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Dirección General de Epidemiología
Instituto de Diagnóstico y referencia Epidemiológicos“Dr. Manuel Martínez Báez”
lineamientos para la vigilancia epidemiológicade leishmaniasis por laboratorio
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LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA
DE LEISHMANIASIS POR LABORATORIO
DGE-InDRE–RNLSP
2015
Fotografía de la portada propiedad de HKS Arquitectos
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PRIMERA EDICIÓN, 2015 LEISHMANIASIS–RNLSP ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE
CONFORMAN EL GRUPO TÉCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMITÉ NACIONAL PARA LA
VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA (CONAVE). TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY © INDRE-DGE-SECRETARÍA DE SALUD SE PERMITE LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: “LINEAMIENTOS
PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE LEISHMANIASIS POR LABORATORIO” VERSIÓN
NO. 01. INDRE, 2015. COLECCIÓN PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE: ISBN: EN PROCESO INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DR. MANUEL MARTÍNEZ
BÁEZ. FRANCISCO P MIRANDA 177, COL. LOMAS DE PLATEROS DEL. ÁLVARO OBREGÓN, C. P. 01480, MÉXICO, D. F. WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX TEL. (55)53-42-75-50 LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO DEL DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LÓPEZ IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO
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SECRETARÍA DE SALUD
DRA. MERCEDES JUAN LÓPEZ SECRETARIA DE SALUD
DR. EDUARDO GONZÁLEZ PIER
SUBSECRETARIO DE INTEGRACIÓN Y DESARROLLO DEL SECTOR SALUD
DR. PABLO ANTONIO KURI MORALES SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD
LIC. MARCELA GUILLERMINA VELASCO GONZÁLEZ
SUBSECRETARIA DE ADMINISTRACIÓN Y FINANZAS
DR. GABRIEL O´SHEA CUEVAS COMISIONADO NACIONAL DE PROTECCIÓN SOCIAL EN SALUD
LIC. MIKEL ARRIOLA PEÑALOZA
COMISIONADO FEDERAL DE PROTECCIÓN CONTRA RIESGOS SANITARIOS
DR. JOSÉ MELJEM MOCTEZUMA COMISIONADO NACIONAL DE ARBITRAJE MÉDICO
DR. GUILLERMO MIGUEL RUIZ-PALACIOS Y SANTOS
TITULAR DE LA COMISIÓN COORDINADORA DE INSTITUTOS NACIONALES DE SALUD Y
HOSPITALES DE ALTA ESPECIALIDAD
LIC. RODRIGO REINA LICEAGA TITULAR DE LA UNIDAD COORDINADORA DE VINCULACIÓN Y PARTICIPACIÓN SOCIAL
DR. NELLY AGUILERA ABURTO
TITULAR DE LA UNIDAD DE ANÁLISIS ECONÓMICO
LIC. CARLOS SANDOVAL LEYVA DIRECTOR GENERAL DE COMUNICACIÓN SOCIAL
DR. JESÚS FELIPE GONZÁLEZ ROLDAN
DIRECTOR GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE PROGRAMAS PREVENTIVOS Y CONTROL
DE ENFERMEDADES
DR. EDUARDO JARAMILLO NAVARRETE DIRECTOR GENERAL DE PROMOCIÓN DE LA SALUD
DR. CUITLÁHUAC RUIZ MATUS
DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA
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LIC. JUAN CARLOS REYES OROPEZA DIRECTOR GENERAL DE INFORMACIÓN EN SALUD
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INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
DR. MANUEL MARTÍNEZ BÁEZ
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ
DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS
DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO
LIC. ADRIANA CASRTRO CABRERA
SUBDIRECTORA DE OPERACIÓN
BIOL. NORMA ANGÉLICA MONTES COLIMA
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA
QBP. IRMA HERNÁNDEZ MONROY
ASESORA TÉCNICA DE LA DIRECCIÓN
M. EN C. BÉLEN TORRES LONGORIA
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA
QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS
DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA
M. EN C. JUDITH ESTEVEZ RAMÍREZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS
DR. JOSÉ ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y
VALIDACIÓN DE TÉCNICAS
M. EN C. JUAN CARLOS CARPIO PEDROZA
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA
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QFB. OCTAVIO CÉSAR RIVERA HERNÁNDEZ
JEFE DEL LABORATORIO DE LEISHMANIA
COORDINADOR DE LA RED DE DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIA
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GRUPO DE TRABAJO
QFB. OCTAVIO CÉSAR RIVERA HERNÁNDEZ
JEFE DEL LABORATORIO DE LEISHMANIA
COORDINADOR DE LA RED DE DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIA
QFB. ROCIO ROBLEDO CARREÓN
QFB. CRISTHIAN ZUÑIGA ORTEGA
TEC. BEATRIZ ORNELAS PÉREZ
ADSCRITOS AL LABORATORIO DE LEISHMANIA
IBT. SUSANA CHÁVEZ LÓPEZ
DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA
BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ
DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
DR. HUGO MARTÍNEZ ROJANO
ASESOR TÉCNICO DE LA DIRECCIÓN GENERAL ADJUNTA DEL INDRE
COORDINADOR DE MEDICINA LABORAL
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
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LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA
EPIDEMIOLÓGICA DE
LEISHMANIASIS POR LABORATORIO
DGE-INDRE–RNLSP
2015
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ÍNDICE
INTRODUCCIÓN 10
ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA PARA EL DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIASIS 11
MARCO LEGAL 12
DEFINICIONES OPERATIVAS 13
OBJETIVOS 14
RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA LEISHMANIASIS 15
ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE LEISHMANIASIS 15
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE LEISHMANIASIS 16
DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS POR LABORATORIO 20
TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS CLÍNICAS 20 ALGORITMO DIAGNÓSTICO DE LA LEISHMANIASIS 22 ESTÁNDAR DE CALIDAD 25 CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZO 26 CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS 28 PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED) 28 CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO 31
BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO 32
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES 33
BIBLIOGRAFÍA 34
ANEXOS 36
ANEXO I. TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS 37
ANEXO II. PREPARACIÓN DE REACTIVOS 53
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INTRODUCCIÓN
Panorama epidemiológico
En México la leishmaniasis es una enfermedad parasitaria causada por un
protozoario perteneciente al género Leishmania, transmitida por un vector
(Lutzomia), conocido en algunas zonas del país como jején, papalotilla, palomilla,
quemador. La enfermedad en el ser humano se presenta de 4 formas clínicas:
cutánea localizada (LCL), cutánea diseminada (LCD), mucocutánea (LMC) y
visceral (LV) siendo esta última la forma clínica más grave, se presenta en niños
menores de 5 años y puede ser mortal. La enfermedad es endémica en muchas
regiones tropicales y subtropicales del mundo y está considerada por la
Organización Mundial de la Salud (OMS) como una de las Enfermedades Tropicales
desatendidas.
En nuestro país, la mayoría de los casos de leishmaniasis corresponden a LCL,
principalmente en el sureste del país en los estados de Veracruz, Tabasco, Oaxaca,
Chiapas, Yucatán, Quintana Roo y Campeche, lo que constituye el foco sur, de igual
manera se han reportado casos en Coahuila, Nuevo León, Tamaulipas, Hidalgo, San
Luis Potosí (foco norte), aunque también en Nayarit en el Noroeste se ha presentado
casos. La leishmaniasis cutánea diseminada se ha reportado con menor frecuencia
y se localizan en ambos focos (sur y norte), con excepción de Yucatán y Quintana
Roo. Los casos de LMC se han detectado en los estados de Veracruz, Tabasco,
Chiapas y Oaxaca. En cuanto a la LV existe un foco en la cuenca del río Balsas, entre
los estados de Guerrero, Puebla, Morelos y otro foco en Chiapas.
Las leishmaniasis son parasitosis consideradas como zoonosis, donde pequeños
mamíferos silvestres y cánidos domésticos son reservorios importantes. Las
acciones de vigilancia epidemiológica se apoyan en el Sistema Nacional de Vigilancia
Epidemiológica (SiNaVE), el cual cuenta con el laboratorio de leishmaniasis del
Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) para llevar a cabo
las actividades para el diagnóstico, control de calidad y referencia de esta
enfermedad de manera oportuna y uniforme.
El presente documento establece los lineamientos de operación para la vigilancia
basada en el laboratorio de leishmaniasis incluyendo las funciones por niveles; la
toma, manejo y envío de muestras; la metodología para el análisis de muestras, la
evaluación del desempeño así como los estándares de calidad.
Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública
La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) es el conjunto de laboratorios para la vigilancia epidemiológica con objetivos específicos que le han permitido unificar métodos de diagnóstico, criterios de interpretación de resultados, transferencia tecnológica, generación de conocimiento y formación de recursos
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humanos. Es el soporte técnico-científico útil para la vigilancia epidemiológica y que genera información de calidad para la toma oportuna de decisiones a través de la confirmación de diagnósticos mediante estudios de laboratorio en muestras biológicas.
La RNLSP depende de la Secretaría de Salud y es el Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) su órgano rector en el área de vigilancia epidemiológica. Tiene fundamento legal en la Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica y está conformada por 31 Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) de las 32 entidades federativas del país (el Distrito Federal envía sus muestras al InDRE).
El Marco Analítico Básico de la RNLSP consta de 27 diagnósticos, distribuidos en 16 redes de vigilancia específica.
ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE
SALUD PÚBLICA PARA EL DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIASIS
La Leishmaniasis cutánea fue descrita por vez primera en la Península de Yucatán
por Seidelin en 1992, quien la denominó “úlcera de los chicleros”, el primer estudio
epidemiológico sobre la leishmaniasis en México fue realizado por Beltrán y
Bustamante en el Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales (ISET), hoy
Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos Dr. Manuel Martínez Báez
(InDRE), en el año de 1942, de los campamentos de chicleros de la península de
Yucatán. En 1950, se logró aislar el primer caso de leismaniasis visceral en México,
que es la forma más grave de la enfermedad, conocida como Kala-azar.
