I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Untuk meneliti bakteri di laboratorium, kita harus dapat menumbuhkan

mereka dalam biakan murni. Untuk melakukan hal ini, haruslah dimengerti jenis-

jenis lingkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhannya.

Dalam laboratorium, lingkungan fisik yang dimaksud adalah media biakan.

Media biakan adalah media steril yang digunakan untuk menumbuhkan

mikroorganisme. Media biakan terdiri dari garam organik, sumber energi

(karbon), vitamin dan zat pengatur tumbuh (ZPT). Selain itu dapat pula

ditambahkan komponen lain seperti senyawa organik dan senyawa kompleks

lainnya (Soeryowinoto, 1985).

Keragaman yang luas dalam hal tipe nutrisi diantara bakteri, diimbangi

oleh tersedianya berbagai macam media yang banyak macamnya untuk

kultuivasinya. Macam media tersebut dapat dibagi berdasarkan bentuknya dan

susunannya.

Berdasarkan bentuknya, media dibagi atas medis cair, semi cair dan

padat. Sedang menurut susunannya, media dapat dibagi atas media kompleks

dan media sintetik.

Media biakan yang mampu mendukung optimalisasi pertumbuhan

milroorganisme harus dapat memenuhi persyaratan nutrisi bagi mikroorganisme.

unsur tersebut berupa garam organik, sumber energi (karbon), vitamin dan zat

pengatur tumbuh (ZPT). Selain itu dapat pula ditambahkan komponen lain

seperti senyawa organik dan senyawa kompleks lainnya (Soeryowinoto, 1985).

B. Tujuan dan Kegunaan

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui prosedur pembuatan

medium.

Kegunaan dari praktikum ini ialah agar praktikan dapat mengetahui

prosedur pembuatan medium.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme yang ingin kita tumbuhkan, yang pertama harus

dilakukan adalah memahami kebutuhan dasarnya kemudian memformulasikan

suatu medium atau bahan yang akan digunakan. Air sangat penting bagi

organisme bersel tunggal sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk

masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan medium sebaiknya menggunakan air

suling. Air sadah umumnya mengandung ion kalsium dan magnesium yang

tinggi. Pada medium yang mengandung pepton dan ektrak daging, air dengan

kualitas air sadah sudah dapat menyebabkan terbentuknya endapan fosfat dan

magnesium fosfat (Hadioetomo, 1993).

Alat yang akan digunakan dalam suatu penelitian atau praktikum harus

disterilisasi terlebih dahulu untuk membebaskan semua bahan dan peralatan

tersebut dari semua bentuk kehidupan. Sterilisasi merupakan suatu proses untuk

mematikan semua organisme yang teradapat pada suatu benda. Proses

sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu penggunaan panas

(pemijaran dan udara panas); penyaringan; penggunaan bahan kimia (etilena

oksida, asam perasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin) (Hadioetomo,

1993).

Memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan untuk

menumbuhkan mikroorganisme di dalamnya harus memperhatikan berbagi

macam ketentuan seperti jika yang ingin kita membuat medium untuk organisme

bersel tunggal, biasanya air sangat penting sebagai komponen utama

protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan medium

agar padat, digunakan agar-agar, gelatin atau gel silika. Bahan agar yang utama

adalah galaktan (komplek karbohidrat yang diekstrak dari alga genus Gelidium).

Agar akan larut atau cair pada suhu hampir 100oC dan akan cair apabila kurang

lebih 43oC (Hadioetomo, 1993).

Menurut Schlegel (1993) agar merupakan media tumbuh yang ideal yang

diperkenalkan melalui metode bacteriaological.

Organisme hidup memerlukan nutrisi untuk pertumbuhannya. Subtansi

kimia organik dan inorganik diperoleh dari lingkungan dalam berbagai macam

bentuk. Nutrien diambil dari likungan kemudian ditransformasikan melalui

membran plasma menuju sel. Di sel beberapa nutrisi diolah menghasilkan energi

yang digunakan dalam proses seluler (Lim, 1998).

