Material and methods

Pengumpulan sampel klinisTujuh belas sampel tumor payudara manusia dari Rumah Sakit Apadana dikumpulkan selama operasi. jaringan normal dijadikan kontrol. Dua ahli patologi dari laboratorium patologi RS Apadana melakukan pemeriksaan terhadap jaringan patologi tumor dan patologis kontrol. Karakteristik klinis dan histologis pasien kanker payudara ditunjukkan pada Tabel 1. Sampel segera diawetkan dalam nitrogen cair, diangkut ke laboratorium, dan disimpan pada -80 C. Studi ini disetujui oleh komite etika dari Jundishapour Medical University of Ahvaz dan dilakukan sesuai dengan Panduan untuk studi Human oleh National Academy of Sciences (National Institutes of Health), dan informed consent diperoleh dari semua pasien yang terlibat dalam penelitian ini.

Persiapan sampel dan pemurnian parsial LDH

Tumor yang beku dan jaringan normal dihomogenkan (1: 5 w: v) dalam buffer es homogenisasi (20 mMTris-HCl, pH 8,0, 10 mM 2-mercaptoethanol, 10% v: v gliserol, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, dan 20 mM- glycerophosphate) dan beberapa kristal dari phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) juga ditambahkan pada saat homogenisasi. Sampel dihomogenkan menggunakan homogenizer Miccra (Miccra, Jerman), disentrifugasi selama 30 menit pada 13.500 g pada 4 C dan supernatan disimpan dalam es sampai digunakan. Metabolit berat molekul rendah dan ion telah dipisahkan dari supernatan dengan kolom Sephadex G25 (1 5 cm) (Sigma, Jerman) yang telah disetimbangkan dalam buffer.

Pemurnian parsial LDH dimulai dengan persiapan kolom DEAE-Sephasex (1,5 10 cm) yang disetimbangkan dalam buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8). Setelah setimbang, sekitar 1,5 mL ekstrak kasar ditempatkan di atas kolom. Kolom kemudian ditambahkan dengan 30 mL buffer untuk menghilangkan protein terikat seperti LDH.Percobaan ini memerlukan banyak sampel LDH murni, dan karena itu aktivitas fraksi yang baik dari kolom DEAE-Sephadex digabungkan dan dikromatografi pada kolom Biru Sepharose CL-6B (1,5 10 cm) sebelumdisetimbangkangkan dalam buffer homogenisasi. Setelah setimbang, kolom kemudian dicuci dengan 50 mL buffer homogenisasi untuk menghilangkan protein yang terikat. Garis gradien garam linear 0-2 M KCl kemudian ditambahkan kedalam kolom untuk elusi LDH. Aktivitas fraksiyang baik kemudian dikumpulkan dan didisimpan pada 4 C sampai digunakan. Sampel ini digunakan untuk karakterisasi LDH kinetik berikutnya.