isolasi dan identifikasi molekuler bakteri …repository.unimus.ac.id/2717/2/manuscript.pdfisolasi...

1

*Corresponding Author :

Nining Mony

Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas

Muhammadiyah Semrang 50273

E-mail: [email protected]

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI

PENGHASIL ENZIM PROTEASE PADA TEMPE GEMBUS PASCA

FERMENTASI 48 JAM BERDASARKAN ANALISIS GEN 16S rRNA

Manuscript

Disusun oleh :

Nining Mony

G1C217189

PROGRAM STUDI D IV ANALIS KESEHATAN

FAKULTAS ILMU KEPERAWATAN DAN KESEHATAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SEMARANG

2018

http://repository.unimus.ac.id


2


Nining Mony




1



3


Nining Mony




2



4


Nining Mony




ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI

PENGHASIL ENZIM PROTEASE PADA TEMPE GEMBUS PASCA

FERMENTASI 48 JAM BERDASARKAN ANALISIS GEN 16S rRNA

Nining Mony1, Stalis Norma Ethica

2, Ana Hidayati Mukromah

3

1. Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas

Muhammadiyah Semrang

2. .Laboratorium Paologi Klinik Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhmmadiyah

Semarang

3. Laboraorium Biologi Molekuler Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhmmadiyah

Semarang

Info Artikel Abstrak

Keywords:

Identifikasi molekuler,

bakteri proteolitik, gen

16S rRNA, Bacillus

cereus

Enzyme is a complex molecule of proteins are produced by living and

working cells as catalyst in various chemical processes in the body . In

medical world, enzyme proteases used as medical therapy for treatment

of tumors , inflammation, an abnormality of blood and arrangement of

immunity . The purpose of this research is to know the presence of

bacteria producing protease that is found in the tempe gembus after

fermentation 48 hours, as well as to find out the type of bacteria

producing protease that is found in tempe gembus after fermentation 48

hours based on 16S rRNA gene analysis. The process of isolation and

purification bacteria colonies is done on media nutrient agar by using

speread method, while production of enzyme proteases test carried out

using selective media skim milk Agar (SMA). Molecular identification

process based on 16S rRNA gene sequence analysis done by Polymerase

Chain Reaction (PCR), and followed by sequencing. From the process of

isolation obtained results in from of a single isolate bacterial have

proteolytic activity is demonstrated by the existence of a clear zone of

Skim Milk Agar media that have a sizeable diameter is 85.00 mm.

Based on 16S rRNA gene sequence analysis showed that proteolytic

bacteria isolates in this study, That isolation ISTD 2.1 has a semblance of

98% 16S rRNA gene fragments with isolates of bacteria Bacillu cereus

KAVK5 ( genbank the access codes: kp792776.1 ) . Based on the results

of this research it can be concluded that isolates ISTD 2.1 potential

producers of proteolytic enzymes and based on molecular identification

of isolates, ISTD, exercised 2.1 expressed as Bacillus cereus ISTD1

(Indonesian Soybean Tempeh Day-1).



5


Nining Mony

Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah

Semrang 50273


PENDAHULUAN

Tempe merupakan makanan tradisional

khas dan telah dikenal lama di fermentasi

Indonesia. Dalam SNI 3144 - 2009 tempe

didefinisikan sebagai produk makanan hasil

biji kedelai oleh jamur tertentu, berbentuk

padatan kompak, berbau khas serta berwarna

putih atau sedikit keabu-abuan, dan beraroma

khas tempe. Salah satu yang mendukung

popularitas tempe di kalangan internasional

adalah kandungan gizi tempe yang cukup

tinggi. Berdasarkan kandungan nutrisi makro

pada tempe, 100 g tempe segar dapat

berkontribusi pada 16.9-17.9 g protein, 20-20.1

g lemak, dan 21.5-27.6 g karbohidrat dengan

energi sebesar 350.5-380.8 kalori (Efriwati dan

Nuraida 2013).

Bakteri merupakan salah satu

mikroorganisme penghasil enzim yang paling

banyak digunakan sebagai sumber enzim.

Bakteri lebih dianggap menguntungkan karena

pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh pada

substrat yang relatif murah dan mampu

menghasilkan enzim (Akhdiya, 2003).

Protease adalah enzim yang berperan

dalam reaksi biokatalis yang

menyebabkanpemecahan protein. Enzim

protease dapat dihasilkan oleh tanaman, hewan

maupun mikroorganisme seperti bakteri.

