Aktifitas Antitumor dari Ekstrak Serutan Bambu (Caulis Bamfusae) yang Kaya Akan Triterpenoid

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Sejak dahulu ekstrak serutan bamboo memang sudah dikenal sebagai resep obat – obatan tradisional secara turun – temurun. Beberapa peneliti dari Departemen Ilmu Pangan dan Gizi dari Fakultas Teknik Biosistem dan Ilmu Pangan, Universitas Zhejiang, Hangzhou, Propinsi Zhejiang, China, melakukan penelitian mengenai zat aktif yang terkandung dalam ekstrak serutan bamboo, shingga dia dapat mengobati beberapa penyakit seperti mengurangi atau mengobati sakit perut, diare, vomitin, peradangan diafragma dada, kegelisahan dan haus yang berlebihan.

Para peneliti berhipotesis bahwa ekstrak serutan bamboo mengandung senyawa biologi aktif yang berlimpah, seperti triterpenoid, saponin dan sterol. Triterpenoid dan saponin adalah komponen-komponen biologis aktif yang penting didalam bahan alam. Triterpenoid dari ekstrak serutan bambu Cina, terutama terdiri dari triterpenoid pentasiklik seperti friedelin, friedelinol, lupenone dan lupenol.

Banyak peneliti telah meneliti bahwa triterpenoid telah memiliki banyak fungsi fisiologis seperti antisepsis, antivirus,antitumor, antikelelahan, antihiperlipidemia, antihipertensi, anti-hiperglikemia. Banyak Penelitian tentang triterpenoid yang telah dipublikasikan di beberapanegara yang menyatakan bahwa fungsi fisiologis dari triterpenoid yang terkandung dalam ekstrak serutan bamboo lebih dominan pada fungsi fisiologis antitumor.Dalam penelitian sebelumnya, menunjukkan bahwa friedelin dari ekstrak serutan bambu memiliki khasiat besar untuk aktivitas antitumor (Fukuda et al, 2005., 2006).Namun, tidak ada laporan yang sistematis untuk menyelidiki triterpenoid dari ekstrak  serutan bambu cina, terutama komponen utamanya yaitu friedelin.

BAHAN DAN METODE

 Bahan Tanaman

Serutan bambu diperoleh dari lapisan tengah batang bambu di Anji Kabupaten (Huzhou, Zhejiang, Cina). Sampel ini telah dikonfirmasi oleh Penelitian dari Institut Kehutanan Subtropis Cina Akademi Kehutanan Cina (Hangzhou, Cina) (Zhang et al., 2004). Sebuah spesimen ekstrak serutan bambu itu disimpan di Herbarium Laboratorium Penelitian dan Pengembangan Produk Alam di Departemen Ilmu Pangan dan Gizi (Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang, Cina).

Persiapan ekstrak serutan bambu dan identifikasi triterpenoid   

Triterpenoid dihasilkan dari ekstrak serutan bambu yang telah diidentifikasi oleh Lembaga Penelitian Subtropis  Kehutanan Akademi Kehutanan Cina (Hangzhou, Cina). Secara singkat, serutan bambu segar cukup dicuci dengan air dan dikeringkan di udara. Bubuk kasar dari serutan bambu  diperoleh setelah penumbukan dan penyaringan (10 ~ 20 mesh). 5,5 kg  bubuk sirkuler diekstrak menggunakan teknik karbon dioksida SFE . Akhirnya, ekstrak dari serutan bambu dikumpulkan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak serutan bambu berwarna kuning atau hijau kekuningan berwujud bubuk dengan kisaran titik leleh dari 74 sampai  79 ° C. hasil Utama berupa triterpenoid dari ekstrak serutan bambu diidentifikasi dengan GC-MS ( GC Hewlett-Packard dan MS 6890 dengan mesin 5973 spektrometer massa dari perusahaan agilent Inc, Amerika Serikat) dan dianalisis dengan GC (Agilent 6890N dan detektor FID, Agilent Inc, USA) (Yao dkk., 2004). Pemisahan kromatografi dilakukan dengan kolom HP5-MS dengan dimensi 30 m × 0,25 mm dilapisi dengan fase stasioner polisiloksan metil fenil (ketebalan film: 0,2 pM). Helium digunakan sebagai gas pembawa dengan laju alir 1 mL / menit. 1 uL ekstrak serutan bambu dilarutkan dalam diklorometana kemudian disuntikkan menggunakan modus injeksi tidak terpisah dengan suhu port injeksi 280 ° C. suhu kolom diatur pada 100 ° C selama 2 menit, kemudian diprogram hingga suhu 270 ° C dengan kenaikan suhu 20 ° C/ Menit, selama 20 menit. Detektor selektif massa dioperasikan pada jenis modus ionisasi elektron dengan energi ionisasi dari 70 eV. Suhu sumber pengion adalah 230 ° C. modus Kendali scan digunakan pemindai MS 18-500 m / z. Datadianalisis oleh NIST database 98.

