3. Hasil dan Pembahasan

Alat-alat yang digunakan pada praktikum

spektrofotometri adalah spektrofotometer Optima sp-3000

plus, kuvet, mikropipet, dan mikrotip. Cara kerja

spektrofotometer secara umum adalah memisahkan cahaya

putih atau cahaya polikromatik menjadi suatu spektrum

warna. Spektrofotometer membandingkan jumlah cahaya

yang keluar tabung dengan cahaya yang memasuki tabung

(Vodopich & Moore 2005: 67).

Bahan-bahan yang digunakan saat praktikum adalah

sampel DNA darah dan tanaman, akuabides, dan tisu.

Sampel DNA berperan sebagai sampel yang akan diukur

tingkat kemurniannya. Sampel tersebut didapat dari hasil

praktikum isolasi DNA darah Akuabides berperan sebagai

pelarut yang digunakan untuk mengencerkan DNA. Pada

praktikum, akuabides yang digunakan yaitu sebanyak 490

µL. Akuabides adalah air leding biasa yang didistilasi

sebanyak dua kali. Akuabides juga digunakan sebagai

blanko. Blanko digunakan untuk mengkalibrasikan

spektrofotometer. Alasan dari penggunaan blanko adalah

agar spektrofotometer benar-benar dalam kondisi normal,

dan kuvet dalam keadaan yang bersih sehingga dapat

melewatkan cahaya dengan optimal (Basset dkk. 1994:

818).

Kuvet digunakan sebagai wadah bagi sampel atau

pelarut untuk selanjutnya dimasukkan kedalam

spektrofotometer. Kuvet adalah adalah suatu tabung uji

yang bening yang terbuat dari kaca atau quartz (Vodopich

& Moore 2005: 68). Kuvet yang umumnya dipergunakan

dalam proses spektrofotometri memiliki ketebalan 1 cm.

Kuvet memiliki dua macam permukaan bagian luar,

permukaan kasar dan permukaan yang halus. Permukaan

kuvet yang halus tidak boleh disentuh oleh tangan, dan

harus dalam keadaan bersih dan bening karena digunakan

untuk melewatkan cahaya. Mikropipet digunakan untuk

memindahkan sampel atau pelarut kedalam kuvet.

Mikrotip digunakan untuk melengkapi mikropipet agar

pengukuran volume mikroliter semakin besar, sehingga

mengurangi kesalahan pengukuran volume (Boyer 1993:

15).

Langkah pertama yang dilakukan dalam praktikum

spektrofotometri adalah menghidupkan mesin

spektrofotometeri dengan menekan tombol on yang

terdapat di bagian belakang mesin. Kemudian tampilan

dicek sampai semua OK, pilih single cell/multi cell,

kemudian panjang gelombang ditentukan yaitu 260 dan

tekan ENTER. Selanjutnya lakukan kalibrasi dengan

membuat blanko.Akuabides dimasukan ke dalam kuvet,

lalu letakkan kuvet ke dalam sample chamber, sebelumnya

permukaan bagian luar kuvet harus dalam keadaan yang

benar-benar bersih. Kuvet terlebih dahulu dibersihkan

dengan mengelap permukaan luar dengan tisu, boleh juga

dengan menyemprotkan sedikit alkohol. Setelah kuvet

diletakkan pada sample chamber, pilih autozero dengan

menekan tombol F3, ditunggu hingga muncul measure,

pastikan Abs= 0. Semua tahap di atas dilakukan dengan

panjang gelombang 280, pastikan pula Abs= 0.

Untuk mengetahui nilai absorban dari sampel DNA,

hal yang perlu dilakukan yaitu memasukkan larutan DNA,

yang terdiri atas campuran dari 10 µL sampel DNA darah

dan 490µL pelarut (akuabides), ke dalam kuvet. Letakkan

kuvet di dalam sample chamber, lalu pilih measure dan

catat nilai Abs dan %T. Langkah yang sama dilakukan

pada sampel DNA tumbuhan. Absorbansi pada panjang

gelombang 260 nm (A260) dapat digunakan untuk

mengukur keseluruhan konsentrasi DNA dalam suatu

larutan (Barber 2001: 1). Konsentrasi DNA dalam suatu

larutan dapat dihitung dengan persamaan berikut:

Konsentrasi DNA (µg/ml) = A260 x 50 (konstanta) x faktor

pengenceran (Frederick 2003: 990).

Perbandingan antara absorbansi pada panjang gelombang

260 nm dengan absorbansi pada panjang gelombang 280

nm merupakan ukuran kemurnian suatu sampel DNA.

Pernyataan tersebut dapat digunakan untuk mengukur

tingkat kemurnian DNA sampel, sehingga diperoleh:

Nilai kemurnian DNA:

= A260

A280

= 1,8 – 2 (Basset dkk. 1994: 818).

Kemurnian DNA yang didapat dapat dilihat bila

dibandingkan dengan teori, sampel DNA yang murni

secara keseluruhan akan memiliki rasio A260: A280

sebesar 1,8 sampai 2. Nilai kemurnian yang bernilai lebih

kecil dari 1,80 menandakan bahwa sampel banyak

terkontaminasi oleh protein dan terjadi kontaminasi oleh

RNA atau DNA lain bila lebih besar dari 2. (Barber 2001:

1) terjadi kontaminasi oleh RNA atau DNA lain bila lebih

besar dari 2 (Barber 2001: 1).

VI. DAFTAR ACUAN

Vodopich, D.S. & R. Moore. 2005. Biology: Laboratory

manual. 7th ed. McGraw-Hill Company, Boston:

ix + 555 hlm.

Barber, L. 2001. DNA concentration determination. 25

April 2003: 1 hlm. http://www.protocol-

online.org/archieve/posts/709.html. 21 April 2011,

pk 23.12.

Bassett, J, R.C. Denney, G.H. Jeffrey, J. Mendham. 1994.

Buku ajar vogel: Kimia analisis kuantitatif

anorganik. Terj. Dari Vogel’s textbook

quantitative inorganic analysis including

elementary instrumental analysis, Pudjaatmaka,

H. & L. Setiono. EGC, Jakarta: xii + 1502 hlm.

Boyer, R. F. 1993. Modern experimental biochemistry.

The Benjamin Cummings Publishing Company,

Inc., Redwood City: xix + 555hlm.

Frederick, M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston,

David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith,

Kevin Struhl. 2003.

Current protocols in molecular biology. John

Wiley & Sons, Inc. NC: xv = 4410 hlm.