Bakteri dalam medium juga memerlukan makanan untuk

pertumbuhannya. Bakteri yang tidak punya akar harus berada pada permukaan

larutan makanan yang cair. Pertumbuhan bakteri berarti meningkatnya jumlah sel

yang konstituen (yang menyusun). Apabila disusun 10 bakteri dalam 1 ml

medium yang cocok dan 24 jam kemudian ditemukan 10 juta bakteri tiap

milimeternya, maka terjadilah pertumbuhan bakteri. Meningkatnya jumlah bakteri

terjadi dengan proses yang disebut dengan pembelahan biner, dimana setiap

bakteri membentuk dinding sel baru (Volk, 1993).

Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga memerlukan pH

yang tepat. Kebanyakan bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi yang terlalu

basa, kecuali Vibrio cholerae yang dapat hidup pada pH lebih dari 8. Suhu juga

merupakan variabel yang perlu dikendalikan. Kelompok terbesar yaitu mesofil,

suhu optimum untuk pertumbuhannya 20-40oC (Volk, 1993).

PH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan

dalam pembuatan medium sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu

asam tidak cocok untuk dijadikan medium mikroba karena mikroba tidak dapat

hidup pada kondisi tersebut. Medium didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam

untuk menyakinkan bahwa medium masih steril, karena selain pH sebagai

penentu tumbuhnya mikroba, alat dan medium yang steril juga menentukan

(Dwidjoseputro, 1994).

Beberapa medium buatan manusia dapat berupa:

1. Medium yang cair

Medium cair yang biasa dipakai ialah kaldu yang disiapkan sebagi berikut.

1 L air murni ditambahkan 3 gram kaldu lembu dan 5 gram pepton. Medium ini

kemudian di tentukan pHnya 6,8 sampai 7 jadi sedikit asam atau netral, keadaan

yang demikian tersebut sesuai bagi kebanyakan bakteri

2. Meduim yang kental (padat)

Suatu penemuaan yang baik sekali ialah medium dari kaldu yang sedikit

di campur dengan agar-agar. Setelah medium itu disterilkan, dan kemudian

medium itu dibiarkan mendingin, maka kita memperoleh mdium yang padat.

Gelatin dapat juga dipakai sebagai bahan pengental dan memang orang dulu

bias mengkklaimnya-tetapi sejak lama orang lebih suka menggunakan agar-agar.

(Prof. DR, Dwidjoseputro.1981.hal.32-33)

3. Medium yang diperkaya

Serum atau darah yang dicamprkan kedalam medium yang sudah

disterilkan. Jika pencampuran ini dilakukan secara sterilisasi , maka serum atau

darah tersebut akan mengental, akibat pemanasan. Pada medium Loeffer, serum

dicampurkan kedalam dasar seringkali orang menambahkan makanan sebelum

disterilisasi. Seringkali orang menambahkan susu-air tomat kepada dasar

makanan untuk menumbuhkan Loctobacillus dan beberapa spesies lainnya.

4. Medium kering

Untuk menyiapkan medium kering, cukup mengambil sekian gram serbuk

kering tersebut untuk dilarutkan sekian liter dan kemudian lautan tersebut

disterilkan. Penentuan pH tidak lagi, karena hal itu sudah dilakukan terlebih

dahulu pada pembuatan serbuk.

5. Medium sintetik

Medium sintetik berupa ramuan. Ramuan zat organic yang tertentu yang

mengandung zat karbon dan nitrogen. Bakteri outotrof dapat hidup dalam

medium ini. Bakteri safprofit juga dapat hidup didalam medium ini asalkan

ditambahkan natriun-sitrat dan patrium. Amonicium posfat yang pertama

merupakan sumber karbon, sedang yang kedua merupakan sumber nitrogen.

(Prof. DR, Dwidjoseputro.1981. hal.32-33)

Jenis-jenis media juga dapat dibagi menjadi beberapa jenis :

Lactose Broth

Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran

koliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-

enrichment broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa

oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien

esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber

karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan

dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform.

Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton;

dan 0,5% laktosa.

EMBA (Eosin Methylene Blue Agar)

Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan mengandung

laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa

seperti S. aureus, P. aerugenosa, danSalmonella. Mikroba yang memfermentasi

laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam.

Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya

eosin dan metilen blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun

demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga

tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella sp dapat menimbulkan

keraguan. Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa

kontaminan tersebut adalah E.coli.

