MACAM-MACAM TEKNIK PEWARNAAN BAKTERIPosted January 12, 2011 by aguskrisno in KAJIAN MIKROBIOLOGI UMUM. Leave a Comment

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008).Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul.(waluyo,2010)Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003)Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008).2.1 Macam-macam pewarnaan2.1.1  PewarnaanTujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk :1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui.Langkah-langkah utama teknik pewarnaan1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol.3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna

Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel bakteri terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan untuk pemisahan kelompok bakteri digunakan pewarnaan Gram, dan pewarnaan “acid-fast”(tahan asam) untuk genusMycobacterium.Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik (Pelezar,2008).2.1.2 Macam-Macam PewarnaanSecara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :1.   Pewarnaan sederhanaMenggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).

     

  gambar pewarnaan sederhana2.   Pewarnaan differensial dibagi pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asamPewarnaan differensialPewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut:Pewarnaan GramPewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu : Zat warna utama (violet kristal) Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan

warna utama. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan

uantuk melunturkan zat warna utama. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-

sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safraninPerbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel  dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat

didalam

lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.

Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal

violet. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. Tidak resisten terhadap gangguan fisik. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat Peka terhadap streptomisin Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada

yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. Lebih resisten terhadap gangguan fisik. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut Tidak peka terhadap streptomisin Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Contoh bakteri gram posittif                                    contoh bakteri gram negatif        Sumber: “http://

id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_GramPewarnaan Tahan AsamPewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)

   

  Bakteri Tahan Asam (pink) dan bakteri Tidak Tahan Asam (biru)Sumber: http://www.google.com3. Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul.Pewarnaan SporaSpora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan.Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau  bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaan  Basil Tahan Asam dimana cat  carbol   fuschsin  harus dipanaskan untuk bisa menembus  lapisan lilin asam mycolic  dari Mycobacterium .Skema prosedur pengecatan Spora Schaeffer Fulton

    Sumber http://images.suite101.com/400620_com_endosporestainprocpscanite.jpgProtokol   pewarnaan diferensial endospores dan sel vegetatif adalah sebagai berikut:

   Sumber:Prinsip kerja:Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori membesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue.Cara Kerja :• Dibuat suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak.• Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oc selama 10 menit.• Dibuat sediaan dan dikeringkan.• Dimasukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik• Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir.• Sediaan dicuci dengan air.• Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan.• Diperiksa dibawah mikroskop.Pewarnaan flagelPewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.4. Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri : pewarnaan Neisser (granula volutin), pewarnaan yodium (granula glikogen).

5. Pewarnaan negatifTujuanMempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaetaCara pewarnaan negatif- Sediaan hapus → teteskan emersi → lihat dimikroskopPewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.Kajian religi1. Al-Furqon: 2

2. Yang kepunyaan-Nya-lah kerajaan langit dan bumi, dan Dia tidak mempunyai anak, dan tidak ada sekutu baginya dalam kekuasaan(Nya), dan Dia telah menciptakan segala sesuatu, dan Dia menetapkan ukuran-ukurannya dengan serapi-rapinya[1053].[1053] Maksudnya: segala sesuatu yang dijadikan Tuhan diberi-Nya perlengkapan-perlengkapan dan persiapan-persiapan, sesuai dengan naluri, sifat-sifat dan fungsinya masing-masing dalam hidup.2. An nahl: 1212. Dan Dia menundukkan malam dan siang, matahari dan bulan untukmu. dan bintang-bintang itu ditundukkan (untukmu) dengan perintah-Nya. Sesungguhnya pada yang demikian itu benar-benar ada tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi kaum yang memahami (Nya),1. Al-Baqarah : 164