En 1983 inició el estudio de tripanosomátidos (Tripanosoma cruzi y Leishmania
sp) en México. Un año después se crearon los ceparios de Leishmania sp y T. cruzi,
así como el montaje de técnicas de diagnóstico serológico preparado con antígenos
propios. La técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) fue la primera en ser
estandarizada como metodología de referencia para el diagnóstico de Leishmania.
En 1994, se crea el laboratorio de Leishmaniasis.
A partir del 2005 el laboratorio se incorpora al programa de Evaluación Externa del
Desempeño para los Microscopistas de la Red de Parasitosis Transmitidas por
Vector. El Laboratorio de Leishmania apoya a los programas de Vigilancia
Epidemiológica de La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP)
mediante un diagnóstico que se basa en el cuadro clínico y antecedentes de
residencia o procedencia de áreas endémicas con transmisión de la enfermedad,
demostración directa al microscopio e indirectamente por inmunología, serología y
PCR (NOM-032-SSA2-2010).
Uno de los objetivos del InDRE en los que el laboratorio de leishmaniasis participa
de forma permanente es la formación de recursos humanos, impartiendo
anualmente un curso de “Actualización de Enfermedades Transmitidas por Vector”,
tanto para la RNLSP como para todo el sector salud. Así mismo, se imparten cursos
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dirigidos al personal técnico de la RNLSP sobre las diferentes técnicas diagnósticas
que se encuentran instauradas en el InDRE. La vigilancia epidemiológica es esencial
para establecer el impacto de la enfermedad y evaluar los esfuerzos de control de la
transmisión y detección de epidemias.
Como parte del Programa de Acción para la Prevención y Control de Enfermedades
Transmitidas por Vector, se recomienda aplicar insecticidas de acción residual en
viviendas, erradicar las hojarascas y maleza creciente alrededor de las viviendas,
promover el uso de pabellones, mosquiteros o telas metálicas, en especial en
exteriores, uso de repelente para insectos y vestimenta que cubra extremidades
superiores e inferiores.
En enero del 2012 el laboratorio de leishmaniasis se certifica bajo los requerimientos
de la norma ISO 9001:2008. Sistema de Gestión de la Calidad.
MARCO LEGAL
1. Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. DOF
05/02/1917, Última Reforma D.O.F. 15/02/2012.
2. Ley General de Salud. Artículo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y 141.
DOF 7/02/1984, Última Reforma DOF 07/06/2012.
3. Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012. Para la vigilancia epidemiológica.
(DOF: 19/02/2013)
4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Protección
ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos-Clasificación
y especificaciones de manejo. (DOF: 17/02/2003).
5. Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005. Que establece las
características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados
de los residuos peligrosos. (DOF: 23/06/2006).
6. Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010. Para la vigilancia
epidemiológica, prevención y control de enfermedades transmitidas por
vector. (DOF: 01/06/2011).
7. Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011. Para la organización y
funcionamiento de los laboratorios clínicos. (DOF: 27/03/2012).
8. Lineamientos para los programas de evaluación externa del desempeño de la
Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, InDRE-Secretaría de Salud,
2014.
9. Criterios de Operación para la Red Nacional de Laboratorios de Salud
Pública, InDRE-Secretaría de Salud, 2014.
10. Reglamento Interior de la Secretaría de Salud, publicado en el Diario Oficial
de la Federación el 19 de enero del 2004.
11. Secretaría de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial
de la Federación DOF: 12/12/2013.
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12. Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario Oficial de la Federación, DOF:
20/05/2013, www.dof.gob.mx
13. Secretaría de Salud. Programa de Acción Específico 2013-2018. Sistema
Nacional de Vigilancia Epidemiológica, primera edición 2014.
DEFINICIONES OPERATIVAS
Leishmaniasis, se denomina así a la enfermedad zoonótica con afectaciones dérmicas cutáneas o visceral causada por protozoarios del género Leishmania, de las especies L. mexicana, L. brasiliensis, y L. chagasi, los cuales son transmitidos de una persona infectada a una sana mediante la picadura de insectos hematófagos del género Lutzomyia. (Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010).
Caso sospechoso: Toda persona con cuadro inespecífico de Leishmaniasis que refiera antecedentes de residencia o visista a zona endémica de este padecimiento.
Caso probable: Todo caso sospechoso que presente alguno o varios de los siguientes signos y síntomas.
a. Caso probable de Leishmania Cutánea Localizada (LCL): aparición de una o más lesiones nodulares o úlceras de bordes indurados, fondo limpio e indoloro, o bien reacción positiva a la reacción de Montenegro.
b. Caso probable de Leishmania Mucocutánea (LMC): obstrucción o perforación de membranas nasales.
c. Caso probable de Leishmania Visceral (LV): presencia de fiebre irregular y prolongada, hepatoesplenomegalia indolora, linfadenopatía y pérdida de peso.
d. Caso probable de Leishmaniasis Cutánea Difusa (LCD): presencia de múltiples nódulos que se diseminan a lo largo de casi todo el cuerpo con anergia a la reacción de Montenegro.
Caso confirmado de Leishmaniasis: Todo caso en que se demuestre la presencia del parásito mediante pruebas parasitológicas y serológicas específicas, o bien sea clínicamente compatible con Leishmaniasis.
Caso desacartado: Todo caso probable cuyo resultado de laboratorio no corresponden a infección por Leishmania.
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OBJETIVOS
Objetivo general
o Establecer los procedimientos para la aplicación del algoritmo de laboratorio
para el diagnóstico de leishmaniasis y establecer el manejo adecuado de la
información generada por laboratorio, a través de la Red Nacional de
Laboratorios de Salud Pública (RNLSP), en apoyo a la vigilancia
epidemiológica de esta enfermedad.
Objetivos específicos
o Dar respuesta a las solicitudes de exámenes de laboratorio de las
enfermedades parasitarias ocasionadas por Leishmania sp.
o Emitir de manera oportuna la información relacionada con las actividades de
apoyo a los programas sustantivos del área de su competencia.
o Capacitación técnica al personal de los Laboratorios Estatales de Salud
Pública y otras instituciones.
o Elaborar propuestas para abordar las áreas de oportunidad sobre las
necesidades técnicas y desarrollo de habilidades, para el fortalecimiento del
marco analítico del laboratorio.
o Emitir en tiempo y forma los resultados de los exámenes de laboratorio.
o Desarrollar, evaluar e implementar técnicas de vanguardia para el
diagnóstico de Leishmaniasis en apoyo a los programas sustantivos que le
competen.
o Mantener el control de existencias de materiales y reactivos con los que se
apoya a los LESP, para la oportuna respuesta de solicitud de insumos.
o Participar en la evaluación del desempeño de los LESP, a través del Boletín
Caminando a la Excelencia.
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RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA
LEISHMANIASIS
En el gráfico de pastel se observa el porcentaje de muestras recibidas para el control
de calidad en los últimos 5 años
Figura. 1. Conformación de la red para el diagnóstico de leishmaniasis en México
ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE
LEISHMANIASIS
La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública para el diagnóstico de
leishmaniasis (RNLSP-LEIS) la encabeza el Laboratorio de Leishmania, adscrito al
Departamento de Parasitología del InDRE y está integrada por los Laboratorios
Estatales de Salud Pública (LESP) a través del componente Leishmania y los
laboratorios de diagnóstico locales.
Programa establecido (búsqueda activa)
Capacitados, en proceso de búsqueda activa
Capacitados y/o en proceso de capacitación
6.60%7.95%
0.04%0.62%
16.28%
0.15%
64.27%
4.01%
0.08%
CAMPECHE
CHIAPAS
JALISCO
OAXACA
PUEBLA
QUINTANA ROO
SINALOA
TABASCO
VERACRUZ
YUCATÁN
2007-2011
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Figura. 2. Flujo de trabajo de la Red Nacional de Laboratorios para el diagnóstico
de enfermedades parasitarias transmitidas por vector
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE LEISHMANIASIS
FUNCIONES DEL LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA
El laboratorio de Leishmania es el Laboratorio Nacional de Referencia y el órgano
normativo para el diagnóstico, las funciones que competen al área de microscopía
de la Red de Laboratorios son:
o Efectuar diagnóstico Parasitoscópico de la leishmaniasis.
o Consolidar algoritmos de referencia y criterios de interpretación de
resultados.
o Realizar control de calidad en el diagnóstico parasitológico, apoyado a nivel
estatal por los LESP. El control de calidad se realizará con el 100% de las
muestras biológicas positivas y el 10% de las negativas.
o Transmitir tecnología estandarizada a los laboratorios integrantes de la Red,
Técnicas Serológicas (Inmunofluorescencia Indirecta ver anexo II técnica
diagnósticas).
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o Brindar material biológico como antígeno de Montenegro, antígeno IFI y
sueros control.
o Capacitar en servicio para la formación de recursos humanos en la prestación
de un servicio eficiente.
o Implementar y adecuar nuevas técnicas de diagnóstico en apoyo al algoritmo
de referencia.
o Desarrollar investigación aplicada en apoyo a la vigilancia epidemiológica.
o Generar información de orden nacional, integrando y siendo el rector de la
Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, en materia de diagnóstico,
investigación y desarrollo tecnológico para la vigilancia epidemiológica para
la toma de decisiones en el control de la enfermedad que incidan en la
formulación y orientación del programa nacional de salud.
FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS ESTATALES
Para el diagnóstico:
Vigilar los procesos analíticos para la investigación de la presencia o no, de
amastigotes en material biológico.
Asegurar la calidad del diagnóstico en el laboratorio de Leishmania.
Emitir en tiempo y forma los resultados de los exámenes de laboratorio.
Referir muestras al InDRE para control de calidad y conformación del banco
de láminas o en caso de duda diagnóstica.
Generar evidencia y notificar al órgano normativo estatal correspondiente los
casos confirmados.
Participar como mecanismo de apoyo técnico, proporcionando la
información relacionada y requerida por el programa sustantivo del área de
su competencia.
Para la evaluación del desempeño:
Evaluar que se lleven a cabo los procedimientos, métodos y técnicas
estandarizadas.
Seleccionar las muestras para control de calidad positiva y negativa del área
de influencia del LESP.
Compilar las muestras de las jurisdicciones y redes de apoyo.