  Filtrasi antitumor aktif dari ekstrak serutan bambu secara in vitro

Metode Filtrasi

metode (SRB) pewarnaan protein Sulforhodamine B digunakan untukmengevaluasi efek penghambatan pertumbuhan sel tumor yang melekat pada sel-sel leukemia tikus P388 oleh ekstrak serutan bambu dan metode tetrozolium microculture digunakan untuk mengvaluasi efek penghambatan pertumbuhan dari sel tumor (A549 paru-paru manusia) masing-masing. Efek Waktu adalah 48 dan 72 jam dibandingkan dengan kontrol, Vincristin, masing-masing.

Uji SRB

Uji SRB dari efek penghambatan oleh ekstrak serutan bambu dilakukan sesuai dengan program oleh Xiao et al. (2001). Secara singkat, sel-sel ditanam dalam 0,1 mL media menggunakan cawan petri sebanyak 96 buah, kemudian diinkubasikan selama 24 jam. Setelah proses inkubasi tersebut ditambahkan ekstrak serutan bambu pada masing – masing cawan petri, kemudian dikultur pada suhu 37 ° C selama 72 jam. Sel kemudian ditambahkan 100 mL asam trikloroasetat 10% dingin (4 ° C) untuk setiap cawan petri. Cawan petri kemudian dicuci dengan air deionisasi lima kali dan dibiarkan di udara kering. Sel kemudian diwarnai oleh penambahan 100 mL larutan SRB [0,4% SRB (b / v) dalam asam asetat 1% (v / v)] selama 15 menit. Setelah pewarnaan, piring dicuci lima kali dengan cepat menggunakan asam asetat 1% untuk menghilangkan zat pewarna berlebih dan dikering anginkan. Dye pada sel kemudian dilarutkan dengan 10 mmol / L Tris basa (pH 10.5) sebelum pengukuran. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 515 nm dengan Perangkat Molekuler (model # VERSAmax). Efek penghambatan pada sel – sel dinyatakan sebagai IC50. Kemudian, IC50 rata – ratanya dari tiga kali ulangan.

Uji

MTT

Larutan kompleks baru dipersiapkan dengan penambahan pelarut DMSO (Dimethyl sulfoxide)10% dan dapat diencerkan dengan konsentrasi yang diperlukan. Sel tumor ditumbuhkan dalam media RPMI 1640 kemudian ditambahkan serum janin anak sapi (FCS) sebanyak10% dilemahkan dan antibiotik. Sel – sel tersebut dipanen dari fase eksponensial (2 × 105 per mL), dari hasil cawan – cawan petri yang bagus ditambahkan senyawaan (FCS) 10% dan antibiotik. Kemudian senyawa ditambahkan dalam deret konsentrasi dari 1000, 100, 10, 1 dan 0,1 µM. Masing – masing cawan petri disimpan pada suhu 37 ° C dengan keadaan udara mengandung 5% CO2 dan diinkubasi selama 48 jam, kemudian MTT ditambahkan pada setiap cawan petri dengan konsentrasi (1 mg / mL) dan diinkubasi kembali pada suhu 37 ° C selama 4 jam. Absorbansi dari larutan yang berhubungan dengan jumlah sel yang hidupdiukur dengan menggunakan spektrofotometer ELISA pada panjang gelombang 570 nm (Zhou et al.,2001).