Indonesia merupakan salah satu negara yang

telah memanfaatkan enzim protease dalam

bidang industri. Protease digunakan dari

berbagai aplikasi industri seperti detergen,

farmasi, produk-produk kulit dan produk-

produk makanan (Fatoni dkk., 2008).

Identifikasi 16S rRNA dapat dilakukan

dengan metode Polymerase Chain Reaction

(PCR). PCR merupakan suatu metode

molekuler untuk membuat salinan segmen

spesifik dari suatu DNA. Metode ini jauh lebih

cepat daripada pengklon gen dengan DNA

plasmid atau DNA faga dan seluruhnya

dilakukan in vitro (Campbell, 2002). Gen

pengkode 16S rRNA terdapat bagian

penyimpan yangberguna untuk mendisain

primer universal PCR yang mampu

memperbanyak beberapa fragmen gen 16S

rRNA dari semua bakteri patogen dan

nonpatogen. Fragmen ini termasuk bagian

hipervariable yang tidak mudah termutasi dan

mengandung tanda urutan spesifik spesies yang

berguna untuk mengidentifikasi bakteri hingga

ke level spesies (Israhmadini, 2008).

Penelitian ini perlu dilakukan karena

pada penelitian sebelumnya telah dilaporkan

adanya bakteri penghasil dari protease yang

dihasilkan dari fermentasi tempe gembus.

Namun belum ada laporan tentang isolasi

bakteri proteolitik dari sampel yang sama pasca

fermentasi. Penelitian ini adalah bagian dari

penelitian tentang keanekaragaman bakteri

proteolitik yang terdapat pada bahan makanan

sumber protein hasil fermentasi yang ada di

Indonesia.

METODE dan BAHAN

Jenis penelitian yang digunakan

merupakan analisis deskriptif.

Alat dan bahan yang digunakan dalam

penelitian adalah cawan petri, mikropipet,

inkubator, autoklaf, oven, hot plate, tabung

reaksi, erlenmeyer, rak tabung, gelas ukur,

laminar, lampu spirtus, ose jarum, pinset,

neraca analitik, mikrotube, waterbath, vortex,

termal cyler, cetakan gel agarose, alat

elektroforesis, power supply, ultraviolet

transilluminator, dan tabung ependrof.

Bahan yang dibutuhkan dalam penelitian

ini adalah sampel tempe gembus, NaCl

fiologis, dH2O, kapas dan kasa, plastik dan

plastik wrap, aluminium foil, kertas label,

media Skim Milk Agar, aquades, Nuclease free

water (NFW), Promega Kit, Etanol absolut

70%, TE Buffer, DNA Template (isolat DNA

genom /total), PCR Master Mix (Promega),

Primer Forward 8F 16S rRNA, Primer Reverse

1492R 16S rRNA, gel agarose, Loading dye,

Larutan Tris Borat EDTA, media Nutrien



6


Nining Mony




Agar, dan Ethidium Bromida

HASIL PENELITIAN

Gambaran Sampel

Setelah dilakukan penelitian mengenai

isolasi dan identifikasi molekuler bakteri

penghasil protease pada tempe gembus pasca

fermentasi 48 jam maka diperoleh hasil

sebagai berikut:

Setelah difermentasi 2 hari tempe

gembus yang awalnya semua putih berubah

menjadi sedikit kecoklatan disertai tekstur

lembek dan sedikit berair serta agak berbau,

tertera pada Gambar 1

(a) (b)

Gambar 1. (a) Tempe gembus sebelum

fermentasi 48 jam (b) Tempe

gembus pasca fermentasi 48 jam

Isolasi dan Identifikasi Koloni Bakteri

Total bakteri koloni yang ditemukan

dari isolasi satu sampel tempe gembus pasca

fermentasi 48 jam didapatkan sebanyak 5

koloni bakteri murni dengan morfologi

koloni yang berbeda. Karakteristik morfologi

pada masing-masing koloni bakteri yang

didapatkan dari isolasi tempe gembus pasca

fermentasi 48 jam, koloni dapat dilihat pada

gambar 2 dan tabel 1

(a) ISTD2.1 (b) ISTD2.2 (c) ISTD2.3

(d) ISTD2.4 (e) ISTD2.5

Gambar 2. (a) Karakteristik morfologi isolat

bakteri ISTD2.1 (b) bakteri

ISTD2.2 (c) bakteri ISTD2.3 (d)

bakteri ISTD2.4 (e) bakteri

ISTD2.5

Tabel 1 Morfologi Koloni Bakteri

Dari Tabel 1. Diketahui mayoritas

bakteri berbentuk bulat. Sedangkan dari

karakteristik warna mayoritas warna koloni

putih dan kuning. Selanjutnya ditemukan

klobi yang mempunyai tepi rata. Dari segi

elevasi, semua kloni mempunyai elevasi

cambung dan mempunyai ukuran besar, keil

dan sedang dengan kosisten tidak berlendir

Pewaarnaan Gram

Koloni bakteri yang ditemukan pada

isolasi bakteri pada sampel tempe gembus

pasca fermentasi 48 jam diidentifikasi

karakteristik dan jernihnya berdasarkan

pewarnaan Gram.

