3

1.PENDAHULUAN

1.1Tinjauan Pustaka

Bakteri dibedakan menjadi 2, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif didasarkan pada komposisi dinding selnya dan juga sifat pewarnaannya (Fardiaz, 1992). Perbedaan antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif terletak pada struktur dinding selnya yang dapat menyebabkan perbedaan larutan pemucat. Bakteri gram negatif hanya memiliki 5 20% peptidoglikan sedangkan bakteri gram positif memiliki 90% peptidoglikan di dalam membran selnya, dan dengan adanya peptidoglikan yang tebal meyebabkan bakteri tersebut tidak mudah terdehidrasi saat pelarutan ataupun pemanasan sehingga cat yang sudah masuk tidak dapat keluar lagi. Lipida akan larut dalam alkohol dan aseton sebagai larutan pemucat, sehingga pori-pori dinding sel gram membesarkan dan meningkatkan daya larut kompleks kristal violet iodium pada dinding sel bakteri gram negatif, sehingga proses pemucatan berlangsung lebih cepat dibanding bakteri gram positif dan akhirnya terwarnai oleh cat penutup safranin yang berwarna merah. Sehingga bakteri gram positif adalah bakteri yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai akhir prosedur, sehingga pada akhir proses pengecatan didapatkan bakteri dengan warna biru gelap atau ungu. Sedangkan bakteri yang disebut gram negatif, adalah bakteri yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan alkohol, dan kemudian terwarnai dengan cat pewarna tandingan yaitu safranin, sehingga pada akhir proses pengecatan didapatkan bakteri dengan warna merah. (Lay, 1994).

Faktor yang dapat mempengaruhi sifat gram negatif dan gram positif, yaitu penyiapan preparat yang terlalu tebal menyebabkan pelarutan kurang baik, konsentrasi dan kesegaran bahan untuk pewarna, waktu pelarutan yang terlalu lama menyebabkan warna pada sel bakteri gram positif ikut terlarut, pencucian dan pengeringan yang mempengaruhi keberadaan iodin, serta umur bakteri yang mempengaruhi keutuhan bakteri (Trihendrokesowo, 1989).Bakteri umumnya mempunyai ukuran sel 0,5 1,0 (m kali 2,0 5,0 (m. Bakteri terdiri dari 3 bentuk dasar, yaitu bulat (kokus), batang (basilus) dan spiral. Staphylococcus merupakan bakteri yang berbentuk coccus atau bulat. Staphylococcus thermophillus merupakan bakteri berbentuk bulat yang terdapat dalam bentuk tunggal, berpasangan, tetrad, atau berkelompok seperti buah anggur (Fardiaz, 1992).

Bacillus subtilis merupakan bakteri yang menghasilkan spora berbentuk silinder yang tidak membengkak, sporanya langsing dan tidak melebihi diameter 0,9 m (Fardiaz, 1992). Bacillus subtilis merupakan kelompok bakteri gram positif. Bakteri gram positif ini seharusnya dapat menahan zat pewarna primer violet kristal sampai akhir porsedur, sehingga hasil akhir pengecatan seharusnya akan berwarna biru (Schlegel & Shmidt, 1994). B. subtilis dan S. Thermophilus bersifat basa sehingga dapat bereaksi dengan sitoplasma bakteri yang umumya bersifat basofilik (suka akan basa) (Timotius, 1982).. Escherichia coli merupakan anggota dari famili enterobacteriaceae yang mempunyai flagela monotrikat dan merupakan koliform fekal karena terdapat saluran usus hewan dan manusia. Eschericia coli merupakan bakteri kelompok gram negatif yang berberbentuk batang atau basilus, namun penampakan pada mikroskop bentuknya sangat pendek sehingga terlihat hampir bulat menyerupai kokus (Fardiaz, 1992). Bakteri E. coli merupakan bakteri gram negatif yang mempunyai morfologi berbentuk batang dengan kebutuhan oksigen anaerob fakultatif (Schlegel & Shmidt, 1994).

