.

Kategori Besar III : Eubacteria tanpa dinding sel dari hanya terdiri dari 1

GRUP, yakni MYCOPLASMA (GRUP 30).

Kategori Besar IV : Archeobacteria terdiri GRUP 31 sampai dengan

GRUP 35.

2.3. Gen 16S rRNA

RNA di dalam sel dapat dikelompokkan menjadi 2 kelompok yaitu

kelompok RNA yang berhubungan dengan ekspresi gen yaitu mRNA, tRNA dan

kelompok rRNA yang tidak berhubungan dengan ekspresi gen. Ribosomal RNA

merupakan salah satu makromolekul yang menarik karena molekul ini bersifat

stabil, terdapat sekitar 83% dari keseluruhan RNA dalam sel dan merupakan

kerangka ribosom yang sangat berperan dalam mekanisme translasi. Semua rRNA

identik secara fungsional yakni terlibat dalam produksi protein, walaupun

demikian sekuen-sekuen dibagian tertentu terus berevolusi dan mengalami

perubahan pada level struktur primer sambil mempertahankan struktur sekunder

dan tersier yang homolog (Gutell et al., 1994).

19

Kemampuannya mewakili semua informasi filogenetik dan kepraktisannya

menyebabkan sekuen 16S rRNA lebih sesuai digunakan untuk identifikasi bakteri

daripada menggunakan 5S rRNA atau 23S rRNA (Drancourt, 2000). Aplikasi

molekular untuk menganalisis keragaman mikroba melalui analisis gen 16S rRNA

sesuai untuk mengidentifikasi mikroorganisme karena gen ini terdapat pada semua

organisme prokariot. Molekul 16S rRNA memiliki daerah-daerah berbeda berupa

sekuen yang konservatif dan sekuen lain yang sangat variatif (Bottger, 1996).

Strategi yang sering digunakan untuk melihat keragaman mikroba yang meliputi

tahap-tahap isolasi DNA dari komunitas alami, amplifikasi gen 16S rRNA

menggunakan PCR, penapisan klon-klon untuk variabilitas genetik, pemilihan

klon unik untuk disekuen dan menentukan klon filogeniknya (Marchesi et al.,

1998). Gen 16S rRNA bersifat relatif stabil dalam sel bakteri dari pada rRNA

yang biasanya didegradasi dan hanya terdapat pada fase-fase tertentu saja

(Drancourt, 2000).

2.4. Bakteri Penghasil Auksin

Selain dapat mensintesis sendiri, tanaman juga dapat memperoleh

fitohormon auksin dari mikroba yang bersimbiosis dengan tanaman tersebut.

Mikroba-mikroba tersebut biasanya hidup di daerah rhizosfer dan endofit

tanaman. Strain bakteri Rhizozobium sp. yang hidup dalam bintil akar kacang-

kacangan seperti Rhizobium japonicum yang diisolasi dari akar kacang kedelai,

Rhizobium leguminosarium dari bintil akar kacang turi, Rhizobium lupini dari

bintil akar kacang merah, dan Rhizobium phaseoli yang diisolasi dari akar kacang

hijau telah lama dikenal sebagai bakteri-bakteri penghasil auksin. Isolat bakteri

20

Pseudomonas fluorescens dan Pseudomonas putida yang diisolasi dari akar

jagung serta strain aktinomicetes seperti Streptomyces griseoviridis dapat

mendapatkan auksin jenis IAA (Cappuyuns et al., 2004).

Tanaman dengan spesies endofit tertentu mampu tumbuh lebih cepat dan

terlihat dominan dari tanaman yang lain karena produksi fitohormon. Mikroba

endofit strain Epicoccum purpurascens dan Aureobasidium pullullan mampu

memproduksi IAA dan Indol-3-Acetonitrile secara in vitro. Endofit strain

Balansia sp. dan Acremonium coenophialum mampu memproduksi IAA dan

hormon auksin yang lain secara in vitro (Wilson, 1995). Endofit Hypoxylon

serpens yang diisolasi dari tembakau mampu memproduksi sitokinin. Auksin dan

sitokinin juga dapat diperoleh dari endofit Steril red yang diisolasi dari gandum

dan rye-grass (Hallmann, 2001).

Biosintesis mikrobial IAA dalam tanah dapat dipacu dengan adanya

triptofan yang berasal dari eksudat akar atau sel-sel yang rusak (Arshad &

Frankerberger, 1991). Terdapat lintasan-lintasan metabolik yang dapat mengubah

triptofan menjadi IAA pada beberapa organ atau jaringan tanaman yang telah

diteliti (Heddy, 1996).

2.5. Bakteri Penghasil Sitokinin

Kemampuan Azotobacter dalam memproduksi fitohormon sitokinin dan

auksin dilaporkan pertama kali oleh Vancura dan Macura pada tahun 1960

(Vancura, 1988). Sampai saat ini sejumlah penelitian telah membuktikan

kemampuan rizobakter Azotobacter chroococcom, A. beijerinckii, A. paspali

maupun A. vinelandii dalam memproduksi fitohormon terutama sitokinin . Taller

21

dan Wong (1989) membuktikan adanya sitokinin dari jenis zeatin ribosida (ZR),

Zeatin (Z), isopenteniladenosin (2iPR), isopenteniladenin (2iP), metiltiozeatin

(MSZ) dan metiltioisopentenil-adenin (MS2iP) yang diekskresikan oleh A.

vinelandii (Kakimoto, 2003).

Abbas dan Okon (1993) memperlihatkan bahwa kemampuan A. paspali

untuk meningkatkan pertumbuhan tanaman berhubungan dengan kapasitasnya

dalam mensintesis faktor tumbuh. Sejumlah isolat Azotobacter yang dikulturkan

pada suhu kamar maupun 30ºC selama 60 jam mensekresikan fitohormon

sitokinin, atau giberelin ke dalam media pertumbuhan bebas N. Di dalam

supernatant kultur cair A. chroococcum, yang diisolasi dari rizosfer jagung,

dengan kepadatan 109 cfu/ml terdapat kinetin dan benziladenin-9-glukosida

masing-masing dengan konsentrasi 0.0197 dan 0.004 μg/ml.

Azotobacter sp., diisolasi dari rizosfir tomat, yang dikulturkan di media

bebas N mengekskresikan (Giberelid Acid) GA1 sebanyak 13.57 µg/mL dan

sitokinin sebanyak 10.13 µg/mL (Hindersah et al., 2001). Analisis HPLC fase

terbalik pada kultur isolat Azotobacter yang diisolasi dari rizosfir bibit lettuce

memperlihatkan adanya 0.04 ppm sitokinin, 1.9 ppm GA3, 0.9 ppm GA5 dan 1.0

ppm GA7 tetapi tidak terdeteksi adanya auksin (Hindersah et al., 2003).

22

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari – April 2011 di

Labratorium Mikrobiologi, Institut Teknologi Indonesia (ITI), Serpong,

Tangerang Selatan untuk pengamatan morfologi bakteri dan pengujian fisiologis

secara biokimia dan di Laboratorium Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan

Indonesia (LIPI), Cibinong-Bogor untuk uji Molekular.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sentrifuge, tabung

sentrifuge, mikro pipet, pipet tips, gelas ukur, Beaker Glass, timbangan analitik,

spatula, cawan petri, tabung reaksi, hot plate, magnetic stirrer, incubator shaker,

laminar air flow, jarum ose, tabung PCR, water bath, mesin PCR, elektroforesis

kit, UV transluminator, pipet tetes, kapas, alumunium foil, pipet tip, mikro pipet.

3.2.2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat murni bakteri

penghasil fitohormon auksin (KNG.RT 1) dan isolat bakteri penghasil fitohormon

sitokinin (JGEA7) yang diperoleh dari BPPT serpong, Genomic DNA Mini Kit

(Merk: Genaid), ethanol pekat, reagen PCR (buffer, dNTP, enzyme Taq

23

Polimerase, MgCl2), TAE 1X, Agarose, primer 9 F (5’-GAG TTT GAT CCT

GCC TCA G-3’) 20 pmol, primer 1541 R (5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-

3’) 20 pmol, DNA template, loading dye, media Nutrient Agar, nutrient Broth,

laruan H2O2 3%, NaCl, Larutan pewarnaan gram, malacit green, reagen Erhlich,

merah metil, larutan KOH, asam sulfanilat, asam naftilamin.

3.3. Cara Kerja

3.3.1. Pembuatan Media

3.3.1.1. Media Nutrient Agar (NA)

Sebanyak 0,5 gram pepton, 0,3 gram beef ekstrak dan 1,5 gram agar-agar

dilarutkan dalam 100 ml akuadest. Media NA dipanaskan dengan menggunakan

hot plate dan magnetic stirrer agar larut, kemudian disterilisasi menggunakan

autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit pada tekanan 1 atm.

3.3.1.2. Media Nutrient Broth (NB)

Sebanyak 0,5 gram pepton, dan 0,3 gram beef ekstrak dilarutkan dalam

100 ml akuadest. Media NA dipanaskan dengan menggunakan hot plate dan

magnetic stirrer agar larut, kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf dengan

suhu 1210C selama 15 menit pada tekanan 1 atm.

3.3.1.3. Media Agar Semi Solid

Sebanyak 0,5 gram pepton, 0,3 gram beef ekstrak dan 1 gram agar-agar

dilarutkan dalam 100 ml akuadest. Media NA dipanaskan dengan menggunakan

24

hot plate dan magnetic stirrer agar larut, kemudian disterilisasi menggunakan

autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit pada tekanan 1 atm.

3.3.1.4. Media Trypton Broth

Sebanyak 1 gram trypton dilarutkan dalam 100 ml akuadest. Media

tersebut dipanaskan dengan menggunakan hot plate dan magnetic stirrer agar

larut, kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 1210C selama 15

menit pada tekanan 1 atm.

3.3.1.5. Media MR-VP

Sebanyak 5 gram pepton, 5 gram glukosa, dan 5 gram K2HPO4 dilarutkan

dalam 100 ml akuadest. Media tersebut dipanaskan dengan menggunakan hot

plate dan magnetic stirrer agar larut, kemudian disterilisasi menggunakan

autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit pada tekanan 1 atm.

3.3.1.6. Media Starch Agar

Sebanyak 0,5 gram pepton, 0,3 gram beef ekstrak, 0,2 gram soluble starch

dan 1,5 gram agar-agar dilarutkan dalam 100 ml akuadest. Media tersebut

dipanaskan dengan menggunakan hot plate dan magnetic stirrer agar larut,

kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit

pada tekanan 1 atm.

3.3.1.7. Media Nitrat

Sebanyak 5 gram pepton, 3 gram beef ekstrak, dan 3 gram KNO3

dilarutkan dalam 100 ml akuadest. Media tersebut dipanaskan dengan

25

menggunakan hot plate dan magnetic stirrer agar larut, kemudian disterilisasi

menggunakan autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit pada tekanan 1 atm.

3.3.1.8. Media Fermentasi Karbohidrat

Sebanyak 5 gram pepton, 3 gram beef ekstrak, dan 3 gram KNO3

dilarutkan dalam 100 ml akuadest. Media tersebut dipanaskan dengan

menggunakan hot plate dan magnetic stirrer agar larut, kemudian disterilisasi

menggunakan autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit pada tekanan 1 atm.

3.3.2. Peremajaan Isolat bakteri

Satu ose isolat murni masing-masing bakteri dari medium stok

diinokulasikan ke dalam media agar miring NA segar dan media NB, kemudian

diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.

3.3.3. Identifikasi Isolat Bakteri Lokal KNGRT1 dan JGEA7

3.3.3.1.Pengamatan Sifat Morfologi Koloni Isolat Bakteri

Isolat bakteri ditumbuhkan pada medium NA dan dilakukan pengamatan

pertumbuhan koloni bakteri pada medium agar lempeng yaitu bentuk, tepian,

elevasi, permukaan warna (Metting, 1993).

3.3.3.2. Pengamatan Morfologi Sel

a. Pewarnaan Gram

Satu tetes larutan NaCl diteteskan pada kaca objek. 1 ose isolat bakteri

lokal diambil dan dicampurkan dengan NaCl 0,85%. Preparat dibiarkan

kering dengan cara diangin-anginkan, dan difiksasi sebanyak 3 kali diatas

26

nyala api kemudian dibiarkan dingin. Kemudian dilakukan pewarnaan gram

yakni dengan cara diberi tetesan larutan kristal violet selama ± 2-3 menit,

dicuci dengan aquadest dan selanjutnya ditetesi dengan larutan lugol pada

seluruh permukaan preparat selama ± 1-2 menit. preparat dicuci dengan

aquadest dan di cuci kembali dengan alkohol 96% hingga bersih. Kemudian

di cuci dengan air, lalu diberi tetesan larutan safranin selama ± 1-2 menit.

Preparat di cuci kembali dengan aquadest dan dikeringkan setelah itu di amati

di bawah mikroskop (Waluyo, 2008).

b. Pewarnaan Spora

Satu tetes larutan NaCl diteteskan pada kaca objek. Kemudian di ambil 1

ose isolat bakteri lokal dan dicampurkan dengan NaCl 0,85%. Preparat

dibiarkan kering dengan cara diangin-anginkan, dan difiksasi sebanyak 3 kali

di atas nyala api kemudian dibiarkan dingin. Kemudian diberi tetesan Malacit

Green, dibiarkan selama 2-3 menit di atas penangas air. Lalu preparat di

angkat dan dibiarkan dingin, selanjutnya dibilas dengan aquadest. Beri tetesan

safranin, dibiarkan selama 30 detik,lalu dibilas dengan aquadest, dan

dikeringkan setelah itu diamati di bawah mikroskop. Sel vegetatif akan

terlihat berwarna merah dan sporanya akan terlihat berwarna hijau (Madigan

et al., 2009).

c. Uji Motilitas

Satu ose biakan diinokulasikan kedalam medium agar semisolid dengan

cara ditusukkan secara tegak dan 1 tabung medium tidak diinokulasi sebagai

27

kontrol. Kemudian diinkubasi pada temperatur 37oC selama 24 jam, setelah

itu diamati perubahan yang terjadi. Hasil positif menunjukkan media menjadi

keruh seluruhnya dan negatif apabila keruh hanya pada daerah tusukan saja.

