BAB 4: ANALISIS DETEKSI PROTEIN

Oleh : Reyhan Jonathan / Teknik Kimia / 1206263420

ABSTRAK

Protein adalah polimer dari asam amino dan merupakan makromolekul berbobot molekul tinggi. Fungsi protein secara umum sebagai sumber energy ketika kebutuhan tubuh terhadap energy tidak terpenuhi oleh karbohidrat dan lemak.sebagai bahan structural, sebagai enzim dan sebagai mesin yang bekerja pada tingkat molecular. Terdapat dua metode yang bisa menganalisis protein, yaitu secara kualitatif dan kuantitatif. Analisis secara kualitatif terdiri dari, analisis berat molekul (elektroforesis protein), struktur (kristalografi sinar X, spektroskopi NMR, CD-spektroskopi), urutan asam amino (sekuensing), uji asam amino (xantoprotein, reaksi Hopkins-cole, reaksi natriumnitroprusida, reaksi sakaguchi), uji protein (uji biuret, uji ninhidrin, reaksi millon). Lalu analisis kuantitatif terdiri dari analisis langsung (spektromometri langsung), pewarnaan (metode lowry, metode buiret, uji BCA, uji Bradford), titrasi (kjehdahl, titrasi formol).

Kata Kunci

Protein, asam anmino, metode kualitatif, metode kuantitatif, amino acid analysis, CDS, X-Ray chrystallography, NMR Spectroscopy, uji komposisi secara umum, dengan sulfur, dengan nitrogen organic, ninhidrin, sakaguchi, sulfur, biuret, millon, xantoprotein, natriumnitroprusida, Hopkins cole, metode kjehdahl dan spektroskopi UV-VIS, uji Bradford, uji BCA.

4.1. PENDAHULUAN

Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus. Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton. Protein terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali dalam bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan juga dalam transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino bagi organisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut (heterotrof).

4.2. ANALISIS DETEKSI PROTEIN

Protein tidaklah sama antara yang satu dan yang lainnya. Protein dibedakan berdasarkan tipe, jumlah, dan juga susunan asam aminonya. Perbedaan yang ada ini menyebabkan perbedaan struktur molecular, kandungan nutrisi, dan sifat fisiokimia. Dalam menganalisis makanan, mengetahui kadar total, jenis, struktur molekul dan sifat fungsional dari protein sangatlah penting. Untuk menganalisis protein pada bahan makanan terdapat dua metode yang bisa digunakan, yaitu secara kualitatif dan kuantitatif.

4.2.1. METODE KUALITATIFAnalisis protein secara kualitatif memiliki tujuan untuk mengetahui analisis struktur, uji

komposisi protein, analisis bikomia & biofisika, dan uji reaksi warna.

4.2.1.1. ANALISIS BERAT MOLEKUL

A. Elektroforesis ProteinSeperti halnya dengan elektroforesis DNA, elektroforesis protein memungkinkan kita untuk

memisahkan protein berdasarkan ukurannya dan memperlihatkan hasilnya. Akan tetapi protein jauh lebih beragam dalam ukuran dan strukturnya, karena itu tekniknya jauh lebih rumit. Pada dasarnya alat elektroforesis terdiri atas 2 bagian utama yaitu bagian electric transformer yang mengubah arus AC ke DC dan bagian tanki elektroforesis yang berisi flat bed, slab, column, dan selang. Beberapa faktor yang mempengaruhi pemisahan komponen pada elektroforesis protein :

1. Densitas muatan molekul – berbeda diantara pH media dan pl molekul.

2. Pengaruh buffer

- pH : akan mempengaruhi densitas muatan protein dan akibatnya mempengaruhi tingkat dan arah pergerakannya

- Kekuatan ionik : mempengaruhi tingkat pemisahan

- Komposisi : bisa berinteraksi dengan protein menyebabkan perubahan dalam densitas muatan sebagai contoh ion borak dan glikoprotein.