Hubungan bakteri dengan zat perwarna basa yang menonjol disebabkan oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi jika bakteri diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa. Oleh karena itu, pada percobaan digunakan metilen loeffer yang memiliki sifat basa dan alkalin sebagai pewarna sederhana. Pewarna alkalin lain yang umumnya digunakan dapat berupa pewarna basa seperti metylen blue, basic fuschin, dan violet kristal (Volk dan Wheeler, 1993)

Sebelum melakukan pengecatan diperlukan penyiapan preparat yang baik, saat pemindahan kultur dari biakan murni dengan ose tidak boleh terlalu tebal atau terlalu tipis dan tetap melekat pada gelas preparat selama pencucian berulang ulang sehingga sel-selnya tidak berubah bentuk atau morfologi setelah fiksasi dan pengecatan. Bakteri bakteri hidup sukar untuk dilihat dengan mikroskop cahaya biasa karena bakteri tersebut tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri sendiri, meskipun biakan secara keseluruhan mungkin berwarna. Kebanyakan sel sel mikrobia tidak berwarna atau mempunyai pigmen yang sangat sedikit dan tidak dapat mengabsorpsi ataupun membiaskan cahaya sehingga tidak dapat dilihat dengan mudah pada mikroskop karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antar sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan mewarnai sel-sel tersebut dengan sel warna (Hadioetomo, 1993). Pengecatan bakteri ini dilakukan untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya sehingga mudah dilihat dengan mikroskop (Lay, 1994).

Faktor yang mempengaruhi pewarnaan gram antara lain konsentrasi dan umur reagen reagen yang digunakan, sifat dan konsentrasi serta jumlah pemucat yang dipakai, fiksasi panas terhadap olesan. Selain itu juga dipengaruhi kerapatan sel pada olesan dan sejarah biakan. Jika olesan terlalu tebal tidak akan cepat memucat. Semakin tua biakan yang digunakan maka bakteri gram positif akan tampak seperti bakteri gram negatif karena permeabilitas dinding selnya berkurang atau hilang (Hadioetomo, 1993).Fiksasi dilakukan dengan cara melewatkan gelas benda pada nyala api spirius beberapa kali selama 1 2 detik. Proses ini bertujuan untuk lebih melekatkan bakteri pada gelas benda dan mematikan bakteri, karena sebenarnya bakteri yang hidup tidak dapat diamati, karena pada bakteri hidup, selnya tidak mengandung pigmen atau transparan, karena indeks bias sitoplasmanya hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair (Lay, 1994). Fiksasi yang berlebihan akan menyebabkan pecahnya dinding sel, akibatnya warna primer akan luntur dan menerima warna tandingan sehingga sulit dibedakan antara bakteri gram positif dan negatif. Fiksasi dilakukan pada bakteri yang benar benar sudah kering, karena jika olesan belum kering benar maka sel sel biakan akan terebus dan bentuknya akan rusak. Waktu fiksasi tidak boleh terlalu lama untuk menghindari penyusutan sel (Hadioetomo, 1993).Pewarnaan sederhana adalah pewarnaan yang hanya menggunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya (Lay, 1994). Pengecatan sederhana bertujuan untuk mengetahui bentuk mikroba dengan bantuan mikroskop (Timotius, 1982). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna sederhana karena sitoplasma bersifat basofilik atau suka dengan basa, maka pewarna sederhana yang digunakan umumnya bersifat alkalin seperti Methylen blue loefler. Cat warna ini tidak luntur meskipun telah dicuci dengan air. Disamping itu Methylen blue loefler mempunyai ion positif yang akan bereaksi dengan asam nukleat yang terdapat dalam protoplasma sehingga pewarna akan menempel pada biakan (Volk & Wheeler, 1993).

Pewarnaan sederhana hanya melalui satu tahap pewarnaan. Diawali dengan fiksasi panas dengan menggoreskan kultur pada kaca preparat sehingga terbentuk lapisan tipis dan setelah itu dikeringkan baru kemudian dipanaskan. Kemudian bentuk dan susunan selnya dapat diamati (Bibiana.1994). Pengecatan sederhana yang dilakukan memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (kokus, basilus, vibrio, sprilum, dan sebagainya) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai (Hadioetomo, 1993).