3.3.3.3. Penguji Fisiologis dengan reaksi Biokimia

Mengikuti cara kerja yang disebutkan dalam Hadioetomo (1993) dan

Amar et al., (2002) yang meliputi :

1. Uji Katalase

Satu ose isolat bakteri lokal diambil dari hasil peremajaan bakteri. Isolat

diletakkan pada kaca objek kemudian ditetesi H2O23%. Kemudian diamati

adanya gelembung O2 (oksigen) yang terbentuk.

2. Uji Fermentasi Karbohidrat

Satu ose biakan diinokulasikan kedalam seri medium (glukosa, laktosa,

sukrosa dan maltosa). Satu seri medium tidak diinokulasi dan digunakan sebagai

kontrol. Kemudian diinkubasi pada temperatur 35oC selama 48 jam, setelah itu

diamati reaksi yang terjadi. Indikator pembentukan asam laktat apabila terjadi

perubahan warna medium menjadi kuning tanpa pembentukan gas pada tabung

durham. Uji akan bersifat fermentasi asam campuran apabila warna medium

berubah dan diikuti pembentukan gas pada tabung durham dan uji akan bersifat

fermentasi alkohol apabila terbentuk gas pada tabung durham tanpa diikuti

perubahan warna medium.

28

3. Uji Hidrolisis Pati

Starch agar dimasukkan dalam cawan petri. Isolat bakteri diinokulasi

dengan cara menempatkan satu mata ose biakan ditengah cawan petri kemudian

disebarkan seluas 0,5 cm dan diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37oC,

setelah diinkubasi, ditambahkan beberapa tetes larutan iodium di atas permukaan

koloni isolat bakteri yang tumbuh, uji akan bernilai positif apabila di sekeliling

koloni terbentuk zona bening dan ini akan menandakan terjadinya proses

hidrolisis pati dan uji akan bernilai negatif di sekeliling koloni terbentuk warna

biru kehitaman.

4. Uji Indol

Satu ose isolate bakteri diinokulasikan ke dalam Trypton Broth dan 1

tabung media tidak diinokulasi sebagai kontrol. Kemudian diinkubasi pada suhu

35±1ºC selama 24 jam, 1 atm. Setelah itu, ditambahkan 1 tetes larutan covac

sampai terbentuk cincin merah. Hasil positif akan menunjukkan terbentuknya

cincin merah dan negatif tidak terbentuk cincin merah.

5. Uji MR

Satu ose isolat bakteri diinokulasikan kedalam media perbenihan MR dan

1 tabung media tidak di inokulasi sebagai kontrol. Kemudian diinkubasi pada

suhu 37ºC selama 24 jam. Setelah itu, sebanyak 0,2 ml ditambahkan larutan

KOH 40% selama 15 menit pada media MR. Hasil positif akan menunjukkan

perubahan warna dari bening menjadi warna pink-merah dan hasil negatif akan

menunjukkan perubahan warna dari bening menjadi kuning kecoklatan.

29

6. Uji VP

Satu ose isolat bakteri diinokulasikan kedalam media perbenihan VP dan 1

tabung media tidak di inokulasi sebagai kontrol. Kemudian diinkubasi pada suhu

37ºC selama 24 jam. Setelah diinkubasi, kedua isolat di tambahkan 5-10 tetes

barit A dan B pada media VP. Hasil positif akan menunjukkan perubahan warna

dari kuning menjadi merah.

7. Uji Nitrat

Satu ose biakan diinokulasikan kedalam tabung yang telah berisi media

pertumbuhan NB dan 1 tabung tidak di inokulasi sebagai kontrol, kemudian

diinkubasi 24 jam pada suhu 37 ºC. Setelah itu, ditambahkan 5 tetes larutan A

(Asam Sulfanilat) dan 5 tetes larutan B (Alfa naftilamin) dan diamati perubahan

warna yang terjadi. Jika terjadi perubahan warna, maka biakan ditambahkan

sedikit serbuk Zn dan diamati perubahan yang terjadi.

3.3.3.4. Analisis Molekular, Meliputi:

a) Isolasi DNA, dilakukan menggunakan Genomic DNA Mini Kit (GeneAid)

1. Preparasi Sampel (Pra-lisis)

Jika Bakteri gram negatif: kultur sel bakteri dipindahkan (hingga 1x109)

kedalam 1,5 ml tabung mikrosentrifuge, kemudian sentrifuge selama 1 menit

dengan kecepatan 13.000 rpm (full speed). Kemudian buang supernatannya dan

ditambahkan 200 µl GT Buffer kedalam tabung kemudian divortex. Inkubasi

selama 5 menit dalam suhu ruang.

30

Jika Bakteri Gram Positif: kultur sel bakteri dipindahkan (hingga 1x109)

kedalam 1,5 ml tabung mikrosentrifuge, kemudian sentrifuge selama 1 menit

dengan kecepatan 13.000 rpm. Kemudian buang supernatannya dan

ditambahkan 200 µl lysozym Buffer kedalam tabung kemudian divortex.

Sampel diinkubasi selama 10 menit dalam suhu ruang, selama inkubasi, tabung

dikocok setiap 2-3 menit.

2. Lisis Sel

Sebanyak 200 µl GB buffer ditambahkan kedalam sampel, kemudian di

vortex selama 5 detik. Kemudian sampel diinkubasi selama 10 menit pada suhu

70oC. selama inkubasi, sampel dalam tabung di balikkan (kocok) setiap 3

menit.

3. Pengikatan DNA

Setelah diinkubasi ditambahkan 200 µl ethanol pekat kedalam sampel dan

di vortex selama 10 detik. GD kolom ditempatkan kedalam tabung koleksi

ukuran 2 ml, kemudian pindahkan semua campuran (termasuk semua endapan

sampel) kedalam GD kolom. Sentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama

2 menit. Tabung koleksi yang berisi cairan (pengotor) dilepaskan dan GD

kolom ditempatkan kedalam tabung koleksi yang baru.

4. Pencucian

Sebanyak 400 µl W1 buffer ditambahkan ke dalam GD kolom, kemudian

disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 30 detik. Tabung koleksi

31

yang berisi cairan (pengotor) dilepaskan dan GD kolom ditempatkan kembali

kedalam tabung koleksi yang baru. kemudian disentrifuge kembali selama 3

menit dengan kecepatan penuh untuk mengeringkan matriks kolom.

5. Pengelusian DNA

GD kolom yang telah kering dipindahkan kedalam tabung mikrosentrifuge

berukuran 1,5 ml yang bersih. Kemudian ditambahkan 100 µl elusi buffer atau

TE buffer kedalam bagian tengah dari matriks kolom. Larutan didiamkan

selama 3-5 menit atau sampai buffer elusi atau TE terserap oleh matriks.

Kemudian disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 30 detik untuk

mengelusi DNA yang telah dipurifikasi.

b) Polymerase Chain Reaction (PCR)

Untuk melakukan amplifkasi DNA , dibuat larutan pereaksi PCR yang

terdiri atas: 20 µl dH2O, 25 µl 5x buffer (ready mix), 2 µl primer 9F 20 pmol, 2 µl

primer 1541R 20 pmol, 1 µl DNA template (menggunakan Kappa ready mix

master kit for PCR) yang kemudian ditempatkan dalam satu ependorf tube volume

500 µl. Reagen mix tersebut di aduk dengan rata menggunakan vortex, dan di

sentrifuges dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit. Kemudian di

“flashing”, selanjutnya dimasukkan dalam takaran PCR Thermal Cycler MP, lalu

dilakukan pengesetan program PCR.

32

Tabel 1. Proses PCR dalam amplifikasi DNA pada isolat bakteri lokal

KNG.RT1 dan JGEA7

Reaksi Siklus Suhu Lama Reaksi

Pre Denaturasi 1 kali 96°C 5 menit

Siklus PCR

Denaturasi

Annealing

Ekstensi

30 kali

96

55

72

30 detik

30 detik

1 menit

Elongasi 1 kali 72 7 menit

Stand by - 4 ∞

c) Elektroforesis

Hasil PCR di elektroforesis dalam 1% gel agarosa dengan cara menimbang

agarosa 1 g untuk dilarutkan ke dalam bufer (Tris Acetate EDTA) TAE 1x hingga

volume 100 ml. Larutan agarosa dilarutkan dalam microwave. Kemudian dituang

dalam plate yang diberi sisir dan ditunggu sampai beku. Gel agarose yang telah

membeku kemudian dimasukkan kedalam baki elektroforesis (kit) yang telah

berisi larutan buffer TAE 1x hingga permukaan gel agarose terendam sempurna.

Parafilm disiapkan untuk mencampurkan loading dye 6x sebanyak 2 µl dengan

sampel DNA produk amplifikasi sebanyak 10 µl dengan menggunakan

mikropipet, kemudian campuran tersebut dimasukkan dalam sumur gel agarose.

Selanjutnya dibuat catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang

dimasukkan agar tidak keliru.

33

Selanjutnya kabel dihubungkan dari sumber arus ke tangki. Sumber arus

dinyalakan, lalu voltase diatur dan waktu running hingga diperoleh angka 100 V

dan 30 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus.

Elektroforesis dijalankan dengan cara menekan tombol run pada sumber arus.

Elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang

ditandai oleh adanya bunyi alarm. Kemudian sumber arus dimatikan dan baki

diangkat dari tangki elektroforesis. Gel dikeluarkan dan direndam dalam buffer

TAE 1x selama 10 menit. Setelah itu gel diletakkan di atas UV transluminator.

Kemudian UV transluminator dinyalakan dan diamati pita-pita DNA yang

tervisualisasi.

d). Purifikasi, dilakukan menggunakan Gel/PCR DNA Fragment extraction kit

(Geneaid)

1. Penguraian Gel

Gel agarose yang mengandung fragmen DNA diambil atau diiris.

Selanjutnya irisan gel dipindahkan kedalam tabung sentifuge ukuran 1,5 ml.

Sebanyak 500 µl DF Buffer ditambahkan kedalam sampel dan di vortex,

selanjutnya sampel diinkubasi pada suhu 55-60o C selama 10 menit atau sampai

irisan gel benar-benar larut. Selama inkubasi,setiap 2-3 menit sampel dibolak-

balikkan setelah itu sampel campuran yang telah larut didinginkan pada suhu

ruang.

34

2. Pengikatan DNA

DF kolom ditempatkan kedalam sebuah tabung koleksi 2 ml, kemudian

sebanyak 800 µl sampel campuran dipindahkan dari hasil langkah pertama tadi

kedalam DF kolom. Sampel disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 30

detik, kemudian tabung koleksi yang berisi cairan (pengotor) dilepaskan dan DF

kolom ditempatkan kembali ke dalam tabung koleksi 2ml.

3. Pencucian

Sebanyak 400 µl W1 buffer ditambahkan ke dalam DF kolom dan sampel

dimikrosentrifuge selama 30 detik, selanjutnya tabung koleksi yang berisi cairan

(pengotor) dilepaskan dan DF kolom ditempatkan kembali kedalam tabung

koleksi 2 ml. Sebanyak 600 µl buffer pencuci (yang sudah ditambahkan ethanol

pekat) ke dalam DF kolom dan didiamkan selama 1 menit selanjutnya

dimikrosentrifuge selama 30 detik dan tabung koleksi dilepaskan. Tempatkan

kembali DF kolom kedalam tabung koleksi 2 ml, sampel di mikrosentrifuge

kembali selama 3 menit untuk mengeringkan matriks kolom.

4.Pengelusian DNA

DF kolom yang telah kering dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifuge

1,5 ml, kemudian ditambahkan 15-50 µl buffer elusi/TE ke dalam bagian tengah

dari matriks kolom. Selanjutnya, didiamkan selama 2 menit atau sampai buffer

elusi/TE terserap oleh matriks. Sampel di sentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm

selama 2 menit untuk mengelusi DNA yang telah dipurifikasi.

35

e). Sequencing

Sampel yang telah dipurifikasi dilakukan elektroforesis kembali kemudian

dilakukan sekuensing di Lab. First Base Singapura untuk mengetahui urutan basa

DNA nya. Hasil sekuen kemudian dijajarkan dengan data GenBank menggunakan

program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotide) dari situs

NCBI (National Center for Biotechnology Information) untuk mengetahui

kemiripan spesies dari kedua isolat yang di analisis.

3.4. Analisis Data

Data yang diperoleh dianalisis dengan metode deskriftif, data yang

diperoleh dipaparkan secara rinci dengan menyertakan tabel hasil uji serta

gambar-gambar pendukung.

36

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Karakteristik Morfologi Koloni Isolat KNG.RT1 dan JGEA7

Pengamatan karakterisasi morfologi pada isolat bakteri lokal KNG.RT1

dan JGEA7 dilakukan untuk mengamati baik morfologi koloni maupun morfologi

sel bakteri pada isolat bakteri yang telah lolos seleksi.

Berdasarkan hasil pengamatan morfologi koloni bakteri, menunjukkan

bahwa isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7 memiliki ciri-ciri yang berbeda secara

pengamatan makroskopis (lihat gambar 2.), isolat bakteri lokal KNG.RT1

mempunyai bentuk morfologi menyebar tidak teratur, warna koloni gading, jika

dilihat dari arah tepi bentuknya lobat atau tidak rata dan elevasinya datar.

Sedangkan koloni dari isolat bakteri lokal JGEA7 mempunyai bentuk morfologi

bulat dengan tepi berserabut, warna koloni gading, jika dilihat dari arah tepi

bentuknya lobat dan elevasinya datar.