Hasil pewarnaan Gram koloni bakteri

didapatkan dari isolasi tempe gembus pasca

fermentasi 48 jam dapat dilihat pada tabel 2

Tabel 2. Pewarnan Gram Bakteri

Sampel Hasil Pewarnaan Gram



7


Nining Mony




ISTD2.1 Basil Gram-negatif

ISTD2.2 Basil Gram-positif


ISTD2.4 Kokus Gram-negatif


Berdasarkan Tabel 2 pewarnaan Gram

yang telah dilakukan, mayoritas bakteri

berbentuk kokus dan merupakan kelompok

Gram-positif. Namun demikian ditemukan

pula bakteri yang berbentuk basil baik Gram-

positif maupun Gram-negatif. Dari koloni

yang ada, dipilih satu isolat dengan bentuk

sel yang unik yaitu isolat kode ISTD2.1

untuk dilanjukan pada uji penghasilan enzim

protease menggunakan media Skim Milk

Agar (SMA).

Uji Enzimatik Penghasil Protease

Koloni bakteri yang telah diisolasi dan

identifikasi kemudian dilakukan uji

enzimatik untuk mengetahui kemampuan

bakteri dalam memecah protein.

Hasil uji enzimatik penghasil protease

isolate ISTD2.1 yang dilakukan pada media

skim milk agar dapat dilihat pada gambar 3

sebagai berikut:

Gambar 3. Uji enzimatik protease pada media

susu milk agar

Pada gambar 3 dapat dilihat aktivitas

protease isolat ISTD2.1 pada media agar

yang mengandung substrat susu milk agar.

Terlihat adanya zona bening atau zona

protease yang memenuhi permukaan petri

disekitar koloni bakteri.

Berdasarkan hasil uji enzimatik

gambar 3, isolat ISTD2.1 mempunyai

aktivitas proteolitik dengan diameter zona

bening yang relatif besar yaitu 85,00 mm.

Pengukuran dilakukan menggunakan alat

jangka sorong. Selanjutnya dilakukan isolasi

genom bakteri penghasil protease untuk

keperluan identifikasi molekuler

Tabel 3. Hasil Nilai Absorbansi isolasi

DNA genom isolat ISTD2.1

No

Sampel

ID

Nucleic

Acid

Conc

A260 A280 260/

280

1

ISTD2.1

54.5 ng/µl

1.091

0.458

2.38

Dari tabel 3 perhitungan nilai

absorbansi pada merupakan hasil kemurnian

isolat DNA genom bakteri berupa nilai

absorbansi. Isolat DNA genom yang

diperoleh akan digunakan sebagai template

atau cetakan dalam proses PCR untuk

amplifikasi fragmen gen 16S rRNA bakteri.

Berdasarkan hasil perhitungan absorbansi

dapat dikatakan genom bakteri dengan

kemurnian yang cukup dapat digunakan

sebagai template untuk PCR gen 16S rRNA.

Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan

untuk memisahkan DNA dari bahan lain.

Prinsip metode ini yaitu isolasi Genom

dilakukan dengan cara penghancur (lisis),

ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan

padat seperti protein dan pemurnian DNA,

sel tersebut diharapkan akan pecah dan DNA

genom keluar dari sel. Hasil isolasi DNA

genom yang ditunjukkan pada gambar 4.

memperlihatkan adanya satu pita DNA yang

menujukkan adanya DNA genom dari hasil

isolasi.

