METODE KIMIA KLINIK

TAHAP DASAR I : ORIENTASI

PEMERIKSAAN ADRENOCORTICOTROPIC HORMONE (ACTH)

METODE ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

Presentan : Josua Sinambela

Pembimbing : M.I. Diah Pramudianti, dr.,SpPK (K), M.Sc

Program Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Klinik

Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret

Surakarta

2014

1

Lembar Pengesahan

PEMERIKSAAN ADRENOCORTICOTROPIC HORMONE (ACTH)

METODE ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

Tinjauan Pustaka

Metode Stase Orientasi Kimia Klinik

Dipersiapkan dan disusun oleh

Josua Sinambela, dr

Dipresentasikan pada tanggal

Telah diperiksa dan disetujui oleh Pembimbing:

M.I. Diah Pramudianti , dr.,SpPK (K), M.Sc

NIK. 19760906 201104 2 008 K

Mengetahui

Kepala Bagian Patologi Klinik/Ketua Program Studi Patologi Klinik

Fakultas Kedokteran UNS

Tahono, dr., Sp . PK (K)

NIP 19491112 197609 1 001

i

DAFTAR ISI

Halaman

Halaman Judul…………………………………..……………….…………....Lembar Pengesahan…………………………………………………………...Daftar Isi …………………………………………………………………..….Daftar Gambar …………………………………………………………..……Daftar Tabel…………………………………………………………………...BAB I. PENDAHULUAN………………………………...............................BAB II. PEMERIKSAAN ADRENOCOTICOTROPIC HORMONE (ACTH)

METODE ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)………...….….......................................................................

A. Pra Analitik………………………………………………………..1. Tujuan…………………………………………………………..2. Alat dan Bahan ..………………………..…………....................3. Persiapan Reagen..……………………………………………..

B. Analitik ……………………………………...…….………………1. Persiapan Sampel…………………………………………….....2. Prosedur Pemeriksaan …………….….………………………..

C. Paska Analitik ………………………......………………...............1. Nilai yang Diharapkan.………………………………….…….2. Presisi..…………………………………………..……………..3. Batasan Deteksi (Sensitifitas Analitik) ……………..…………4. Spesifisitas Analitik (Interferensi)…..………………………...5. High Dose Hook Effect………………………………………..6. Linearitas………………………………………………………

BAB III. SIMPULAN ………………………………………………...............Daftar Pustaka ………………………………………………………...............

iii

iiiiv1

44447889

101011121212121415

ii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1.Gambar 2.Gambar 3.Gambar 4.Gambar 5.Gambar 6.

Aksis Hypothalamic-Pituitary-Adrenal……….….…………... Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Reader….....

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Washer….....Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kit…………..Prinsip Pemeriksaan ACTH Metode ELISA…………………Kurva Standar ACTH ELISA ………………………………..

2445

1011

iii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1.Tabel 2.Tabel 3.

Tabel 4.Tabel 5.Tabel 6.Tabel 7.Tabel 8.Tabel 9.Tabel 10.

Penyakit yang Berkaitan dengan Kadar ACTH Abnormal………Perbandingan antara metode RIA dan ELISA…………………Hubungan antara Strip yang Digunakan dan Campuran Antibodi………………………………………………..............Konfigurasi Tes…………………………………..………………Contoh Data Absorbance ELISA ACTH…………………………Presisi Intra Assay ACTH…….………..…………………………..Presisi Inter Assay ACTH……………………………………….Linearitas ACTH………………………………..…………………..Persentase Nilai Recovery ACTH……………………………….Spike dan Recovery ACTH……………………………………………

23

88

111212121313

iv

v

BAB I

PENDAHULUAN

Adrenocorticotropic hormone (ACTH) merupakan hormon polipeptida

yang disekresikan oleh kelenjar pituitary anterior dengan fungsi utama

menstimulasi sintesa dan pelepasan glukokortikoid dari lapisan fasciculata

korteks adrenal. Adrenocorticotropic hormone merupakan komponen penting

dalam aksis hypothalamic-pituitary-adrenal. Bekerja dengan cara berikatan pada

permukaan sel reseptor yang terletak pada sel adrenocortical korteks adrenal

(Kaplan et al., 2010).

