ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI PENGHASIL ENZIM

L-ASPARAGINASE DARI BATANG DAN DAUN MANGROVE Sonneratia alba

SKRIPSI

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN

JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN

Oleh:

FERDINA TRI LAKSMITA

NIM. 135080300111073

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2017

ii

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI PENGHASIL ENZIM

L-ASPARAGINASE DARI BATANG DAN DAUN MANGROVE Sonneratia alba

SKRIPSI

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERIARAN

Sebagai salah satu syarat untuk Meraih Gelar Sarjana Perikanan

di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya

Oleh:

FERDINA TRI LAKSMITA

NIM. 135080300111073

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2017

iii

iv

PERNYATAAN ORISINALITAS

Dengan ini saya bertanggung jawab dan menyatakan bahwa dalam

skripsi yang berjudul “Isolasi dan Identifikasi Molekuler Bakteri Penghasil Enzim

L-asparaginase dari Batang dan Daun Mangrove Sonneratia alba” merupakan

benar-benar hasil karya dan pemikiran saya sendiri.

Sepanjang penulisan skripsi ini sepengetahuan saya tidak terdapat

tulisan, pendapat atau karya orang lain yang pernah diterbitkan oleh instansi atau

orang lain kecuali yang tertulis dalam laporan ini yang tercantum dalam daftar

pustaka.

Apabila dikemudian hari atau dapat dibuktikan bahwa skripsi ini

merupakan hasil plagiasi, maka saya siap dan bersedia menerima segala

konsekuensi dan sanksi atas perbuatan tersebut yang sesuai dengan hukum

yang berlaku di Indonesia.

Malang, 31 Juli2017

Penulis

Ferdina Tri Laksmita

NIM. 135080300111073

v

DAFTAR RIWAYAT HIDUP

Nama : Ferdina Tri Laksmita

Temp at, Tgl. Lahir : Nganjuk, 10 Februari 1995

Jenis Kelamin : Wanita

Agama : Islam

Alamat : Jl.MT Haryono No 18 Ploso Nganjuk

No. Telep on : 085655778330

DAFTAR RIWAYAT PENDIDIKAN

o 2001 – 2007 : SDN PLOSO 1 NGANJUK

o 2007 – 2010 : SMPN 2 NGANJUK

o 2010 - 2013 : SM AN 2 NGANJUK

o 2013 – 2017 : Universitas Brawijaya Malang

vi

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya

kepada :

1. Kedua Orang tua tercinta Bapak Djarot Dwi Sasongko dan Ibu Reni Kustiari yang

telah melahirkan, membesarkan dan mendidik penulis dalam menimba ilmu

pengetahuan sampai kepada penyelesaian studi, serta memberikan dukungan

baik material maupun non-material dan memberikan semangat yang luar biasa

dalam setiap langkah penyusunan skripsi ini.

2. Dr. Sc. Asep Awaludin Prihanto, S.Pi, MP selaku Pembimbing I yang telah

membimbing dengan sabar dan memberi saran masukan kepada Penulis dalam

penelitian dan penulisan skripsi ini.

3. Dr. Ir. Happy Nursyam, MS selaku Pembimbing II yang telah memberi saran bagi

Penulis dalam penulisan skripsi ini.

4. Dr. Ir. Hardoko, MS dan Hefti Salis Yufidasari, S.Pi, MP selaku dosen Penguji

yang telah memberikan saran dan masukan dalam penulisan skripsi ini.

5. Seluruh dosen Teknologi Hasil Perikanan FPIK UB yang telah memberikan ilmu

kepada Penulis selama masa perkuliahan di kelas.

6. Mas Ismail selaku laboran Laboratorium Genetika dan Molekuler Fakultas Sains

dan Teknologi Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang atas

bantuannya selama menjalankan peneltiian.

7. Kedua kakak tercinta David Eka Setiawan dan Renja Dwi Andika yang telah

membantu secara moril. Terima kasih telah mendoakan dan memberikan

bantuan secara materil kepada Penulis selama penulisan skripsi ini.

8. Teman-teman satu tim (Kasyanto, Wuri, Lutfiana, Randy, Kiki, Ovi, Anggra,

Puspita, Ifa, Fifta, Inga, Egar, Ciko, Guntur, Hafiz, Gio, dan Yulia,) atas kerja

keras dan kerja ikhlasnya selama ini, serta dukungan, semangat, perhatian,

waktu, pengalaman dan persaudaraan yang telah diberikan kepada Penulis.

vii

9. Sahabat tercinta Rani Dwi Andriani, Bora Anggraeni dan Nurmala yang telah

memberi dorongan semangat secara moril dan motivasi kepada Penulis selama

penelitian dan penulisan laporan skripsi ini.