Agar EMB (levine) merupakan media padat yang dapat digunakan untuk

menentukan jenis bakteri coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung.

EMB yang menggunakan eosin dan metilin bklue sebagai indikator memberikan

perbedaan yang nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan yang tidak.

Medium tersebut mengandung sukrosa karena kemempuan bakteri koli yang

lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa. Untuk mengetahui jumlah

bakteri coli umumnya digunakan tabel Hopkins yang lebih dikenal dengan nama

MPN (most probable number) atau tabel JPT (jumlah perkiraan terdekat), tabel

tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah bakteri coli dalam 100 ml

dan 0,1 ml contoh air.

Nutrient Agar

Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA

juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak

selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media

sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Na merupakan salah

satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa

dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk

pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam

kultur murni.

Untuk komposisi nutrien adar adalah eksrak beef 10 g, pepton 10 g, NaCl

5 g, air desitilat 1.000 ml dan 15 g agar/L. Agar dilarutkan dengan komposisi lain

dan disterilisasi dengan autoklaf pada 121°C selama 15 menit. Kemudian

siapkan wadah sesuai yang dibutuhkan.

Nutrient Broth

Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk

cair. Intinya sama dengan nutrient agar. Nutrient broth dibuat dengan cara

sebagai berikut.

1.Larutkan 5 g pepton dalam 850 ml air distilasi/akuades.

2.Larutkan 3 g ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah pertama.

3.Atur pH sampai 7,0.

4.Beri air distilasi sebanyak 1.000 ml.

5.Sterilisasi dengan autoklaf.

MRSA (deMann Rogosa Sharpe Agar)

MRSA merupakan media yang diperkenalkan oleh De Mann, Rogosa,

dan Shape (1960) untuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis

Lactobacillus dari seluruh jenis bahan. MRS agar mengandung polysorbat,

asetat, magnesium, dan mangan yang diketahui untuk beraksi/bertindak sebagai

faktor pertumbuhan bagi Lactobacillus, sebaik nutrien diperkaya MRS agar tidak

sangat selektif, sehingga ada kemungkinan Pediococcus dan jenis Leuconostoc

serta jenis bakteri lain dapat tumbuh. MRS agar mengandung:

1.Protein dari kasein 10 g/L

2.Ekstrak daging 8,0 g/L

3.Ekstrak ragi 4,0 g/L

4.D (+) glukosa 20 g/L

5.Magnesium sulfat 0,2 g/L

6.Agar-agar 14 g/L

7.dipotassium hidrogen phosphate 2 g/L

8.Tween 80 1,0 g/L

9.Diamonium hidrogen sitrat 2 g/L

10.Natrium asetat 5 g/L

11.Mangan sulfat 0,04 g/L

MRSB

MRSB merupakan media yang serupa dengan MRSA yang berbentuk

cair/broth.

Trypticase Soy Broth (TSB)

TSB adalah media broth diperkaya untuk tujuan umum, untuk isolasi, dan

penumbuhan bermacam mikroorganisme. Media ini banyak digunakan untuk

isolasi bakteri dari spesimen laboratorium dan akan mendukung pertumbuhan

mayoritas bakteri patogen.

Media TSB mengandung kasein dan pepton kedelai yang menyediakan

asam amino dan substansi nitrogen lainnya yang membuatnya menjadi media

bernutrisi untuk bermacam mikroorganisme. Dekstrosa adalah sumber energi

dan natrium klorida mempertahankan kesetimbangan osmotik. Dikalium fosfat

ditambahkan sebagai buffer untuk mempertahankan pH.

Plate Count Agar (PCA)

PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobik dengan inokulasi

di atas permukaan. PCA dibuat dengan melarutkan semua bahan (casein

enzymic hydrolisate, yeast extract, dextrose, agar) hingga membentuk suspensi

22,5 g/L kemudian disterilisasi pada autoklaf (15 menit pada suhu 121°C). Media

PCA ini baik untuk pertumbuhan total mikroba (semua jenis mikroba) karena di

dalamnya mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang menyediakan

asam amino dan substansi nitrogen komplek lainnya serta ekstrak yeast

mensuplai vitamin B kompleks.