Adrenocorticotropic hormone (39 amino acids) berasal dari protein

proopiomelanocortin (POMC) di dalam sel corticotrope. Selain ACTH, POMC

juga menghasilkan beberapa peptida lain termasuk β lipotropin, β endorphin, met-

enkephalin, α melanocyte stimulating hormone (α MSH), dan corticotropin like

intermediate lobe protein (CLIP). Gen POMC distimulasi oleh corticotropin

releasing hormone (CRH), arginine vasopressin (AVP), sitokin pro inflammation

seperti interleukin 6 maupun leukemia inhibitory factor dan diinhibisi oleh

glukokortikoid itu sendiri. Corticotropin releasing hormone (41 amino acid

hypothalamic peptide) yang disintesa di dalam nukleus paraventricular

merupakan stimulator utama sintesa dan pelepasan ACTH. Adrenocorticotropic

hormone memiliki berat molekul 4540 dalton. Sekresi ACTH bersifat pulsatil dan

menunjukkan karakteristik circadian rhythm, mencapai kadar puncak pada pukul

6 pagi dan kadar terendah pada tengah malam. Waktu paruh ACTH di dalam

darah cukup singkat yakni kurang dari 10 menit dan didegradasi di hati dan

diekskresikan melalui ginjal. Konsentrasi ACTH meningkat oleh AVP, stres fisik,

latihan, penyakit akut, dan hipoglikemi yang distimulasi insulin. Hilangnya

umpan balik cortisol seperti pada gagal ginjal primer, tampak pada peningkatan

kadar ACTH yang sangat ekstrim (Larry, 2010).

Steroid ini terlibat dalam pengaturan metabolisme karbohidrat, protein,

dan lemak. Hormon ini penting bagi kehidupan manusia terutama ketika

berhadapan dengan stress biologis seperti tindakan operasi, sakit berat, maupun

1

trauma berat, sekresi cortisol akan meningkat dari 25 mg/hari menjadi 200 sampai

300 mg/hari. Jika cortisol tidak dikeluarkan dalam jumlah yang memadai, pasien

mungkin akan meninggal karena kolapsnya pembuluh darah. Sejumlah besar

glukokortikoid juga memiliki efek anti inflamasi dan imunosupresi (Kaplan et al.,

2010).

Gambar 1. Aksis hypothalamic-pituitary-adrenal (Anonim, 2010)

Beberapa penyakit yang yang berkaitan dengan kadar ACTH yang

abnormal dapat dilihat pada tabel di bawah,

Tabel 1. Penyakit yang berkaitan dengan kadar ACTH abnormal (Kaplan et al., 2010).

Meningkat MenurunAddison’s diseases or primary adrenal

insufficiencyHipopituarism and/or secondary adrenal

insufficiencyCongenital adrenal hyperplasia Adrenal gland tumor

Cushing’s disease Other tumor that produce cortisolMultiple endocrine neoplasia

Gold standard untuk pemeriksaan ACTH adalah dengan menggunakan

metode radio immune assay (RIA). Namun dalam pemeriksaan ACTH ini

menggunakan metode enzime linked immunosorbent assay (ELISA).

2

Perbandingan antara metode RIA dan ELISA dapat dilihat pada tabel di

bawah.

Tabel 2. Perbandingan antara metode RIA dan ELISA dalam mengukur kadar serum ACTH (Unnikrishnan, 2006).

RIA ELISASangat spesifik dan sangat sensitif Sensitif

Menggunakan radio isotop Menggunakan enzimBahan tidak stabil Lebih stabilLebih berbahaya Lebih aman

Lebih mahal Relatif lebih murahMenggunakan alat pemecah radioaktif

gamma (laboratorium lengkap)Dapat dikerjakan di laboratorium kecil

Berisiko tinggi Risiko lebih rendahKalibrasi yang lama (berhari-hari) Kalibrasi dalam waktu lebih singkat

Tidak praktis Lebih praktis

3

BAB II

PEMERIKSAAN ADRENOCORTICOTROPIC HORMONE (ACTH)

METODE ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

A. Pra analitik (Anonim, 2011)

1. Tujuan

Pemeriksaan ini bertujuan untuk mengukur secara kuantitatif ACTH

dalam plasma ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) yang berguna

dalam mendeteksi peningkatan dan penurunan konsentrasi ACTH

dengan metode ELISA (two-site sandwich technique) menggunakan

antibodi spesifik yang berikatan dengan terminal N dan terminal C

epitope ACTH.