10. Seluruh pihak yang telah membantu terselesaikannya laporan Skripsi, yang tidak

bisa disebutkan satu-persatu, saya ucapkan bamyak terima kasih.

Malang, 31Juli 2017

Penulis

viii

RINGKASAN

Ferdina Tri Laksmita. 135080300111073. Laporan Skripsi dengan Judul “Isolasi dan Identifikasi Molekuler Bakteri Penghasil Enzim L-Asparaginase dari Batang dan Daun Mangrove Sonneratia alba”, dibawah bimbingan Dr. Sc. Asep Awaludin Prihanto, S.Pi, MP dan Dr. Ir. Happy Nursyam, MS.

L-asparaginase merupakan enzim yang mampu menghidrolisis L-asparagin menjadi L-aspartat dan amonia. Kemampuan ini dalam dunia medis digunakan sebagai kemoterapi bagi penderita leukimia terutama acute lymphoblastic leukemia (ALL). Selain sebagai kemoterapi, L-asparaginase juga digunakan dalam industri pangan untuk mencegah terbentuknya senyawa akrilamid yang terbentuk ketika makanan diolah pada suhu tinggi lebih dari 120oC. Sumber enzim L-asparaginase dapat dihasilkan dari sel hewan, sel tumbuhan dan sel mikroorganisme. Namun mikroorganisme merupakan sumber penghasil enzim yang paling baik, karena pertumbuhan mikroorganisme relatif cepat sehingga menghasilkan enzim yang lebih banyak. Selain itu sifat dari mikroorganisme yang mudah dikultur dan dipurifikasi, sehingga memungkinkan produksi enzim dalam skala besar.

Tujuan dari penelitian ini adalah mengeksplorasi bakteri penghasil enzim L-asparaginase yang berasal dari batang dan daun mangroveSonneratia albayang berpotensi menghasilkan enzim L-asparaginase. Bakteri yang memiliki aktivitas hidrolisis L-asparaginase tertinggi dilakukan identifikasi molekuler dengan gen 16S rRNA untuk mengetahui spesies dari bakteri tersebut. Metode penelitian yang digunakan adalah deskriptif eksploratif yaitu penelitian yang dilakukan apabila pengetahuan tentang gejala yang diteliti masih sangat kurang atau tidak ada sama sekali. Tahapan penelitian dimulai dari pengambilan sampel mangrove, kultivasi, isolasi, skrining dan identifikasi bakteri secara molekuler.Teknik penanaman bakteri menggunakan metode pengenceran untuk mengurangi kepadatan mikroba, dipindah ke streak tiga kuadran, dan dibuat stok kultur pada media agar miring. Tahap tersebut bertujuan untuk mendapatkan isolat murni dari bakteri.

Hasil isolasi didapatkan sebanyak 18 isolat bakteri yang selanjutnya ditumbuhkan pada media skrining L-asparaginase. Sebanyak 4 isolat dari 18 isolat bakteri memiliki aktivitas hidrolisis L-asparaginase. Isolat yang menghasilkan enzim L-asparaginase tertinggi yaitu isolat MB-3 dengan ditandai terbentuknya zona warna biru tertinggi di media skrining. Isolat MB-3 kemudian dilakukan tahap identifikasi molekuler 16S rRNA. Berdasarkan uji identifikasi molekuler 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat MB-3 teridentifikasi memiliki kedekatan genetik dengan Paenibacillus dendritiformis memiliki nilai identity sebesar 94%. Nilai tersebut menunjukkan tingkat kesamaan dalam genus, namun berbeda spesies. Sehingga bakteri isolat MB-3 dapat dikatakan spesies baru dengan penamaan Paenibacillus brawijaya. Selanjutnya dilakukan analisa kekerabatan dengan bakteri lainnya menggunakan perancangan pohon filogenetik. Hasil konstruksi pohon filogenetik menunjukkan bahwa bakteri Paenibacillus brawijaya memiliki nilai bootsrap pada cabang pertama sebesar 0,89 memiliki arti dalam satu genus. Cabang kedua menunjukkan nilai bootsrap 0, yang memiliki arti bahwa bakteri paenibacillus brawijaya tidak memiliki kekerabatan spesies dengan Paenibacillus dendritiformis. Adapun saran penelitian ini diperlukan uji biokimia untuk memastikan hasil identitas bakteri dari uji molekuler 16S rRNA. Serta dilakukan uji lanjutan optimasi produksi enzim L-aspraginase dari isolat Paenibacillus brawijaya.