Pengecatan gram menggunakan zat warna primer yaitu violet kristal, larutan mordan yaitu iodin, bahan peluntur berupa alkohol dan zat warna penutup berupa safranin. Cat utama violet kristal ini berwarna ungu dan merupakan zat utama yang akan membedakan bakteri menjadi gram positif dan gram negatif, maka disebut zat pewarna diferensial. Zat pewarna primer yang digunakan dalam pengecatan gram, ialah zat pewarna khusus yang sangat penting dalam bakteriologi (Volk dan Wheller, 1993). Sedang larutan iodin berperan sebagai larutan mordan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat, memperjelas warna, mempersulit pelarutan zat warna, menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks kristal violet iodium. Alkohol berfungsi untuk melunturkan zat warna primer dengan daya kerja yang lambat sehingga memperkecil kemungkinan terjadinya pemucatan yang berlebihan. Fungsi cat penutup safranin adalah sebagai pembeda (kontras) terhadap zat warna primer dan juga untuk mewarnai kembali sel sel yang telah kehilangan zat warna primernya (Lay, 1994).Pengecatan gram bertujuan untuk memilah bakteri menjadi kelompok gram positif dan kelompok gram negatif dan untuk dapat membedakan jenis-jenis bakteri berdasakan komposisi penyusun dinding selnya. Komposisi dinding sel bakteri gram negatif mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi, jika diberi larutan pemucat (etanol 95%) maka akan larut, keluar dari dinding sel sehingga akan memperbesar pori pori dinding sel. Akibatnya kompleks kristal violet iodium keluar dari dinding sel atau luntur (Pelczar & Reid, 1958). Sebaiknya pengecatan gram dilakukan beberapa kali, untuk mendapatkan hasil akhir yang akurat (Hadioetomo, 1993).Endospora merupakan struktur yang dibentuk dalam bakteri tipe tertentu seperti Bacillus. Endospora bakteri mulai terbentuk pada akhir fase logaritmik dan dibentuk oleh sel basilus, bersifat sangat tahan terhadap pemanasan, pengeringan, disinfektan dan setelah diwarnai sukar untuk dihilangkan. Endospora ini dibentuk pada kondisi yang tidak memungkinkan untuk pertumbuhan sel vegetatif. Endospora berbentuk sangat padat dan bersifat sangat refraktif bila dilihat di bawah mikroskop, karena kandungan airnya sangat rendah (Fardiaz, 1992). Pengecatan struktur merupakan pengecatan yang jarang dilakukan karena biasanya untuk melakukan pewarnaan pada flagela, endospora ataupun kapsula. Dimana tidak semua bakteri memilikinya. Namun pengecatan ini juga dapat dipakai untuk klasifikasi bakteri, karena dengan pengecatan ini dapat diketahui keberadaan endospora, dan kemudian bakteri yang mengandung endospora dikelompokkan ke dalam genus tertentu; namun ada kelemahan dalam klasifikasi ini yaitu bila ada bakteri yang tidak tampak endosporanya setelah pengecatan maka belum tentu bisa dimasukkan ke dalam golongan bakteri tidak berendospora tapi mungkin saja karena lingkungan tidak terlalu buruk untuk melakukan pembentukan endospora. Endospora umumnya cukup besar dan berwarna hitam. Cara yang paling sering dipakai dengan memakai cat safranin dan malachite green yang dapat mewarnai spora di dalam sel. (Fardiaz.1992)

Dalam pengecatan endospora, pada akhir proses pengecatan, yang akan terlihat terwarnai adalah bagian endospora atau spora yang sudah lisis atau pecah. Pada umumnya setelah membentuk endospora, bakteri akan mati lalu mengalami lisis atau pemecahan membran sel. Spora bekas lisis memiliki ukuran cukup besar, sehingga dapat terlihat jelas pada mikroskop. Spora bekas inilah yang menunjukkan adanya endospora (Lay, 1994). Setelah penetesan pewarna malachite green, dilakukan pemanasan. Pemanasan ini bertujuan untuk mengembangkan lapisan luar spora yang bersifat tahan terhadap perubahan faktor luar, yang dalam hal ini adalah penambahan bahan kimia berupa larutan pewarna malachite green, sehingga zat warna malachite green dapat masuk ke dalam spora. Selain itu dengan pemanasan, endospora dalam bakteri menjadi aktif karena lingkungan menjadi ekstrim dan kandungan airnya (Fardiaz, 1992). Pemanasan akan mempercepat pengecatan, dimana pemanasan membantu zat warna menembus dinding endospora. Sehingga meskipun dilakukan pencucian dengan air mengalir, semua zat warna bagian sel akan luntur kecuali zat warna pada endospora tetap tertinggal. Setelah didinginkan, warna hijau tersebut terperangkap dalam spora, sehingga struktur endospora dapat diamati (Tortora et al., 1995).