2. Alat dan Bahan

a. Alat

Gambar 2. ELISA Reader (Anonim, 2010)

Gambar 3. ELISA Washer (Anonim, 2010)

4

Gambar 4. ELISA kit (Anonim, 2011)

b. Bahan (Anonim, 2011)

1) Sampel

Sampel yang digunakan adalah plasma dengan antikoagulan

EDTA. Sampel serum tidak dianjurkan karena ACTH tidak stabil

dalam serum.

2) Kit dan Reagen (Anonim, 2011)

ELISA ACTH reagen kit:

a. Anti ACTH antibody coated microplate

Satu microplate dengan 12 x 8 strips (total 96 sumuran)

yang telah dilapisi dengan antibodi monoclonal antihuman

ACTH. Reagen ini harus disimpan pada suhu 2-8°C dan

stabil sampai tanggal kadaluarsa yang tertera pada ACTH

ELISA assay kit.

b. Horse radish peroxidase (HRP) conjugated anti ACTH

antibody

Setiap vial mengandung 0,25 mL HRP yang telah diberi

label antibodi anti human ACTH dalam matriks protein

stabil.

c. Enzyme linked immunosorbent assay wash concentrate

Setiap botol mengandung 30 mL dari 30 fold concentrate.

Larutan pencuci yang telah diencerkan ini harus disimpan

pada suhu ruangan dan akan stabil sampai masa

kadaluarsanya.

5

d. Enzyme linked immunosorbent assay HRP substrate

Setiap botol mengandung 25 mL tetramethylbenzidine

(TMB) hidrogen peroksida. Reagen ini harus disimpan pada

suhu 2-8°C, dan stabil sampai masa kadaluarsanya.

e. Stop solution ELISA

Setiap botol mengandung 12 mL stop solution. Reagen ini

harus disimpan pada suhu 2-8°C, dan stabil sampai masa

kadaluarsanya.

f. Human ACTH standard

6 vial mengandung ACTH manusia dalam serum lyophilized

bovine based matrix dengan non azide, non mercury

preservative. Standar ini harus disimpan pada suhu 2-8°C,

dan stabil sampai masa kadaluarsanya. Untuk

pengencerannya mengikuti prosedur yang telah ditentukan.

g. Enzyme linked immunosorbent assay controls

2 vial mengandung ACTH manusia dalam lyophilized bovine

serum based matrix non azide preservative. Kontrol ini

harus disimpan pada suhu 2-8°C dan stabil sampai masa

kadaluarsanya. Untuk pengencerannya mengikuti prosedur

yang telah ditentukan.

h. Tracer antibody diluents

Satu vial mengandung 5 mL buffer yang siap digunakan.

Hanya digunakan untuk tracer antibody dilution sesuai

prosedur yang telah ditentukan. Reagen ini harus disimpan

pada suhu 2-8°C, dan stabil sampai masa kadaluarsanya.

Untuk pengencerannya mengikuti prosedur yang telah

ditentukan.

Material lain yang dibutuhkan namun tidak disediakan dalam kit: Precision single channel pipettes capable of delivering

25µL, 200µL, dan seterusnya.

6

Disposable pipette tips suitable for above volume

dispensing.

Aluminum foil.

Deionized or distilled water

Plastic microtiter well cover or polyethylene film.

Enzyme linked immune sorbent assay multi channel washes

bottle atau automatic (semi automatic) washing system.

Spectrophotometric microplate reader capable of reading

absorbance at 450/650 nm. (Anonim, 2011).