3. Bentuk dan ukuran molekul

4. media pendukung

-  Restriksi pada mobilitas

-  Pengaruh difusi

-  Elektroendosmosis

-  Mikro-heterogenitas molekuler spesies

4.2.1.2. ANALISIS STRUKTUR

A. Circular Dichroism Spectroscopy / CD spektroskopiMetode Circular Dichroism Spectroscopy (CDS) ini digunakan untuk menganalisis struktur

sekunder dan struktur tersier. Selain itu fungsi CDS ini juga untuk menunjukkan perbandingan konformasi dan menentukan apakah interaksi protein-protein atau protein-ligan mengubah konformasi protein. Prinsip dari metode CDS ini adalah mengukur perbedaan penyerapan left-handed polarized light right-handed polarized light. Spektrum-spektrum CD dari puntiran-alfa menunjukkan dua absorbans negative pada panjang gelombang 208 nm dan 220 nm, lempeng beta menujukkan satu puncak negative sekitar 210-216 nm. Dengan membangun database protein berstruktur serupa, melalui analisa computer, dapat dipisahkan elemen dari masing-masing struktur. Dipadu dengan kekuatan tools bioinformatika sehingga bisa diperoleh struktur protein

yang bersangkutan, walaupun memang tidak menjelaskan secara terperinci hingga level atom struktur protein.

B. X-Ray Crystallography / Kristalografi Sinar XX-ray Crystollography merupakan salah satu metode yang digunakan untuk menentukan

struktur tersier dari protein. X-ray crystallography pada dasarnya adalah sebuah bentuk mikroskop yang beresolusi tinggi. Sehingga memungkinan untuk memvisualisasikan struktur protein sampai tingkat atom. Berdasarkan gambar 2 dapat terlihat bahwa lebih dari 85% struktur protein bisa teridentifikasi dengan menggunakan x-ray crystallography ini.

Mengapa menggunakan sinar X? karena untuk melihat protein secara detai atom, diperlukan radiasi elektromagnetik dengan panjang gelombang 0,1 nm atau dengan kata lain menggunakan sinar x. Prinsip kerjanya adalah mengukur sudut dan intensitas dari Kristal terdifraksi yang bisa menghasilkan gambar tiga dimensi dari kepadatan electron di dalam Kristal. Pada mikroskop cahaya, subjek disinari dengan cahaya dan menyebabkan radiasi yang akan terdifraksi ke segala arah oleh kristal. Balok difraksi kemudian akan dikumpulkan, dan dengan focus dan perbesaran dari lensa mikroskop akan memberikan gambar yang diperbesar dari objek. Hal yang diharapkan adalah belok terdifraksi dan difokuskan dengan menggunakan magnet, namun hal itu tidak memungkinkan sehingga harus dilakukan secara matematis.

Hal pertama yang harus dilakukan adalah mempersiapkan sampel murni yang akan digolongkan dengan beberapa kriteria. Sebelum percobaan dimulai, sampel yang dipilih harus dikristalkan terlebih dahulu. Setelah Kristal telah ada, maka Kristal tersebut akan diuji dengan menggunakan sinar x dan kemudian mengumpulkan data x-ray (pastikan simetri Kristal, parameter sel satuan, orientasi Kristal, dan batas resolusi). Semakin rendah simetri, maka lebih banyak data yang dubutuhkan. Setelah data terkupul, maka akan dipecahkan solusi struktur dan akhirnya membuat model bangunan protein untuk model awal, dari model awal tersebut dilakukan evaluasi untuk menyempurnakan hasil analisis.

C. NMR Spectroscopy / Spektroskopi NMRMetode NMR Spectroscopy untuk menentukan struktur tersier protein. Biasanya, metode ini

digunakan untuk menganalisis protein yang memiliki asam amino hidrofobik yang sulit untuk dikristalkan sehingga tidak dapat dianalisis dengan metode x-ray crystallography. NMR digunakan untuk menentukan struktur dari komponen alami dan sintetik yang baru, kemurnnian dari komponen, dan arah reaksi kimia sebagaimana hubungan komponen dalam laritan yang dapat mengalami reaksi kimia.