Warna hijau ini ada yang hijau gelap dan ada yang hijau muda. Warna hijau gelap adalah bakteri berendospora yang berkoloni, sedangkan wana hijau muda adalah bakteri berendospora yang memisah. Lalu sel vegetatif yang berwarna merah muda ini didapat dari penambahan safranin. Penambahan safranin ini disebabkan karena sel vegetatif yang terdapat pada Bacillus subtilis tidak berwarna. Oleh karena itu penambahan safranin yang merupakan zat warna basa akan mengikat muatan negatif yang terdapat pada permukaan sel sehingga sel vegetatif berwarna merah muda kekuningan. Dalam hal ini safranin tidak masuk ke dalam spora (Lay,1994). Spora akan menyerap warna dan tidak akan melepaskannya lagi meskipun diberi etanol, sedangkan ruang sel selebihnya akan kehilangan warna (Schlegel & Shmidt, 1994).

Sel khamir yang termasuk jenis Saccharomyces mungkin berbentuk bulat, oval, atau memanjang dan mungkin membentuk pseudomiselium. Reproduksi khamir ini dilakukan dengan cara pertunasan multipolar atau melalui pembentukan askospora. Askospora dapat terbentuk setelah terjadi konjugasi atau berasal dari sel diploid. Askospora yang berjumlah satu sampai empat per askus, biasanya berbentuk bulat atau oval (Fardiaz,1992) 1.2Tujuan Praktikum

Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui berbagai macam pewarnaan seperti pewarnaan gram, pewarnaan spora, pengecatan spora yeast dan pengecatan sederhana, mengetahui perbedaan antara keempat macam pengecatan tersebut, mengamati bentuk dan koloni sel setelah pengecatan, mengetahui ciri ciri dan perbedaan bakteri gram positif dan negatif.2.MATERI DAN METODA

2.1Materi

2.1.1Alat

Alat alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas obyek, kaca penutup, jarum ose, mikroskop, bunsen, korek api, pipet dan tissue.2.1.2Bahan

Bahan bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah Bacillus subtilis, Streptococcus thermophilus, Escheruchia coli, Saccharomyces cereviceae, aquades, larutan methylen blue, larutan violet kristal, larutan lugol, alkohol 95%, larutan safranin dan larutan malachite green.2.2Metoda

2.2.1Pewarnaan Sederhana

Mula mula kaca preparat diberi setetes aquades. Kemudian diambil sedikit biakan, yang berupa Bacillus subtilis atau Streptococcus thermophilus, dengan menggunakan ose dan dioleskan di atas kaca perparat tersebut. Kaca preparat ditunggu hingga kering lalu difiksasi dengan cara melewatkan kaca preparat pada nyala api sebanyak 15 kali. Kemudian diberi pewarna methylen blue dan dikeringkan selama kurang lebih 1 menit. Pewarna dicuci dengan air lalu dikeringkan lagi, kemudian diamati biakan yang telah diwarnai dengan menggunakan mikroskop.2.2.2 Pewarnaan GramMula mula kaca preparat diberi setetes aquades. Kemudian diambil sedikit biakan, yang berupa Escheruchia coli atau Streptococcus thermophilus, dengan menggunakan ose dan dioleskan di atas kaca perparat tersebut. Kaca preparat ditunggu hingga kering lalu difiksasi dengan cara melewatkan kaca preparat pada nyala api sebanyak 15 kali. Kemudian diberi pewarna violet kristal dan didiamkan selama 1 menit. Pewarna violet ini kemudian dibilas dengan air yang mengalir. Sisa air yang tertinggal di atas kaca preparat dikeringkan. Lalu kaca preparat ditetesi larutan lugol dan didiamkan selama 1 menit. Kemudian dicuci lagi dengan air, dan dihilangkan warnanya dengan alkohol 95% selama 10 20 detik, sampai warna biru tidak luntur lagi. Kemudian kaca preparat ditetesi pewarna ke dua berupa safranin dan didiamkan selama 10 20 detik. Kemudian kaca preparat dibilas dengan air, sisa airnya dikeringkan. Lalu biakan yang sudah diwarnai diamati dengan menggunakan mikroskop.2.2.3 Pewarnaan Spora