3. Persiapan reagen (Anonim, 2011)

a. Sebelum digunakan, semua reagen harus dibiarkan dalam suhu

ruangan. Reagen yang berasal dari nomor lot yang berbeda tidak

dapat digunakan atau dikombinasikan.

b. Konsentrat pencuci ELISA harus dilarutkan dengan 870 mL air

yang telah didemineralisasi, sehingga menghasilkan larutan

pencuci yang mengandung surfaktan dalam phosphate buffer

saline non azide, non mercury preservative.

c. Campurkan standard assay dan kontrol dengan menambahkan

2,0 mL air yang telah didemineralisasi pada tiap botol standar

dan kontrol. Biarkan standar dan kontrol selama 5 menit, lalu

dicampur dengan cara membalikkan atau dengan memutar secara

hati-hati. Harus dipastikan bahwa seluruh serbuk padat telah

larut sebelum digunakan. Standar dan kontrol yang telah

dilarutkan dapat disimpan pada suhu 2-8°C selama 24 jam atau

pada suhu -10°C bila ingin disimpan dalam waktu yang lama.

Hindari lebih dari 3 siklus beku.

d. Siapkan larutan tracer antibody pengenceran 1:21 dengan

menambahkan tracer antibody diluents. Harus dingat agar tracer

antibody disiapkan sesaat sebelum memulai tes.

Berikut adalah tabel hubungan antara strip yang digunakan dan

campuran antibodi yang digunakan.

7

Tabel 3. Hubungan antara strip yang digunakan dengan campuran antibodi (Anonim, 2011).

Dilution Scheme Tracer AntibodyDiluen

t

Tracer Antibody

1 0,4 mL 20 µL2 0,8 mL 40 µL3 1,2 mL 60 µL4 1,6 mL 80 µL5 2,0 mL 100 µL6 2,4 mL 120 µL7 2,8 mL 140 µL8 3,2 mL 160 µL9 3,6 mL 180 µL10 4,0 mL 200 µL11 4,4 mL 220 µL12 4,8 mL 240 µL

e. Persiapkan Anti ACTH antibody coated microplate untuk human

ACTH standard, kontrol dan sampel dengan cara duplikasi.

f. Konfigurasi tes.

Tabel 4. Konfigurasi tes (Anonim, 2011).ROW STRIP 1 STRIP 2 STRIP 3 STRIP 4A STD 1 STD 5 SAMPLE 1 SAMPLE 5B STD 1 STD 5 SAMPLE 1 SAMPLE 5C STD 2 STD 6 SAMPLE 2 SAMPLE 6D STD 2 STD 6 SAMPLE 2 SAMPLE 6E STD 3 C 1 SAMPLE 3F STD 3 C 1 SAMPLE 3G STD 4 C 2 SAMPLE 4H STD 4 C 2 SAMPLE 4

B. Analitik

1. Persiapan sampel (Anonim, 2011)

Sampel yang digunakan adalah plasma dengan antikoagulan EDTA.

Sirkulasi ACTH dipengaruhi oleh circadian rhythm, maka

direkomendasikan untuk mengumpulkan sampel pada pagi hari sebelum

pukul 8 pagi. Pasien tidak diperbolehkan mengkonsumsi steroid sebelum

pemeriksaan darah. Plasma EDTA merupakan sampel yang sesuai untuk

pengukuran kadar ACTH. Sebanyak 0,4 mL plasma EDTA dibutuhkan

8

untuk penentuan kadar ACTH secara duplikasi menggunakan test kit ini.

Plasma EDTA harus dipisahkan dari sel segera setelah pengumpulan

sampel, dengan cara disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 3000

rpm kurang dari 1 jam setelah pengumpulan sampel. Sampel harus

disimpan pada suhu 2-8°C bila akan digunakan kurang dari 8 jam, dan

stabil selama 4 bulan bila disimpan dalam suhu -20°C. Hindari lebih dari

3 kali freeze thaw cycles.