Gambar 2. Bentuk morfologi koloni pada Isolat Bakteri KNG.RT1 dan JGEA7

Umur : 24 Jam; Medium : Nutrient Agar

37

Menurut Capuccino dan Sherman (1992), apabila mikroorganisme

ditumbuhkan dalam media yang bervariasi akan menunjukkan penampakan

makroskopis yang berbeda-beda pada pertumbuhannya. Perbedaan ini disebut

dengan karakteristik kultur, yang digunakan sebagai dasar untuk memisahkan

mikroorganisme dalam kelompok taksonomik.

4.2. Karakteristik Morfologi Sel Isolat KNG.RT1 dan JGEA7

Berdasarkan hasil pengamatan mofologi sel bakteri pada isolat bakteri

lokal KNG.RT1 dan JGEA7 yang meliputi pengamatan pewarnaan Gram,

pewarnaan spora dan uji motilitas menunjukkan hasil yang berbeda diantara

keduanya. Pada hasil pengamatan pewarnaan Gram, isolat bakteri KNG.RT1

menunjukkan Gram yang berbeda dengan isolat bakteri JGEA7. Isolat KNG.RT1

menghasilkan Gram negatif dengan bentuk sel batang pendek dengan warna sel

pink-merah, sedangkan isolat bakteri JGEA7 menghasilkan Gram positif, bentuk

batang pendek dengan warna sel ungu.

Gambar 3. Hasil Pewarnaan Gram dan bentuk sel pada Isolat Bakteri KNG.RT1 (A) dan

JGEA7 (B) Umur : 24 Jam; Medium : Nutrient Agar ; Perbesaran : 1000 x

dengan menggunakan mikroskop cahaya di Laboratorium Mikrobiologi ITI-

Serpong.

Isolat Bakteri KNG.RT1 Isolat Bakteri JGEA7

A B

38

Penyebab terjadinya perbedaan hasil pewarnaan Gram pada isolat bakteri

lokal KNG.RT1 dan JGEA7 adalah komposisi dan struktur dinding sel bakteri.

Isolat bakteri lokal KNG.RT1 memiliki kandungan lipid dalam persentase lebih

tinggi dengan struktur dinding sel yang lebih tipis, berbeda pada isolat bakteri

lokal JGEA7 memiliki kandungan lipid lebih rendah dengan struktur dinding sel

bakteri yang lebih tebal.

Berbagai jenis bakteri telah diidentifikasi sebagai bakteri yang mampu

menghasilkan fitohormon yang dapat memacu pertumbuhan tanaman. Sebagian

besar berasal dari kelompok bakteri Gram negatif dengan jumlah strain paling

banyak dari genus Pseudomonas dan beberapa dari genus Serratia (kloepper,

1993). Selain itu ada juga yang berasal dari genus Azotobacter, Azospirillum,

Acetobacter dan Bacillus (Glick, 1995). Meskipun sebagian besar genus Bacillus

(Bakteri Gram positif) tidak tergolong pengkoloni akar, beberapa strain tertentu

dari genus ini ada yang mampu melakukannya, sehingga dapat digolongkan

sebagi bakteri pemacu pertumbuhan tanaman. Sifat terhadap pewarnaan Gram

adalah suatu yang fundamental untuk identifikasi bakteri, karena reaksi gram

dihubungkan dengan banyaknya sifat-sifat morfologi bakteri tersebut (Jawetz,

et.al.,2005).

Selanjutnya, berdasarkan hasil pengamatan pewarnaan spora isolat bakteri

lokal KNG.RT1 tidak dapat membentuk spora, hal ini diketahui dari tidak ada sel

spora yang terbentuk ketika di amati di mikroskop (lihat gambar 4.) sedangkan

pada isolat bakteri lokal JGEA7 dapat membentuk sel spora. Ada dua tipe spora

yang terbentuk, yang pertama yang terbentuk dalam sel, yang disebut dengan

39

endospora dan spora yang terbentuk diluar sel yang disebut eksospora

(Constantin, 2008). Isolat bakteri JGEA7 termasuk kedalam spora yang terbentuk

di dalam sel yakni jenis endospora. Endospora yang dimilik oleh isolat bakteri

lokal JGEA7 berada posisi subterminal yang sedang mengalami pembengkakan,

karena itu ada atau tidak adanya spora, letak serta ukuran endospora sangat

bermanfaat didalam pencirian dan identifikasi bakteri (Pelczar dan Chan, 1986).

Gambar 5. Hasil Pewarnaan Spora dan Posisi Spora pada Isolat Bakteri JGEA7, Umur : 24

Jam; Medium : Nutrient Agar ; Perbesaran : 1000 x dengan menggunakan

mikroskop cahaya di Laboratorium Mikrobiologi ITI-Serpong.

Spora Bakteri

Sel Vegetatif

Sel Vegetatif

(Non spora)

Gambar 4. Hasil Pewarnaan Spora pada Isolat Bakteri KNG.RT1 (tidak terdapat spora)

Umur : 24 Jam; Medium : Nutrient Agar ; Perbesaran : 1000 x dengan

menggunakan mikroskop cahaya di Laboratorium Mikrobiologi ITI-Serpong.

40

Yang menyebabkan terjadinya perbedaan dalam menghasilkan spora

dimungkinkan karna perbedaan bagian jaringan tanaman yang di isolasi pada

isolat bakteri lokal KNG.RT1 dan JGEA7. Isolat bakteri lokal KNG.RT1 diisolasi

dari ranting tanaman kangkung, dimana pada daerah tersebut biasa terpapar

dengan udara dan tidak terganggu dengan adanya berbagai penyesuaian habitat

seperti tingkat keasaman tanah, temperatur, kelembapan, dll. Sedangkan isolat

bakteri lokal JGEA7 diisolasi dari endofit akar tanaman jagung, dimana pada

daerah jaringan akar tersebut biasanya memiliki cekaman lingkungan yang lebih

besar serta banyak terjadi kompetisi dengan bakteri lainnya. Oleh sebab itu,

makanya isolat bakteri lokal JGEA7 ini dapat membentuk spora untuk

mempertahankan kelangsungan hidupnya.

Endospora adalah bentuk kehidupan alternatif yang dihasilkan oleh

Bacillus, Clostridium, dan beberapa genera bakteri termasuk Desulfotomaculum,

Sporosarcina, Sporolactobacillus, Oscillospira, dan Thermoactinomyces

(dwijoseputro, 2003). Bacillus adalah aerob obligat yang tinggal di tanah

sementara Clostridium spesies yang wajib anaerob sering ditemukan sebagai flora

normal dari saluran usus pada hewan. Fase endospora dibentuk ketika kondisi

lingkungan kurang mendukung pertumbuhannya, misalnya kekurangan karbon,

nitrogen, fosfat (Waluyo, 2008). Struktur ini merupakan bentuk kehidupan yang

paling resisten, tahan terhadap desikasi, pemanasan, sinar UV, radiasi gamma,

bahan kimia toksik dan kekeringan serta perubahan kondisi lingkungan

(Constantin, 2008).

41

Uji motilitas pada isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7 digunakan untuk

mengetahui kemampuan bakteri dalam pergerakannya. Dari hasil uji tersebut

menunjukkan hasil positif pada kedua isolat bakteri, hasil positif ini ditandai

dengan keruhnya media pada daerah tusukan didalam media agar semisolid. Hasil

ini membuktikan bahwa kedua isolat bakteri tersebut melakukan motilitas

(pergerakan).

Tidak semua bakteri memiliki flagella, banyak spesies seperti Bacillus dan

Spirillum memiliki flagel, flagella jarang dijumpai pada bakteri coccus. Bagi

bakteri-bakteri berflagel, pola pelekatan serta banyaknya yang melekat, digunakan

untuk mengklasifikasi bakteri kedalam kelompok taksonomi tertentu. Sebagai

contoh, diantara bakteri yang berbentuk batang Gram negatif, pada genus

Pseudomonas dicirikan dengan flagella yang terletak diujung sel (flagella

monotrikus atau lofotrikus) dan genus Escherichia berflagel disekitar sel (flagella

peritrikus) (Pelczar dan Chan, 2006).

4.3. Pengujian Fisiologis dengan Reaksi Biokimia pada Isolat Bakteri

KNG.RT1 dan JGEA7

Pengujian fisiologis dengan reaksi biokimia pada bakteri memiliki peran

yang penting dalam proses identifikasi. Uji biokimia ini bertujuan untuk

mengetahui aktivitas biokimia dari isolat bakteri lokal KNG.RT1 dan JGEA7

sehingga diketahui sifat-sifat yang khas dari kedua bakteri tersebut serta

mempermudah pengidentifikasian sehingga dapat menentukan genus dari kedua

isolat bakteri lokal tersebut yang dapat menghasilkan fitohormon auksin dan

sitokinin. Selain itu, diharapkan pula dari hasil uji biokimia ini tidak hanya dapat

42

memproduksi fitohormon saja, tetapi juga dapat memproduksi senyawa lain yang

dapat diaplikasikan pada bidang-bidang yang lainnya.

Hasil pengamatan dari ketujuh uji biokimia (lihat tabel 2.) memperlihatkan

kemiripan/kesamaan hasil reaksi antara isolat bakteri lokal KNG.RT1 dengan

JGEA7. Kedua isolat bakteri menunjukkan hasil yang positif terhadap uji katalase,

uji Fermentasi Karbohidrat, uji hidrolisis pati, uji indol, uji MR (Methyl Red), uji

Reduksi nitrat, dan menunjukkan hasil negatif terhadap uji VP (Voges Proskeuer).

Tabel 2. Hasil uji biokimia isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7

No Uji Biokimia Isolat

KNG.RT1

Isolat

JGEA7

1. Katalase + +

2. Fermentasi Karbohidrat

a. Fermentasi Glukosa + +

b. Fermentasi Sukrosa + +

c. Fermentasi Laktosa + +

d. Fermentasi Maltosa + +

3. Hidrolisis Pati + +

4. Indol + +

5. Methyl Red + +

6. Voges-Proskauer - -

7. Reduksi Nitrat + +

Berdasarkan tabel hasil uji katalase, kemampuan isolat bakteri KNG.RT1

dan JGEA7 dalam menguraikan H2O2 ditunjukkan pada uji katalase yang

memberikan hasil uji positif, hasil positif ini ditandai dengan terbentuknya

gelembung udara (oksigen) dan air. Hal ini membuktikan bahwa kedua isolat

bakteri tersebut mampu menghasilkan enzim katalase yang dapat digunakan pada

reaksi penguraian hydrogen peroksida (H2O2) menjadi oksigen bebas dan air.

43

H2O + O2(g) H2O2

Gambar 6 . Hasil Uji Fermentasi Karbohidrat pada Isolat KNG.RT1 dan JGEA7

Ket. Gambar : 1 = Isolat KNG.RT1, 2 = Isolat JGEA7, K = Kontrol

Menurut Fardiaz (1992), bakteri yang mampu menghasilkan enzim

katalase adalah kelompok bakteri aerobik dan anaerobic aerotoleran. Hasil ini

membuktikan isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7 termasuk kedalam bakteri

aerobik.

Reaksi kimia yang terjadi pada uji katalase terhadap kedua bakteri uji

(KNG.RT1 dan JGEA7) yaitu :

(Volk dan Wheeler, 1993).

Sifat karakteristik suatu spesies mikroba antara lain adalah daya

fermentasinya terhadap gula-gula (dekstrosa, laktosa, sukrosa, hidrolisis pati).

Sifat-sifat ini dapat membantu identifikasi dan determinasi bakteri, karena gula

dapat difermentasikan menjadi bermacam-macam zat seperti alkohol, asam, dan

gas, tergantung macam gula dan spesies.

Media Glukosa Media Sukrosa Media Laktosa Media Maltosa

1 2 K 1 2 K 1 2 K 1 2 K

44

Gambar 7 . Hasil Uji Hidrolisis pati pada Isolat KNG.RT1 (A) dan JGEA7 (B)

Hasil uji fermentasi karbohidrat pada isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7

yang ditumbuhkan pada media glukosa, sukrosa, lakstosa dan maltosa

menunjukkan bahwa kedua isolat bakteri tersebut dapat memfermentasikan

karbohidrat (lihat gambar 6). Hal ini ditandai dengan terjadi perubahan warna

media biakan menjadi lebih kuning dari kontrol, akan tetapi tidak terbentuk gas

pada tabung durham.

Isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7 memberikan hasil uji positif pada uji

hidrolisis pati. Keberadaan pati/amilum yang terhidrolisis dalam media pati pada

kedua isolat ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening disekitar daerah

pertumbuhan bakteri setelah diberi beberapa tetes larutan iodium. Hal ini

menunjukkan bahwa isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7 dapat menghidrolisis

pati.

Pada hidrolisis pati, enzim yang berperan adalah -amilase yang bekerja

memutuskan ikatan dengan konfigurasi α pada pati. Hasil hidrolisis pati oleh

enzim -amilase yang berasal dari bakteri yang berbeda akan menghasilkan

produk akhir yang berbeda pula. Bakteri jenis Bacillus amyloliquefaciens dan

Bacillus subtilis menghasilkan produk akhir berupa maltosa, glukosa dan

maltooligosakarida. Bacillus licheniformis menghasilkan maltosa, maltotriosa dan

A B

45

Gambar 8 . Hasil Uji MR (kiri) dan uji VP (kanan) pada Isolat KNG.RT1 dan JGEA7

maltopentosa. Streptomyces hygroscopicus dan Thermoactinomyces vulgaris

menghasilkan maltosa. Acinetobacter sp menghasilkan maltosa dan maltotriosa

(Suhartono, 1999).

Isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7 memberikan hasil uji positif pada uji

MR (Methyl Red) yang ditandai dengan perubahan warna dari kuning menjadi

orang hingga merah setelah penambahan reagen merah metil. Hal ini memberikan

informasi bahwa kedua isolat bakteri tersebut mampu menghasilkan asam

campuran.

Isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7 memberikan hasil uji negatif pada uji

VP (Voges Proskauer) yang ditandai dengan tidak terjadi perubahan warna dari

kuning menjadi orang hingga merah setelah penambahan reagen Barit A dan Barit

B. Hal ini memberikan informasi bahwa kedua isolat bakteri tersebut tidak

mampu menghasilkan asetoin dan 2,3-butanadiol. Menurut Lay (1994), hasil uji

VP (Voges Proskauer) akan bereaksi positif apabila terjadi perubahan warna pada

KNG.RT

1

JGEA7 Kontrol KNG.RT

1

JGEA7 Kontrol

46

Gambar 9 . Hasil Uji Indol pada Isolat KNG.RT1 dan JGEA7

media uji dari kuning menjadi orange hingga merah setelah ditambahkan Barit A

dan Barit B.

Kedua isolat bakteri (KNG.RT1 dan JGEA7) memberikan hasil uji positif

terhadap uji indol, hasil positif ini ditandai dengan terbentuknya cincin berwarna

merah pada biakan setelah diberi reagen Ehrlich. Hal ini menunjukkan bahwa

kedua isolat bakteri tersebut mampu menghasilkan enzim triptonase yang dapat

mengkatalisis reaksi pemecahan triptofan menjadi indol, asam piruvat dan

amonia.

Triftopan telah diakui sebagai prekursor fisiologis biosintesis auksin dan

sitokinin baik pada tanaman maupun pada mikroorganisme (Tarabily et al., 2003).

Dan juga merupakan prekursor fisiologis yang efisien dalam proses biosintesis

mikrobial auksin. Prekursor ini mengandung sumber berupa senyawa aktif yang

memacu pertumbuhan mikroba rizosfer dan endofit (Arshad et al., 1995). Dan

biosintesis mikroba IAA dalam tanah dapat di pacu dengan adanya triptofan yang

berasal dari eksudat akar atau sel-sel yang rusak (Arshad & Frankerberger, 1991).

KNG.RT

1

JGEA7 Kontrol

Terbentuk

Lapisan merah

47

Kelompok bakteri yang dapat menghasilkan enzim triftopan dengan

mensintesisnya menjadi auksin yang bermanfaat bagi pertumbuhan tanaman

secara langsung adalah kelompok penghasil zat pengatur tumbuh. Kelompok ini

berperan penting pada pertanian diwilayah tropis. Beberapa strain bakteri dari

genus Azospirillum memiliki kemampuan phytostimulatori (merangsang

pertumbuhan tanaman). Hal ini disebabkan karena bakteri tersebut mampu

memproduksi fitohormon, yaitu IAA (Akbari et al., 2007).

Hasil uji reduksi nitrat pada isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7

memberikan hasil uji positif yang ditandai dengan perubahan reaksi pada media

biakan dari kuning menjadi merah setelah ditambahkan reagen asam sulfanilat dan

asam naftilamin. Hal ini menunjukkan bahwa kedua isolat bakteri tersebut selain

dapat menggunakan nitrat (NO3-) sebagai akseptor elektron terakhir dalam sistem

transfortasi elektron dengan mereduksinya menjadi nitrit (NO2-) dengan katalis

enzim nitrase.

NO3- + 2e

- + 2H

+ NO2- + H2O

Terbentuk Gas

Gambar 10 . Hasil Uji Reduksi Nitrat pada Isolat KNG.RT1 dan JGEA7

Terbentuk gas

48

Pada hasil uji reduksi nitrat terhadap kedua isolat, juga dihasilkan gas pada

tabung durham. Menurut Lay (1994), gas dalam tabung durham tersebut

merupakan campuran gas CO2 dan N2. Gas N2 berasal dari penguraian sempurna

nitrat sedangkan CO2 merupakan produk respirasi anaerobik.

2NO2- + 7e- + 8H

+ N2(g) + 4H2O

Ciri-ciri isolat bakteri KNG.RT1 yang diperoleh dari pewarnaan Gram dan

uji biokimia yaitu berjenis Gram negatif, berbentuk batang pendek, tidak

berspora, dapat mereduksi hidrogen peroksida (H2O2) menjadi CO2 dan O2, dapat

memfermentasikan karbohidrat, motilitas (pergerakannya) positif, dapat

menghidrolisis pati, mampu menghasilkan produk asam campuran, tidak mampu

memproduksi asetoin dan 2,3-butanadiol, dapat menguraikan asam amino jenis

triptofan, dan dapat mereduksi nitrat menjadi nitrit dan gas nitrogen serta isolat

bakteri ini termasuk kedalam bakteri aerobik. Dalam Bergey's Manual of

Determinative Bacteriology edisi kesembilan (1994), ciri-ciri isolat bakteri

KNG.RT1 tersebut cenderung mengarah pada ciri-ciri grup 4 (kelompok bakteri

aerob) yang tergolong Famili Pseudomonadaceae dan kemungkinan termasuk

kedalam genus Pseudomonas.

Berdasarkan hasil pewarnaan Gram dan hasil uji biokimia, ciri-ciri isolat

bakteri JGEA7 yakni berjenis Gram positif, berbentuk batang pendek, bermotil,

membentuk endospora, dapat memecah H2O2, dapat memfermentasikan

karbohidrat, mampu menghidrolisis pati, menghasilkan produk asam campuran,

tidak dapat menghasilkan asetoin dan 2,3-butana diol, dapat menguraikan asam

49

amino jenis triptofan, dan dapat mereduksi nitrat menjadi nitrit dan gas nitrogen

serta temasuk bakteri aerobik. Dalam Bergey's Manual of Determinative

Bacteriology edisi kesembilan (1994), ciri-ciri isolat bakteri JGEA7 cenderung

mengarah pada ciri-ciri grup 18 (bakteri Gram positif, pembentuk endospora,

batang dan kokus) yang tergolong famili Bacilliaceae, dan genus Bacillus.

4.4. Analisis Molekular dari isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7

4.4.1. Amplifikasi Gen 16s rRNA

Identifikasi secara analisis molekular pada isolat bakteri lokal KNG.RT1

dan JGEA7 dilakukan dengan metode identifikasi berdasarkan urutan 16S-rRNA.

Identitas bakteri hasil identifikasi secara molekuler akan semakin memperkuat

dan membuktikan dugaan identitas isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7 hasil

karakterisasi morfologi dan uji aktivitas secara biokimia. Alasan yang digunakan

untuk memanfaatkan urutan 16S-rRNA ini adalah karena molekul rRNA

mengandung urutan yang sangat konservatif secara evolusi. Daerah yang sangat

konservatif dapat digunakan sebagai situs pelekatan primer sehingga dapat

diamplifikasi secara in vitro dengan PCR (Han et al., 2002).Urutan yang lebih

beragam dari molekul 16S-rRNA sangat cocok untuk membedakan suatu

organisme ke dalam taksa yang lebih rendah seperti genus dan spesies (pangastuti,

2006). Urutan 16S rRNA ini juga menyediakan data yang secara statistik cukup

valid (Amann et al., 1995).

Analisis PCR gen penyandi 16s rRNA dilakukan dengan menggunakan

elektroforesis gel. Dalam tahap ini keberadaannya dapat dideteksi dengan melihat

apakah ada pita yang terbentuk pada ukuran basa tertentu sesuai jenis dan

50

besarnya sekuen gen. Elektroforesis gel merupakan salah satu alat untuk

mengetahui pemisahan asam nukleat atau protein berdasarkan ukuran dan muatan

listriknya, dengan cara mengukur laju pergerakan melalui suatu medan listrik

dalam suatu gel (Campbell et al., 2002).

Gambar 11. Hasil purifikasi PCR produk dalam gel agarosa 1% pada

isolat bakteri KNG.RT1 (A/Kiri) dan JGEA7 (B/kanan)

Pada isolat bakteri KNG.RT1 dan JGEA7, DNA genom yang diperoleh

kemudian dijadikan sebagai template PCR dengan menggunakan primer 9F (5’-

GAG TTT GAT CCT GCC TCA G-3’) dan 1541R (5’-AAG GAG GTG ATC

CAG CC-3’), (primer spesifik gen penyandi 16s rRNA). Hasil PCR dilihat dengan

menggunakan elektroforesis. Dari hasil elektroforesis, isolat KNG.RT1 dan

JGEA7 memperlihatkan pita DNA yang berada pada 1500 bp. Pita DNA pada

1500 bp menunjukkan adanya gen penyandi 16S rRNA (Hart et al., 2003).

Pergerakan DNA dalam elektroforesis ditentukan oleh kuat arus, besar molekul

DNA, dan bentuk molekul DNA yang digunakan (Viljoen et al., 2005).

M = Marker

1 = Sampel

2 = Kontrol (+)

3 = Kontrol (-)

M

A

1 2 3

A B

51

4.4.2. Sikuen Gen 16S rRNA isolat bakteri lokal KNG.RT1 dan JGEA7

Urutan sikuen gen 16s rRNA isolat bakteri lokal KNG.RT1 dan JGEA7

merupakan hasil sikuen dari dua arah, arah ujung forward menggunakan primer

9F (5’-GAG TTT GAT CCT GCC TCA G-3’) dan primer 1541R (5’-AAG GAG

GTG ATC CAG CC-3’) untuk arah sebaliknya (reverse). Prinsip kerja mesin

sikuenser (Automated DNA sequencing) yang digunakan untuk mengetahui sikuen

gen 16S rRNA isolat bakteri lokal KNG.RT1 dan JGEA7 merujuk pada metode

Reece (2004).

Tabel 3. Urutan nukleotida gen 16s rRNA isolat bakteri KNG.RT1 dalam format

FASTA Hasil Sikuen gen 16s rRNA

No. Gen 16s rRNA Sikuen

1. Isolat Bakeri

KNG.RT1 arah

Forward

>326747_ISOLAT_01_9F

NNNNNNNNNGNNGCTACACATGCAAGTCGAGC

GGATGAGTGGAGCTTGCTCCATGATTCAGCGGC

GGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGG

TAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTA

ATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTGGGG

GATCTTCGGACCTCGCGCTATCAGATGAGCCTA

GGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTC

ACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGG

ATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCC

AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATT

GGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCC

GCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGC

ACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAAT

ACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAG

CACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAA

TACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTG

GGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTT

GGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACT

GCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGCAG

52

AGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAAT

GCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAA

GGCGACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGT

GCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATA

CCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACT

AGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCA

GCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTAC

GGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGG

GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAA

TTCNAAGCANCGCGAAGAACCTTACCAGGNNTT

GACATGCANNNAACTTTCCAGANATGGATTGGT

TGCCTTCGGAACTCTGACACNNNGCTNCATGGC

TGTCGTCAGCTCGTGNCNTGNNNTNNTTNGGTT

ANTCCCNNAACNANCGCAACCCTTNNNCNTTAN

NTTACCAGCNNCNTTTANNGNNGGGCACNCTNC

NNNN

2. Isolat Bakeri

KNG.RT1 arah

Reverse

>326748_ISOLAT_01_1541R

GGCAAGCTCTTGTACGACTTCCCCCAGTCATGA

ATCACTCCGTGGTAACCGTCCCCCCGAAGGTTA

CACTACCTACTTCTGGAGCAACCCACTCCCATG

GTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAA

CGTATTCACCGTGACATTCTGATTCACGATTACT

AGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGA

CTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGAT

TAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTTTGTAC

CGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGT

AAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCT

TCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGT

GCCCACCTTAACGTGCTGGTAACTAAGGACAAG

GGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATC

TCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCAC

CTGTGTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATC

TCTGGAAAGTTCTCTGCATGTCAAGGCCTGGTA

AGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACAT

GCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCA

TTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGG

Lanjutan Tabel 3. Urutan nukleotida gen 16s rRNA isolat bakteri KNG.RT1

dalam format FASTA Hasil Sikuen gen 16s rRNA

53

CGGTCGACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAG

ATCTCAAGGATCCCAACGGCTAGTCGACATCGT

TTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTG

TTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGT

ATTAGCCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGT

TCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACA

GGAAATTCCACCACCCTCTGCCATACTCTAGCT

CGCCAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCC

CGGGGCTTTCACATCCAACTTAACGAACCACCT

ACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAAC

GCTTGCACCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGC

ACGAAAGTTAGCCCGGTGCTTATTCTGTTGGTA

ACGTCAAAACAGCAAGGTATTAACTTACTGCCC

TTTCCTCCCAACTTAAAAGTGGCTTTTACAATCC

CGAAAAACCTTC

Urutan nukleotida gen 16S rRNA isolat bakteri lokal KNG.RT1 dari arah

forward dan reverse yang terbaca oleh komputer (menggunakan program BioEdit

Sequence Alignment Editor) menunjukkan komposisi G+T dan A+T yang cukup

tinggi. Sikuen gen 16S rRNA isolat bakteri lokal KNG.RT1 yang disikuensing

dari arah forward menggunakan primer 9F memiliki 1060 nukleotida dengan

persentase komposisi G+C sebesar 52,92% dan A+T sebesar 47,07%, sedangkan

untuk arah reverse mengunakan 1541R memiliki 1113 nukleotida dengan

persentase komposisi G+C sebesar 52,92% dan A+T sebesar 47,07%.

Lanjutan Tabel 3. Urutan nukleotida gen 16s rRNA isolat bakteri KNG.RT1

dalam format FASTA Hasil Sikuen gen 16s rRNA

54

Tabel 4. Urutan nukleotida gen 16s rRNA isolat bakteri JGEA7 dalam format

FASTA Hasil Sikuen gen 16s rRNA

No. Gen 16s rRNA Sikuen

1. Isolat Bakteri JGEA7

dari arah Forward

>326749_ISOLAT_02_9F

GGCCAGGCGGCGGCTAATACATGCAAGTCGAG

CGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGC

GGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTG

CCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGA

GCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGT

TCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTA

CAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTG

AGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAG

CCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGAC

TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAG

CAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCT

GACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTT

TCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAAC

AAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGT

ACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCC

AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT

GTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGG

CGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGC

TCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAA

CTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCAC

GTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGG

AACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGT

AACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGC

GAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG

TAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCC

GCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCAC

TCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAAC

TCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAACCGG

TGGGAGCATGTGGTTTTAATTCCAAAGCCACCC

CGAAAAAACCTTACCAGGTCTTGGACATCCTCT

GGACAACCCCTAGAGATAAGGGGCTTTCCCCTT

CGGGGAAAAGAATTGACAAGGGGGGGGGCAAT

GGGTTTGCCGTCCCCCC

55

2.