ix

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI PENGHASIL ENZIM L-ASPARAGINASE DARI BATANG DAN DAUN MANGROVE Sonneratia alba

Ferdina Tri Laksmita1), Asep Awaludin Prihanto2), dan Happy Nursyam2)

1) Mahasiswa Fakultas Parikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya, Malang

2) Dosen Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya, Malang

ABSTRAK

Enzim L-asparaginase merupakan enzim yang dapat mengkatalis proses hidrolisis L-asparagin menjadi L-aspartat dan amonia. Aplikasi enzim L-asparaginase dalam industri nonpangan sebagai agen kemoterapi pada penyakit acute lymphoblastic leukemia (ALL), sedangkan dalam industri pangan digunakan untuk mengurangi terbentuknya senyawa akrilamida pada makanan yang diolah dengan suhu tinggi (120oC). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menemukan sumber bakteri penghasil enzim L-asparaginase yang berasal dari batang dan daun mangrove Sonneratia alba. Hasil skrining didapatkan 4 isolat dari 18 isolat yang memiliki aktivitas enzim L-asparaginase berdasarkan zona berwarna biru yang terbentuk pada media skrining. Isolat tersebut yaitu MB-3, MD-3, SD-3 dan BD-6. Dari 4 isolat, isolat MB-3 memiliki aktivitas produksi enzim terbanyak. Oleh sebab itu dilakukan identifikasi molekuler 16S rRNA pada isolat MB-3. Hasil identifikasi molekuler menunjukkan bahwa isolat MB-3 merupakan bakteri spesies baru dari genus Paenibacillus dengan nilai kemiripan 94%. Sehingga penamaan dari bakteri tersebut menjadi Paenibacillus brawijaya. Kemudian dilakukan pengkonstruksian pohon filogenik untuk mengetahui kekerabatannya dengan bakteri lainnya. Hasil pohon filogenik menunjukkan nilai bootstrap 0,89 pada cabang pertama yang menunjukkan tingkat kekerabatan genus yang tinggi dan nilai bootsrap 0 pada cabang selanjutnya yang menunjukkan bahwa tidak ada kekerabatan dalam tingkat spesies dengan bakteri Paenibacillus dendritiformis. Hasil konfirmasi pewarnaan gram menunjukkan bahwa bakteri Paenibacillus brawijaya merupakan gram positif dan berbentuk batang (basil). Kata kunci: L-asparaginase, bakteri endofit, mangrove, Sonneratia alba, 16S rRNA, Phylogeny

ISOLATION AND MOLECULAR IDENTIFICATION OF BACTERIA PRODUCES ENZYME L-ASPARAGINASE FROM STEAM AND LEAF MANGROVE Sonneratia Alba

ABSTRACT

L-asparaginase is an enzyme that catalyze the hydrolysis of L-asparagin to L-aspartate and ammonia. Application of L-asparaginase enzyme in non-food industry as chemotherapeutic agent in acute lymphoblastic leukemia (ALL) disease, while in the food industry is used to reduce the formation of acrylamide compounds in foods who are cooked in high temperature (120oC). The purpose of this study was to find the source of L-asparaginase enzyme-producing bacteria derived from the stems and leaves of Sonneratia alba mangroves. The result of screening showed 4 isolates from 18 isolates positive to produce L-asparaginase, they are MB-3, MD-3, SD-3 and BD-6. MB-3 is considered as the best L-asparaginase producer. Hence, it will continoue to species analyze with molecular identification of 16S rRNA. The result of molecular identification showed that the MB-3 isolate is a new species of bacterium from genus Paenibacillus with 94% similarity value. Hence, we named Paenibacillus brawijaya. Constructed phylogenic tree to know the realationship with other bacteria. The results of the phylogenic tree showed a bootstrap value of 0.89 in the first branch showing the high genus relationship level and the bootsrap value 0 in the subsequent branches indicating that there was no relationship at the species level with the Paenibacillus dendritiformis bacteria. The results of the confirmation of gram staining showed that the bacteria of Paenibacillus brawijaya were gram positive and rod shape. Keywords: L-asparaginase, endophyte bacteria, mangrove, Sonneratia alba, 16S rRNA, Phylogeny

x

KATA PENGANTAR

Puji syukur atas kehadirat Allah S.W.T atas limpahan berkah, karunia

serta ridho-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul:

“Isolasi dan Identifikasi Molekuler Bakteri Penghasil Enzim L-asparaginase dari

Batang dan Daun Mangrove Sonneratia alba”.

Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk mendapatkan gelar

sarjana perikanan di Fakultas Perikanan dan Ilmu kelautan Universitas

Brawijaya. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan yang mendasar.

Oleh karena itu penulis mengharapkan kritik serta saran yang dapat membangun

untuk penyempurnaan laporan selanjutnya. Demikian penulis sampaikan terima

kasih.

Malang, 31 Juli 2017

Penulis

(Ferdina Tri Laksmita)

xi

DAFTAR ISI SAMPUL ................................................................................................................i HALAMAN JUDUL .............................................................................................. ii LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................... iii PERNYATAAN ORISINALITAS ......................................................................... iv UCAPAN TERIMA KASIH .................................................................................. vi RINGKASAN .................................................................................................... viii KATA PENGANTAR .......................................................................................... ix DAFTAR ISI ....................................................................................................... xi DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiv DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xv 1.PENDAHULUAN .............................................................................................. 1

1.1 Latar Belakang ........................................................................................ 1 1.2 Rumusan Masalah .................................................................................. 2 1.3 Tujuan Penelitian .................................................................................... 2 1.4 Kegunaan ............................................................................................... 3 1.5 Waktu dan Tempat Pelaksanaan ............................................................ 3

2. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................... 4

2.1 Mikroba Endofit ....................................................................................... 4 2.2 Mangrove Sonneratia alba ...................................................................... 5 2.3 Enzim ...................................................................................................... 6

2.3.1 Klasifikasi Enzim .............................................................................. 7 2.3.2 Sifat Katalitik Enzim ......................................................................... 8 2.3.3Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim ..................................... 8 2.3.4 Teori Pembentukan Kompleks Enzim Substrat .............................. 11

2.4 Enzim L-Asparaginase .......................................................................... 12 2.4.1 Sejarah Enzim L-asparaginase ...................................................... 13 2.4.2 Klasifikasi Enzim L-Asparaginase .................................................. 13 2.4.3 Sumber L-asparaginase ................................................................ 14 2.4.4 Aplikasi Enzim L-Asparaginase ..................................................... 15

2.5 Isolasi Mikroorganisme Penghasil Enzim L-asparaginase ..................... 19 2.6 Identifikasi Molekuler 16S rRNA ............................................................ 21 2.7Analisis Hasil Sekuensing ...................................................................... 25 2.8Analisis Filogenetik ................................................................................ 26 2.9 Pewarnaan Gram .................................................................................. 26

3.METODE PENELITIAN .................................................................................. 28

3.1 Tempat dan Waktu Pelaksanaan .......................................................... 28 3.2 Alat dan Bahan ..................................................................................... 28

3.2.1 Peralatan Penelitian ...................................................................... 28 3.2.2 Bahan Penelitian ........................................................................... 29

3.3 Metodologi Penelitian ............................................................................ 29 3.4 Prosedur Penelitian ............................................................................... 30 3.4.1 Pengambilan Sampel dari Mangrove Sonneratia alba ........................ 30 3.4.2 Tahap Persiapan Media ..................................................................... 31 3.4.3 Tahap Persiapan Sampel dan Pengenceran ...................................... 32 3.4.4 Tahap Kultur Bakteri .......................................................................... 32 3.4.5 Tahap Isolasi Bakteri .......................................................................... 33

xii

3.4.6 Tahap Skrining Bakteri Penghasil Enzim L-asparaginase .................. 33 3.4.7 Pembuatan Stok Kultur ...................................................................... 33 3.4.8 Identifikasi Molekuler Bakteri 16S rRNA ............................................ 34

3.4.8.1Isolasi DNA .................................................................................. 34 3.4.8.2 Amplifikasi Gen dengan Teknik Polymerase Chain Reaction ...... 35 3.4.8.3 Konfirmasi Hasil Amplifikasi Gen ................................................ 36 3.4.8.4Purifikasi Amplikon Gen ............................................................... 37 3.4.8.5 Sequencing (Pengurutan Sekuen) DNA Amplikon Gen .............. 37 3.4.8.6Pembacaan Sekuen Hasil Sekuensing ........................................ 38 3.4.8.7Penggabungan Hasil Sekuensing Forward dan Reverse ............. 38 3.4.8.8Pencarian Database Spesies lain dengan Gen Bank ................... 39 3.4.8.9Filogenik Sekuen DNA ................................................................. 40