Reportar inmediatamente las incongruencias encontradas en la re-
observación.
Análisis de la información generada.
Capacitar en los diferentes temas concernientes a leishmaniasis en apoyo a la
vigilancia epidemiológica, al personal de los laboratorios locales del
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programa y demás instituciones del Sector Salud que lo requieran (o se ha
detectado que lo requieren a través del monitoreo del desempeño en el área
de influencia).
Recabar, analizar y evaluar la información sobre la prestación de servicios de
diagnóstico de Leishmania de los laboratorios locales para el aseguramiento
de la calidad de la red.
Supervisar que no existan muestras de diagnóstico pendientes en los
laboratorios.
Supervisar el manejo del equipo asignado conforme a lo establecido en los
documentos autorizados y manuales de operación correspondiente para el
aseguramiento de la calidad en la red estatal.
Proporcionar información relevante detectada en el laboratorio mediante
informes, notas informativas y reportes de Leishmania, a la Dirección del
LESP para que sea difundida a las instancias estatales correspondientes
contribuyendo a la vigilancia epidemiológica estatal y nacional de manera
veraz y oportuna.
Para el PEEDMiVec
Participar en el Programa de Evaluación Externa del Desempeño (PEED) del
InDRE, a través de los programas oficiales correspondientes.
Aplicar el PEED a los laboratorios locales de la red.
Generar la evidencia de la evaluación para la red, enviar copia de resultados
al microscopista y al InDRE.
Organizar la información de estas actividades y proporcionarla cuando sea
requerida por las instancias evaluadoras.
Para capacitación
Organizar el curso anual de capacitación estatal a los laboratorios locales de
acuerdo a las necesidades detectadas a través del PEED o del monitoreo.
Mantener en niveles óptimos la capacidad diagnóstica de los integrantes de
la red.
Capacitar a los microscopistas en el manejo del equipo nuevo.
Brindar apoyo técnico a los elementos de la red que lo soliciten.
Proporcionar el curso de inducción al puesto del personal de nuevo ingreso y
generar evidencia.
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Apoyo técnico
Participar en las urgencias epidemiológicas en el área de su competencia.
El laboratorio podrá colaborar y/o elaborar trabajos de investigación
operativa que proporcione información prioritaria estatal, una vez que los
protocolos sean aceptados por los comités de investigación ad hoc.
Apoyar con la preparación y/o evaluación de los reactivos que utilizan los
integrantes de la red.
Apoyar en la selección para la adquisición y en el suministro de materiales y
reactivos requeridos por los laboratorios de la red estatal de acuerdo a la
evaluación proporcionada por el InDRE.
Participar en la elaboración y actualización de los manuales técnicos
referentes a diagnóstico y temas especializados (bioseguridad, manejo de
residuos peligrosos biológico-infecciosos, etc.) para uso en el ámbito estatal
y local.
FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS A NIVEL LOCAL
Realizar la recepción e identificación de las muestras recibidas.
Procesar las muestras de acuerdo a los procedimientos pre-establecidos.
Seleccionar de las muestras que se van a analizar de acuerdo a la prioridad
del material biológico y número de muestras recibidas.
Observar microscopio las muestras de acuerdo a los procedimientos pre-
establecidos.
Referir muestras al LESP de su entidad para control de calidad y para la
realización de las pruebas generales y especializadas o de referencia que no
realicen.
Notificar al órgano normativo jurisdiccional correspondiente los casos de
Leishmaniasis confirmados: LCL, LCD, LMC y LV.
Recibir capacitación y asesoría del nivel estatal.
Proporcionar el curso de inducción al puesto a todos los microscopistas de
nuevo ingreso.
Colaborar en el ámbito de su competencia en actividades prioritarias
señaladas por su jefe inmediato.
Aplicar las recomendaciones del nivel estatal.
Cumplir con el programa de control de calidad que establece el nivel estatal.
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DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS POR LABORATORIO
TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS CLÍNICAS
Cuadro 1. Métodos directos parasitológicos
Métodos directos parasitológicos
Tipo Improntas de lesión o extendidos de médula ósea
Nº de
muestras y
cantidad
Para diagnóstico:
Mínimo: 3 impresiones en 1 portaobjetos sin teñir.
Óptimo: 3 laminillas con 3 impresiones cada una sin teñir.
Laminillas para control de calidad: debe enviar la totalidad de
las improntas positivas y 10% de las negativas, teñidas por
Giemsa.
*Para el caso de médula ósea debe remitir 2 extendidos sin teñir
Momento de
recolección Al momento de la sospecha y antes de iniciar tratamiento
Contenedor Portaobjetos nuevos desengrasados y limpios
Conservación
Las improntas y extendidos de médula ósea que son remitidos
para diagnóstico deben ser fijados con metanol y enviados a
temperatura ambiente, son estables hasta el momento de su
análisis. Para el caso de las improntas que son remitidas para
control de calidad únicamente deben conservarse a temperatura
ambiente hasta su recepción en el InDRE
Transporte Enviar a temperatura ambiente, envueltos en cartón, de acuerdo
a su calendario de envío de cada uno de los LESP
Observación Nivel Local→LESP→InDRE
Cuadro 2. Métodos indirectos parasitológicos
Métodos indirectos parasitoscópicos
Tipo Microbiopsias y biopsias
Nº de muestras y
cantidad
Una muestra de aspirado del borde indurado de la
lesión (microbiopsias) y/o 1.0 cm3 de biopsia
Momento de
recolección
Al momento de la sospecha y antes de iniciar
tratamiento.
Contenedor
Biopsia: Tubo de plástico herméticamente cerrado y
rotulado; en solución salina o en formalina al 10%
Microbiopsia: Se deposita el aspirado en tubos
N´N´N´(previa solicitud de insumo al Laboratorio
del InDRE)
Conservación Biopsias Temperatura 4 °C
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Microbiopsias (Tubos N´N´N´, a temperatura
ambiente)
Transporte
Biopsias: Debe depositarse en un recipiente hermético
a prueba de filtraciones a 4 °C
Microbiopsias: Debe depositarse en un recipiente
hermético a prueba de filtraciones y a temperatura
ambiente
Observación Nivel Local→LESP→InDRE
Cuadro 3. Métodos inmunológicos
Métodos inmunológicos
Tipo Sangre sin anticoagulante o suero
Nº de muestras y
cantidad
Como mínimo 1.0 mL de suero o 3.0 mL de sangre sin
anticoagulante
Momento de
recolección
Al momento de la sospecha, en ayuno de 12 h y antes
de iniciar tratamiento.
Contenedor Tubo de plástico herméticamente cerrado y rotulado
Conservación Temperatura 4-8 °C
Transporte Enviar con refrigerantes, manteniendo temperatura de
conservación
Observación Nivel Local→LESP→InDRE
Para su correcta identificación es imprescindible que cada muestra esté
debidamente rotulada con nombre completo y/o No. de identificación, fecha de
toma de muestra.
ENVÍO Y RECEPCIÓN DE MUESTRAS
El envío de muestras debe realizarse lo más pronto posible según sea el caso. El tubo
con la muestra de suero se empaqueta bien y se envía utilizando el Sistema Básico
de Triple Embalaje [1], se debe proteger de la luz solar y del calor excesivo
conservando la temperatura adecuada de transporte entre 4 a 8 °C.
1 El sistema básico de triple embalaje consiste en la utilización de un recipiente primario, en el cual está
contenida la muestra biológica (exudado faríngeo, exudado nasofaríngeo, lavado bronquio alveolar, biopsia,
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La muestra de biopsias (piel, hígado y bazo) deberán ser recibidas en un lapso no
mayor de 24 h. Las muestras deberán estar bien selladas y rotuladas con el nombre
del paciente, el tipo de muestra y fecha de la toma de la misma, deberán estar a una
temperatura de 2 a 4 °C, si no cumple con lo anterior, la biopsia será rechazada y se
notificará al usuario o responsable del envío, vía fax.
En el caso de la Secretaría de Salud la muestra se envía al Laboratorio Estatal de
Salud Pública correspondiente. Para otras instituciones el envío se realizará de
acuerdo con los procedimientos que se determine en el nivel estatal o federal.
A. InDRE/Instructivo para la Toma y Envío de Muestras Biológicas para
Diagnóstico y Control de Calidad:
http://www.indre.salud.gob.mx/interior/publicaciones_tecnicas.html
B. Instructivo para Toma y Recepción de muestras en el InDRE:
http://www.indre.salud.gob.mx/interior/publicaciones_tecnicas.html
ALGORITMO DIAGNÓSTICO DE LA LEISHMANIASIS
El diagnóstico etiológico de la leishmaniasis se obtiene con base en los resultados de
las pruebas de laboratorio, en conjunto con los datos clínicos y epidemiológicos. Sin
embargo, el diagnóstico definitivo de la enfermedad requiere de la demostración del
parásito. En los casos crónicos de LCL y LMC, el diagnóstico definitivo es difícil, a
veces, por la escasez de parásitos en la lesión. El diagnóstico de la LV es complicado
por el hecho de que los signos clínicos y los síntomas de la enfermedad son parecidos
a los de otras enfermedades infecciosas. La naturaleza insidiosa e inespecífica de la
LV, así como la reactividad cruzada, pueden confundir el diagnóstico. Por lo tanto,
un diagnóstico definitivo de LV depende también de la detección de parásitos por
examen de extendidos de médula ósea, ganglio linfático o aspirados de bazo. Aunque
los resultados de los procedimientos de diagnóstico no invasivos, como el ELISA o
suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser hermético para
evitar que la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o número de muestra
del paciente. El recipiente primario deberá rodearse de material absorbente como gasa o papel absorbente y
colocarse en un recipiente secundario hermético a prueba de derrames y golpes. Si se colocan varios recipientes
primarios dentro de un recipiente secundario se deberá usar una gradilla y material absorbente para evitar algún
derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera) tiene que haber suficientes
refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8 °C. Los recipientes secundarios deberán llevar las etiquetas
de riesgo biológico y señal de orientación del recipiente, a su vez el recipiente secundario deberá ir contenido
en un paquete externo de envío (caja de cartón o hielera) que proteja el contenido de elementos externos del
ambiente y debe estar etiquetado con los datos del remitente, destinatario y señal de orientación. La
documentación que se integre al triple embalaje deberá colocarse en la parte interior del paquete.