Efek ekstrak serutan bambu pada tumor tikus S180

Sel S180 sarkoma pada tikus dimatikan secara dislokasi leher rahim sebelum percobaan selama 8 – 10 menit pada larutan benzalkonium bromida jenuh. Kemudian, beberapa blok tumorterisolasi dalam kondisi operasional asepsis agar pencampurannya menjadi homogen dengan garam fisiologis dengan proporsi 1: 3 (3 ml garam fisiologis untuk masing-masing 1 gblok tumor). Setiap tikus percobaan disuntik dengan 0,2 ml larutan garam fisiologis dalam jaringan aksila endermic setelah sebagiannya telah didesinfektan menggunakan yodium etanol. Kemudian tikus – tikus tadi dibagi menjadi beberapa kelompok secara acak menurut asupan senyawa kimia melaui saluran pencernaannya, 24 jam kemudian dianalisis selama 10 hari berurutan (sekali untuk setiap hari) dengan kelompok sebagai berikut:

(i) kontrol pasokan air, 20 ml / kg (0,4 mL/20g),

(ii) kontrol positif, pasokan siklofosfamid, 30 mg / kg,

(iii) Ekstrak serutan bambu dengan dosis tinggi, 1,6 g / kg,

(iv) Ekstrak serutan bambu dengan dosis menengah, 0,8 g / kg, dan

(v) Ekstrak serutan bambu dengan dosis rendah, 0,4 g / kg.

Tikus tewas hari berikutnya ketika asupan senyawa kimia melalui saluran pencernaannya dihentikan. Berat tubuh tikus tersebut ditimbang dan blok tumor yang sesuaidiisolasi dan ditimbang untuk masing-masing tikus. kemudian, tingkat penghambatan tumordihitung.

Tes Antitumor friedelin yang diekstrak dari ekstrak serutan bambu

persiapan Silica Gel Kolom Kromatografi dan teknik Kromatografi berlawanandigunakan untuk memperoleh friedelin yang terisolasi dari ekstrak serutan bambu untuk mengevaluasi aktifitas antitumor pada friedelin tersebut. Kemurnian friedelin ini ditentukan dengan GC memberikan hasil kemurnian sebesar 90,5%. Metode MTT adalah metode yang digunakan untuk menunjukkan aktivitas antitumor dari friedelin secara in vitro.A375, L929, HeLa dan THP-1 adalah sel – sel yang digunakan digunakan untuk pengujian aktifitas friedelin pada percobaan ini. semua sel diinkubasi pada medium kultur RPMI-1640 yang telah ditambahkan dengan 10% serum janin sapi, 100 U / mL penisilin, 100 mg / ml streptomisin dan 0,2% NaHCO3. Bahan tambahan ini dilarutkan dalamair deionisasi dan membran filtrasi dengan dimeter 0,2 mm digunakan untuk filter

sterilisasi. Serum janin anak sapi tidak boleh aktif 30 menit sebelum percobaan pada suhu 56 ° C. Sel dikultur dalam inkubator dengan kandungan CO2 sebesar 5% pada suhu 37 ° C.

Sel

A375, L929 dan HeLa tumbuh dalam fase pertumbuhan logaritmik dengan kepadatan sel sekitar 5 × 104 sel / mL pada cawan petri. Selain itu sel THP-1 tumbuh dengan kepadatan sel sekitar 1 × 105 per mL karena sel tersebut memiliki ukuran yang lebih kecil dari yang lain. Friedelin dilarutkan dalam DMSO kemudian di kultur pada medium, di mana konsentrasi akhir dari pelarut dalam medium kultur sebesar <0,1% (v / v). friedelin ditambahkan dengan konsentrasi 7.5, 15, 30, 60, 120, 240, 480 dan 960 mmol / L. Sel – sel dikultur selama 24dan 48 jam.

Setelah dikultur selama 48 jam, sel – sel tersebut disentrifugasi pada kecepatan 1500 rpmselama 5 menit. kemudian absorbansi diukur dengan menggunakan spektrofotometer ELISA pada panjang gelombang 492 nm. sehingga, tingkat penghambatan proliferasi sel dan nilai IC50 dari friedelin dapat dihitung dengan menggunakan metode Bliss. De-metil-Cantharidin berfungsi sebagai kontrol positif dan tingkat penghambatan sel A375, L929 dan HeLadiukur dengan menambahkan de-metil-Cantharidin (120 mmol / L) selama 24 dan 48 jam sehingga efek penghambat sel tumor friedelin dapat dibandingkan dengan de-metil-Cantharidin.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Identifikasi triterpenoid di ekstrak serutan bambu

Beberapa pentasiklik triterpenoid, seperti friedelin, friedelinol, lupenone dan lupenol, diidentifikasi dengan GC-MS. Diantara senyawa – senyawa ini, friedelin bisa dianggap sebagai triterpenoid yang mewakili ekstrak serutan bambu karena friedelin merupakan triterpenoid yang dominan dalam fraksi aktif.