Mula mula kaca preparat diberi setetes aquades. Kemudian diambil sedikit biakan, yang berupa Bacillus subtilis, dengan menggunakan ose dan dioleskan di atas kaca perparat tersebut. Kaca preparat ditunggu hingga kering lalu difiksasi dengan cara melewatkan kaca preparat pada nyala api sebanyak 15 kali. Kemudian diberi pewarna malachite green dan didiamkan selama 5 menit di atas penangas air tapi tidak sampai kering. Kaca preparat dicuci dengan air selama 20 detik. Kemudian di atas kaca preparat ditetesi safranin dan didiamkan selama 30 detik. Setelah itu dibilas dengan air dan dikeringkan, lalu biakan yang sudah diwarnai diamati dengan menggunakan mikroskop.2.2.4 Pewarnaan Spora YeastMula mula kaca preparat diberi setetes aquades. Kemudian diambil sedikit biakan, yang berupa Saccharomyces cereviceae, dengan menggunakan ose dan dioleskan di atas kaca perparat tersebut. Kaca preparat ditunggu hingga kering lalu difiksasi dengan cara melewatkan kaca preparat pada nyala api sebanyak 15 kali. Kemudian diberi pewarna violet kristal. Kaca preparat dipanaskan selama 3 menit tapi tidak sampai kering. Lalu kaca preparat dicuci dengan air mengalir dan alkohol, lalu dikeringkan lagi. Setelah kering kaca preparat diberi pewarna safranin lalu didiamkan 10 detik. Setelah diberi pewarna ke dua, kaca preparat dicuci lagi dengan air mengalir. Kemudian kaca preparat dikeringkan. Setelah kering diamati biakan yang sudah diwarnai dengan menggunakan mikroskop.

3.HASIL PENGAMATANJenis PengecatanJenis MOGambarKeterangan

Pengecatan sederhanaB. subtilis

Perbesaran: 10 x 40Bentuk koloni: individu, berkelompok 2, rantai

Bentuk sel: batang

Warna: biru muda

Pengecatan sederhanaS. thermophilus

Perbesaran: 10 x 40

Bentuk koloni: individu, bergerombol, rantai

Bentuk sel: coccus

Warna: biru muda

Pengecatan gramE. coli

Perbesaran: 10 x 40

Bentuk koloni: individu, bergerombol, rantai

Bentuk sel: coccus

Warna: merah muda

Pengecatan gramS. thermophilus

Perbesaran: 10 x 40

Bentuk koloni: individu, bergerombol, rantai

Bentuk sel: coccus

Warna: merah muda

Pengecatan sporaB. subtilis

Perbesaran: 10 x 40

Bentuk koloni: individu

Bentuk sel: coccus

Warna: hijau muda

Pengecatan spora yeastS. cereviceae

Perbesaran: 10 x 40

Bentuk koloni: rantai

Bentuk sel: coccus

Warna: merah muda

4.PEMBAHASAN

Pada percobaan ini dilakukan berbagai jenis pengecatan terhadap mikroba. Dalam mikrobiologi, pengecatan ini cukup penting karena sebagian besar bakteri hidup sukar untuk dilihat dengan mikroskop cahaya. Kebanyakan sel sel mikrobia tidak berwarna atau mempunyai pigmen yang sangat sedikit dan tidak dapat mengabsorpsi ataupun membiaskan cahaya sehingga tidak dapat dilihat dengan mudah pada mikroskop karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Dengan pewarnaan, kontras antar sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan mewarnai sel-sel tersebut dengan sel warna (Hadioetomo, 1993).