164. Sesungguhnya dalam penciptaan langit dan bumi, silih bergantinya malam dan siang, bahtera yang berlayar di laut membawa apa yang berguna bagi manusia, dan apa yang Allah turunkan dari langit berupa air, lalu dengan air itu Dia hidupkan bumi sesudah mati (kering)-nya dan Dia sebarkan di bumi itu segala jenis hewan, dan pengisaran angin dan awan yang dikendalikan antara langit dan bumi; sungguh (terdapat) tanda-tanda (keesaan dan kebesaran Allah) bagi kaum yang memikirkanDAFTAR PUSTAKADwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: JakartaPelezar,chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: JakartaWaluyo,lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM. MalangWidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : DjambatanJimmo., 2008, http ://Pembuatan PReParAT dan PengeCaTAnnyA _ BLoG KiTa.mht,. diakses pada tanggal 14 April 2009, Makassar.Fauziah., 2008, http://www.fkugm2008.com/wp-content/uploads/HSC/1-2x/6/Praktikum6.pdf. diakses pada tangan 04 April 2009, Makassar.

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

16 JENIS PEWARNAAN MIKROORGANISME YANG BISA DIGUNAKANPosted August 18th, 2012 by copernicus  & filed under Media Mikrobiologi .

Pewarnaan adalah salah satu tekhnik identifikasi mikroorganisme  yang masih banyak digunakan. 

Pewarnaan microorganisme berperan penting dalam analisa morphologi mikroorganisme. Dalam dunia kedokteran , hasil ini bisa digunakan untuk menentukan tindakan pada pasien.

 

Dalam tulisan ini , kami akan memuat 16 bahan kimia yang  digunakan untuk pewarnaan. Bahan kimia untuk pewarnaan bakteri ini dimbil dari HiMedia yang dapat digunakan untuk Laboratorium Patologi Anatomi, Laboratorium Riset, Laboratorium Institusi Pendidikan dan Laboratorium Mikrobiologi Industri.

16 Jenis Pewarnaan Mikroorganisme  Yang Dapat Digunakan :1. Stains For Gram Staining

Gram Stains Kit

2. Stains For Metachromatic Staining

Alberts’s Metachromatic Stains Kit

Neissers’s Metachromatic Stains Kit

Modified Neissers’s Metachromatic Stains Kit ( 1 minute Staining )

3. Stains For Capsule Staining

Capsule Stains Kit

4. Stains For Acid Fast Staining

ZN Acid Fast Stains Kit

5. Stains For Spore Staining

Schaeffer & Fulton’s Spore Stains- Kit

6. Blood Film Stains for Spirochaetes , Protozoa and other purpose

Brilliant Cresyl Blue Solution

Giemsa’s Stain

Haematoxylin ( Delafields’s )

Leishman’s Stain ( twin pack )

May-Grunwaald’s Stain

Wright’s Stain

Malarial Parasite – Kit

7. Stains For Mycobacteria Staining

Fluorescent Stains – Kit for Mycobacteria

HiCold Stain TB – Kit for Mycobacteria

HiFluo-Phenol Free Stain Kit for Mycobacteria

8. Simple Stains For Bacteria

Carbol Fuchsin

Eosin 2 %

Gentian Violet

Malachite Green 1 %

Methylene Blue

9. Stains For Bacteria and Bovine Cells in Milk

Newman’s Stain, Modified

10.Stains For Fungi

Lactophenol

Lactophenol Cotton Blue

Lactophenol Picric Acid

Mayer’s Mucicarmine Stain

Picric Acid ( Saturated Aqueous )

11. Stains For Intestinal Protozoa

Lugol’s Iodine

12. Stains For Negative Staining

Congo red Solution

Nigrosin Stain 10 %

13. Staining Kits For Haematology

C.S.F Diluting Fluid

E D T A ( di-sodium) 5 %

R B C Diluting Fluid ( Grower’s )

R B C Diluting Fluid ( Hayemis )

Thrombocount reagents

W B C Diluting Fluid

14. Stains and Kits For Cytology

Papanicolaou-OG-6

Papanicolaou EA 36

Papanicolaou EA 50

15. Staining Kit For Histology

HiDecal ( Mild Decalcifying Solution )

HiDecal ( Strong Decalcifying Solution )

16. Other Stains

Borax Carmine ( Grenacher’s ) Alcoholic Stain

Borax carmine ( Grenacher’s ) Aqueous Stain

FA Rhodamine Counterstain

Fixative ( BFA ) for rapid fixing for haematological samples

Fixative ( Buffered Formalin Fixative ) For fixing cytological or histological samples