3.4.9 Konfirmasi Gram dan Morfologi .......................................................... 40 3.4.10Diagram Alir Penelitian ...................................................................... 43

4.HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................... 44

4.1 Isolasi Bakteri Endofit Mangrove.......................................................... 44 4.2 Skirining Bakteri Penghasil L-Asparaginase ........................................ 47 4.3 Identifikasi Molekuler Bakteri Penghasil Enzim L-asparaginase ........... 50

4.3.1Hasil Isolasi DNA .............................................................................. 50 4.3.2Amplifikasi Gen dengan Teknik PCR ................................................ 52 4.3.3Hasil Sekuensing DNA Amplikon Gen .............................................. 56

4.4 Analisa Kekerabatan dan Pohon Filogenetik ....................................... 61 4.5 Konfirmasi Gram dan Morfologi ........................................................... 63

5. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................................... 66

5.1 Kesimpulan ........................................................................................... 66 5.2 Saran .................................................................................................... 66

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 67 LAMPIRAN ....................................................................................................... 76

xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman 1. Mangrove Sonneratia alba.. ....................................................................................... 6

2. Hubungan aktivitas enzim dengan suhu ................................................................. 9

3. Hubungan kecepatan reaksi dengan pH ................................................................ 10

4. Hubungan laju reaksi dengan konsentrasi enzim ................................................. 11

5.Teori kunci gembok dan teori Induksi ..................................................................... 12

6. Rekasi Enzim L-asparaginase. ................................................................................ 12

7. Mekanisme penghambatan sel tumor .................................................................... 17

8. Mekanisme terbentuknya senyawa akrilamid ........................................................ 18

9. Metode Goresan (streak plate method) ................................................................ 19

10. Metode Sebaran dan Metode Agar Tuang (pour plate method) ...................... 21

11. Tahapan pewarnaan Gram . .................................................................................. 27

12. Peta wilayah pengambilan sampel mangrove .................................................... 30

13. Diagram Alir Isolasi dan Identifikasi Bakteri penghasil L- asparaginase ........ 43

14. Bagian Endofit Sampel Mangrove Sonneratia alba ........................................... 45

15. Hasil Isolasi Bakteri sampel Batang dan Daun Mangrove Sonneratia alba.. . 47

16. Hasil Uji aktivitas semikuantitatif L-asparaginase .............................................. 48

17. Hasil Elektroforesis isolasi DNA kromosom ........................................................ 50

18. Elektroforesis hasil amplifikasi DNA isolat MB-3 ............................................... 55

19. Hasil Pewarnaan Gram Bakteri Panaebacillus dentritiformis ........................... 64

20.Pohon Filogenetik dari Identifikasi Paenibacillus dendritiformis UB3 ............... 62

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman 1. Penampilan sel sewaktu pewarnaan Gram ........................................................... 27

2. Komposisi Media Luria Bertani Agar (LBA) ........................................................... 31

3. Hasil Uji Aktivitas L-asparaginase semikuantitatif ............................................... 48

4. Nilai Kemurnian DNA ................................................................................................ 51

5. Hasil Pembacaan BLAST Assembly ....................................................................... 59

6. Hasil bermacam-macam BLAST bakteri sehomolog dengan isolat MB-3 ........ 62

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman 1. Diagram Alir Isolasi dan Skrining Bakteri Penghasil L-Asparaginase ............... 76

2. Pembuatan Stok Kultur Bakteri................................................................................ 77

3. Isolasi DNA (Wizard Genomic DNA Purification Kit from Promega) ................. 78

4.Amplifikasi Gen dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) .............................. 80

5. Elektroforesis Gel agarosa ....................................................................................... 81

6. Purifikasi Amplikon Hasil PCR ................................................................................. 82

7. Sekuensing DNA Amplikon Gen.............................................................................. 83

8. Skema Pewarnaan Gram Bakteri ............................................................................ 84

9. Hasil Alignment Software Online BLAST Isolat MB-3 .......................................... 85

10. Elektroferogram Forward Isolat MB-3 .................................................................. 87

11. Elektroferogram Reverse Isolat MB-3 ................................................................... 88