Inti proton (atom hydrogen) dan karbon (karbonn 13) mempunyai sifat-sifat magnet. Bila suatu senyawa mengandung hydrogen atau karbon diletakkan dalam bidag magnet yang sangat kuat dan diradiasi dengan radiasi elektromagnetik maka inti atom hydrogen dan karbon dari senyawa tersebut akan menyerap energy melalui suatu proses adsorpsi yang dikenal dengan resonansi magnetic. Untuk protein dan protein kompleks dengan berat massa molekul sekitar 25-30 kDa, kualitas spectra menurun dengan cepat membatasi mayor A ketika bekerja dengan makromolekul besar yang berasal dari kecepatan relaksasi tinggi signal NMR.

4.2.1.3. UJI URUTAN ASAM AMINO

A. Sekuensing

Sekuensing protein atau sekuensing peptida adalah penentuan urutan asam amino pada suatu protein atau peptida (oligopeptida maupun polipeptida). Metode untuk sekuensing protein umumnya melibatkan pemutusan ikatan yang diikuti dengan identifikasi asam amino.

Pada metode degradasi Edman, residu pada ujung-N (ujung amino) protein dipotong satu per satu dengan reaksi kimia. Setelah setiap pemotongan, residu asam amino yang telah dipotong tersebut dapat diidentifikasi menggunakan kromatografi. Prosedur tersebut diulangi untuk setiap residu asam amino. Kelemahan metode ini adalah bahwa polipeptida yang di-sekuensing tidak dapat lebih panjang dari 50–60 residu (dapat disiasati dengan memotong-motong polipeptida berukuran besar menjadi peptida-peptida berukuran lebih kecil sebelum dilakukan reaksi).

4.2.1.4. UJI ASAM AMINO

A. Uji XantoproteinLarutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah

dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin, fenilalanin dan triptofan.

B. Uji Reaksi Hopkins-ColeLarutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole

yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air.

Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut.

C. Uji Reaksi NatriumnitroprusidaPada asam amino sistein, selain memiliki gugus –COOH, -NH2, dan gugus R, juga terdapat

gugus –SH bebas, yaitu gugus sulfidril. Apabila gugus ini bereaksi dengan natrium nitroprusida dalam ammonia berlebih maka akan menghasilkan kompleks yang berwarna merah. Beberapa protein yang memberikan hasil negative ketika diuji menggunakan uji natrium ropusida ini ternyata akan menjadi poritiv apabila dipnasakan sampai mengalami koagulasi atau denaturasi. Denaturasi adalah proses yang mengubah struktur molekul tanpa memutuskan ikatan kovalen. Hal ini menunjukkkan bahwa pada proses menghasilkan gugus –SH bebas.

D. Uji Reaksi Sakaguchi

Pada metode Sakaguchi ini, Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan natriumhipobromit. Pada dasarnya reaksi ini memberikan hasil positif apabila ada gugus guanidin. Jadi arginin atau protein yang mengandung arginin dapat menghasilkan warna merah.

4.2.1.5. UJI PROTEIN

A. Uji NinhidrinNinhidrin adalah salah satu reagen yang memiliki fungsi untuk mendeteksi asam ami no dan

menetapkan konsentrasinya dalam larutan. Semua asam amino alfa bereaksi dengan ninhidrin membentuk aldehid dengan satu atom C lebih rendah dan melepaskan NH3 dan CO2. Selain itu juga terbentuk kompleks berwara biru yang diperkirakan disebabkan oleh 2 molekul ninhidrin yang bereaksi dengan NH3 setelah asam amino tersebut dioksidasi. Hal-hal yang perlu dilakukan pada metode ini antara lain:

Menyediakan tabun reaksi yang diisi dengan albumin, kasein, gelatin, dan gissin (sampel) Menambahkan 5 teter pereaksi ninhidrin

Memanaskan dengan air hingga mendidihPada percobaan tadi, albumin, gelatin, dan fenilanin membentuk warna biru/ungu karena

bereaksi dengan ninhidrin menandakan adanya asam amino. Selain protein, hasil positif jug diberikan oleh pepton, asam amino, dan amin primer lainnya.