Hasil amplifiksi dicek dengan uji

elektroforesis, dan hasilnya ditunjukkan pada

gambar 4 adalah sebagai berikut:



8


Nining Mony




(b)

No

Sampel

ID

Nucleic

Acid

Conc

A260 A280 260/

280

1

ISTD2.1

54.5 ng/µl

1.091

0.458

2.38

(a)

No

Sampel

ID

Nucleic

Acid

Conc

A260 A280 260/

280

1

ISTD2.1

54.5 ng/µl

1.091

0.458

2.38

Gambar 4. Hasil Amplifikasi Fragmen 16S

rRNA isolasi ISTD2.1 (a) Marker

(b) Sampel ISTD2.4

Pada gambar 4 dapat dilihat hasil

amplifikasi gen 16S rRNA pada gel

elektroforesis berupa pita atau band DNA

tunggal berukuran sekitar 1500 bp. Karena

hasil amplifikasi 16S rRNA didapatkan pita

gen 16S rRNA pada 1500 bp yang sesuai

dengan ukuran gen tersebut pada bakteri,

maka pekerjaan penelitian dapat dilanjutkan

ke tahap sekuensing.

Hasil Sekuensing

Dari hasil sekuensing Gen 16S rRNA

didapatkan kemiripan 98% dengan fragmen

gen 16S ribosomal RNA isolate bakteri

Bacillus cereus strain KAVK5 (Genbank

kode akses : KP792776.1) sehingga isolat

diberi nama Bacillus cereus ISTD1 (ISTD1 =

Indonesian Soybean Tempeh Day-1).

DISKUSI

Penelitian ini diawali dengan

pengenceran 10-1-10-

5. Tempe utuh pasca

fermentasi 48 jam ditimbang sebanyak 1

gram kemudian dimasukkan dalam tabung

dan diberi label tanpa pengenceran. Dari 1

tabung dipipet 1 ml lalu dimasukkan ke

dalam tabung II kemudian dihomogenkan

diberi label 10-1. Perlakuan ini dilakukan

berulang kali sampai pengenceran 10-5. Dari

masing – masing pengenceran di ambil 1 ml

lalu diratakan diatas media Nutrient Agar

menggunakan triangle. Kemudian di inkubasi

selama 24-48 jam pada temperatur 37oC.

Pengamatan tentang karakeristik

morfologi koloni bakteri perlu dilakukan agar

bakteri tidak menumpuk dan memudahkan

pengamatan morfologi koloni (sitasi). Setelah

pengamatan morfologi koloni dilajutkan

dengan pewarnaan Gram yang dibaca pada

mikroskop cahaya untuk melihat jenis bakteri

Gram-negatif dan Gram-positif. Pada

penelitian ini isolat ISTD2.1 diketahui

merupakan bakteri basil Gram-negatif.

(Jawetz, dkk., 2004).

Menurut klasifikasinya bakteri dibagi

menjadi 2 yaitu bakteri Gram-positif dan

bakteri Gram-negatif. Beberapa bakteri

Gram-positif dan bakteri Gram-negatif

merupakan flora normal. Flora normal adalah

mikroorganisme yang menempati suatu

daerah tanpa menimbulkan penyakit pada

inang yang ditempati.

Poernomo dan Purwanto (2003),

menyatakan bahwa zona bening terjadi

apabila protein yang terdapat dalam media

susu skim dihidrolisis oleh enzim

ekstraseluler menjadi asam amino yang dapat

digunakan secara langsung oleh sel sebagai

sumber nutrisi. Hal ini dilakukan karena sel

tidak mampu memanfaatkan protein yang

bersifat makromolekul secara langsung untuk

ditransfer ke dalam sel.

Gen 16S rRNA dapat digunakan

sebagai indikator identifikasi

mikroorganisme yang bersifat universal

berukuran sekitar 1500 pb. Dengan demikian

identifikasi suatu bakteri dapat dilakukan

dengan mengamplifikasi daerah 16S rRNA

dari genom bakteri (Rinata, 2011).

Bacillus cereus ialah bakteri berbentuk

batang yang berspora dan bersifat Gram-

positif, selnya berukuran besar dibandingkan

dengan bakteri batang lainnya serta tumbuh

secara aerob fakultatif. Untuk membedakan

Bacillus cereus dengan Bacillus lainnya

digunakan ciri morfologi dan biokimia.

Bacillus cereus merupakan salah satu jenis

bakteri yang masuk ke dalam genus Bacillus.

yang banyak ditemukan pada makanan dan

dapat menyebabkan sakit pada manusia

sehingga digolongkan ke dalam bakteri

patogen. Bakteri ini mampu menghasilkan

1500

bp



9


Nining Mony




spora yang tahan terhadap panas dan proses

dehidrasi (Nurwidiani, 2010).

Pada penelitian ini bakteri Bacillus

cereus ditemukan pada tempe gembus pasca

fermentasi 48 jam. Hal ini kemungkinan

disebabkan oleh adanya kontaminan terhadap

makanan lain saat proses pembuatan tempe

gembus yang tidak steril dilakukan.

Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang

berjudul Isolasi dan Identifiksi Molekuler

Bakteri Penghasil Enzim Protease Pada

Tempe Gembus Pasca Fermentasi 48 Jam

Berdasarkan Analisis Gen 16S rRNA dapat

disimpulkan dari kelima isolasi bakteri yang

berhasil disolasi dari sampel tempe gembus

pasca fermentasi 48 jam, terdapat satu isolate

bakteri, yaitu ISTD2.1 yang kemudian diberi

label ISTD2.1 yang memiliki aktivitas

protease ditandai dengan terbentuknya zona

bening yang berdiameter 85,00 mm

disekelilingi koloni bakteri pada medium

Skim Milk Agar. Kemudin Proses

identifikasi molekuler isolat ISTD2.1

menghasilkan sekuen gen 16S rRNA dengan

urutan nukleotida yang menunjukkan tingkat

kesamaan dengan urutan nukleotida gen 16S

rRNA bakteri Bacillus cereus. Maka

disimpulkan bahwa isolasi dengan sampel

ISTD2.1 merupakan akteri Bacillus cereus.

Saran

Disarankan dilakukan isolasi bakteri

enzim penghasil proetase pada produk hasil

fermentasi makanan lain.

Ucapan Terima Kasih

Penulis ucapkan terima kasih kepada

ibu Dr. Stalis Norma Ethica, M. Si, selaku

pembimbing pertama yang telah banyak

memberi waktu, semangat, ilmu dan

bimbingan selama penulisan skripsi ini.

Ibu Dr. Ana Hidayati Mukromah,

M.Si, selaku pembimbing kedua yang telah

memberikan waktu ilmu dan membimbing

selama menulis skripsi ini.

Ibu Andri sukeksi, SKM., M.Si, selaku

ketua program studi diploma IV analis

kesehatan universitas muhammadiah

semarang, kepada kedua orang tua saya

Ayahanda Mansur Mony, ibunda Sattia Ridi

yang telah memberikan do'a dan bimbingan

secara materal dan moril, serta semua pihak

yang tidak dapat saya sebutkan satu-persatu

yang turut membantu dalam menyelesaikan

penulisan skripsi ini

REFERENSI

Dewi, R.S. & Aziz, S., 2011. Isolasi

Rhizopus oligosporus pada beberapa

inokulum tempe di kabupaten banyumas.

Molekul, 6, pp.93–104.

Ethica, S.N., Nataningtyas, D.R., Lestari, P.,

Istini, I., Semiarti, E., Widada, J. and

Raharjo, T.J., 2013. Comparative Evaluation

of Conventional Versus Rapid Methods for

Amplifiable Genomic DNA Isolation of

Cultured Azospirillum sp. JG3. Indonesian

Journal of Chemistry, 13(3), pp.248-253.

Fatchiyah, Estri, L. A, Sri, W., dan Sri, R.

2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar

Analisis. Erlangga. Jakarta.

Jawetz, E., J, Melnick dan Adelberg. 2004.

Mikrobiologi Kedokteran Edisi 23. EGC.

Jakarta

Kuswanto, R. K., Sudarmadji, Slamet. 1989.

Mikrobiologi Pangan. Yogyakarta: UGM.

Nicholl, dan Soeka, Y.S. 2011. Kemampuan

Bacillus lichenoformis Dalam Mempreduksi

Enzim Protease Yang Bersifat Alkali dan

Termofilik. 20. 2.

Poernomo AT, DA Purwanto, 2003. Uji

aktivitas crude enzim proteolitik Bacillus

subtilis FNCC 0059 hasil fermentasi curah.

Majalah Farmasi Airlagga. 3(3):103-107.

Rinanta, R. 2011. Analisis Sekuensing 16S

rRNA diBidang Mikroorganisme.Vol 11 No3

Sambrook J, dan Russel, D.W. 2001.

Molecular Cloning A Laboratory Manual. Ed

ke-3. Cold Spring Habor: Cold Spring

Laboratory Pres. ISBN: 0-87969-576-3

Sambrook J, Russell DW. 1989. Molecular

Cloning : A Laboratory Manual 3 rdedition.

New York : Laboratory Pr.



10


Nining Mony




Sambrook, J.R. and Russel, D.W., 2001. DW

2001. Molecular Cloning: A Laboratory.

Sirvia, M.O, dkk. 2011. Isolasi Bakt



11


Nining Mony

Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah

Semrang 50273




isolasi dan identifikasi molekuler bakteri …repository.unimus.ac.id/2717/2/manuscript.pdfisolasi...

Documents