Fixative, for fixing cytological or histological samples

Fixing solution for fixixng haematological samples

Grams Iodine , Stabilized

Haematoxylin ( Ehrlich )

Haematoxylin ( Gill no.3 )

Haematoxylin ( Harris )

Haematoxylin ( Mayer )

Periodic Acid Solution

Romanowsky-Giemsa ( RG ) Stain

Schiff’s Fuchsin Sulphite Reagents

Schiff’s Reagents

Shorr’s Stain Solution for hormonal cytodiagnosis

 

Selain dari Hi Media, bahan kimia untuk pewarnaan juga bisa didapat dari Merck Millipore, Becton Dickinson  dan produk lokal seperti ST Reagent.

Untuk informasi lengkap tentang pewarnaan bakteri termasuk harga dan ketersediaan produk dapat menghubungi kami di 0852-6727-7949 atau e-mail kami di sales@AlatAlatLaboratorium.com

PEWARNAAN = StainingPewarnaan (stainning) merupakan pemberian warna pada jaringan/ sel/ komponennya supaya mudah diamati di bawah mikroskop cahaya. Zat warna yang digunakan harus memiliki syarat sebagai berikut: senyawa organik kompleks punya pembawaan khusus (warna), dapat dipertahankan dalam jaringan, terdiri dari gugus chromophore.

Radikal auxochrome

Amonia ( NH2)

Karboksil (COOH)

Hidroksil (OH)

Sulfonat (SO3H)

Senyawa diatas yang memberikan dissosiasi elektrolit pada Zat warna agar warna tak hilang. Adanya gugus chromophore dan radikal auxochrome akan terjadi interaksi muatan dengan sel (ikatan ionik—>sintetik atau ikatan kovalen –> alami ). Tiap bagian dari sel / komponen dalam sel mempunyai sifat- sifat khusus (afinitas terhadap zat warna juga tidak sama). Zat warna mempunyai kemampuan khusus dalam mewarnai jaringan sesuai sifatnya. Dua macam zat warna denga sifat sama dapat mempengaruhi/ memberi kemampuan tidak sama dalam mewarnai 1 macam jaringan (PERLU MENGENALI SETIAP BAGIAN DARI SEL & MENGENALI SETIAP ZAT WARNA YG AKAN DIGUNAKAN

PEMBAGIAN ZAT WARNA< Berdasar sifatnya :

- Zat warna asam , misalnya acid fuchsin, eosin

- Zat warna basa, misalnya hematoxylin, basic fuchsin

Berdasar asalnya:

- Zat warna alam, yaitu zat warna yang diperoleh dari tumbuhan atau hewan, misalnya hematoxylin (dr tumbuhan), carmin (dr. hewan)

- Zat warna sintetis, yaitu zat warna yg dibuat di pabrik, misalnya basic fuchsin

Berdasar kemampuan mewarnai jaringan:

- Z. warna substantif, yaitu z.warna yg bila diberikan pd jar langsung dpt mewarnai, misalnya neutral red, janus green B dsb.

- Z. warna ajektif, yaitu z.warna yg dpt mewarnai dg bantuan Mordan ( subst yg dpt memfiksir/ mengikat z.warna pd jar ), misalnya hematoxylin Ehrlich dg mordan Potasium Aluminium Sulphat.BERSAMBUNG…..

wahju hidayat/Departement of Biology-UNS

MORFOLOGI DAN PEWARNAAN BAKTERI

A. LATAR BELAKANG

Bakteri berasal dari kata “bakterion” (bahasa Yunani) yang artinya tongkat atau benang. Saat ini nama itu dipakai untuk menyebut sekelompok mikroorganisme yang bersel satu, tidak berklorofil (meskipun ada kecualinya), berkembang biak dengan pembelahan diri, serta demikian kecilnya sehingga hanya tampak dengan menggunakan mikroskop.