B. Uji SulfurDengan menggunakan metode ini maka akan diketahui asam amino yang mengandung sulfur.

Jika larutan protein didihkan dengan campuran larutan KOH atau NaOH dan Pb-asetat, maka akan terbentuk endapan berwarna hitam apabila terdapat asam amino yang mengandung sulfur. Contoh protein yang mengandung sulfur adalah sistein dan metionin. Laruta basa kuat memutus ikatan sulfur pada asam amino, membentuk K2S yang akan bereaksi dengan Pb-asetat membentuk PbS, senyawa yang berwarna hitam. Namun, metionin tidak positif dengan metode uji ini kecuali apabila larutan protein tersebut terlebih dahulu dipanaskan dengan asam mineral.

C. Uji BiuretLarutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji

ini untuk menunjukkan adanya senyawasenyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet.

D. Uji Reaksi MillonPereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi

ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna.

4.2.2. METODE KUANTITATIFMetode Kuantitatif terdiri dari metode langsung ( spektrofotometri langsung), pewarnaan (metode lowry, metode biuret, uji BCA, uji Bradford), titrasi(kjehdahl, titrasi formol)

4.2.2.1. METODE TITRASI

A. Metode KjehdahlMetode ini merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam

amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan alkali dengan kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi.

Metode ini terbagi menjadi 3 cara, yaitu Disgestion, Neutralization, Titration.

a. Disgestion

Sampel makanan yang dianalisis dipanaskan di dalam asam sulfat pekat (sebagai oksidator yang dapat mendigesti sampel) sehingga akan terjadi pemecahan enjadi unsure-unsurnya. Seringkali juga ditambahkan natrium sulfat anhidrat untuk mempercepat tercapainya titik didih dan katalis seperi selenium untuk mempercepat reaksi. Suhu destruksi ini berkisar antara 370-410oC. disgesti mengubah nitrogen pada sampel menjadi ammonia, sementara itu unsure organic lain berubah menjadi CO2 dan H2O. Proses destruksi sudah selesai apabila larutan menjadi jernih atau tidak berwarna lagi. Reaksi yang terjadi adalah:

b. NeutralizationLarutan yang telah didigesti kemudia ditambahkan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan sehingga ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia. Ammonia yang telah bebas selanjutnya akan berikatan oleh larutan asam standar. Larutan asam standar yang digunakan adalah asam borat 2% dalam jumlah ynag berlebihan. Rendahnya ph larutan di labu penerima mengubah gas ammonia menjadi ion ammonium serta mengubah asam borat menjadi ion borat. Destilasi diakhiri bila semua ammonia sudah terdestilasi sempurna dengan ditandai destilat tidak bereaksi basa. Reaksi yang terjadi adalah:

c. TitrationKandungan nitrogen kemudia diestimasi dengan titrasi ion ammonium borat yang terbentuk dan menggunakan indicator yang sesuai untuk menentukan titik akhir titrasi, ditandai dengan perubahan warna larutan dari kuning menjadi orange. Kadar air ion hydrogen yang dibutuhkan untuk mencapai titik akhir setara dengan kadar nitrogen dalam sampel makanan. Reaksi yang terjadi adalah:

Persamaan yang digunakan untuk menentukan kadar nitrogen dalam mg sampel dengan menggunakan asam klorida adalah:

Setelah kadar nitrogen ditentukan, maka dikonversikan menjadi kadar protein dengan faktor konversi yang sesuai:

Kelebihan yang dimiliki metode Kjeldahl antara lain: Metode ini digunakan secara luas di seluruh dunia Sifatnya universal, presisi tinggi, dan reprodusibilitas baik membuat metode ini banyak

untuk penetapan kadar protein.