P á g i n a 23 | 61
la prueba de aglutinación directa (DAT) se comparan favorablemente con la
detección directa del parásito, estas pruebas serológicas no pueden diferenciar entre
una LV activa y una infección pasada o subclínica, cuando se determina IgG contra
el parásito.
Figura 3. Algoritmo de laboratorio para el diagnóstico de leishmaniasis. Clave
tabulador 2012 1D2613000 Leishmania spp.
P á g i n a 24 | 61
Cuadro 4. Utilidad de los métodos diagnósticos
Método Utilidad
Parasitoscópico
Observación al microscopio en
busca de amastigotes a partir de
impresiones en portaobjetos de
material obtenido de lesiones
cutáneas, aspiración del borde de
las lesiones o biopsias de tejidos y
cultivo de inoculaciones en
animales
Este método es de utilidad
para todas las formas
clínicas. El diagnóstico
definitivo de LV se realiza
con extendidos de médula
ósea, ganglio linfático o
aspirados de bazo
Inmunológico
Se evalúa la respuesta celular a la
aplicación intradérmica del
antígeno de Montenegro
(Leishmania)
Es útil en casos de LCL y
LMC. La
intradermorreacción no se
emplea en casos de LCD
debido a la condición
anérgica de esta forma
clínica
Serológico
Se emplean las siguientes técnicas:
hemaglutinación,
inmunofluorescencia indirectas,
ELISA. La tipificación de
complejos y especies se realiza
mediante PCR e hibridación con
sondas específicas
La serología es de utilidad
para todas las formas
clínicas de la enfermedad
en especial para LCD y
LMC
Cuadro 5. Técnicas diagnósticas
Método diagnóstico LCL LCD LMC LV
Impronta ++ ++++ ++ NR
Biopsia ++ ++++ ++ ++++
Extendido de médula ósea NR NR NR +++
Aislamiento en animales y
medios de cultivo +++ ++++ ++ ++
Serología ++ ++++ ++ ++++
Intradermoreacción ++++ Negativo +++ Negativo
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Caso Probable
Encuesta individual Historia clínica
Encuesta de reservorios
Paciente con sospecha de leishmaniasis
Toma de Muestra
LCL, LCD, LM, LV
IDR
TEJIDO
SUERO
RASPADO
FROTIS
BIOPSIA HISTOPATOLOGIA IHQ
ASPIRADO
Cultivo In vivo (RATÓN) e invitro (NNN-
RPMI)
FROTIS
IFI
IMPRONTA
ESTÁNDAR DE CALIDAD
La funcionalidad de una red de diagnóstico para la vigilancia epidemiológica de
Leishmaniasis por laboratorio debe evaluarse en las tres fases: 1) Pre-analítica, 2)
Analítica, y 3) Post-analítica, de acuerdo a los algoritmos diagnósticos.
Figura. 4 Diagrama de flujo del diagnóstico de leishmaniasis. Clave tabulador:
1D2613000
El tiempo máximo para el reporte de resultados hasta finalizar con el algoritmo
depende del servicio solicitado.
P á g i n a 26 | 61
Cuadro 6. Emisión de resultados para diagnóstico
Diagnóstico Tiempo de entrega
Serológico
Visceral 24 horas
Localizada, Diseminada,
Mucocutánea 2 a 5 días
Parasitoscópico
Improntas 2 días
Biopsias (IHQ) 15 a 20 días
Cultivo in vitro 21 días
Cultivo in vivo 1 a 6 meses
Inmunológico Leishmania IDR 2 días
Cuadro 7. Emisión de resultados para control de calidad y referencia
Tiempo de entrega
Control de calidad improntas o laminillas 10 días
Referencia(*) serología y laminillas 2 días
(*)Referencia: Resolución de discordancias
CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZO
La muestra de impronta como mínimo, será de 0.5 mm x 0.5 mm, el
extendido de muestra no debe ser grueso.
La muestra de suero humano en volumen debe ser de al menos 1.0 mL.
Biopsia piel (epidermis), hígado y bazo. El tejido obtenido se enviará en
recipiente estéril con solución salina isotónica en un volumen de 3 veces el
tamaño de la biopsia. La biopsia como mínimo será de 1.0 cm3.
Para el cultivo in vitro depositar el tejido macerado o el contenido de la
microbiopsia en el interior del tubo con medio de cultivo, manteniendo
estrictas condiciones de esterilidad y enviar el tubo a temperatura ambiente.
La muestra deberá acompañarse del formato único de recepción de muestras
del InDRE, del resumen de historia clínica y de la solicitud del estudio. La
falta de alguno de los documentos anteriores causará rechazo y la muestra
quedará en resguardo. Se notificará al usuario y contará con un periodo de
siete días naturales para enviar la documentación complementaria, de no
hacerlo se rechazará definitivamente la muestra y se notificará al usuario o
responsable del envío vía fax.
La muestra no deberá estar contaminada, si sucede, la muestra será
rechazada de manera definitiva y se notificará al usuario o responsable del
envío vía fax.
La laminilla deberá venir rotulada y no deberá estar rota, si sucede, será
rechazada y se notificará al usuario o responsable del envío, vía fax.
P á g i n a 27 | 61
En casos especiales, si la muestra no cumple con los criterios de calidad
biológica pero el usuario considera que la muestra es de alto valor, deberá
notificarlo al Laboratorio de Leishmania por escrito en la solicitud o formato
y aceptar que el resultado debe ser interpretado con cautela, quedando el
laboratorio del InDRE libre de toda responsabilidad legal.
Cuadro 8. Causas de rechazo de muestras clínicas
Causa de rechazo
1.0 Calidad de las
muestra 2.0 Administrativas
3.0 Clínico
epidemiológicas
1.1 Envase inadecuado 2.1 Sin solicitud original de estudio
3.1 Cuadro clínico
(definición de
caso)
1.2 Envase roto 2.2 Solicitud original de estudio
incompleta
3.2 Tiempo de
evolución
1.3 Laminilla rota 2.3 Sin formato único del InDRE
3.3 Factores de
riesgo
(especifique)
1.4 Temperatura
inadecuada
(especifique)
2.4 Formato único del InDRE
incompleto
3.4 Días de
tránsito
1.5 Suero-Plasma
lipémico 2.5 Sin fecha de depósito y/o pago
3.5 Otra
(especifique)
1.6 Suero-Plasma
hemolizado 2.6 Sin historia clínica
1.7 Cantidad
insuficiente 2.7 Historia clínica incompleta
Ver manual de
recepción de
muestras del
InDRE
1.8 Muestra
contaminada
(especifique)
2.8 Sin formato de encuesta
1.9 Muestra
inadecuada
(especifique)
2.9 No concuerda número de
muestra con oficio
1.10 Muestra en estado
putrefacto
2.10 No concuerdan datos del
oficio con la muestra (nombres)
1.11 Muestra
derramada 2.11 Falta convenio institucional
1.12 Muestra sin
identificación 2.12 Otra (especifique)
1.13 Otra (especifique)
P á g i n a 28 | 61
CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS
Figura 5. Emisión y entrega de resultados
Anotar los resultados obtenidos de la prueba, en la bitácora de trabajo
correspondiente.
Verificar que los datos contenidos en el formato de reporte sean compatibles con
la forma de solicitud, especialmente en lo que se refiere a: tipo de muestra,
procedencia, número de oficio, número de registro del InDRE y del laboratorio,
fecha y tipo de prueba solicitada (diagnóstico, control de calidad o referencia).
Anotar el resultado de la prueba en la base de datos del lNFOLAB. (La clave de
acceso a las bases de datos es de uso confidencial, y es otorgada a cada
laboratorio por el área de informática).
Entregar al jefe de laboratorio el formato del reporte.
Verificar de los datos del formato de reporte versus los anotados en la (s) libreta
(s) de trabajo del analista por el jefe de laboratorio, quien verifica que coincidan.
Revisar documentación correspondiente a cada muestra (o lote).
Verificar que las pruebas realizadas corresponden a lo solicitado por el cliente.
Comprobar los resultados con base en el diagnóstico solicitado.
Rubricar el resultado y entregar al área técnica.
El personal técnico o asignado entregará al área de recepción de muestras el
resultado junto con la documentación correspondiente para su trámite posterior.
Guardar una copia autorizada del resultado en el archivo del laboratorio.
PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED)
El Programa de Evaluación Externa del Desempeño (PEED) de La Red Nacional de
Microscopistas de Laboratorios de Salud Pública para el diagnóstico de Leishmania,
se encuentra incluido en el Panel de evaluación de Enfermedades Transmitidas por
Vector bajo la coordinación del Laboratorio de Paludismo.
Cuadro 9. Actividades del Programa de Evaluación Externa del Desempeño
Entrega de resultados al
área de Recepción de
Muestras InDRE
Firma de resultados por
el Jefe del Laboratorio
(previa revisión con el químico)
Impresión de resultados e impresión de
hoja de entrega de resultados
REMU
Captura de resultados INFOLAB
P á g i n a 29 | 61
Objetivos:
Evaluar la competencia técnica y desempeño de los
microscopistas de la red nacional de enfermedades
parasitarias transmitidas por vector
Alcance: Marco analítico a evaluar, por prueba o algoritmo
Periodicidad: Anual
Matriz:
Extendido de sangre periférica (enfermedad chagas y
paludismo) e impresiones de lesiones causadas por el
parásito (Leishmania)
Envío del panel: Instructivo del panel y documentos anexos para emisión
de resultados
Tiempo de respuesta: Tercer trimestre del boletín caminando a la excelencia
¿Qué se evalua? Concordancia entre formas parasitarias y parasitemia
Formato de
resultados: Resultados cualitativos y cuantitativos
Informe general: Se envian resultados por estado e informe general a la
dirección general adjunta
Informe individual: Se entrega en el informe del tercer trimestre del boletín
caminando a la excelencia (BCE)
Acciones de mejora: Exclusivamente al personal de los LESP
El laboratorio de leishmaniasis prepara el material biológico correspondiente con
base en su algoritmo, y entrega el material para la creación de los paneles de
evaluación, al área correspondiente.