Berbagai jenis cat yang digunakan dalam percobaan ini adalah methylen blue, violet kristal dan malachite green. Pewarna tersebut merupakan pewarna basa. Berbagai bakteri bisa mengikat pewarna basa karena adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Sel bakteri umumnya bermuatan negatif saat diwarnai bakteri bereaksi dengan ion positif dari zat pewarna basa. Sebelum melakukan pengecatan, diadakan pemindahan kultur dari biakan ke kaca preparat. Sebelumnya kaca preparat diberi setetes air. Pemberian kultur tidak boleh terlalu tebal dan tipis. Dengan pengecatan bakteri dapat diamati ukuran, bentuk dan ada atau tidaknya struktur internal seperti spora dan butiran (Volk dan Wheller, 1993).

Dalam percobaan ini juga dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan gelas benda pada nyala api dengan cepat selama 15 kali. Proses ini bertujuan untuk lebih melekatkan bakteri pada gelas benda dan mematikan bakteri (Lay, 1994). Fiksasi ini harus dilakukan pada bakteri yang benar benar sudah kering, karena jika olesan belum kering benar maka sel sel biakan akan terebus dan bentuknya akan rusak. Waktu fiksasi juga tidak boleh terlalu lama karena dapat menyebabkan penyusutan sel (Hadioetomo, 1993).

Pewarnaan sederhana dalam percobaan ini hanya menggunakan satu macam pewarna saja yaitu methylen blue (Lay, 1994). Pengecatan ini bertujuan untuk mengetahui bentuk mikroba dengan bantuan mikroskop (Timotius, 1982). Pewarna methylen blue ini bisa menempel pada biakan karena methylen blue bermuatan negatif bertemu dengan asam nukleat dalam protoplasma bakteri yang bermuatan positif. Oleh karena itu pengecatan sederhana dalam percobaan ini menggunakan bakteri Bacillus subtilis dan Staphylococcus thermophillus (Volk & Wheeler, 1993). Dengan perwanaan sederhana ini, bakteri dapat dibedakan berdasar tipe morfologinya, antara lain bentuk bulat, batang atau spiral (Hadioetomo, 1993).

Pada pengamatan pewarnaan sederhana didapati bahwa bentuk koloni dari Bacillus subtilis ada yang individu, ganda, rantai. Sedang bentuk dan warna dari spesies ini adalah batang dengan warna biru muda. Bentuk spesies ini sesuai dengan pernyataan Fardiaz (1992), dimana Bacillus subtilis merupakan bakteri yang penghasil spora berbentuk silinder yang tidak membengkak. Warna biru muda dari Bacillus subtilis disebabkan karena spesies ini bersifat basofilik atau suka akan basa. Sehingga methylen blue yang bermuatan negatif dapat diikat oleh muatan positif dari asam nukleat yang dihasilkan protoplasma Bacillus subtilis (Timotius, 1982).

Bentuk koloni dari pengamatan Staphylococcus thermophillus ada yang indvidu, bergerombol dan rantai. Sedang bentuk dan warna dari spesies ini adalah coccus dengan warna biru muda. Bentuk spesies ini sesuai dengan pernyataan Fardiaz (1992), dimana Staphylococcus thermophillus merupakan bakteri berbentuk bulat yang terdapat dalam bentuk tunggal, berpasangan, tetrad, atau berkelompok seperti buah anggur. Selain itu warna biru muda dari spesies ini sudah menunjukkan bahwa cat methylen blue sudah bisa diikat oleh Staphylococcus thermophillus. Karena methylen blue yang bermuatan negatif diikat oleh muatan positif dari asam nukleat yang dihasilkan protoplasma Staphylococcus thermophillus.Pada pewarnaan gram, mula mula kaca preparat diberi setetes aquades. Kemudian diambil sedikit biakan, yang berupa Escheruchia coli atau Streptococcus thermophilus, dengan menggunakan ose dan dioleskan di atas kaca perparat tersebut. Kaca preparat tadi difiksasi lalu diberi pewarna violet kristal dan didiamkan selama 1 menit. Pewarna violet ini kemudian dibilas dengan air yang mengalir. Lalu kaca preparat ditetesi larutan lugol dan didiamkan selama 1 menit. Kemudian dicuci lagi dengan air, dan dihilangkan warnanya dengan alkohol 95% selama 10 20 detik, sampai warna biru tidak luntur lagi. Kemudian kaca preparat ditetesi pewarna ke dua berupa safranin dan didiamkan selama 10 20 detik. Kemudian kaca preparat dibilas dengan air, sisa airnya dikeringkan. Lalu biakan yang sudah diwarnai diamati dengan menggunakan mikroskop.