Kekurangan dari metode Kjeldahl adalah: Tidak memberikan pengukuran protein yang sesungguhnya (yang dihitung adalah

nitrogen). Penggunaan asam sulfat pada suhu tinggi bisa berbahaya Waktu yang dibutuhkan cukup lama

B. Metode Titrasi Formol

Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik.

4.2.2.2. METODE LANGSUNG

A. Spektrofotometri langsung pada 280 nmMetode spektroskopi ini memanfaatkan kemampuan protein untuk menyerap atau

menyebarkan cahaya pada rentang UV-visible pada setrum elektromagnetik. Semua serapan kurva kalibrasi vs kadar protein disiapkan menggunakan ser larutan protein yang telah diketahui kadarnya. Serapan larutan yang dianalisis kemudian diukur pada panjang gelombang yang sama dan kadar protein ditentukan dari kurva kalibrasi. Perbedaan utama dari pengujian ini adalah gugus fungsi yang berperan untuk absorbs atau pembiasan elektromagnetik. Triptofan dan tirosin mengabsorbs cahaya pada 280 nm. Sehingga panjang gelombang tersebut dapat digunakan untuk menentukan kadarnya. Keuntungan dari metode ini adalah sangat sederhana untuk dilakukan karena tidak membutuhkan reagen tertentu. Namun kekurangannya adalah asam nukleat juga mengabsorbsi pada panjang gelombang 280 nm.

4.2.2.3. METODE PEWARNAAN

A. Metode LowryPada metode ini, protein bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteau membentuk senyawa

kompleks berwarna. Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca antara 500-750 nm. Pembentukan warna tersebut disebabkan karena reaksi alkaline copper dengan protein sebagaimana uji biuret oleh tirosin dan triptofan yang terdapat pada protein. Metode ini umunya digunakan pada analisis biokimia, dan bersifat lebih sensitive untuk protein dengan konsentrasi rendah dibandingkan metode biuret. Secara umum keuntungan dari teknik ini adalah teknik ini merupakan teknik yang cepat dan sederhana serta sensitive pada protein meskipun konsentrasinya rendah. Namun teknik ini juga memiliki kerugian yaitu terlalu sensitifnya alat sehingga sampel harus sangat encer dan tidak boleh mengandung kontaminan sehingga harus melewati beberapa proses preparasi. Kelemahan lainnya adalah serapan tergantung pada jenis protein.

B. Metode BiuretLarutan protein ditambahkan dengan reagen biuret, dicampur dan kemudian dihangatkan

pada suhu 37oC selama kurang lebih 10 menit. Kemudian didinginkan dan ekstinsi dibaca pada gelombang dengan panjang 540 nm. Warna violet akan terbentuk bila ion cupri berinteraksi dengan ikatan peptide dalam suasan basa. Keuntungan dari teknik ini adalah tidak adanya gangguan dari senyawa yang menyerap pada panjang gelombang yang lebih renda. Teknik ini kurang sensitive pada jenis protein.

C. Uji BCAPada uji BCA (Bicinchoninic Acid), Cu+ membentuk kompleks ungu gelap dengan BCA, yang

memungkinkan protein ditentukan dalam kisaran 0,0005 – 2 mg/mL. Uji ini sering disebut “uji Pierce” sesuai dengan produsen kit reagen. Ion kupri berkoordinasi dengan 4 ikatan peptida, yang mereduksinya menjadi ion kupro dan memungkinkan ia membentuk kompleks dengan BCA yang menyerap sekitar 540 nm, menghasilkan menghasilkan warna. Uji protein dengan BCA meningkatkan kepekaan uji biuret dengan faktor sekitar 100, dan memberikan manfaat penting kompatibi-litas dengan sampel yang mengandung sampai 5% surfaktan. Hal ini dicapai dengan kelasi asam bisinkoninat (bicinchoninic acid) dengan ion tembaga yang dibentuk oleh reaksi biuret. Hal ini meningkatkan sensitivitas karena  BCA/kompleks tembaga larut air menyerap jauh lebih kuat daripada peptida/kompleks tembaga.