Isolat Bakteri JGEA7

dari arah Reserve

>326750_ISOLAT_02_1541R

CCAGATGCTCTTGTTCGACTTCACCCCAATCATC

TGCCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGT

TACCTCACCGACTTCGGGTGTTGCAAACTCTCGT

GGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGA

ACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTA

CTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCA

GACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGG

ATTGGCTAAACCTTGCGGTCTCGCAGCCCTTTGT

TCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTC

ATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCAC

CTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGA

GTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGATCAAG

GGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATC

TCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCAC

CTGTCACTCTGTCCCCGAAGGGAAAGCCCTATC

TCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTA

AGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACAT

GCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCT

TTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGC

GGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGG

GGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGT

TTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTG

TTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGT

TACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGT

TCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACG

TGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTT

CCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCG

GGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTG

CGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACG

CTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCA

CGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGT

CAAGGTGCAAGCAGTTACTCTTGCACTTGTTCTT

CCCTAACAACAAAAGCTTTACGATCCGAAAACC

TTCATCACTC

Lanjutan Tabel 4. Urutan nukleotida gen 16s rRNA isolat bakteri JGEA7 dalam

format FASTA Hasil Sikuen gen 16s rRNA

56

Urutan sikuen gen 16S rRNA isolat bakteri lokal JGEA7 yang

disikuensing dari arah forward menggunakan primer 9F memiliki 1261 nukleotida

dengan persentase komposisi G+C sebesar 62,72% dan A+T sebesar 37,27%,

sedangkan untuk arah reverse mengunakan 1541R memiliki 1106 nukleotida

dengan persentase komposisi G+C sebesar 53,88% dan A+T sebesar 46,11%.

Menurut Logan et al. (2006), gen 16S rRNA memiliki nilai persentase G+C yang

tinggi. Nilai persentase G+C dari keempat sikuen (KNG.RT1 dan JGEA7) dari

arah forward dan reverse masing-masing cukup tinggi ( >50%), hal ini

menandakan bahwa sikuen tersebut merupakan sikuen gen 16S rRNA.

Sikuen gen 16S rRNA dari isolat bakteri lokal KNG.RT1 dan JGEA7

masih harus diolah kembali menggunakan analisis contig menggunakan program

BioEdit untuk mengetahui urutan sikuen yang terbaca dari kedua arah (forward

dan reverse) oleh mesin sikuenser.

Tabel 5. Hasil Urutan sikuen parsial gen 16s rRNA isolat bakteri KNG.RT1 dan

JGEA7 hasil contig menggunakan program BioEdit dalam format

FASTA

No. Gen 16s rRNA Sikuen

1. Isolat Bakteri Lokal

KNG.RT1

>Contig-0_Isolat_KNG.RT1

NNNNNNNNNGNNGCTACACATGCAAGTCGAG

CGGATGAGTGGAGCTTGCTCCATGATTCAGCG

GCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCC

TGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACG

CTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTG

GGGGATCTTCGGACCTCGCGCTATCAGATGAG

CCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAA

GGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCT

GAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGAC

57

ACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGG

GGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCC

AGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTTCG

GGATTGTAAAAGCCACTTTTAAGTTGGGAGGA

AAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGAC

GTTACCAACAGAATAAGCACCGGGCTAACTTT

CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGC

AAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCG

CGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAA

GCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAA

ACTGGCGAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTG

GAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAT

ATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACC

ACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAA

GCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGG

TAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCG

TTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTA

ACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGC

CGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGG

GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAT

TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTT

GACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGG

TTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCAT

GGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGNTTG

GGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTC

CNTTAGNTTACCAGCANCGTTTAANGGTGGGC

ACNCTNCNNNNTAAGGAGACTGCCGGTGACAA

ACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAT

CATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGC

TACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCG

CGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGT

AGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGT

GAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGA

ATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTAC

ACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGC

TCCAGAAGTAGGTAGTGTAACCTTCGGGGGGA

CGGTTACCACGGAGTGATTCATGACTGGGGGA

AGTCGTACAAGAGCTTGCC

Lanjutan Tabel 5. Hasil Urutan sikuen parsial gen 16s rRNA isolat bakteri

KNG.RT1 dan JGEA7 hasil contig menggunakan program

BioEdit dalam format FASTA

58

2.

Isolat bakteri Lokal

JGEA7

>Contig-0_isolat_JGEA7

GGCCAGGCGGCGGCTAATACATGCAAGTCGAG

CGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAG

CGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCT

GCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCG

GAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCAT

GGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCA

CTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGT

TGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATG

CGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC

TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG

AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACG

AAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAT

GAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTTGTTGTTA

GGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCA

CCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCT

AACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG

GTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTA

AAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATG

TGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCAT

TGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGG

AGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGC

GTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAG

GCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGA

GCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGAT

ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG

CTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCT

GCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGA

GTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATT

GACGGGGGCCCGCACAACCGGTGGGAGCATGT

GGTTTTAATTCCAAAGCCAACCCGAAAAAACC

TTACCAGGTCTTGGACATCCTCTGGACAACCCC

TAGAGATAAGGGGCTTTCCCCTTCGGGGAAAA

GAATTGACAAGGGGGGGGGCAATGGGTTTGCC

GTCACCCCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTC

CCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGC

CAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGC

CGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGAC

Lanjutan Tabel 5. Hasil Urutan sikuen parsial gen 16s rRNA isolat bakteri

KNG.RT1 dan JGEA7 hasil contig menggunakan program

BioEdit dalam format FASTA

59

GTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTA

CACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCT

GCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAA

TCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTC

GACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGC

GGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGG

GCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGA

GTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCT

TTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGCAGAT

GATTGGGGTGAAGTCGAACAAGAGCATCTGG

Setelah diketahui urutan nukleotida yang terbaca dari dua arah, selanjutnya

akan diperoleh urutan sikuen parsial gen 16S rRNA yang berhasil diamplifikasi

secara utuh. Setelah dianalisis lebih lanjut, diketahui bahwa sikuen gen parsial

16S rRNA isolat bakteri lokal KNG.RT1 berukuran 1467 pasang basa dengan

persentase G+C sebesar 53,78% dan A+T sebesar 46,22%, sedangkan sikuen gen

parsial 16S rRNA isolat bakteri lokal JGEA7 berukuran 1472 pasang basa dengan

persentase G+C sebesar 55,09% dan A+T sebesar 44,9%.

4.4.3. Analisis Bioinformatika Sikuen Gen 16s rRNA Isolat Bakteri Lokal

KNG.RT1 dan JGEA7

Urutan sikuen gen 16S rRNA isolat bakteri lokal KNG.RT1 dan JGEA7

hasil sikuensing dari dua arah (forward dan reverse) selanjutnya dianalisis

bioinformatika secara online menggunakan program BLASTN pada situs

“GeneBank” di alamat Website http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST/blast.cgi.

Analisis bioinformatika yang pertama dilakukan yakni penyejajaran sikuen

(aligment) dengan database sikuen gen 16S rRNA yang ada pada “GeneBank”.

Lanjutan Tabel 5. Hasil Urutan sikuen parsial gen 16s rRNA isolat bakteri

KNG.RT1 dan JGEA7 hasil contig menggunakan program

BioEdit dalam format FASTA

60

Secara otomatis program BLASTN akan memproses penyejajaran data sikuen

yang dimasukan (subject) dengan data sikuen yang ada pada database (Query).

Tampilan hasil analisis bioinformatika sikuen “Subject” (sikuen gen 16S rRNA)

denga sikuen “Query” divisualisasikan dalam bentuk grafik kesesuaian sikuen,

skor penyejajaran sikuen, kemiripan dengan sikuen database dan tampilan

penyejajaran sikuen dengan database. Tampilan hasil analisis bioinformatika

menggunakan program BLASTN pada isolat bakeri lokal KNG.RT1 dan

JGEA7dapat dilihat pada Lampiran 7. Dari tampilan tersebut kita bisa mengetahui

identitas spesies bakteri spesifik yang kemiripannya cukup tinggi dengan gen 16S

rRNA subjek.

Hasil analisis bioinformatika untuk sikuen parsial 16s rRNA isolat bakteri

lokal KNG.RT1 dan JGEA7 (reverse dan forward) memperlihatkan kesamaan

yang tinggi antara sikuen subjek dengan sikuen yang ada pada database. Hal ini

ditunjukkan dengan grafik hasil penyejajaran sikuen yang berwarna merah untuk

kedua sikuen gen (Lampiran 6). Dari hasil penyejajaran gen 16s rRNA isolat

bakteri lokal KNG.RT1 diketahui bahwa bakteri yang dianalisis merupakan

spesies Pseudomonas stutzeri dengan berbagai strain yang presentasi identitas

kemiripannya cukup tinggi. Srain yang paling mirip adalah Pseudomonas stutzeri

16S ribosomal RNA gene, partial sequence, Accession Number FJ768951.1 yang

memiliki presentasi identitas kemiripan 98% dan angka kemungkinan

ketidakmiripan (E value) sama dengan 0,0. Hal ini menunjukkan bahwa gen yang

dianalisis benar-benar merupakan gen parsial 16S rRNA milik bakteri

61

Pseudomonas stutzeri. Hasil analisis bioinformatika sikuen gen 16S rRNA bakteri

lokal KNG.RT1 dapat diihat pada tabel 6 .

Tabel 6. Hasil analisis bioinformatika gen 16S rRNA isolat bakteri lokal

KNG.RT1

Hasil penyejajaran sikuen untuk gen 16S rRNA isolat bakteri lokal JGEA7

menunjukkan bahwa bakteri yang dianalisis merupakan spesies Bacillus sp.

dengan berbagai strain yang presentasi identitas kemiripannya cukup tinggi.

Strain yang paling mirip adalah Bacillus sp. TSH22w gene for 16S ribosomal

RNA, partial sequence, Accession Number AB508850.1 yang memiliki persentase

identitas kemiripan 98% dan angka kemungkinan ketidakmiripan (E value) sama

dengan 0,0. Hasil analisis bioinformatika sikuen gen 16S rRNA bakteri JGEA7

daat dilihat pada tabel 7.

62

Tabel 7. Hasil analisis bioinformatika gen 16S rRNA isolat bakteri lokal JGEA7

Menurut Berkeley et al., (2002), persentase kandungan G+C pada sikuen

gen 16S rRNA bakteri Bacillus sebesar 50-55%. Nilai ini cukup sesuai dengan

persentase G+C yang dimiliki sikuen parsial 16S rRNA bakteri lokal JGEA7

yakni sebesar 55,09%. Menurut Lalucat et al., (2006), persentase kandungan G+C

pada sikuen gen 16S rRNA bakteri Pseudomonas stutzeri sebesar 62%.

Hasil identifikasi berdasarkan pengamatan morfologi koloni bakteri,

morfologi sel, aktivitas secara biokimia dan secara analisis molekular dengan

sikuen 16s rRNA, maka diketahui jenis/ spesies dari isolat KNG.RT1 dan JGEA7

serta identitas spesifik dari kedua isolat bakteri tersebut.

63

Jadi, klasifikasi untuk isolat bakteri lokal KNG.RT1 dan JGEA7 adalah

sebagai berikut:

Isolat bakteri lokal KNG.RT1 dan JGEA7 berpotensi diaplikasikan pada

bidang pertanian, dimana kedua isolat ini dapat dimanfaatkan dalam penyuburan

tanaman karena menghasilkan gas nitrogen dan menghasilkan enzim triptonase

yang dapat digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara tumbuhan. Kedua

isolat bakteri lokal tersebut juga dapat diaplikasikan dalam bidang fermentasi

karna mampu menghasilkan asam dari hasil fermentasi karbohidrat. Enzim

amilase yang dihasilkan dari kedua isolat tersebut juga dapat digunakan untuk

produksi fruktosa dari serelia untuk digunakan sebagai bahan diet (Waluyo,

2008).

4.5. Karakteristik Bakteri Pseudomonas stutzeri

Pseudomonas stutzeri adalah bakteri Gram negatif dengan sel berbentuk

batang, bersifat motil dengan flagela tipe polar, aerobik, kemoorganorof, selain itu

Kingdom : Bakteria

Filum : Proteobacteria

Kelas : Gamma Proteobacteria

Ordo : Pseudomonadales

Famili : Pseudomonadaceae

Genus : Pseudomonas

Spesies : P. stutzeri

(Holt., et al. 1994)

Kingdom : Bakteria

Filum : Firmicutes

Kelas : Bacilli

Ordo : Bacillales

Famili : Bacillaceae

Genus : Bacillus

Spesies : Bacillus sp.

(Holt., et al. 1994)

Isolat Bakteri KNG.RT1 Isolat Bakteri JGEA7

64

P. stutzeri merupakan bakteri denitrifikasi, biasanya tumbuh pada media pati dan

maltose dan bereaksi negatif dalam hidrolisis arginin dan hidrolisis glikogen, serta

memiliki kandungan G+C sebesar 62% (Lalucat et al.,2006) .