Filtrasi

Anti-tumor aktif dari ekstrak serutan bambu secara in vitro

Metode SRB dan MTT digunakan untuk mengukur efek penghambatan pertumbuhan sel tumor P388 dan A549. Dari hasil pengamatan seperti pada table 1 dan table 2 dapat disimpulkan bahwa Ekstrak Serutan Bambu memiliki penghambatan sel tumor P388 pada kadar terkecilnya sebanyak 0,016 mg/mL dengan % penghambatan sebesar 57,7% dan ekstrak serutan bamboo juga memiliki penghambatan sel tumor A549 pada konsentrasi terkecil sebesar 0,063 dengan % penghambatan sebesar 24,8%. Berdasarkan hasil tersebut jelas bahwa ekstrak serutan bambu memiliki kemampuan menghambat tumbuhnya sel tumor P388 dan sel tumor A549.

Efek penghambatan tumor pada tumor tikus jenis S180

Hasil penelitian menunjukkan bahwa baik siklofosfamid dan ekstrak serutan bambu memiliki efek penghambatan pada sel-sel tumor sarcoma tikus Model S180, yang dapat dilihat dari pengurangan bobot tumor. Sampel yang di uji pada metode ini adalah Sikloposfamida, ekstrak serutan bamboo pada dosis tinggi, sedang(intermediet) dan rendah. Dari pengujian didapatkan hasilnya sebagai berikut :

Hasil penghambatan tumor dari ekstrak serutan bambu kemudian di bandingkan dengan sikloposfamida dengan uji T dan didapat bahwa ekstrak bamboo memiliki kemampuan menghambat tumor yang tidak berbeda nyata dengan sikloposfamida.

Uji Antitumor dari friedelin yang diisolasi dari ekstrak serutan bamboo secara in vitro

Dari gambar 3 didapatkan bahwa Friedelin lebih efisien sebagai penghambat sel tumor jenis Hela dan THP-1 pada 24 jam. Friedelin memiliki sensitivitas yang lebih tinggi pada penghambatan tumor jenis ini.

Disisi lain friedelin sedikit lemah/kurang efisien kemampuannya dalam menghambat sel tumor jenis A375 dan L929 hingga 48 jam. Hal ini dijelaskan pada grafik berikut:

Dari gambar 4, friedelin dibandingkan dengan di – metil – canthridin dan diperoleh kesimpulan bahwa:

Pada sel tumor A375, friedelin bekerja hampir sama dengan kinerja di – metil – canthridin hingga 24 jam dan kemudian friedelin lebih efisien menghambat setelah 48 jam. Pada sel tumor L929, friedelin bekerja hampir sama dengan kinerja di – metil – canthridin hingga 24 jam dan kemudian friedelin lebih efisien menghambat setelah 48 jam. Pada sel tumor Hela, friedelin bekerja lebih efisien dari di – metil – canthridin dari 24 hingga 48 jam.

Berdasarkan hasil tersebut, dapat dikatakan bahwa friedelin memiliki aktivitas antitumor yang kuat.

Penelitian ini di awali dari beberapa penelitian sebelumnya yang menjabarkan mengenai aktivitas-aktivitas aktif biologis yang terkandung di dalam tumbuhan bambu. Dari sekian banyak penelitian belum ada yang meneliti secara sistematis kandungan utama yang terkandung dalam ekstrak serutan bambu yakni Friedelin yang memiliki aktivitas fungsional sebagai antitumor.

Pada sel tumor, terdapat dua hal yang sangat berpengaruh dalam pertumbuhan tumor itu sendiri, yaitu apoptosis dan proliferasi. Apoptosis ialah suatu proses kematian sel yang terprogram atau proses perusakan yang terkontrol terhadap diri sel itu sendiri yang mana proses tersebut melibatkan sinyal selular yang khusus atau spesifik. Apoptosis memiliki peran yang sangat penting dalam embryogenesis, penggantian jaringan yang rusak, perkembangan sistem imun, dan perlindungan melawan perkembangan tumor (tumorigenesis). Peran penting apoptosis dalam embryogenesis tampak pada setiap jari tangan dan kaki kita yang terpisah dengan sempurna. Apabila apoptosis tidak sempurna, maka jari tangan/kaki kita akan tetap bertautan. Proliferasi ialah proses  Immortalitas tumor yang disebabkan oleh hilangnya mekanisme DNA repair dalam sel. Dengan tidak adanya kemampuan koreksi DNA sebelum sel tersebut membelah, sel menganggap dirinya layak untuk direplikasi sehingga jumlah se tersebut secara terus menerus melakukan replikasi.