P á g i n a 30 | 61
Figura. 6. Algoritmo de procedimientos técnicos para la preparación de laminillas
para paneles de diagnóstico por microscopia. Clave tabulador: 1D2614003
ALGORITMO DE PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS CON COSTOS PARA LA PREPARACION
DE LAMINILLAS PARA PANELES DE DIAGNOSTICO POR MICROSCOPIAPANEL LAMINILLAS ENSAYOS DE APTITUD EN EL DIAGNÓSTICO MICROSCÓPICO
DE PARASITOSIS TRANSMITIDAS POR VECTOR (1D2614003)
CEPARIO
5 mL RPMI + 2mL de N`N`N` con paràsitos
5-8 DIAS
PRODUCCION DE MASA PARASITARIA
Aumenta el vol. de producciòn 10 mL RPMI
5-8 DIAS
Crecimiento de masa parasitaria
Cosecha de la masa parasitaria
Conteo de masa parasitaria
Ajuste
Inoculación en ratones Balb/C
1 a 3 meses
Sacrif icio y preparación de improntas
Conteo de masa parasitaria
PANELES DE EVALUACIÓN RLSP
MATERIAL DE CAPACITACIÓN
Conteo de masa parasitaria Tinción de Giemsa y montaje
Banco de material de apoyo
P á g i n a 31 | 61
Cuadro 10. Características a evaluar para control de calidad
Características Observación microscópica Reporte
Estado de la
tinción Alcalina y/o ácida Alcalina y/o ácida
Calidad de la
toma
Adecuada o correcta Sin contaminación
Inadecuada o incorrecta
Contaminada por bacterias y
hongos, muestra barrida
Presencia del
parásito Se encontraron parásitos Positivo
No se encontraron parásitos Negativo
Densidad
parasitaria Menos de 10 parásitos por campo -10
Más de 10 parásitos por campo +10
Forma parasitaria Amastigotes intracelulares AIn (Amastigotes intracelulares)
Amastigotes extracelulares AEx (Amastigotes extracelulares)
CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO
Adquiere la liberación del diagnóstico el LESP que cumpla lo siguiente:
Establecer un algoritmo diagnóstico (improntas).
Participar en el PEEDMIVEC por tres ciclos seguidos con una calificación
mayor o igual al 95%.
Tener concordancia (C) en el Boletin Caminando a la Excelencia (BCE) mayor
o igual 90% durante dos años continuos.
Participar y acreditar el curso anual de Actualización de Enfermedades
Transmitidas por Vector.
Tener una calificación (C+PEED)/2 mayor o igual 95%.
Aprobar la visita de verificación (procesos técnicos y administrativos) que
realizan el personal experto del Laboratorio de Leishmania del InDRE.
Mantiene su liberación diagnóstica el LESP que cumpla lo siguiente:
Cumplir con todo lo descrito en los criterios para la liberación diagnóstica.
Envío del 100% de muestras positivas y 10% de negativas.
Pierden su liberación diagnóstica los LESP que no cumplen lo siguiente:
El incumplimiento de algún punto de lo señalado anteriormente tanto para la
liberación como para el mantenimiento del diagnóstico.
Si el LESP requiere confirmar su desempeño técnico, debe solicitar un panel
nuevo, cuyo costo es de acuerdo al tabulador vigente. El panel deberá ser
P á g i n a 32 | 61
solicitado dentro de los siguientes 10 días hábiles, después de haber recibido
el informe final. Cabe menionar que la calificación obtenida en este panel no
será tomada en cuenta para el Boletín Caminando a la Excelencia.
Concordancias no aceptables (menor al 95%) en el segundo panel, requerirán
de capacitación y establecer nuevamente el envío de muestras para realizar
diagnóstico en el InDRE.
BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO
Para fortalecer y complementar a la RNLSP se cuenta con un Banco de Material
Biológico el cual consta de un Banco de Sueros y un Banco de Improntas, los cuales
están dirigidos hacia los programas de validación de cada técnica empleada en el
diagnóstico de la leishmaniasis en instituciones o servicios particulares de los
sectores de salud, control de calidad, referencia o pertenecientes a protocolos de
investigación.
BANCO DE SUEROS
El Área de Serodiagnóstico será la encargada de seleccionar los sueros positivos y
negativos que formarán parte del Banco de Sueros. Todos los sueros seleccionados
se entregarán al personal del área de Banco de Sueros, quienes deberán registrar en
la bitácora correspondiente cada uno de ellos.
Procedimiento:
Dividir cada muestra en alícuotas en criotubos estériles de 2.0 mL.
Etiquetar los criotubos con el número de registro del laboratorio, nombre del
paciente y fecha de ingreso al banco.
Almacenar cada una de las alícuotas de cada suero a 4 °C en el refrigerador
para utilizarse en capacitación y como control de calidad interno y externo
(un criotubo por muestra).
Colocar las alícuotas restantes de las muestras en orden de registro en cajas
para criotubos.
Congelar las alícuotas restantes a –60 °C para uso posterior.
El encargado del banco se registrará en la bitácora correspondiente.
Solo se podrá disponer del material del banco de sueros con la autorización
del jefe del laboratorio o del departamento quienes deberán asentar su
rúbrica en la libreta correspondiente.
BANCO DE IMPRONTAS
Procedimiento
1. Guardar las improntas en una caja de porta preparaciones.
P á g i n a 33 | 61
2. Identificar cada impronta con el número de registro del laboratorio, nombre
del paciente, resultado y fecha de almacenamiento.
3. Colocar las muestras en orden de registro.
4. El encargado del banco las registrará en la bitácora correspondiente.
Figura.7. Caja porta preparaciones para banco de improntas.
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDAD
EN
E
FE
B
MA
R
AB
R
MA
Y
JU
N
JU
L
AG
O
SE
P
OC
T
NO
V
DIC
Curso teórico XX
Curso teórico-
práctico XX XX XX
Envío del primer
panel a los
laboratorios estatales
de la red
XX XX XX
Recepción de
resultados del panel
en el InDRE
XX XX XX
Envío de resultados
preliminares a la
RNLSP
XX XX XX
Envío de resultados
finales del monitoreo
del desempeño a la
RNLSP
XX XX
* Si alguna fecha corresponde a un día no hábil o festivo, la actividad programada
para ese día, se recorre al día hábil siguiente.
P á g i n a 34 | 61
BIBLIOGRAFÍA
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chemotherapeutic developments in the last 10 years. Clin. Infect. Dis.
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21. Norma Oficial Mexicana NOM -032-SSA2-2010, Para la vigilancia
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22. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, tercera edición, OMS
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23. Pardo F.J. Anatomía Patológica, Primera edición, Mosby; 1997.
24. Jorge P. Alvar Ezquerra. Las Leishmaniasis: de la Biología al control.
Laboratorio de Referencia para la Leishmaniasis (OMS, 1983), Instituto de
Salud Carlos III, Junta De Castilla y León, Madrid, 1997.pp111-117.
25. Manual para la Toma, Envío y Recepción de Muestras para Diagnóstico.
www.indre.salud.gob.mx/interior/publicaciones_tecnicas.html
26. Manual para evaluación del desempeño “Caminando a la Excelencia”
www.indre.salud.gob.mx/interior/publicaciones_tecnicas.html
27. Miller MJ, et al. Guidelines for safe work practices in human and animal
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28. Guidelines for Biosafety Laboratory Competency. MMWR. Supplement / Vol.
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29. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of
Infectious Substances 2013-2014; Geneva: WHO Press; 2012.
30. Chosewood C & Wilson DE. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories – 5th ed. CDC-NIH; 2009.
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biorisk management standard. Brussels: CEN; 2011.
32. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual – 3rd ed. Geneva:
WHO Press; 2004.
P á g i n a 36 | 61
ANEXOS
P á g i n a 37 | 61
ANEXO I. TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS
1. MÉTODOS DIRECTOS PARASITOLÓGICOS
GUIA PARA LA IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA DEL AGENTE EN
MUESTRAS CLÍNICAS (IMPRONTAS). TINCION DE GIEMSA
1. Principio del método
La tinción de Giemsa emplea como colorante fundamental, una mezcla de tiácinicos
catódicos, como el azul A, B y azul de metileno, que colorean el núcleo, mientras que
la eosina para coloración citoplasmática, estas sustancias están disueltas en alcohol
metílico. Su fundamento está en la disociación controlada de las sales de eosianato,
que ocurre por la mezcla de Giemsa con agua destilada. La cromatina nuclear adopta
la tinción azul violácea algo distinta a la habitual para los colorantes tiacínicos y que
recibe la denominación de efecto Giemsa.
2. Sistema de muestra primaria
Improntas: son impresiones de la lesión que se toman con un portaobjetos
perfectamente limpio y desengrasado.
Extendido de médula ósea: La toma de esta muestra debe llevarse a cabo en un
hospital por personal capacitado, quien realiza una punción a cielo abierto. El
extendido se coloca en un portaobjetos perfectamente limpio y desengrasado, no
debe ser grueso.
3. Tipo de contenedor y aditivos
Envolver las laminillas en forma individual con varias capas de papel absorbente.
No hay que refrigerar el paquete, pero si protegerlo de la humedad, la luz solar o del
calor excesivo.
4. ObjetivoEstablecer un proceso para la identificación rápida del parásito.
5. Especificación del desempeño
La sensibilidad de los métodos directos de demostración del parásito varía entre 60
a 95% en cultivos y frotis respectivamente en pacientes con Leishmaniasis Cutánea
Localizada (LCL) y 100% en los pacientes con Leishmaniasis Cutánea Difusa (LCD).
6. Método improntas
Lavar la lesión con agua y jabón.
Desinfectar la lesión y la piel circundante con una torunda embebida en
alcohol al 70%.
P á g i n a 38 | 61
Raspar cuidadosamente el borde indurado de la lesión o la piel que cubre la
lesión con uno de los lados de un portaobjetos, si se produce sangrado limpiar
la lesión con una gasa estéril, esperar a que se produzca un exudado seroso.