Yang menarik dari bakteri ini adalah kemampuannya dalam menghasilkan

hormon IAA yang tinggi (Picard & Bosco, 2005). Berdasarkan berbagai penelitian

sebelumnya, bakteri Pseudomonas stutzeri ini telah diketahui merupakan anggota

bakteri rhizosfer pemacu pertumbuhan tanaman (Dey et al., 2004). Menurut

Lalande et al. (1989), Pseudomonas sp. mampu menghasilkan hormon pemacu

pertumbuhan tanaman yang dapat meningkatkan berat kering tanaman jagung

mencapai 9%,

4.6. Karakteristik Bakteri Bacillus sp.

Menurut Holt., et al (1994), Bacillus sp. adalah bakteri Gam + dan biasa

moril oleh flagel peritrikus. Endospora oval, kadang-kadang bundar atau silinder

dan sangat resisten pada kondisi yang tidak menguntungkan. Bakteri ini dapat

ditemukan dan dapat diisolasi dari tanah. Bentuk endospora merupakan nilai lebih

bagi bakteri yang sangat terkait secara ekologi di dalam tanah. Kemampuannya

membentuk endospora menyebabkan bakteri ini relative lebih tahan terhadap

kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan dan kritis misalnya radiasi,

panas, asam, desinfektan, kekeringan, nutrisi yang terbatas, dan dapat dorman

dalam jangka waktu yang lama hingga bertahun-tahun. Struktur spora tidak akan

terjadi jika sel sedang berada pada fase pembelahan secara eksponensial tetapi

akan dibentuk terutama pada kondisi nutrisi esensial misalnya karbon dan

65

nitrogen terbatas (Madigan et al., 2009). Mereka tidak lebih dari satu spora per sel

dan sporulasi tidak tahan pada udara terbuka. Bakteri ini bersifat aerobik atau

fakultatif anaerob. Kemampuan fisiologis sangat beragam; sangat peka terhadap

panas, pH dan salinitas; kemorganotrof dengan metabolisme fermentasi atau

pernapasan (Wahyudi et al., 2011).

Selain itu, Bacillus sp. mempunyai sifat katalase positif sehingga mampu

menguraikan peroksida toksik menjadi air dan oksigen. Bacillus sp. termasuk

kelompok PGPR yang banyak memiliki potensi karena mampu memproduksi

IAA, melarutkan fosfat, memsekresi siderofor, dan berperan sebagai agens

biokontrol dengan menginduksi sistem kekebalan tanaman serta menghasilkan

antibiotik (Compant et al., 2005). Pemanfaatan Bacillus sp. Sebagai mikroba

penyubur tanah yang sesuai dengan kondisi tanah dan target peruntukannya

merupakan alternatif untuk meningkatkan kesuburan tanah, efisiensi pemupukan,

produktivitas tanaman, dan mengurangi bahaya pencemaran lingkungan

(Widayanti, 2006).

66

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

a) Hasil identifikasi berdasarkan pengamatan morfologi bakteri, uji biokimia

dan analisis molekular berdasarkan sekuen 16s rRNA, pada isolat bakteri

lokal KNG.RT1 termasuk kedalam genus Pseudomonas, dan memiliki

similariti dengan Pseudomonas stutzeri 16S ribosomal RNA gene, partial

sequence dengan nilai angka kemiripan 98% yang berpotensi sebagai bakteri

penghasil fitohormon auksin. Pada isolat bakteri lokal JGEA7 termasuk

kedalam genus Bacillus, dan memiliki similariti dengan Bacillus sp. TSH22w

gene for 16S ribosomal RNA, partial sequence dengan nilai angka kemiripan

98% yang berpotensi sebagai bakteri penghasil fitohormon sitokinin.

2. Hasil identifikasi berdasarkan pengamatan morfologi bakteri, uji biokimia dan

analisis molekular berdasarkan sekuen gen 16s rRNA, Isolat bakteri lokal

KNG.RT1 memiliki karakteristik yang berbeda dengan isolat bakteri JGEA7.

5.2. Saran

Perlu dilakukan uji fisiologi yang lebih lengkap agar diketahui reaksi-

reaksi yang terjadi sehingga dapat diketahui keragaman dalam aplikasi dari kedua

isolat bakteri tersebut, dan perlu dilakukan pembuatan pohon filogeni untuk

melihat hubungan kekerabatan dengan spesies yang lainnya . Disamping itu perlu

dilakukan aplikasi pada tanaman sehingga diketahui pengaruh isolat bakteri pada

tanaman dengan komposisi yang sesuai.

67

DAFTAR PUSTAKA

Abbass, Z. & Okon, Y. 1993. Plant growth promotion by Azotobacter paspali in

the rhizosphere. Soil Biol. Biochem.28:1075-1083.

Ahmad, F., I. Ahmad, dan M.S. Khan. 2005. Indole acetil acid production by the

indigenous isolat of Azotobacter dan Pseudomonas fluorescent in the

presence and absence od trypthopan. Turk J Biol. 29 : 29-34.

Akbari, G. A., S.M. Arab, H.A. Alikhani, Allahdadi. dan M.H. Arzanesh. 2007.

Isolation and Selection of Indigenous Azospirillum spp. and The IAA of

Superior Strains Effects on Wheat Roots.World Journal of Agricultural

Sciences. 3 (4): 523-529.

Amann, R.I., W. Ludwig, dan K.H. Schleifer. 1995. Identification of uncultured

bacteria. A challenging task for molecular taxonomists. ASM News 60:360-

365.

Amar, A., S. Setiarti, dan S. Lie. 2002. Isolasi dan Identifikasi Bakteri dalam

Badeg Page dari Ponorogo Jawa Timur. Jurnal Biosains. ISSN: 0215-9333.

7 (2): 1-7.

Arshad, M. dan W.T. Frankerberger. 1991. Microbial Production of Plant

Hormones. Plant and Soil. 133(2): 1-8.

Arshad, M., A. Hussain dan A. Shakoor. 1995. Effect of Soil applied L-Tryptofan

on growth and Chemical compotition of Cotton. Journal Plant Nutrition.

18:317-329.

Berkeley, R.C.W., R.Berkeley, P.D.Vos, M. Heyndrickx, dan N. Logan. 2002.

Application and systematics of Bacillus and Relatives. Blackwell Publishing

Company. United Kingdom.

Bottger, S.C. 1996. Approachs for identification of Microorganisms. ASM. News.

62 : 227-250.

Campbell, N.A., J.B.,Reece, dan L.G., Mitchell. 2002. Biologi I. Edisi ke-5.

Erlangga. Jakarta.

Capuccino, J.G dan Sherman, N. 1992. Microbiology a Laboratory Mannual. The

Benjamin/Cummings Publish. USA

Cappuyuns A., I. Smets, K. Bernaerts, O. Ona, J. Somers, E. Prinsen dan J. Van

Impe. 2004. Forward a Model for Indole-3-Acetil Acid (IAA) Production by

Azospirillum brasilense sp254. Croylaan 46, B-3001 Leuven.

Compant,S., B. Duffy, J. Nowak, C. Clement dan E.A. Barkal. 2005. Minireview :

Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant disease :

68

Principles, mechanisms of action, and future prospect. Applies and

Environment Microbiology. 71.(9): 4951-4959.

Constantin, C. 2008. Cereulide Producing Bacillus cereus and amylosin producing

Bacillus subtilis and Bacillus mojavensis : characterization of strains and

toxigenicities. Disertasi Doktor.University of Helsinky.

Dey, R., K.K.,Pay, D.M.,Bhat, dan S.M.,Chauhan. 2004.Growth promotion and

yield enhancement of peanut (Arachis hypogeal L.) by application of plant

growth promotion rhizobacteria . Microbiol Res 159: 371-394.

Drancourt, M. 2000. 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection

of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates. J Clin

Microbiol. 38: 3623-3630.

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Feliatra. 1999. Identifikasi bakteri Patogen (Vibrio sp ) di Perairan Nongsa Batam.

Riau. Jurnal Natur Indonesia. Vol.II.(2) : 28-33.

Glick, B. R. 1995. The enhancement of plant growth by free-living bacteria. Can.

J. Microbiol. 4: 109-117.

Guttel, R.R., N. Larsen, C.R. Woese. 1994. Lesson for Evoluting rRNA, 16S

rRNA and 23S rRNA Strutsfores from a Comparative Perspective Microbes.

Kev 58 : 10-26.

Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek, Teknik Dan

Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka. Jakarta

Hallman, J. 2001. Plant Interaction with Endophutic Bacteria. Biotic Interaction in

Plant-Phatogen Association., 87-119.

Han, X.Y., A.S. Pham, J.J. Tarrand, P.K. Sood, dan R.Luthra. 2002. Rapid and

accurate identification of mycobacteria by sequencing hypervariable regions

of the 16S ribosomal RNA gene. J. Microbiology and Infectious Disease

Am. J. Clin. Pathol. 118(5):796-801.

Hart, H., L.E., Craine, D.J., Hart. 2003. Kimia Organik. Erlangga. Jakarta.

Heddy, S. 1996. Hormon Tumbuhan. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta.

Hidayat, A.N. 2008. Isolasi dan seleksi bakteri penghasil fitohormon Auksin.

Skripsi S1. Institute Teknologi Indonesia. Serpong.

Hindersah, R., M.R.,Setiawati & B.N., Fitriatin. 2001. Pengaruh supernatan

suspensi kultur cair Azotobacter terhadap pertumbuhan bibit tanaman

69

tomat. Laporan Penelitian. Lembaga Penelitian Universitas Padjadjaran.

Bandung.

Hindersah, R., Setiawati, M.R. dan Fitriatin, B.N. 2003. Inokulasi Azotobacter sp.

melalui filosifr dan rizosfir pada pembibitan selada lettuce (Lactuca sativa

L.).Laporan Penelitian. Bandung: Lembaga Penelitian Universitas

Padjadjaran.

Hindersah, R dan T. Simarmata. 2004. Potensi Rizobakteri Azotobacter dalam

Meningkatkan Kesehatan Tanah. Jurnal Natur Indonesia 5(2): 127-133.

Hoflich, G., W. Wiehe, C. Hecht-Buchholz. 1995. Rhizosphere colonization of

different crops with growth promoting Pseudomonas and Rhizobium

bacteria. Microbiol Res 150:139-147.

Holt, JG., Noel, R.K, Peter, H.A, James, T.S, dan Stanley, T.W. 1994. Begey’s

Manual of Determinative Bacteriology. Ninth Edition. Williams &

Wilkins 428 East Preston Street Baltimore, Maryland 21202. USA.

Indarwati, I., R., Safitri, M., Miranti. 2002. Praktikum Mikrobiologi Dasar.

Sumedang. Jurusan Biologi FMIPA UNPAD.

Jawetz, E., J. L. Melnick, dan E.A. Adelberg. 2005. Mikrobiologi Kedokteran.

SalembaMedika. Jakarta.

Kakimoto, T. 2003. Biosynthesis of cytokinins. Journal of Pant Research.

116(3):233-239.

Kloepper, J. W. 1993. Plant growth promoting rhizobacteria as biological control

agent. P. 255-274. In F.B. Meeting, J.R.(Ed.). Soil Microbial Ecology,

Applicationt in Agricultural and Environmental Management. Marcel

Dekker, Inc. New York.

Lalande, R., N. Bissonett, D. Coutlee dan H. Antoon. 1989. Identification of

rhizobacteria from maize and determination of their plant-growth promoting

potential. Plant and Soil. 115: 7-11.

Lalucat, A. Bennasar , R. Bosch, E.García-Valdés, dan N.J. Palleroni. 2006.

"Biology of Pseudomonas stutzeri". Microbiol Mol Biol Rev 70 (2): 510–47.

Lay, W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada.

Jakarta.

Madigan, M. T., Martinko, J.M., Dunlap, P.V, dan Cark, D.P. 2009. Brock

Biology of Microorganism, 12th edition. Pearson Benjamin-Cumming. San

Fransisco. ISBN 0-13-2232460-1.

Marchesi, J. R., T. Sato, A. J. Weightman, T. A. Martin, J. C. Fry, S. J. Hiom, and

W. G. Wade . 1998. Design and evolution of useful bacteria spesific PCR

70

primer that amplify genes coding for bacteria 16S rRNA. Appl Environ

Microbiol 64 : 795-799.

Metting, F.B. 1993. Soil Microbiologi Ecology, Aplication in Agricultural and

Environmental Management. Mercell Dekker Inc. New York.

Pangastuti, A. 2006. Definisi Spesies Prokaryota Berdasarkan Urutan Basa Gen

Penyandi 16s rRNA dan Gen Penyandi Protein. Biodiversitas 7(3): 292-296.

Pelczar, M. J dan E.C.S. Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jilid 1. UI-Press.

Jakarta.

Pelczar, M. J dan E.C.S. Chan. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jilid 2. UI-Press.

Jakarta.

Picard, C., dan M. Bosco. 2005. Maize heterosis effect the structure and dynamics

of indigenous rhizospheric auxins-producing Pseudomonas population.

FEMS Microbiol Ecol 53: 349-357.

Prescott, LM., P.H.,John dan A.K., Donald. 2002. Microbiology 5th

edition.

McGraw-Hill Company. New York.

Reece, R.J. 2004. Analyses of Genes and Genomes. John Willey and Sons Ltd.

United Kingdom.

Schaechter, M. 2004. The Desk Encyclopedia of Microbiology. p-198- 204.

Elseiver Ltd. British LibrarSy

Suhartono, T.P. 1999. Biologi Molekuler Kedokteran. Erlangga University Press.

Surabaya.

Tarabily, K., A.H.Nassar, K. Sivasithamparam. 2003. Promotion of Plant Growth

By an Auxin-producing Isolate of the Yeast Williopsis Saturnus Endophytic

in Maize Roots. The Sixth U.A. E University Research Conference. 60-69.

Teale, W.D., A.P. Ivan dan P. Klaus. 2006. Auxin in Action: Signaling, Transport

and the Control of Plant Growth ang Development. Institut fur Biologie II/

Botanic, Schanzlestrase, 79104 Freiburg.

Taller, B.J. & T.Y.,Wong.1989. Cytokinins in Azotobacter vinelandii culture

medium. Appl Environ Microbiol. 55: 266-267.

Theresiawati, I. 2008. Isolasi dan seleksi bakteri penghasil fitohormon sitokinin.

Skripsi S1. Institute Teknologi Indonesia. Serpong.

71

Vancura, V. 1988. Microorganisms, their mutual relation and function in the

rhizosfer. Didalam Vancura, V dan F, Kunc. (eds.). Soil microbial.

Association Praha : Elsevier.

Viljoen, G.J., L.H.Neland dan J.R. Crowter. 2005. Moleculer Diagnostic PCR

Handbook. Published by Springer, Dodrecht, The Netherlands.