Perlakuan fiksasi dalam percobaan ini bertujuan untuk melekatkan mikroba pada kaca preparat (Hadioetomo, 1993). Cat violet kristal yang digunakan dalam pengecatan ini digunakan untuk membedakan bakteri menjadi gram positif dan gram negatif (Volk dan Wheller, 1993). Sedang larutan lugol yang digunakan berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat, memperjelas warna, mempersulit pelarutan zat warna dan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks kristal violet iodium. Alkohol berfungsi untuk melunturkan zat warna primer dengan daya kerja yang lambat sehingga memperkecil kemungkinan terjadinya pemucatan yang berlebihan. Fungsi cat penutup safranin adalah sebagai pembeda terhadap zat warna primer dan juga untuk mewarnai kembali sel sel yang telah kehilangan zat warna primernya (Lay, 1994).

Percobaan pengecatan gram ini dilakukan untuk memilah bakteri menjadi kelompok gram positif dan kelompok gram negatif dan untuk dapat membedakan jenis-jenis bakteri berdasakan komposisi penyusun dinding selnya (Pelczar & Reid, 1958). Pada percobaan ini pengecatan gram dilakukan terhadap 2 jenis bakteri yaitu Staphylococcus thermophillus dan Escherichia coli. Pada pengecatan Escherichia coli didapati bentuk sel yang coccus, bentuk koloni ada yang individu, bergerombol dan rantai. Seharusnya Escherichia coli memiliki bentuk bacillus namun karena ukurannya sangat pendek, maka terkadang spesies ini terlihat bulat atau coccus (Fardiaz, 1992). Warna yang ditimbulkan dari spesies ini adalah merah muda. Dari pengamatan warna tersebut, dapat diketahui bahwa Escherichia coli benar benar bakteri gram negatif. Bakteri gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis dalam membran selnya. Saat pemberian alkohol, lipida akan larut sehingga pori pori dinding sel gram membesar dan kompleks kristal violet iodium pada dinding sel bakteri gram negatif akan larut. Dengan ini proses pemucatan berlangsung cepat dan akhirnya sel akan menyerap cat penutup safranin yang berwarna merah (Lay, 1994).

Pada pengecatan Staphylococcus thermophillus didapati bentuk sel yang coccus, bentuk koloni ada yang individu, bergerombol dan rantai. Hasil pengamatan tersebut sudahs esuai dengan teori dimana Staphylococcus thermophillus merupakan bakteri berbentuk bulat yang terdapat dalam bentuk tunggal, berpasangan, tetrad, atau berkelompok seperti buah anggur (Fardiaz, 1992). Warna yang ditimbulkan dari spesies ini adalah merah muda. Seharusnya Staphylococcus thermophillus tidak memberikan warna tersebut karena bakteri ini adalah bakteri gram positif. Bakteri gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal dalam membran selnya. Bakteri ini seharusnya tidak mudah terdehidrasi saat pelarutan ataupun pemanasan sehingga cat yang sudah masuk tidak dapat keluar lagi. Seharusnya bakteri ini dapat menahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai akhir prosedur, sehingga pada akhir proses pengecatan didapatkan bakteri dengan warna biru gelap atau ungu (Lay, 1994). Kesalahan ini dapat disebabkan karena biakan terlalu tua sehingga bakteri gram positif akan kehilangan permeabilitas dinding selnya (Hadioetomo, 1993). Selain itu hal ini dapat disebabkan waktu pelarutan yang terlalu lama sehingga warna awal pada sel bakteri gram positif ikut terlarut (Trihendrokesowo, 1989).

Pada perwarnaan spora, digunakan pewarna malachite green dan safranin. Kultur yang digunakan di sini adalah Bacillus subtilis. Dari hasil pengamatan terlihat bahwa bentuk dari spesies ini adalah coccus dengan koloni individu yang berwarna hijau muda. Seharusnya spesies ini berbentuk bacillus tetapi karena terlalu pendek seringkali terlihat berbentuk coccus. Sebagai penghasil spora, Bacillus subtilis akan berwarna hijau dalam pewarnaan ini (Fardiaz, 1992). Warna hijau muda dari pengamatan menunjukkan bahwa bakteri berendospora mengalami pemisahan (Schlegel & Shmidt, 1994).