Aplicar la superficie de un portaobjetos desengrasado sobre el exudado.
Tomar 3 a 4 impresiones en cada portaobjetos. Repetir la operación con 5
portaobjetos.
Secar a temperatura ambiente, identificar la lámina (con lápiz diamante u
otro medio) con los datos correspondientes.Fijar con metanol absoluto y
teñir con Giemsa.
6a. Tinción de Giemsa
Método tradicional
1. Depositar el colorante de Giemsa en la superficie de la muestra, cuidar que la
preparación no se seque. Pueden ser utilizadas canastillas de tinción o utilizar
el método de la jeringa.
2. Realizar iluminación Köhler previamente, observar a inmersión.
6b. Método de la jeringa: si se coloca el portaobjetos con la cara hacia bajo de la
bandeja, se reduce la precipitación del colorante y el precipitado que se forme caerá
en la bandeja.
1. Colocar la preparación boca abajo en una capa Petri con un angulo de diez
grados
2. Utilizar una jeringa o pipeta Pasteur para instilar solución colorante
3. Dejar durante 20 a 30 min
4. Enjuagar y dejar secar
P á g i n a 39 | 61
Observar a inmersión 100x
Figura 8
Para la verificación estatal se enviarán el 100% de las láminas positivas y el 10% de
las láminas negativas de acuerdo a la solicitud y selección del LESP (Manual para
evaluación del desempeño “Caminando a la Excelencia”.
7. Interpretación por el laboratorio
Para el reporte de los resultados se aplicarán los siguientes criterios:
Características Observación Microscópica Reporte
Estado de la
tinción Alcalina y/o ácida Alcalina y/o ácida
Calidad de la
toma
Adecuada o correcta Sin contaminación
inadecuada o incorrecta Contaminada por bacterias y
hongos, muestra barrida
Presencia del
parásito
Se encontraron parásitos Positivo
No se encontraron parásitos Negativo
Densidad
parasitaria
Menos de 10 parásitos por campo -10
Más de 10 parásitos por campo +10
Forma parasitaria Amastigotes íntracelulares AIn (Amastigotes intracelulares)
Amastigotes extracelulares AEx (Amastigotes extracelulares)
NOTA: LAS MUESTRAS PARA CONTROL DE CALIDAD QUE SEAN ENVIADAS CON ALGUNA MARCA,
DEBERÁN DE ESPECIFICAR QUE TIPO DE MARCAJE PRESENTAN, LÁPIZ DE DIAMANTE, LÁPIZ DE
CERA, MARCADOR INDELEBLE U OBJETIVO MARCADOR.
8. Control de calidad
La tinción debe ser ácida.
La preparación no deberá venir contaminada (bacterias y hongos) rota y ni
barrida.
9. Interferencias
La impresión de la impronta no debe ser gruesa.
La tinción no debe ser alcalina y estar sobreteñida.
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10. Valores de alerta críticos
Cuando son detectados amastigotes en una preparación de extendido de médula
ósea con historia clínica de probable leishmaniasis visceral (LV) se realizará la
notificación en no más de 24 horas.
11. Medidas de bioseguridad
Nivel de Bioseguridad 2-laboratorio básico
12. Fuentes de variabilidad
Cuando no se consiga la visualización del protozoario por esta técnica, se pueden
utilizar los métodos serológicos.
En caso de ser imposible la confirmación parasitológica, el diagnóstico debe ser
establecido reuniendo varios criterios como: paciente procedente de área endémica,
características clínicas altamente sugestiva de leishmaniasis, biopsia de piel que
reporte la presencia de un granuloma por agente vivo.
INMUNOHISTOQUÍMICA (IHQ)
Las técnicas inmunohistoquímicas “corresponden a un grupo de técnicas de
inmunotinción que permiten demostrar una variedad de antígenos presentes en las
células o tejidos utilizando anticuerpos marcados. Estas técnicas se basan en la
capacidad de los anticuerpos de unirse específicamente a los correspondientes
antígenos. Esta reacción es visible sólo si el anticuerpo está marcado con una
sustancia que absorbe o emite luz o produce coloración”. El material así estudiado
puede archivarse por años sin pérdida de la intensidad de la reacción.
Resultados
Positivo: Se observa la presencia del parásito en coloración café.
Negativo: Ausencia de amastigotes en el total de campos microscópicos de la
preparación
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Figura.9. Presencia del parásito en coloración café
Fuente: Laboratorio de Leishmania. InDRE
http://escuela.med.pue.el/publ/patologiageneral/Patol_125/html
MICROBIOPSIA PARA INOCULACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y
ANIMALES DE LABORATORIO
Un medio de cultivo generalmente se considera como un medio que favorece el
crecimiento de los organismos, por lo cual debe reunir las características
apropiadas, de acuerdo al tipo de organismos de que se trate. Parte del inóculo de la
biopsia o aspirado de médula ósea se puede cultivar en los casos que se desee aislar
la cepa con fines taxonómicos, para realizar pruebas de susceptibilidad a
medicamentos, para estudios epidemiológicos y con fines diagnósticos cuando hay
una alta sospecha clínica y no ha sido detectado el parásito por otros métodos. Los
medios de cultivo utilizados son axénicos mono o bifásicos, el más idóneo es un
agar-sangre de conejo al 15%, conocido como NNN (Novy-Nicolle-McNeal).
La inoculación en animales de experimentación se reserva a situaciones de campo
cuando el aislamiento en medios de cultivo corre el riesgo de contaminarse, o
cuando no hay disponibilidad de microscopía. El sacrificio del animal dos meses
después de infectado permite aislar los parásitos del bazo o de la piel en el punto de
inoculación.
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Microbiopsia de lesión cutánea
Procedimiento
Figura. 10. Procedimiento para la toma de biopsia
Se recomienda sembrar al menos 2 tubos con medio de cultivo N`N`N` y/o
inocular 2 animales de experimentación que pueden ser hámsteres, ratones
BALB/c o CD1, en el cojinete plantar de las patas traseras.
Resultados:
a. Medio de cultivo
Positivo: Presencia de promastigotes.
Negativo: Ausencia de promastigotes.
No utilizar ratones de la cepa C 57 porque son resistentes a la infección por Leishmania.
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Fuente: laboratorio de Leishmania. InDRE
Figura. 11. Leishmania sp en fase de promastigotes
b. Animales
Positivo: Presencia de lesiones más presencia de amastigotes en la impronta de la
lesión.
Negativo: Ausencia de lesiones y amastigotes en tejido.
Figura. 12 Lesiones causadas por Leishmania
Fuente: Laboratorio de Leishmaniasis. InDRE
BIOPSIA DE ÚLCERA
Procedimiento
Previo lavado con agua y jabón, aplicar un antiséptico (alcohol yodado o
timerosal) sobre la lesión y piel circundante.
Cubrir delimitando un campo estéril.
Tomar la biopsia, ya sea con un equipo de “punch” o de la manera
tradicional (escalpelo).
Separar la biopsia.
Conservar una cuarta parte en formalina al 10% para histopatología.
Realizar improntas.
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Área que será
cortada
Cortar sección a través de la piel
Conservar en solución salina isotónica una cuarta parte, macerar para
sembrar en medio de cultivo y/o inocular animales.
Figura. 13. Biopsia de una lesión cutánea
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Figura. 14. Biopsia de lesión cutánea
Resultados
a. Impronta
Positivo: Presencia de amastigotes intra o extracelulares.
Negativo: Ausencia de amastigotes en el total de campos microscópicos de la
preparación.
b. Medio de cultivo
Positivo: Presencia de promastigotes.
Negativo: Ausencia de promastigotes.
c. Animales
Positivo: Presencia de lesiones más amastigotes en la impronta de la lesión.
Negativo: Ausencia de lesiones y amastigotes en tejido.
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Figura.15. Presencia de
promastigotes
Figura. 16. Presencia de
lesiones
Fuente: Laboratorio de Leishmaniasis. InDRE
BIOPSIA DE HÍGADO Y BAZO
La toma de estas muestras debe llevarse a cabo en un hospital por personal
capacitado, quien realiza una punción hepática o esplénica (a cielo abierto) y la
biopsia se procesa como la de la úlcera o piel.
Figura. 17. Obtencion de médula ósea
La toma debe llevarse a cabo en un hospital por personal capacitado
• Realizar una punción de médula ósea para obtener 0.5 mL de la muestra.
• Sembrar 0.2 mL de médula ósea en medio de cultivo.
• Inocular 0.2 mL de médula ósea en animales para el aislamiento de la cepa.
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Cuadro 11. Resultados de la biopsia o punción de médula ósea
2. MÉTODOS INDIRECTOS PARASITOSCÓPICOS
MÉTODOS INDIRECTOS INMUNOLÓGICOS
a. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)
Esta técnica es específica y práctica, no requiere de leishmanias vivas. Los parásitos
se fijan y se ponen en presencia del suero del paciente y de un antisuero marcado
con fluoresceína.
Debido a que es factible conocer la clase de inmunoglobulinas, es decir IgM o IgG,
también es posible determinar el estado de la infección, aguda o crónica. La
detección de IgM ayuda para detectar la posibilidad de una infección reciente o
activa. Algunos pacientes inmunodeficientes no montan una respuesta de IgM
detectable, lo cual limita la prueba.
Medio de cultivo
Positivo: Presencia de promastigotes
Negativo: Ausencia de promastigotes
Animales
Positivo: Presencia de lesiones y de amastigotes impronta de la lesión
Negativo: Ausencia de lesiones y de amastigotes en tejido
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Figura 18. Procedimiento de IFI
Preparación del antígeno
•Crecer tres cepas de Leishmania, una
causante de LCL, una de LCD y una de LV en medio RPMI completo
a temperatura ambiente (23-25 °C).
•Ajustar la concentración a 3 x
106 promastigotes/mL en PBS/formol 1%
(Stock).
•Hacer una dilución 1:5 del stock en PBS. (6 x
105
promastigotes/mL).