Volk dan Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Erlangga. Jakarta.

Wahyudi, A.T., R.P. Astuti, A. Widyawati, A. Meryandini, dan A.A. Nawangsih.

2011. Characterization of Bacillus sp. strains isolated from rhizosphere of

soybean plants for their use as potential plant growth for promoting

Rhizobacteria. Journal of Microbiology and antimicrobials. Vol. 3(2), page

34-40.

Waluyo, Lud. 2008. Teknik Metode Dasar Mikrobiologi. UMM-Press. Malang.

Wilson, D. 1995. Endophyte-the Evolution of a Term, and Clarification of its use

and Definition. Oikos 73, 274-276.

Widayanti, T. 2006. Isolasi dan karakterisasi Bacillus sp. indigenus penghasil

indol asam asetat asal tanah rhizosfer. Skripsi S1. Dept. Biologi. FMIPA.

IPB. Bogor.

72

LAMPIRAN

Lampiran 1. Kerangka Berpikir

Indonesia: Negara

Agraris (pertanian)

penggunaan akan pupuk

kima yg tinggi

Mengabaikan kesuburan

tanah

Kandungan humus tanah

rendah kualitas tanaman

rendah & tidak ramah lingkungan

Solusi: penggunaan

Pupuk Hayati

(Fitohormon alami)

Identifikasi isolat

bakteri lokal

Pemanfaat bakteri

alam dari

rhizosfer/endofit

Analisis

Morfologi

Uji Aktivitas

bakteri secara

Biokimia

bakteri yg memiliki kemampuan

menghasilkan fitohormon alami

(auksin & sitokinin) kualitas

tanaman baik dan ramah lingkungan

Analisis Molekuler

dengan Sekuen Gen

16s rRNA

KNGRT1

(Isolat bakteri Penghasil

Fitohormon Auksin)

JGEA7

(isolat bakteri penghasil

Fitohormon sitokinin)

73

Lampiran 2. Bagan Kerja

Mengikuti cara kerja yang disebutkan dalam Amar et al., (2002) yang meliputi :

Peremajaan Isolat Bakteri

Isolasi Isolat bakteri

Pewarnaan Gram

Gram Positif Gram Negatif

Uji Katalase

Katalase Negatif Katalase Positif

Bentuk Bakteri

Batang Bulat

Uji Katalase

Pengamatan Spora

Membentuk Spora Tidak Membentuk Spora

Uji Biokimia

Analisis Molekular

Isolat Bakteri Lokal

KNG.RT1 dan JGEA7

74

Lampiran 3. Komposisi Media

1. Nutrient Agar

Pepton 5 gr

Beef Ekstark 3 gr

Agar 15 gr

Dilarutkan dalam 1 liter akuadest

2. Nutrient Broth

Pepton 5 gr

Beef Ekstark 3 gr

Dilarutkan dalam 1 liter akuadest

3. Agar semi Solid

Pepton 5 gr

Beef Ekstark 3 gr

Agar 10 gr

Dilarutkan dalam 1 liter akuadest

4. Trypton Broth

Trypton 100 gr

Dilarutkan dalam 1 liter Akuadest

5. MR-VP medium (Broth)

Pepton 5 gr

Glukosa 5 gr

K2HPO4 5 gr

Dilarutkan dalam 1 liter akuadest

75

6. Medium Nitrat

Pepton 5 gr

Beef Ekstrak 3 gr

KNO3 5 gr

Dilarutkan dalam 100 ml akuadest

7. Starch Agar

Pepton 0,5 gr

Beef Ekstrak 0,3 gr

Soluble Starch 0,2 gr

Agar 1,5 gr

Dilarutkan dalam 100 ml akuadest

76

Lampiran 4. Reagen dan Indikator

a. Merah Metil (uji MR atau Mhetyl Red)

Mehtyl Red 0,2 gr

Dilarutkan dalam 500 ml

b. Reagen Barit (Uji VP atau Voges-Proskauer)

1. Barit A :

α-naphtol 6 gr

dilarutkan dalam 100 ml

2. Barit B :

KOH 16 gr

Dilarutkan dalam 100 ml

c. Reagen Erhlich (Uji Indol)

n-Amyl alcohol 75 ml

HCL pekat 25 ml

p-dimethylamine-benzaldehyde 5 gr

d. Reagen Uji Nitrit

1. Larutan A :

Sulfanilic acid 0,8 gr

5 N acetic acid 100 ml

2. Larutan B :

Dimethyl-α-naphtylamine 0,5 gr

5 N acetic acid 100 ml

77

BIOTRACEBioEdit v ersion 7.0.4.1 (2/13/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_326747_ISOLAT_01_9F.ab1

$

326747_ISOLAT_01_9F

Lane 58

Signal G:1703 A:1879 T:1568 C:1500

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2240 to 16961

Page 1 of 3

10/14/2010

Spacing: 14.7578325271606

N NN NN N NN N

10

G NN G C T A CA C

20

A T G C AA G T C G

30

A G C G G AT G AG

40

T G G AG C T T G C

50

T C CA T G AT T C

60

A G C G G CG G AC

70

G G G TG AG T A A

80

T GC C T A G G A A

90

T C T G C C T G G T

100

AG T G G GG G AC

110

A A

C G T T T C G A

120

A AG G A AC G C T

130

A A TA C C G C A T

140

A C G T C C T AC G

150

GG AG A A AG TG

160

G GG G AT C T T C

170

G G AC C TC GC G

180

C T AT C A G AT G

190

AG C C TA G G T C

200

G G AT TA G C T A

210

G T TG GT G AG G

220

T AA AG GC T C A

230

C C

A A GG CG AC

240

G A T C CG T AA C

250

TG G T C T G AG A

260

GG AT G AT C A G

270

T C A CA C TG G A

280

AC T G AG AC AC

290

G G T C CA G AC T

300

C C T AC GG G AG

310

GC AG CA G TG G

320

G G AAT A T T G G

330

AC A A TG GG CG

340

A A AG C C TG A T

350

C C A

G CC ATG C

360

C GC G T GT GT G

370

A AG A A GGT C T

380

T CG G AT T GT A

390

A AG C A C T T T A

400

AG TTG GG AGG

410

A AGG GC AG T A

420

A GT T AAT A C C

430

T TG C TG T T T T

440

G AC GT TA C C A

450

A CA G A AT A AG

460

CA C CG G C T A A

470

C T T CG

TG C CA

480

G C AG C CG CG G

490

T A AT A C G A AG

500

GG T GC A AG C G

510

T T A AT C G G A A

520

T T A C T G G G C G

530

T A A AG C G C G C

540

G T AG G TG GT T

550

CG T T A AG T TG

560

G AT G TG AA AG

570

C C C C G GG C T C

580

AA C C T G G G A A

590

C T G C

BIOTRACEBioEdit v ersion 7.0.4.1 (2/13/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_326747_ISOLAT_01_9F.ab1

$

326747_ISOLAT_01_9F

Lane 58

Signal G:1703 A:1879 T:1568 C:1500

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2240 to 16961

Page 2 of 3

10/14/2010

Spacing: 14.7578325271606

AT C C A A

600

A A C TG G CG A G

610

C T A G A G T A T G

620

G C A G AG G G TG

630

G TG GA AT T T C

640

C T G TG T AG C G

650

G T G A A AT G C G

660

T A G A T A T A G G

670

A AG G A A C AC C

680

AG TG G CG A AG

690

G C G AC C AC C T

700

G G G C T A A T A

C

710

T G A C A C T G AG

720

G TG C G A A AG C

730

G T G GG G AG C A

740

A A C AG G AT T A

750

G A T A C C C TG G

760

T AG T C C A C G C

770

C G T A A A C G AT

780

G T C G A C T A G C

790

C G T T G G G AT C

800

C T TG AG A T C T

810

T AG TG G C G C A

820

G C T A A C G C A T

830

T A A G T C G A C C

840

G C C TG G G G A G

850

T A C G G C C G C A

860

AG G T T A A A A C

870

T C A A A T G A A T

880

T G A C G G G G G C

890

C C G C A C A A G C

900

G G T G G A G C A T

910

G T G G T T T A A T

920

T C N

A A G C A NC

930

G C G A A G A A C C

940

T T A C C A G G NN

950

T T G A C A T G C A

960

N N N AA C T T T C

970

C A G AN A T GG A

980

T T G G TTG C C T

990

T C G G AA C T C T

1000

G A C A C N N N G C

1010

TN C A

T GG C T G

1020

T C G T C A G C T C

1030

G T G N C N T G N N

1040

N TNN T T N G G T

1050

T A N T CC C N N A

1060

A C N A N C G C AA

1070

CC C T T N NN C N

1080

TT AN N T T A C C

1090

A G C

Lampiran 5

5.1. Elektroforegram hasil sikuensing parsial gen 16s rRNA isolate bakteri

KNG.RT1 dari arah forward

78

BIOTRACEBioEdit v ersion 7.0.4.1 (2/13/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_326747_ISOLAT_01_9F.ab1

$

326747_ISOLAT_01_9F

Lane 58

Signal G:1703 A:1879 T:1568 C:1500

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2240 to 16961

Page 3 of 3

10/14/2010

Spacing: 14.7578325271606

N N C N T TT

1100

A N N G NN G G G C

1110

ACN C T NC N N N

1120

N

BIOTRACEBioEdit v ersion 7.0.4.1 (2/13/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_326748_ISOLAT_01_1541R.ab1

,

326748_ISOLAT_01_1541R

Lane 56

Signal G:603 A:519 T:622 C:665

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2247 to 16961

Page 1 of 3

10/14/2010

Spacing: 14.8664903640747

G G C A A G C T C

10

T TG TA C G AC T

20

T C C C C C A G T C

30

AT G AA T CA C T

40

C C G T G G T AA C

50

C G T CCC C C CG

60

A AGG T TA C AC

70

T AC C T AC T T C

80

T G G AG C A AC C

90

C A C T C C CA T G

100

G TG TG AC G G G

110

CG

G TG TG TAC

120

A AGG C C CG G G

130

A ACG T A T T CA

140

C CG TG ACA T T

150

C TG AT T CA C G

160

A T T AC T AG CG

170

AT T C C G A C T T

180

CAC G C AG T C G

190

AG T TG CA G AC

200

TG CG AT CC G G

210

AC TA C G AT C G

220

G T T T T AT G G G

230

A

T T A G C T C C A

240

C C T CG CG G C T

250

TG GC A AC C C T

260

T TG T A CC G AC

270

C A T T G T A G C A

280

C G TG TG T AG C

290

C CA G G C C GT A

300

AG G G C C A TG A

310

TG A C T TG A CG

320

T C A T C C C C A C

330

C T T C C T C C GG

340

T T T GT CA C CG

350

G C

AG T C TC C T

360

T AG AG TG C C C

370

A C C T T A A CG T

380

G C T GG T A A C T

390

A AG G AC A A GG

400

G T T G CG C T C G

410

T T A CG G G AC T

420

T A A C C C A A C A

430

T C T C A CG AC A

440

CG AG C TG A CG

450

A C AG C C A TG C

460

AG C A C C T G TG

470

T C

Lanjutan 5.1. Elektroforegram hasil sikuensing parsial gen 16s rRNA isolate

bakteri KNG.RT1 dari arah forward

5.2. Elektroforegram hasil sikuensing parsial gen 16s rRNA isolat bakteri

KNG.RT1 dari arah reserve

79

BIOTRACEBioEdit v ersion 7.0.4.1 (2/13/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_326748_ISOLAT_01_1541R.ab1

,

326748_ISOLAT_01_1541R

Lane 56

Signal G:603 A:519 T:622 C:665

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2247 to 16961

Page 3 of 3

10/14/2010

Spacing: 14.8664903640747

G CG C G C T T

940

T A C G C C C A G T

950

A A T T C C G A T T

960

A A C G C T T G C A

970

C C C T T CG T A T

980

T A C C G C GG C T

990

G C T G G C A C G A

1000

AAG T T AG CCC

1010

G G T G C T T A T T

1020

C T G T T G G T A A

1030

C G T C A

A A A C A

1040

G C AA G G T A T T

1050

A A C T T A C T G C

1060

C C T T T C C T C C

1070

C A A C TT A A A A

1080

G TGGC T T T T A

1090

C A A T C C CG AA

1100

A A A C C T TC

BIOTRACEBioEdit v ersion 7.0.4.1 (2/13/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_326748_ISOLAT_01_1541R.ab1

,

326748_ISOLAT_01_1541R

Lane 56

Signal G:603 A:519 T:622 C:665

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2247 to 16961

Page 2 of 3

10/14/2010

Spacing: 14.8664903640747

AG AG T TC C

480

C G A AGG C A C C

490

A A T C C AT C T C

500

TG G A AA GT TC

510

T C TG C AT G T C

520

A AGG C C T GG T

530

A AG GT T C T T C

540

G CG T T G C T T C

550

G AA T T A A A C C

560

A C A T G C T C CA

570

C C G C T T G T G C

580

G GG C C C C C G T

590

C

A AT T C A T T T

600

G AG T T T T A A C

610

C T T G CG G C C G

620

T A C T C C C C AG

630

G CG G T CG A C T

640

T A A T G C G T T A

650

G C T G C G C C A C

660

T A AG A T C T C A

670

AGG AT C C C A A

680

CG G C T A G T CG

690

AC A T C G T T T A

700

C GG C G T G G

A C

710

T A C C A G GG T A

720

T C T A A T C C T G

730

T T TG C T C C C C

740

AC G C T T T CG C

750

A C C T C A G TG T

760

C AG T A T T A G C

770

C C A G G TG G T C

780

G C C T T CG C C A

790

C TG G TG T T C C

800

T T C C T A T A T C

810

T A C G C A T T T C

820

A C C

G C T A C A C

830

A G G A A A T T C C

840

A C C A C C C T C T

850

G C C A T A C T C T

860

A G C T C G C C A G

870

T T T T G G A T G C

880

A G T T C C C A G G

890

T T G A G C C C G G

900

G G C T T T CA C A

910

T C C A A C T T A A

920

C G A A C C A C C T

930

A C

Lanjutan 5.2. Elektroforegram hasil sikuensing parsial gen 16s rRNA isolat

bakteri KNG.RT1 dari arah reserve

80

BIOTRACEBioEdit v ersion 7.0.4.1 (2/13/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_326749_ISOLAT_02_9F.ab1