Apabila kita ingin mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bekteri dapat diperiksa dalam keadaan hidup maupun dalam keadaan mati. Pemerikasaan morfologi ini perlu untuk mengenal nama bakteri dan sifat-sifat fisiologi yang merupakan faktor penentu dalam mengenal nama spesiesnya.

Pada rangkaian pengamatan bakteri, terdapat cara untuk mengetahui sifat-sifat morfologi tersebut yaitu dengan pewarnaan bakteri. Larutan pewana tidak dapat langsung masuk ke dalam sel hidup. Oleh karena itu, sel biasanya di bunuh dahulu sebelum dilakukan pewarnaan. Sel yang mati akan menyerap dan mempertahankan pewarna. Cara umum untuk membunuh sel adalah dengan fiksasi panas. Sel diapuskan pada gelas objek sehingga diperoleh lapisan tipis. Preparat kemudian dipanaskan pelahan-lahan untuk membunuh sel.

Metode mewarnai atau mengecat preparat itu ada banyak sekali antara lain dengan pewarnaan sederhana. Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan mikroorganisme dengan menggunakan satu jenis zat saja. Kemudian ada pewarnaan negatif. Pewarnaan negatif merupakan pewarnaan dengan mencampurkan sampel dengan zat warna dan disebarkan menjadi lapisan tipis. Selanjutnya ada pewarnaan acid-fast. Pewarnaan acid-fast digunakan untuk membedakan bakteri yang tahan asam dengan yang tidak tahan asam.

Kemudian pewarnaan gram. Pada tahun 1884, seorang ahli histology dan bakteriologiawan dari Denmark, Christian Gram secara kebetulan menemukan prosedur pewarnaan Gram. Pewarnaan ini mungkin merupakan salah satu prosedur yang amat penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode ini, bakteri dapat dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok besar, yaitu pertama, organisme yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap/ungu), disebut “Gram positif”. Kedua, organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh pewarna bandingan, safranin (sel-sel tampak merah muda), disebut “Gram negatif”.

Pada perkembangan ilmu pangan, pengetahuan akan bakteri sangat dibutuhkan terutama dalam identifikasi jenis bakteri yang berkaitan dengan pangan. Misalnya pemanfaatan bakteri yanag menguntungkan sehingga banyak digunakan dalam industri makanan atau proses pengubahan suatu zat dalam makanan.

B. TUJUAN

Tujuan dari praktikum acara Morfologi dan Pewarnaan Bakteri adalah untuk mempelajari morfologi bakteri dan membedakan jenis bakteri dengan cara pewarnaan bakteri menggunakan metode pewarnaan negatif, Gram, dan acid-fast.

C. TINJAUAN PUSTAKA

Ziehl-Neelsen adalah metode yang paling umum digunakan. Dinding sel organisme mikrobakteri mengandung kompleks lipid dikenal sebagai hidroksi karboksilat asam, phitiocerols dan polimetil asam. Kompleks lainnya lipid danglycolipids telah diisolasi. Karboksilat hidroksi asam yang memiliki sifat tahan luntur asam dan lainnya menyajikan sebuah penghalang untuk pewarna masuk serta elusi. Metode Ziehl-Neelsen ini adalah dengan menambahkan fenol, agen lipofilik untuk larutan dari fuchsin dasar oleh pemanasan dan memperpanjang waktu pewarnaan (Raoul, 2009).

Pencarian untuk kecepatan dan keberhasilan telah menghasilkan beberapa modifikasi untuk menyederhanakan metode pewarnaan ZN. Namun, tidak satupun yang telah memperoleh penerimaan yang luas kecuali untuk metode pewarnaan dingin. Dalam studi ini, pewarnaan ZN menggunakan 0,3% fuchsin dasar yang ditemukan sensitif dan spesifik untuk yang menggunakan 1% fuchsin dasar. Menggunakan reagen ini dapat menghindari pemborosan fuchsin dasar dan mengurangi biaya pewarnaan. Mengurangi konsentrasi dari fuchsin dasar di bawah 0,3%, bagaimanapun, ditemukan mempengaruhi sensitivitas ZN (Selvakumar, 2005).