•Sensibilizar las laminillas o almacenar
en alícuotas a 4 °C hasta su uso (no
congelar).
Sensibilización de laminillas
•Utilizar portaobjetos
cubiertos de teflón, de 8 a 12 pozos.
•Homogenizar y añadir 10 mL de antígeno a cada
pozo (6,000 promastigotes/mL).
•Almacenar a –20 °C hasta su uso.
Procedimiento
•Hacer diluciones seriadas dobles de los sueros problema: de 1:2 a 1:1024.
•Añadir 10 mL de una dilución a cada pozo.
•Incubar 30 min a 37 °C en cámara húmeda.
•Preparar el conjugado IgG-isotiocianato de fluoresceína, diluido en PBS-azul de
Evans 0.01%.
•Incubar 30 min a 37 °C en cámara húmeda.
•Montar con glicerina para fluorescencia al 50% en PBS.
•Observar en el microscopio de epifluorescencia.
• El conjugado que se usa es comercial y la dilución de trabajo debe estandarizarse
cada vez que se abre un nuevo vial, tomando en cuenta la concentración del
conjugado que contiene, lo que dependerá de la casa comercial de donde se obtenga.
También se puede utilizar un conjugado anti-IgG humana-isotiocianato de
fluoresceína. (por ejemplo: 5 mL de conjugado comercial + 995 mL de PBS-azul
de Evans 0.01%, dil. 1:200)
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Figura.19. Se muestran los resultados de Inmunofluorescencia Indirecta
Fuente: Laboratorio de Leishmaniasis. InDRE
INTRADERMOREACCIÓN DE MONTENEGRO
Guía para la aplicación de la intradermoreacción con leishmanina
1. Principio del método
La prueba intradérmica (IDR) de Montenegro, mide la reacción de hipersensibilidad
cutánea (RHC) de tipo retardada a antígenos homólogos o heterólogos de
promastigotes de Leishmania y evidencia la presencia o contacto con el parásito.
Es una prueba útil y complementaria en el estudio clínico y epidemiológico.
2. Sistema de muestra primaria
Se sugiere utilizarla en los siguientes casos:
Pacientes con signos clínicos de la enfermedad.
Pacientes con lesiones diferentes o atípicas.
Pacientes con incertidumbre diagnóstica.
Pacientes con lesiones cicatrizadas que presenten características clínicas de
leishmaniasis mucocutánea.
Positivo: La superficie de los promastigotes se observan de color verde manzana brillante en el microscopio de epifluorescencia. El corte se toma cuando la fluorescencia disminuye en una de las diluciones, que se observa de color amarillento y en la siguiente dilución los promastigotes se observan de color rojo
Negativo: Los promastigotes se ven de color rojo
http://www.scalibor.com.ar/leishmaniosis/diagnostico.asp
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3. Materiales y reactivos:
Leishmania sp.
Jeringa insulínica o tububerculínica
Alcohol al 70%
Algodón
Regla graduada
Bolígrafo
4. Objetivo
Revelar la hipersensibilidad celular, propia de las leishmaniasis cutáneas y
mucocutáneas activas, asimismo conocer si el paciente ha estado en contacto con el
parásito.
5. Especificación del desempeño
La sensibilidad de la prueba es del 100 % y se considera a los pacientes de LCD como
anérgicos.
6. Método
a. Limpiar con alcohol al 70% la región de la cara anterior, tercio medio del
brazo.
b. Aplicar 0.1 mL de leishmanina en la cara anterior del antebrazo.
c. Medir el diámetro de la induración después de 48 horas a 72 horas con la
técnica de bolígrafo. Esta técnica permite visualizar los bordes de la
induración cuyo diámetro se puede determinar exactamente midiendo la
distancia entre las líneas opuestas.
d. Ejerciendo presión moderada, se traza lentamente una línea con un bolígrafo
desde un punto exterior distante de 1-2 cm del borde de la reacción cutánea
hacia el centro de ésta.
e. En cuanto se registra resistencia al seguir avanzando (lo que indica el borde
de la reacción) se cierra, se alza el bolígrafo de la piel.
f. Se repite la misma operación en el lado opuesto de la reacción cutánea.
g. Se mide el diámetro de la induración.
h. Tomar la lectura y reportarlo en el formato correspondiente.
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NOTA: Recomendar al paciente no tocarse, rascarse, o frotarse, no aplicar fomentos,
ni colocar cremas o alguna otra sustancia en la zona de la punción.
7. Interpretación por el laboratorio
Reacción Observación Resultado
Reactivo
Presenta edema, enrojecimiento e
induración, el diámetro de la
induración debe ser igual o mayor a
5 mm
Positivo
No reactivo La induración es menor de 5 mm o
no hay reacción Negativo
8. Control de calidad del biológico
Prueba de esterilidad de la leishmanina: Incubar una muestra aleatoria a 37 °C
durante 48 horas. Tomar muestras para tinción de Gram y Giemsa. Sembrar en
gelosa sangre, caldo tioglicolato, agar chocolate y Sabouraud. Los tres primeros se
observan a las 48 horas y el último, a los 5 días. Todos los resultados deben de ser
negativos.
9. Interferencias
Se invalida la prueba si la lectura es tomada antes de las 24 horas o después de las
72 horas.
10. Valores de alerta críticos
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Se debe considerar la forma clínica de la leishmaniasis en el paciente debido a que
en la LCD se presenta una respuesta inmunológica celular abatida o anérgica.
11. Medidas de bioseguridad
Nivel de Bioseguridad 2-laboratorio básico)
12. Fuentes de variabilidad
Los pacientes con LCD presentan altos títulos de anticuerpos contra el parásito y no
hay respuesta a la intradermorreacción de Montenegro.
La respuesta celular de estos individuos está inmunosuprimida específicamente a
Leishmania ya que si presentan respuesta cutánea a otros antígenos, como la
candidina y el PPD.
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ANEXO II. PREPARACIÓN DE REACTIVOS
1. Determinación de anticuerpos séricos de leishmania
inmunofluorescencia indirecta
Equipo
Pipetas automáticas: uso general y volumen variable para dispensar con
exactitud volúmenes líquidos.
Agitador magnético: Velocidad 150-3000 rpm, superficie de acero inoxidable
tratado, peso máximo 1.0 kg(1000 g), placa de 11 x 11 cm, peso 2.8 kg, fuente de
poder externa de 12V DC, 0.5 amp110/50-60HZ o 220/50-60HZ(especificar en
la orden)
Microscopio de fluorescencia: Este microscopio está diseñado para el uso de
diferentes tipos de luz (blanca, ultravioleta, azul, verde, etc., dependiendo del
filtro utilizado). Su utilidad va desde la observación de bacterias y virus a micro
plancton (dimensiones de micrómetros o micras).
Cronómetro: es un reloj o una función de reloj que sirve para medir fracciones
de tiempo, normalmente cortos y con gran precisión.
Refrigerador y congelador. Equipo para la conservación de reactivos y muestras
biológicas.
Termómetro: instrumento de medición de la temperatura, que usa el principio
de la dilatación, por lo que se prefiere el uso de materiales con un coeficiente de
dilatación alto de modo que, al aumentar la temperatura, la dilatación del
material sea fácilmente visible.
Estufa. Equipo para incubación.
Materiales
portaobjetos con impresión blanca de teflón: campos de reacción hidrófilos,
bordes esmerilados 90o, aprox. 75x25x1 mm, con banda mate de 20 mm 2
caras, 12 o 24 pozos
barra magnética: micro de 10x3 mm, color blanca, teflonada
vasos Copling: cubeta de vidrio 105x85x70 mm, con tapa, cestillo y asa de
alambre para cestillo
pipetas Pasteur: es un tubo de vidrio hueco, para agregar pequeñas
cantidades de líquido.
cubreobjetos: 0.13-0.16 mm de espesor, 24 x 50 mm de vidrio
cámara húmeda: caja de alto impacto para 25 laminillas, con papel filtro
placa de dilución: para realizar diluciones de 96 pozos, de poliestileno
papel kraft
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guantes
papel higiénico
2. Reactivos y materiales biológicos
PBS 1X. Solución de fosfatos
TWEEN 20
Conjugado: Anticuerpo anti IgG humana, molécula completa obtenido en
carnero conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC), purificado por
afinidad, ICN. Frasco con 2.0 mL
Azul de Evans: colorante diazo de color azul muy soluble en agua, usado como
medio de diagnóstico Fórmula: C34H24N6Na4O14S4, M.=960.82.
Antígeno de Leishmania: mezcla (pull) de cepas de LV, LCL Y LCD. C 3 x106
parásitos/mL.
Glicerina: 1, 2,3-Propanotriol, 1, 2,3-TrihidroxipropanoC3H8O3/CH2OH-
CHOH-CH2OH, Masa molecular: 92.09.
3. Observación directa del parásito tinción de Giemsa
Equipo
Microscopio de Campo Claro, compuestos por:
Fuente luminosa que ilumina la muestra.
Condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra.
Platina sobre la cual se coloca la muestra.
Objetivo que recibe la luz que atravesó la muestra.
Ocular que recibe directamente la imagen formada por el objetivo.
La muestra a observar debe ser fina para que pueda ser atravesada por la luz.
Materiales
Cajas Petri de vidrio.
Pipetas Pasteur: es un tubo de vidrio hueco, para dispensar pequeñas
cantidades de líquidos.
Bulbos: de hule látex para ayudar en la succión de líquidos con las pipetas.
Lápiz de diamante: con el podrá grabar sobre el vidrio los datos necesarios
de forma fácil y permanente.
Porta preparaciones: caja de alto impacto para el resguardo de las laminillas.
Frascos para colorante: Pueden ser transparentes u opacos, para proteger al
colorante de las radiaciones solares. Hay dos modelos: con tetina y
cuentagotas o sin tetina.
Portaobjetos: se trata de una placa de vidrio sobre la que se colocan las
preparaciones microscópicas. Puede ser rugoso o esmerilado.
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Algodón en torundas.
Reactivos y materiales biológicos
Metanol (alcohol metílico).