2. Prosedur pemeriksaan (Anonim, 2011)

a. Masukkan 200 µL standard, kontrol dan sampel pasien ke dalam

microwells yang telah dilapisi dengan monoclonal antihuman

ACTH.

b. Segera tambahkan 25 µL HRP conjugated anti ACTH antibody ke

tiap-tiap sumuran.

c. Tutup plate wells dengan menggunakan kertas timah atau material

lain untuk melindungi dari cahaya, inkubasi dan putar dengan

menggunakan ELISA plate shaker selama 2 jam pada kecepatan

400 – 450 rpm.

d. Cuci sumuran 5 kali dengan 350 µL larutan pencuci ke dalam tiap

sumuran dan kemudian dibersihkan. Alternatif lain dengan

menggunakan microplate washer automatic.

e. Tambahkan 200 µL ELISA HRP substrate ke dalam tiap sumuran.

f. Tutupi plate wells dengan kertas timah atau material lain untuk

melindunginya dari cahaya. Inkubasi pada suhu ruangan selama 20

menit tanpa diputar.

g. Segera tambahkan 50 µL ELISA stop solution pada tiap sumuran,

campurkan dengan merata.

h. Lakukan pembacaan absorbance pada 450 nm dengan reference

filter 620 atau 650 nm.

9

Gambar 5. Prinsip pemeriksaan ACTH metode ELISA (Anonim, 2012)

C. Paska Analitik

1. Nilai yang diharapkan (expected value)

Nilai normal ACTH yang diharapkan dengan menggunakan ELISA

ini adalah antara 1-72 pg/mL.

Direkomendasikan untuk mengunakan metode titik ke titik

berdasarkan hasil pengukuran nilai standar untuk mendapatkan

kurva standar ACTH.

a. Hitung nilai rerata absorbance tiap pasang hasil tes duplikasi.

b. Kurangi nilai rerata absorbance dari standar level 1 (0 ng/mL)

dari nilai rerata absorbance seluruh hasil pembacaan untuk

menghasilkan absorbance yang benar.

c. Kurva standar dibentuk dengan menggunakan nilai absorbance

yang telah dikoreksi dari seluruh level standar.

d. Konsentrasi ACTH dari kontrol dan sampel dibaca langsung dari

kurva standar menggunakan nilai absorbance masing-masing.

10

Contoh data dan kurva standar

Tabel 5. Contoh data absorbance ELISA ACTH (Anonim, 2011).

Well IDOD 450/650 nm Absorbance

Hasil (pg/mL)Pembacaan Rerata Koreksi

Std 1: 0 pg/mL0,003

0,31 0,0000,028

Std 2: 7,6 pg/mL0,102

0,105 0,0740,109

Std 3: 20 pg/mL0,206

0,215 0,1840,224

Std 4: 51 pg/mL0,562

0,545 0,5140,528

Std 5: 155 pg/mL1,646

1,628 1,5971,610

Std 6: 416 pg/mL3,151

3,373 3,3243,595

Kontrol 10,349

0,390 36,50,364

Kontrol 22,105

1,118 106,01,664

Gambar 6. Kurva standar ACTH ELISA (Anonim, 2011)

2. Presisi

Nilai presisi intra assay divalidasi dengan mengukur 3 sampel

kontrol dengan 16 kali pengulangan.

11

Tabel 6. Nilai presisi intra assay ACTH (Anonim, 2011).Sampel Rerata nilai ACTH (pg/mL) CV (%)

1 36,2 7,62 66,5 8,63 276,9 10,3

Nilai presisi inter assay divalidasi dengan mengukur 2 level kontrol

dengan duplikasi 16 kali dari tes terpisah.

Tabel 7. Nilai presisi inter assay ACTH (Anonim, 2011).Sampel Rerata nilai ACTH (pg/mL) CV (%)

1 32,1 7,12 261,0 5,3

3. Batasan deteksi (sensitifitas analitik)

Sensitifitas analitik dari ACTH ELISA assay kit ini ditentukan

dengan 95% confidence limit pada 8 duplikasi penentuan dari

standar nol adalah mendekati 0,4 pg/mL.

4. Spesifisitas analitik (interferensi)

Air yang dideionisasi dengan polyester resins dapat menginaktifasi

HRP.

5. High dose hook effect

Assay ini tidak menunjukkan adanya high dose hook effect pada

ACTH sampai pada kadar 10.000 pg/mL.

6. Linearitas

Dua level standar ACTH diencerkan dengan assay buffer dan dites.

Persentase nilai recovery ACTH dapat dilihat pada tabel di bawah.

Tabel 8. Linearitas ACTH (Anonim, 2011).