Secara garis besar berdasar pengecatan Gram, bakteri dikelompokkan menjadi 2, yaitu Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna gram A yang mengandung kistal violet, sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri Gram negatif akan berwarna merah atau merah muda, karena warna ungu dapat dilunturkan kemudian mengikat cat Gram D sebagai warna kontras. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Pada bakteri Gram positif susunan lebih sederhana terdiri atas 2 lapis namun memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal sementara pada dinding sel bakteri lebih kompleks terdiri atas 3 lapis namun lapisan peptidoglikan tipis (Juliantina, 2009).

Bakteri Lactobacillus sp. ini termasuk Gram positif, tidak berspora, tidak motil oleh flagel peritrichous, fakultatif anaerob, kadang-kadang mikroaerofilik, sedikit tumbuh di udara tapi bagus pada keadaan di bawah tekanan oksigen rendah, dan beberapa anaerob pada isolasi. Bakteri yang mendekati genus ini mempunyai ciri-ciri morfologi sebagai berikut: warna koloni putih susu atau agak krem, bentuk koloni bulat dengan tepian seperti wol. Sel berbentuk batang dan biasanya tetap, berukuran 0,5-1,2 x 1,0-10,0 μm (Feliatra, 2004).

Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri adalah pewarnaan Gram. Dalam proses ini olesan bakteri terfiksasi dikenai larutan sebagai berikut : ungu kristal, larutan yodium, alcohol (bahan pemucat), dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi 2 kelompok yaitu Gram positif mempertahankan zat pewarna ungu kristal dan karenanya tampak ungu tua. Kelompok lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan merah safranin, tampak bewarna merah (Pelczar, 1986).

Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna merah bila diamati dengan mikroskop. Bakteri Gram negatif (seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda di mana membran plasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luarnya. Banyak spesies bakteri Gram negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi

organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel Gram negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin) (Anonima, 2011).

Gram negatif yang paling terkenal adalah Veillonella alcalescens (dahulu Micrococcus lactilyticus) dan Megasphaera (dahulu Pepto streptococus). Kedua-duanya tidak mampu untuk meragikan karbohidrat. V. alcalescens ditemukan dalam ludah manusia dan hewan, dan juga perut besar hewan pemamah biak. Bakteri ini meragikan asam-asam organik menjadi propionat, asetat, CO2, H2 (Schlegel, 1994).

E.coli adalah suatu bakteri Gram negatif berbentuk batang, bersifat anaerobic fakultatif, dan mempunyai flagella peritrikat. E.coli dibedakan atas sifat scrologinya berdasarkan antigen O (somatik), K (kapsul), H(flagella). Medium selektif yang dapat digunakan untuk mengisolasi E.coli misalnya DHL (Desoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose) Agar atau MacConkey Agar. Koloni E.coli pada DHL dan MacConkey Agar berwarna merah dan dikelilingi oleh areal yang menunjukkan pengendapan bile. E.coli akan menfermentasikan laktosa dalam medium menjadi asam, sehingga mengakibatkan terjadinya pengendapan bile dan penyerapan indikator merah netral (Fardianz,1990).

Lactobacillus adalah suatu bakteri berbentuk batang, bervariasi dari panjang dan ramping sampai kokobaksilus pendek. Pembentukan rantai umum dijumpai, terutama pada fase pertumbuhan logaritma lanjut. Tidak membentuk spora. Gram positif berubah menjadi gram negatif dengan bertambahnya umur dan derajat keasaman. Beberapa galur memperlihatkan tubuh-tubuh bipolar, granulasi internal atau penampilan seperti batang dengan reaksi gram atau pewarna biru metilen (Pelczar, 1988).