Carbinol Monohidroximetano CH3OH Masa molecular: 32.0, CAS: 67-56-1,
RTECS: PC1400000, ICSC: 0057, NU: 1230, CE: 603-001-00-X.
Colorante de Giemsa: Para frotis sanguíneo, frasco con 25 g, Hycel de México.
Agua destilada de 5 partes por millón de Sólidos totales disueltos.
Aceite de Inmersión: producto sanitario para el diagnostico in vitro. Análisis
químico.
Alcohol etílico al 70%.
Colorante de Giemsa
Preparación de la solución madre de Giemsa:
Colorante de Giemsa 3.8 g
Glicerina 250 mL
Metanol libre de acetona 250 mL
Pulverizar en un mortero el colorante.
Añadir poco a poco la glicerina, vaciando el colorante ya disuelto en un frasco,
sin dejar de mezclar.
Colocar el frasco 2 h a 62 °C en baño maría.
Dejar enfriar a temperatura ambiente y adicionar el metanol.
Filtrar y almacenar en un frasco ámbar.
Dejar madurar durante por lo menos dos semanas.
Estandarizar el tiempo de tinción.
Almacenar en un lugar obscuro y fresco.
Solución de trabajo: Hacer una dilución 1:10 de la solución madre de Giemsa
en PB 1X.
1. Cultivo de promastigotes: aislamiento in vivo e in vitro
Materiales
Tubos con tapón de rosca
Caja de cultivo 75 y 250 mL.
Pipetas desechables 1.0, 2.0, 5.0, 10 y 20 mL.
Jeringas de 1.0, 3.0, 10 y 20 mL.
Portaobjetos: se trata de una placa de vidrio sobre la que se colocan las
preparaciones microscópicas. Puede ser rugoso o esmerilado.
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Cubreobjetos: se trata de una placa de vidrio con la que se cubre las
preparaciones microscópicas.
Bulbo de seguridad
Lámpara de alcohol
Gasas
Guantes
Cubre bocas
Reactivos
Alcohol 96° SFT (suero fetal bovino)
Benzal Senekjei
BHI: Infusión Cerebro Corazón Antibiótico–Antimicótico
RPMI Agua destilada
Existen una serie de medios de cultivo para el aislamiento y conservación de
Leishmania spp. Los más utilizados por un gran número de laboratorios son el
medio Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) adicionado con 7.5 al 15% de sangre
desfibrinada de conejo o de carnero y el medio RPMI-1640 adicionado con 10% de
suero fetal de ternera (SFT).
Medio NNN (Novy-Nicolle-MacNeal)
Es un medio bifásico, con una fase sólida preparada con agar y sangre de conejo o
carnero, desfibrinada y una fase líquida, que puede ser solución Ringer o Caldo
infusión cerebro corazón (BHI).
Fase sólida
Agar 8 g
NaCl 4 g
H2 0 destilada 450 mL
Sangre estéril desfibrinada de conejo o carnero 40 mL
1. Disolver el agar y el cloruro de sodio en el agua destilada.
2. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs.
3. Dejar enfriar a una temperatura aproximada de 45 °C.
4. Agregar la sangre desfibrinada y mezclar.
5. Vaciar rápidamente en tubos 13X100 estériles (aproximadamente 3.0 mL
en cada tubo).
6. Dejar enfriar los tubos sobre una superficie inclinada (30 grados).
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Base de agar sangre
La fase sólida del medio NNN puede preparase con base de agar sangre, cuya
fórmula aproximada para 1.0 L es la siguiente:
Infusión de músculo cardíaco 375 g
Peptona de carne 10 g
NaCl 5.0 g
Agar-Agar 15 g
El pH final aproximado es de 7.30.2
1. Disolver 40 g del medio de cultivo en 1.0 L de agua destilada.
2. Calentar agitando a punto de ebullición hasta disolver el medio.
3. Vaciar 100 mL de medio en matraces Erlenmeyer con tapón de rosca.
4. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs.
5. Enfriar el medio hasta aproximadamente 45 °C.
6. Añadir 7.5-10.0 mL de sangre desfibrinada y mezclar.
7. Vaciar rápidamente en tubos 13X100 estériles (aproximadamente 3.0 mL en
cada tubo).
8. Dejar enfriar los tubos sobre una superficie inclinada (30 grados).
Fase líquida: solución de Ringer
NaCl 8.0 g
NaHCO3 0.2 g
KCl 0.2 g
CaCI2 0.2 g
1. Disolver los reactivos en 1.0 L de agua destilada.
2. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs.
3. Añadir 3.0 mL de esta solución a cada tubo.
Infusión cerebro corazón (BHI)
La fórmula del BHI típica para 1.0 L es la siguiente:
Infusión de cerebro de ternera 12.5 g
Infusión de corazón bovino 5.0 g
Proteosa peptona 10.0 g
Glucosa 2.0 g
NaCl 5.0 g
Na2HPO4 2.5 g
El pH final aproximado es de 7.40.2
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1. Disolver 37 g del medio de cultivo en 1.0 L de agua destilada.
2. Mezclar bien y distribuir en frascos de vidrio de 100 mL.
3. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs.
4. Añadir 3.0 mL de este medio a cada tubo estéril.
Medio de Senekjie (bifásico)
Fase sólida
Extracto de carne 2.5 g
Bacto-peptona 2.0 g
Bacto-agar 3.0 g
NaCl 0.5 g
1. Disolver el extracto de carne en 100 mL de agua destilada.
2. Hervir 5 min y dejar enfriar.
3. Filtrar en papel Whatman No. 42.
4. Aforar el volumen.
5. Añadir la bacto-peptona, el bacto-agar y el NaCl.
6. Ajustar a pH 7.2-7.4.
7. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs.
8. Dejar enfriar hasta 45 °C.
9. Añadir 15 mL de sangre de conejo desfibrinada*.
10. Repartir 5.0 mL en frascos estériles de 50 mL.
11. Dejar solidificar colocando los frascos en posición inclinada.
12. Hacer prueba de esterilidad a 37 °C durante 24 h.
* La sangre desfibrinada puede substituirse por paquete de eritrocitos humanos,
libres de patógenos, que desechan los bancos de sangre por envejecimiento.
Solución de Locke
La solución de Locke es la fase líquida del medio de Senekjie.
1. Disolver los reactivos en 100 mL de agua destilada.
2. Esterilizar en autoclave 15 min a 10 lbs de presión.
3. Dejar enfriar a temperatura ambiente.
NaCl 0.9 g
Glucosa 0.25 g
KCl 0.04 g
CaCl2 0.02 g
NaHCO3 0.02 g
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4. Añadir 4.0 mL a cada frasco estéril.
Medio RPMI 1640
1. Disolver 10.4 g de RPMI en 950 mL de agua destilada.
2. Añadir 2 g de NaHCO3.
3. Ajustar el pH a 7.0-7.2 (calcular 0.2-0.3 unidades por debajo del pH deseado,
porque al filtrar por nitrocelulosa aumenta en esta proporción).
4. Aforar el volumen a 1,000 mL con agua destilada.
5. Esterilizar por filtración (0.22 mm).
6. Repartir en alícuotas de 80 mL en frascos de 100 mL estériles.
7. Hacer prueba de esterilidad a 37 °C, durante 48 h.
Solución de antibióticos
La fórmula por mL es la siguiente:
Sulfato de estreptomicina 10 mg
Penicilina G sódica 10,000 U
Disolver el contenido del frasco en 20 mL de SSI.
Hepes 1M
1. Disolver 23.8 g de Hepes en 70 mL de agua destilada.
2. Ajustar el pH a 7.2.
3. Aforar a 100 mL con agua destilada.
4. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs.
Glutamina 200 mM
1. Disolver 3.0 g de glutamina en 100 mL de agua destilada.
2. Esterilizar por filtración (0.22 mm).
3. Distribuir en alícuotas de 5.0 mL.
4. Almacenar a –20 °C hasta su uso.
Suero fetal de ternera (SFT)
1. Descomplementar el suero 30 min a 56 °C en baño María.
2. Distribuir en alícuotas de 20 mL en condiciones de esterilidad.
3. Almacenar a –20 °C hasta su uso.
Solución salina isotónica (SSI)
1. Disolver 8.5 g de NaCl en 1.0 L de agua destilada.
2. Filtrar con membrana de 0.45 mm.
3. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs.
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Hemoglobina bovina (Hb)
La Hb se puede usar en vez del SFT.
1. Disolver 40 g de Hb en 1.0 L de SSI.
2. Esterilizar por filtración (0.22 mm).
3. Distribuir en alícuotas de 100 mL.
4. Almacenar a 4 °C hasta su uso.
VCN (antimicóticos)
La fórmula por mL es la siguiente:
Vancomicina 330 mg
Colistin 740 mg
Nistatina 1,250 U
Disolver el contenido del frasco en 10 mL de agua
destilada.
RPMI completo
RPMI 1640 80.0 mL
Solución de antibióticos 1.0 mL
Hepes 1M (pH 7.2) 2.0 mL
Glutamina 200 mM 1.0 mL
SFT inactivado 15.0 mL
VCNT 1.0 mL
Solución amortiguadora de fosfatos-salina (PBS)
NaCl 8.0 g
Na2HPO4 1.15 g
KH2PO4 0.2 g
KCl 0.2 g
1. Disolver los reactivos en 800 mL de agua destilada.
2. Ajustar a pH 7.0.
3. Aforar a 1.0 L con agua destilada.
4. Filtrar con membrana de 0.45 mm.
5. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs.
6. Almacenar a temperatura ambiente.
Solución amortiguadora de fosfatos (PB) 10X
Na2HPO4 anhidro 5.54 g
NaH2PO4. H2O 8.42 g
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1. Disolver los reactivos en 800 mL de agua destilada.
2. Ajustar a pH 7.0.
3. Aforar a 1.0 L con agua destilada.
4. Filtrar con membrana de 0.45 mm.
5. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs.
6. Almacenar a temperatura ambiente.
Diluir 1:10 para preparar el PB 1X.
Solución salina isotónica (SSI)
1. Disolver 8.5 g de NaCl en 1.0 L de agua destilada.
2. Filtrar con membrana de 0.45 mm.
3. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 lbs.