Adanya friedelin, maka sel tersebut ditangkap, lalu apoptosis dari sel tumor tersebut dipicu dan tahap proliferasi diganggu. Semakin lama kadar friedelin akan semakin berkurang dan tidak lagi mampu menahan pertumbuhan sel tumor.

KESIMPULAN

Dari penelitian ini didapatkan bahwa

1. Di dalam ektrak serutan bamboo didapatkan beberapa senyawaan triterpenoid seperti friedelin, friedelinol, lupenone dan lupenol yang diidentifikasi dengan GC-MSdan semua triterpenoid yang terkandung didalamnya, Friedelin lah yang paling dominan.

2. Berdasarkan metode SRB dan MTT yang dilakukan diketahui bahwa ekstrak serutan bamboo mengandung senyawa aktif yang dapat menghambat sel tumor seperti sel tumor P388 dan sel tumor A549. Kadar terendah dari penelitian ini yang dapat menghambat sel tumor P388 tersebut adalah pada kadar terkeil sebesar 0,016 mg/mL dengan % penghambatan sebesar 57,7% dan pada sel tumor A549 pada kadar terkecil 0,063 dengan % penghambatan sebesar 24,8%.

3. EKSTRAK SERUTAN BAMBU memiliki efek penghambatan pada sel-sel tumor sarcoma tikus Model S180, yang dapat dilihat dari pengurangan bobot tumor. Sampel yang di uji pada metode ini adalah Sikloposfamida, ekstrak serutan bamboo pada dosis tinggi, sedang(intermediet) dan rendah. Hasil penghambatan tumor dari ekstrak serutan bambu kemudian di bandingkan dengan sikloposfamida dengan uji T dan didapat bahwa ekstrak bamboo memiliki kemampuan menghambat tumor yang tidak berbeda nyata dengan sikloposfamida.

4. Friedelin hasil isolasi ekstrak serutan bamboo lebih efisien sebagai penghambat sel tumor jenis Hela dan THP-1 pada 24 jam. Friedelin memiliki sensitivitas yang lebih tinggi pada penghambatan tumor jenis ini. Disisi lain friedelin sedikit lemah/kurang efisien kemampuannya dalam menghambat sel tumor jenis A375 dan L929 hingga 48 jam.

5. Pada sel tumor A375, friedelin bekerja hampir sama dengan kinerja di – metil – canthridin hingga 24 jam dan kemudian friedelin lebih efisien menghambat setelah 48 jam.

6. Pada sel tumor L929, friedelin bekerja hampir sama dengan kinerja di – metil – canthridin hingga 24 jam dan kemudian friedelin lebih efisien menghambat setelah 48 jam.

7. Pada sel tumor Hela, friedelin bekerja lebih efisien dari di – metil – canthridin dari 24 hingga 48 jam.

Dari hasil penelitian di atas Ekstrak daun bambu dan friedelin memiliki aktivitas anti-tumor lebih rendah, namun keamanan ekstrak serutan bambu telah dievaluasi, itu menegaskan bahwa ekstrak serutan bambu aman dan tidak memilikiefek samping(Zhang et al, 2004.). Oleh karena itu,ekstrak serutan bamboo memiliki potensi besar untuk dikembangkan sebagai anti-tumor makanan kesehatan dan pengobatan alami. Dapat disimpulkan bahwa friedelin dapat dianggap sebagai salah satu faktor aktif yang paling penting dalam ekstrak serutan bambu meskipun jarang peneliti untuk menelaah lebih dalam tentang fungsi fisiologis friedelin. Masih belum diketahui apakah terpenoid lain yang terkandung pada ekstrak serutan bambu memiliki efek antitumor yang sesuai mekanisme. Namun, secara keseluruhan,dapat diramalkan bahwa ekstrak serutan bambu memiliki potensi besar untuk diterapkan di bidang yang sesuai yang memiliki aktivitas anti-tumor yang berasal dari friedelin yang merupakan senyawa triterpenoid yang paling dominan.

DAFTAR PUSTAKA

http://www.nano.lipi.go.id/utama.cgi?cetakartikel&1187593839

http://nhc.batan.go.id/iin1.php

http://www.unifr.ch/pathology/en/background/tumormicroenvironment