Pewarnaan negatif adalah cara pengamatan mikrobiologi yang biasa dilakukan untuk membedakan spesimen kecil dengan cairan optiknya.Untuk mikroskop medan terang, pewarnaan negatif biasanya menggunakan cairan hitam misal nigrosin. Spesimen seperti bakteri dalam cairan disebar dalam preparat kaca yang dicampur dengan pewarna negatif dan dibiarkan kering. Ketika diamati dengan mikroskop, bakteri atau kadang sporanya terlihat bersinar dengan latar belakang yang gelap. Pewarnaan negatif atau pewarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel. Oleh karena itu sel menjadi tidak berwarna. Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat dan eosin (Anonimb, 2011).

Bakteri tahan asam adalah bakteri yang pada pengecatan Ziehl-Neelsen (ZN) tetap mengikat warna pertama, tidak luntur oleh asam dan alkohol, sehingga tidak mampu mengikat warna kedua. Bakteri tersebut ketika diamati dibawah mikroskop tampak berwarna merah dengan warna dasar biru muda. Terdapat lebih dari 50 spesies Mycobacterium, antara lain banyak yang merupakan saprofit (Anonimc,2011).

Prosedur pewarnaan yang umum digunakan pada masa kini yaitu pewarna Ziehl – Neelsen, prosedur ini menggunakan pewarna utama dengan pemanasan, dan biru metilena loeffler sebagai warna tandingan. Alkohol-asam merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol aseton yang banyak digunakan dalam pewarnaan gram. Pada kondisi pewarnaan ini,

organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Pada bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam (Hadioetomo, 1990)

D. METODOLOGI

1 1. Alat

a. Gelas objek

b. Gelas penutup

c. Batang gelas

d. Jarum oose

e. Pipet tetes

f. Rak tabung reaksi

g. Bunsen spirtus

h. Label dan tissue

i. Mikroskop cahaya

2. Bahan

a. Biakan murni Lactobacillus achidophilus, Escherichia coli dan Lactococcus sp.

b. Larutan cat nigrosin

c. Aquades

d. Alkohol 70%

e. Larutan cat Ziehl Neelsen carbol fuchsin

f. Larutan peluntur alkohol asam

g. Larutan penutup Loeffler methylen blue

h. Larutan cat Huker’s crystal violet

i. Larutan mordan Lugol’s iodine

j. Larutan peluntur alkohol-aseton

k. Larutan Safranin

E. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

Pewarnaan Gram termasuk pewarnaan differensial karena dapat digunakan untuk membedakan bakteri dalam dua kelompok besar yaitu Gram positif dan Gram negatif. Pada praktikum ini digunakan bakteri L. Achidophilus, E. coli, Lactococcus sp.

Pemberian kristal violet pada bakteri Gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan Gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri Gram positif mengandung protein dan Gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri Gram negatif sedangkan pada bakteri Gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Perbedaan dasar antara bakteri Gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri Gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalahfase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV (warna utama) iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada Gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa spesies yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.

Pembahasan

Pewarnaan acid-fast digunakan untuk membedakan antara bakteri tahan asam dan bakteri tidak tahan asam. Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna akibat alkohol-asam, dan penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses sehingga menghasilkan warna merah.

Pewarnaan menggunakan larutan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri tahan asam yang berwarna merah dengan latar berwarna biru. Bakteri tahan asam akan mempertahankan warna pertama yang diberikan. Hasil yang didapat adalah terdapatnya bakteri tahan asam. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi

pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri.

Pembahasan

Pewarnaan negatif merupakan pewarnaan dengan mencampurkan sampel dengan zat warna dan disebarkan menjadi lapisan tipis. Zat warna atau cat yang digunakan memiliki pengaruh yang lemah terhadap sel mikroorganisme. Pewarnaan ini dinamakan pengecatan negatif karena sel tidak diwarnai dan dibuat menjadi kasat mata karena latar belakang yang gelap.