€¿Ž�

326749_ISOLAT_02_9F

Lane 54

Signal G:1844 A:2020 T:1630 C:1826

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2246 to 16961

Page 1 of 4

10/14/2010

Spacing: 14.7774810791016

GG C CA G G C G

10

GC G G C T AAT A

20

C AT G CAA G T C

30

G AG C G G ACAG

40

AA G G G AG C T T

50

G C T CC C G G AT

60

GT T A G CG G CG

70

G ACG G G TG AG

80

T A ACAC G TG G

90

GT AAC C TG CC

100

TG T AAG AC TG

110

G G AT AA

C T C C

120

G G G A A ACC G G

130

AG C TA AT AC C

140

G G AT AG T T CC

150

T TG A ACC G CA

160

TG G T T CA AG G

170

ATG AA AG ACG

180

G T T T CG G C TG

190

T C A C T TA C AG

200

A TG G AC C C G C

210

G G CG C A T T AG

220

C T A G T TG G T G

230

AG G T A A

C GG C

240

T C AC CA AG G C

250

G AC G ATG C G T

260

AG C CG AC C TG

270

AG AGGG T G AT

280

C G G C C A CA C T

290

G GG ACT G AG A

300

C A CG G C C C A G

310

AC TC C T AC G G

320

G AGG C AG C AG

330

T AG G G A AT C T

340

T CC G C A A TG G

350

AC G A A AG

BIOTRACEBioEdit v ersion 7.0.4.1 (2/13/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_326749_ISOLAT_02_9F.ab1

€¿Ž�

326749_ISOLAT_02_9F

Lane 54

Signal G:1844 A:2020 T:1630 C:1826

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2246 to 16961

Page 2 of 4

10/14/2010

Spacing: 14.7774810791016

T C T

360

G A CG G AG C A A

370

C G C CG C G TG A

380

G TG AT G A AG G

390

TT T T C GG AT C

400

G TA A A GC T C T

410

G T TG T T AGG G

420

A AG A A CA AG T

430

G C A A G AG T A A

440

C TG C T T GC AC

450

C T T G AC G G T A

460

C C T A A C C AG A

470

A AG C C A C G

G C

480

T A A C T A CG T G

490

C C AG C A G C C G

500

CG G T A AT A C G

510

T A GG TG G C A A

520

G CG T T G T C CG

530

G A AT T AT T G G

540

G C G T AA AG G G

550

C T CG C AG G CG

560

G T T TC T T A AG

570

T C T G AT G T G A

580

A AG C C C C CG G

590

C T C AA C C

G G G

600

G A GGG T C AT T

610

G G AA A C T G G G

620

A A A C T TG AG T

630

G C A G A A G A GG

640

AG AG T G G A A T

650

T C C A C G TG T A

660

G C G G TG A A A T

670

G C G T A G AG A T

680

G T G G A G G A A C

690

A C C AG TG G C G

700

A AG G C G A C T C

710

T C

5.3. Elektroforegram hasil sikuensing parsial gen 16s rRNA isolat bakteri

JGEA7 dari arah forward

81

BIOTRACEBioEdit v ersion 7.0.4.1 (2/13/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_326749_ISOLAT_02_9F.ab1

€¿Ž�

326749_ISOLAT_02_9F

Lane 54

Signal G:1844 A:2020 T:1630 C:1826

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2246 to 16961

Page 3 of 4

10/14/2010

Spacing: 14.7774810791016

T G G T C TG T

720

A A C TG A C G C T

730

G A G G AG C G A A

740

AG C G T G G G G A

750

G C G A A C A G G A

760

T T A G A T A C C C

770

T G G T A G T C C A

780

CG C C G T A A A C

790

G A T G AG TG C T

800

A A G TG T T A G G

810

G G G T T T C C G C

820

C C C T T

AG T G C

830

T G C A G C T A A C

840

G C A T T A AG C A

850

C T C C G C C TG G

860

G G A G T A C GG T

870

C G C A AG A C TG

880

A A A C T C AA A G

890

G A A T T G A C G G

900

G G G C C C GC A C

910

A A C C G G TGGG

920

A G C A T G T G G T

930

T

T T AA T T C C A

940

AA G CC A CC CC

950

G A A A A A A C C T

960

T A C C A G G T C T

970

TGG A C A T C C T

980

C TG G A C A A CC

990

C C T A G A G A TA

1000

A GG G G C T T T C

1010

C C C T T C G GG G

1020

A A A AGAA TTG

1030

A CAA GG GG GG

BIOTRACEBioEdit v ersion 7.0.4.1 (2/13/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_326749_ISOLAT_02_9F.ab1

€¿Ž�

326749_ISOLAT_02_9F

Lane 54

Signal G:1844 A:2020 T:1630 C:1826

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2246 to 16961

Page 4 of 4

10/14/2010

Spacing: 14.7774810791016

1040

G GG C AAT GGG

1050

T TT G C CG T C C

1060

CC CC

Lanjutan 5.3. Elektroforegram hasil sikuensing parsial gen 16s rRNA isolat

bakteri JGEA7 dari arah forward

82

BIOTRACEBioEdit v ersion 7.0.4.1 (2/13/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_326750_ISOLAT_02_1541R.ab1

€

326750_ISOLAT_02_1541R

Lane 52

Signal G:1942 A:1758 T:2143 C:2351

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2231 to 16961

Page 1 of 3

10/14/2010

Spacing: 14.8323764801025

C C AG AT G C T

10

C T T GTT C G AC

20

TT CA C C CC AA

30

T CA T C T G C C C

40

CA C C T T CG G C

50

G GC TG G C TC C

60

A TA AA G G T T A

70

C C T CAC CG AC

80

T T CG GG TG TT

90

GC A AA C T C T C

100

G TG G T G TG AC

110

G G G CG G

TG TG

120

TAC AA GG C C C

130

G GG A ACG T A T

140

T C AC CG CG G C

150

ATG C TG A T C C

160

G CG AT T AC TA

170

G CG AT T C CA G

180

C T T CA CG C AG

190

T CG AG T T G CA

200

G AC TG CG AT C

210

CG AA C TG AG A

220

AC AG AT T T G T

230

G GG AT TG

G C T

240

A A A C C T TG CG

250

G T C TCG C AG C

260

CC T T TG T TC T

270

G TC C AT TG T A

280

G C A CG TG TG T

290

A GC C C AGG T C

300

A T A AG GGG C A

310

TG A TG AT T T G

320

AC G T C A T C C C

330

C A C C T T CC T C

340

C GG T TT G T C A

350

C CG G C AG T

C A

360

C C T T AG AG T G

370

C C C A A C T A A A

380

TG C T G G C A A C

390

T A AG A T C A A G

400

G G T T G C G C T C

410

G T TG C GGG A C

420

T T A A C C C A A C

430

A T C T CA CG A C

440

A CG A G C T G AC

450

G A CA A C CA TG

460

C AC C A C C TG T

470

C AC T C T G

BIOTRACEBioEdit v ersion 7.0.4.1 (2/13/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_326750_ISOLAT_02_1541R.ab1

€

326750_ISOLAT_02_1541R

Lane 52

Signal G:1942 A:1758 T:2143 C:2351

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2231 to 16961

Page 2 of 3

10/14/2010

Spacing: 14.8323764801025

T C C

480

C CG A AG GG A A

490

A GC C C T A T C T

500

C T A G GG T T G T

510

C AG AG G AT G T

520

CA AG A C C T G G

530

T A A GG T T C T T

540

C G C G T TG C T T

550

CG A A T T A A A C

560

C A C A T G C T C C

570

A C C G C T T G T G

580

CG G G C C C C C G

590

T C A AT T C

C T T

600

TG A GT T T C A G

610

T C T T G C G A C C

620

G T A C T C C C C A

630

G G C GG A GT G C

640

T T A A T G C G T T

650

A G C T G C A G C A

660

C T A A GG GG C G

670

G A A A C C C C C T

680

A A C A C T T A G C

690

A C T C A T C G T T

700

T A C G G CG T G G

710

A C T A C

C A G GG

720

T A T C T A A T C C

730

T G T T C G C T C C

740

C CA C G C T T T C

750

G C T C C T C A G C

760

G T C A G T T A C A

770

G A C C A G A G AG

780

T C G C C T T CG C

790

C A C T G G TG T T

800

C C T C CA C A T C

810

T C T A CG C A T T

820

T C A C C G C T A C

830

A

CG T GG A A TT

840

C C A C T C T C C T

850

C T T C T G C A C T

860

C A A G T T T C C C

870

A G T T T C C A A T

880

G A C C C T C C C C

890

G G T T G AG C C G

900

GG G G C T T T C A

910

C A T C A G A C T T

920

A A G A A A C C G C

930

C T G CG A G C C C

940

T T T A

5. 4. Elektroforegram hasil sikuensing parsial gen 16s rRNA isolat bakteri JGEA7

dari arah reserve

83

BIOTRACEBioEdit v ersion 7.0.4.1 (2/13/05)

Model 3730

KB.bcp

6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00

File: 1st_BASE_326750_ISOLAT_02_1541R.ab1

€

326750_ISOLAT_02_1541R

Lane 52

Signal G:1942 A:1758 T:2143 C:2351

KB_3730_POP7_BDTv3.mob

?? no 'MTXF' field

Points 2231 to 16961

Page 3 of 3

10/14/2010

Spacing: 14.8323764801025

C G C C C A

950

A T A A T T C C GG

960

A C A A CG C T T G

970

C C A C C T A CG T

980

A T T A C C G C G G

990

C TG C T G G C A C

1000

G T A G T T A G C C

1010

G TGG C T T T C T

1020

G G T T A G G T A C

1030

C G T C A A G G TG

1040

C A A G C A G T T A

1050

C

T C T TG C A C T

1060

T G T T C T T C C C

1070

T A A C A A C A A A

1080

AG C T T T A CG A

1090

T C CG A A A A C C

1100

T T C A T C A C T C

Lanjutan 5.4. Elektroforegram hasil sikuensing parsial gen 16s rRNA isolat

bakteri JGEA7 dari arah reserve

84

Lampiran 6. Hasil Analisis Bioinformatika pada “GeneBank” NCBI

menggunakan program BLASTN

6.1.Hasil Analisis Bioinformatika pada isolat JGEA7 (pada “GeneBank” NCBI

menggunakan program BLASTN

1

2

85

3

4

86

6.2. Hasil Analisis Bioinformatika pada isolat KNG.RT1 pada “GeneBank” NCBI

menggunakan program BLASTN

1

2

87

Ket : 1= identitas sikuen subjek, 2= Gafik Penyejajaran sikuen, 3= Skor

penyejajaran sikuen, 4= Tampilan penyejajaran sikuen antara sikuen subjek

dengan sikuen database (query)

3

4

88

Lampiran 7. Perbandingan Karakteristik Isolat Bakteri Lokal KNG.RT1 dengan

Pseudomonas stutzeri

No Karakteristik Isolat KNG.RT1 Pseudomonas stutzeri

( Holt, J.G .,et al, 1994)

1.

Morfologi Koloni

Pada Media NA: koloni

bkateri berwarna krem,

elevasi datar, menyebar tdk

teratur dan lobat.

Pengecatan Gram Gram – (Gram Negatif) Gam – (Gram negatif)

Bentuk Bakteri Batang pendek, tunggal Batang pendek

Endospora Tidak ada Tidak berspora

Motilitas Motil Motil dengan flagel tipe

polar

Uji Katalase + Katalase positif

Uji Fermentasi

Karbohidrat

- Glukosa

- Sukrosa

- Fruktosa

- Maltosa

Uji Indol + +

Uji Hidrolisis Pati + +

Uji MR +

Uji VP -

Uji Reduksi Nitrat + +

Keterangan : (+) dihasilkan, (-) tidak dihasilkan

-

-

-

- +

+

-

-

89

Lampiran 8. Perbandingan Karakteristik Isolat Bakteri Lokal JGEA7 dengan

Genus Bacillus sp.

No Karakteristik Isolat KNG.RT1 Bacillus sp.

( Holt, J.G . et al., 1994)

1. Morfologi Koloni

Pada media NA: koloni

bakteri berwarna krem,

elevasi datar, penamapkan

dari atas bulat dengan tepi

terserabut dan lobat

2. Pengecatan Gram Gram + (Gram Positif) Gram + (Gram positif)

3. Bentuk Bakteri Batang pendek, tunggal,

sedikit yang berpasangan

Batang

4. Endospora - Ada endospora

- Bentuknya elips

- Posisi spora :

subterminal

- Mengalami

pembekakan

Endospora, terletak di

tengah-tengah, bentuknya

oval, tempat antara tengah

dan ujung, mengalami

pembengkakan.

5. Motilitas Motil Motil

6. Uji Katalase + +

7. Uji Fermentasi

Karbohidrat

- Glukosa

- Sukrosa

- Fruktosa

- Maltosa

8. Uji Indol + +/-

9. Uji Hidrolisis Pati + +/-

10. Uji MR + +/-

11. Uji VP - +/-

12. Uji Reduksi Nitrat + +/-

Keterangan : (+) dihasilkan (-) tidak dihasilkan

-

-

-

-

+/-

90

Lampiran 9. Foto-foto Penelitian

Isolat Murni

Bakteri Lokal

KNG.RT1 (kiri)

dan JGEA7

(kanan)

Alat dan Bahan Pewarnaan Gram pada bakteri

DF kolom / DNA Filter

(Merk: Genaid) Sentifuge (Merk: Eppendorf)

Elektroforesis Kit

(Merk: Genaid)

Genomic DNA Minikit

(Merk: Genaid)