PengenceranNilai pengamatan

(pg/mL)Persentase nilai perbaikan

Sampel A 416 -1:2 231,4 1111:4 102,1 981:8 52,1 1001:16 26,3 101

Sampel B 155 -1:2 80,3 1041:4 38,6 1001:8 20,5 1061:16 9,3 96

12

Dua sampel plasma EDTA ditambah dengan persediaan konsentrat

ACTH dan dites. Persentase nilai perbaikan ACTH dapat dilihat

pada tabel di bawah.

Tabel 9. Persentase Recovery ACTH (Anonim, 2011).

PengenceranNilai pengamatan

(pg/mL)Persentase nilai perbaikan

Sampel A 184,1 -1:2 105,8 1151:4 58,5 1271:8 22,6 98

Sampel B 33,3 -1:2 17,1 1031:4 9,4 1131:8 5,1 121

Dua sampel plasma EDTA dan tiga standar assay (45, 135 dan 405

pg/mL) dikombinasikan dalam volume yang sama dan dites.

Hasilnya dapat dilihat pada tabel di bawah.

Tabel 10. Spike dan Recovery ACTH (Anonim, 2011).

PengenceranNilai pengamatan

(pg/mL)Nilai diharapkan

(pg/mL)Persentase nilai

perbaikanSampel A 12,5 - -

Std-3 25,1 28,8 87Std-4 73,5 73,8 100Std-5 254,0 208,8 122

Sampel B 21,5 - -Std-3 26,1 33,3 79Std-4 66,8 78,3 85Std-5 208,1 213,3 98

13

BAB III

SIMPULAN

Adrenocorticotropic hormone (ACTH) merupakan hormon polipeptida

yang disekresikan oleh kelenjar pituitary anterior yang fungsi utamanya adalah

menstimulasi sintesa dan pelepasan glukokortikoid terutama kortisol dari korteks

adrenal.

Adrenocorticotropic hormone merupakan komponen penting dalam aksis

hypothalamic-pituitary-adrenal, dan diproduksi sebagai respon terhadap stres

biologis, menstimulasi sekresi hormon steroid glukokortikoid dari sel korteks

adrenal lapisan fasciculata. Konsentrasi ACTH meningkat oleh AVP, stress fisik,

latihan, penyakit akut, dan hipoglikemi yang distimulasi insulin.

Gold standard untuk pemeriksaan ACTH adalah dengan menggunakan

metode radio immune assay (RIA).

14

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2010. Enzyme linked immuno sorbent assay reader. http://www.biotek.com/products/microplate_detection/elx808_absorbance_microplate_reader.html (diunduh 30 September 2014).

Anonim, 2011. ELISA Kit for adrenocorticotropic hormone (ACTH). http://elisa - antibody.com (diunduh 30 September 2014).

Anonim, 2012. Direct and indirect ELISA protocols http://www.eiaab.com/info/detail/456 (diunduh 30 September 2014).

Boyar RM., Witkin M., Carruth A., Ramsey J. 1979. Circadian cortisol secretory rhythms in Cushing's disease. J Clin Endocrinol Metab. 48(5):760-5.

Kageyama K., Ikeda H., Nigawara T., Sakihara S., Suda T. 2007. Expression of adrenocorticotropic hormone, prolactin and transcriptional factors in clinically nonfunctioning pituitary adenoma. Endocr J. 54(6): 961-8.

Kaplan L. A., and Pesce A. J. 2010. Clinical Chemistry. 5th Edition. USA: Elsevier Saunders Inc, pp: 672-687.

Kreek MJ., Wardlaw SL., Hartman N., Raghunath J., Friedman J., Schneider B., Frantz AG. 1983. Circadian rhythms and levels of beta-endorphin, ACTH, and cortisol during chronic methadone maintenance treatment in humans. Life Sci. 33 Suppl 1:409-11.

Larry J. 2010. Harrison’s endocrinology. 2nd Edition. New York: Mc Graww Hill Medical. Pp: 103-107.

Liddle GW. 1966. An analysis of circadian rhythms in human adrenocortical secretory activity. Trans Am Clin Climatol Assoc. 77:151-60.

Unnikrishnan MK. 2006. Radio immune assay and enzyme linked immune assay. http:// www.pitt.edu/~super7/25011-26001/25011.ppt (diunduh 30 September 2014)

15