Pada praktikum ini digunakan bakteri Lactobacillus achidophilus. Pewarnaan negatif ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

Pewarnaan negatif atau peawarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel. Oleh karena itu sel menjadi tidak berwarna. Untuk pengamatan menggunakan mikroskop elektron transmisi, kemampuan optis elektron berhubungan dengan nomor atom. Beberapa pewarna negatif seperti ammonium molybdate, uranil acetate, uranyl foemate, phosphotungstic acid dan auroglucotnionate dipilih karena mampu menyebarkan elekron dengan baik dan menyerap zat biologi dengan baik. Struktur yang dapat diamati dengan pewarnaan negatif lebih sedikit dari pada dengan pewarnaan biasa. Cara ini biasa digunakan untuk melihat virus, bakteri, flagel bakteri, struktur protein atau gabungan protein biologi membran yang memiliki pancaran elektron dengan kekuatan rendah. Pewarnaan negatif pada mikroskop cahaya atau mikroskop elektron tidak menimbulkan penularan mikroorganisme. Walau demikian keamanan harus tetap diperhatikan. Berbeda dengan pewarnaan lain, pewarnaan negatif memungkinkan organisme terlihat transparan dan tampak jelas diantara medan yang gelap karena pewarna tersebut tidak menembus mikroorganisme. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini juga berguna untuk bakteri-bakteri tertentu yang sukar diwarnai.

F. Kesimpulan

Kesimpulan yang didapatkan dari praktikum Morfologi dan Pewarnaan Bakteri ini antara lain:

a. Bakteri Gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

b. Kelompok bakteri yang merupakan Gram positif adalah L. Achidophyllus dan Lactococcus sp. Sedangkan kelompok bakteri yang merupakan Gram negatif adalah E. coli.

c. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri Gram negatif karena akan kehilangan cat utama setelah tahap dekolorasi sedangkan pada bakteri Gram positif menyebabkan sel menjadi berwarna ungu karena mengikat kuat cat utama dan tidak dapat dilunturkan oleh bahan peluntur.

d. Pewarnaan menggunakan larutan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri tahan asam yang berwarna merah dengan latar berwarna biru karena tahan terhadap pencucian dengan asam dan alkohol sehingga mempertahankan warna pertama yang diberikan. Sedangkan bakteri tidak tahan asam akan tampak berwarna biru karena cat pertama dilunturkan oleh asam dan alkohol kemudian mengikat cat kedua.

e. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.

f. Pewarnaan negatif atau pewarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif.

g. Beberapa pewarna negatif seperti ammonium molybdate, uranil acetate, uranyl foemate, phosphotungstic acid dan auroglucotnionate dipilih karena mampu menyebarkan elektron dengan baik dan menyerap zat biologi dengan baik.

DAFTAR PUSTAKA

Anonima. 2011. Gram Negatif. http://www.wikipedia.com. Diakses pada tanggal 2 Mei 2011 pukul 16.00 WIB.

Anonimb. 2011. Pewarnaan Negatif http://capuholic.blogspot.com/2010/02/ Diakses pada tanggal 2 Mei 2011 pukul 16.54 WIB.

Anonimc. 2011. Bakteri Tahan Asam . http://my.opera.com/chanlightz/blog. Diakses pada tanggal 2 Mei 2011 pukul 17.12 WIB.

Feliatra, dkk. 2004. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik dari Ikan kerapu Macan (Ephinephelus fuscogatus) dalam upaya Efisiensi Pakan Ikan. Jurnal Natur Indonesia 6(2).

Hadioetomo, Ratna Siri. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT Gramedia. Jakarta.

Fardianz, Srikandi. 1990. Analisis Mikrobiologi Pangan. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta.

Juliantina, Farida. 2009. Manfaat Sirih Merah sebagai Agen Anti Bakterial terhadap Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. Jurnal Kedokteran dan Kesehatan Indonesia.

Pelczar, Michael J. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi 1. UI press. Jakarta.

Pelczar, Michael J. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi 2. UI press. Jakarta.

Raoul, Da’si Kemgni, dkk. 2009. A Faster and saver staining technique for acid fast bacilli in resource-poor settting. Vol 1.(5), May.

Schlegel, Hans G.1994. Mikrobiologi Umum. UGM press. Yogyakarta.

Selvakumar, N, dkk. 2005. Comparison of variants of carbol-fuchsin solution in Ziehl-Neelsen for detection of acid-fast bacilli. Int J Tuberc Dis 9(2). New Delhi, India.