D. Uji BradfordUji Bradford adalah suatu uji untuk mengukur konsentrasi protein total dengan secara

kolorimetri dalam suatu larutan. Dalam uji Bradford melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue (CBB) yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam sehingga memberikan warna (kebiruan). Karena menghasilkan warna, sehingga secara kolorimetri dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri (Lambert‐Beer) pada panjang gelombang 465‐595 nm (cahaya tampak).

KESIMPULANProtein merupakan makromolekul berbobot molekul tinggi. Terdapat dua metode yang bisa menganalisis protein, yaitu secara kualitatif dan kuantitatif. Secara kualitatif dapat dianalisis struktur, uji komposisi protein, uji urutan asam amino, uji asam amino dan uji berat molekul. Untuk menguji secara struktur dapat digunakan aino acid analysis untuk menanalisis struktur primer, metode CDS untuk menganalisis struktur sekunder, serta kristalografi sinar X dan NMR Spectroscopy untuk menganalisis struktur tersier dari protein. Lalu untuk menganalisis berat molekul dari protein, dapat digunakan metode elektroforesis protein. Untuk mengetahui urutan asam amino, dilakukan dengan proses sekuesing untuk mengurutkannya. Untuk melakukan metode uji asam amino, dapat dipakai metode xantoprotein, reaksi Hopkins-cole, reaksi natriumnitroprusida, dan reaksi sakaguchi dengan melihat warna-warna yang akan muncul setelah reaksi terjadi, sehingga dapat mengetahui karakteristik asam amino. Lalu, untuk melakukan uji protein, dapat dilakukan dengan uji biuret, uji ninhidrin, dan reaksi millon. Secara kuantitatif, terdapat juga beberapa metode, yaitu metode langsung, metode pewarnaan, dan metode titrasi. Untuk metode langsung, terdapat metode spetrofotometri langsung dengan menggunakan kemampuan protein untuk menyerap atau memancarkan cahaya pada panjang gelombang 280 nm. Untuk metode pewarnaan, terdapat metode lowry dengan membentuk senyawa kompleks berwarna setelah reaksi, metode biuret, uji BCA, dan uji Bradford. Untuk metode yang terakhir, yaitu titrasi, dapat dilakukan dengan metode kjehdahl dengan prinsip penetapan nitrogen total pada asam amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen, dan juga uji titrasi formol.

REFERENSI

Anonim. 2008. Protein. (http://www.wikipedia.com) diakses tanggal 18 Maret 2014.Sudarmaji, S, dkk. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Penerbit Liberty: Yogyakarta.Page, D.S. 1997. Prinsip-prinsip Biokimia. Erlangga: Jakarta.Santoso, H. 2008. Protein dan Enzim. (http://www.heruswn.teachnology. com) Sloane, E. 2004. Anatomi dan Fisiologi untuk Pemula. Penerbit Buku Kedokteran EGC: Jakarta.Anonim. 2007. Manfaat Protein dalam Kehidupan Sehari-hari. (http://www.blogger.com) Sudjadi, A. dan Rohman. 2004. Analisis Obat dan Makanan cetakan I. Yogyakarta: YayasanFarmasi Indonesia.Apriyantono, A. dkk. 1989. Analisis Pangan. Bogor: Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi IPB.Poedjiadi, A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Penerbit UI-Press.Kamal, M. 1991. Nutrisi Ternak Dasar. Laboratorium Makanan Ternak, Yogyakarta: UGM