Pada umumnya setelah membentuk endospora, Bacillus subtilis akan mati lalu mengalami lisis atau pemecahan membran sel. Spora bekas inilah yang menunjukkan adanya endospora (Lay, 1994). Setelah penetesan pewarna malachite green, dilakukan pemanasan. Pemanasan ini bertujuan untuk membantu zat warna menembus dinding endospora . Selain itu berguna untuk mengembangkan lapisan luar spora yang bersifat tahan terhadap perubahan faktor luar sehingga meskipun dilakukan pencucian dengan air mengalir zat warna pada endospora tetap tertinggal. Setelah didinginkan, warna hijau terperangkap dalam spora, sehingga struktur endospora dapat diamati (Tortora et al., 1995).

Pada pewarnaan spora yeast, umumnya prosedurnya sama dengan pewarnaan spora Bacillus. Hanya saja sebagai cat awal tidak digunakan malachite green melainkan cat violet kristal. Dari hasil pengamatan tersebut spora yeast berbentuk coccus dan koloninya berupa rantai yang berwarna merah muda. Bentuk dari spora sel khamir sudah sesuai dengan teori Fardiaz (1992), dimana Saccharomyces berbentuk bulat, oval, atau memanjang. Pembentukan spora pda khamir terjadi pada saat reproduksi yang berupa askospora. Sedang warna dari pengecatan khamir dalam percobaan berupa merah muda. Hal ini dapat disebabkan karena khamir masih dalam bentuk sel vegetatif dan belum membentuk spora. Sehingga setelah diberi violet kristal dan dicuci, warna akan terlepas. Oleh karena itu saat penambahan safranin yang merupakan zat warna basa, muatan negatif yang terdapat pada permukaan sel sehingga sel vegetatif akan diikat sehingga warna akhir khamir adalah merah muda (Lay,1994). 5.KESIMPULAN

Pengecatan cukup penting karena sebagian besar bakteri hidup sukar untuk dilihat dengan mikroskop cahaya. Dengan pewarnaan, kontras antar sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan mewarnai sel-sel tersebut dengan sel warna. Fiksasi bertujuan untuk lebih melekatkan bakteri pada gelas benda dan mematikan bakteri. Pewarnaan sederhana hanya menggunakan satu macam pewarna berupa methylen blue. Bacillus subtilis dan Staphylococcus thermophillus bermuatan muatan positif sehingga dapat mengikat pewarna basa.

Percobaan pengecatan gram dilakukan untuk memilah bakteri menjadi kelompok gram positif dan kelompok gram negatif dan untuk dapat membedakan jenis-jenis bakteri berdasakan komposisi penyusun dinding selnya. Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif. Staphylococcus thermophillus merupakan bakteri gram positif. Perwarnaan spora menggunakan pewarna malachite green dan safranin. Bacillus subtilis merupakan bakteri penghasil spora. Pewarnaan spora yeast dengan memakai cat violet kristal dan safranin, sehingga sel vegetatif akan diikat sehingga warna akhir khamir adalah merah muda.6.DAFTAR PUSTAKA

Bibiana,W.L. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta.

Fardiaz, S. (1992). Mikrobiologi Pangan 1. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Hadioetomo, R. S. (1993). Mikobiologi Dasar dalam Praktek, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Lay, B.W. (1994) . Analisis Mikroba dalam Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta.

Pelczar, M. J. & R. D. Reid. (1958). Mikrobiology. Mac Graw-Hill Book Company, Inc. New York.

Schlegel, H. G. & K. Schmidt. (1994). Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Timotius, K. H. (1982). Mikrobiologi Dasar. University Kristen Satya Wacana. Salatiga.Tortora, G. J.; B. R. Funke & C. L. Case. (1995). Microbiology an Introduction 5th Edition. The Benjamin / Cummings Publishing Company, Inc. USA.

Trihendrokesowo. (1989). Petunjuk Laboratorium Mikrobiologi Pangan. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. Yogyakarta.

Volk, W. A. & M. F. Wheeler. (1993). Mikrobiologi Dasar. Erlangga. Jakarta.

7.LAMPIRAN