APDA

Media APDA berfungsi untuk menumbuhkan dan menghitung jumlah

khamir dan yeast yang terdapat dalam suatu sampel. Khamir dan yeast akan

tumbuh dengan optimal pada media yang sesuai. Adanya asam tartarat dan pH

rendah maka pertumbuhan bakteri terhambat. APDA dibuat dengan merebus

kentang selama 1 jam/45 menit, agar dilelehkan dalam 500 ml air. Campurkan

ekstrak kentang dalam agar lalu ditambahkan glukosa dan diaduk rata. Pada

APDA jadi ini juga ditambah asam tartarat.

Potato Dextrose Agar (PDA)

PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan

kapang. Dapat juga digunakan untuk enumerasi yeast dan kapang dalam suatu

sampel atau produk makanan. PDA mengandung sumber karbohidrat dalam

jumlah cukup yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga

baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk

pertumbuhan bakteri. Cara membuat PDA adalah mensuspensikan 39 g media

dalam 1 liter air yang telah didestilasi. campur dan panaskan serta aduk.

Didihkan selama 1 menit untuk melarutkan media secara sempurna. Sterilisasi

pada suhu 121°C selama 15 menit. Dinginkan hingga suhu 40-45°C dan tuang

dalam cawan petri dengan pH akhir 5,6+0,2.

VRBA (Violet Red Bile Agar)

VRBA dapat digunakan untuk perhitungan kelompok bakteri

Enterobactericeae. Agar VRBA mengandung violet kristal yang bersifat basa,

sedangkan sel mikroba bersifat asam. Bila kondisi terlalu basa maka sel akan

mati. Dengan VRBA dapat dihitung jumlah bakteri E.coli. Bahan-bahan yang

dibutuhkan untuk membuat VRBA adalah yeast ekstrak, pepton, NaCl, empedu,

glukosa, neutral red, kristal violet, agar). Bahan-bahan tersebut kemudian

dicampur dengan 1 liter air yang telah didestilasi. Panaskan hingga mendidih

sampai larut sempurna. Dinginkan hingga 50-60°C. Pindahkan dalam tabung

sesuai kebutuhan, pH akhir adalah 7,4. Campuran garam bile dan kristal violet

menghambat bakteri gram positif. Yeast ekstrak menyediakan vitamin B-

kompleks yang mendukung pertumbuhan bakteri. Laktosa merupakan sumber

karbohidrat. Neutral red sebagai indikator pH. Agar merupakan agen pemadat.

PGYA

Media ini berfungsi untuk isolasi, enumerasi, dan menumbuhkan sel

khamir. Dengan adanya dekstrosa yang terkandung dalam media ini, PGYA

dapat digunakan untuk mengidentifikasi mikroba terutama sel khamir. Untuk

membuatnya, semua bahan dicampur dengan ditambah CaCO3 terlebih dahulu

sebanyak 0,5 g lalu dilarutkan dengan akuades. Kemudian dimasukkan dalam

erlenmeyer dan disumbat dengan kapas lalu disterilisasi pada suhu 121°C

selama 15 menit.

III. METODOLOGI PRAKTIKUM

A. Waktu dan Tempat

Praktek mikrobiologi laut dilaksanakan pada hari Jumat 15 Maret 2012

pukul 10.00 - 12.30 di Laboratorium Mikrobiologi Laut Jurusan Ilmu Kelautan,

Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan, Universitas Hasanuddin, Makassar.

B. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini ialah timbangan digital untuk

mengukur jumlah bahan, magnetic strirrer with hot plate untuk mengaduk dan

memanaskan bahan, tabung reaksi sebagai wadah, spatula untuk mengambil

bahan, pipet tetes untuk mengambil sampel, erlenmeyer untuk mencampurkan

bahan, dan gelas piala untuk mengukur jumlah air.

Bahan yang digunakan untuk praktikum ini ialah pepton, beef ekstract,

agar, dan aquades sebagai bahan medium, kapas untuk menutup tabung reaksi,

dan alumunium foil sebagai wadah bahan saat menimbang.

C. Prosedur Kerja

1. Nutrient Agar (NA)

Pertama-tama menyiapkan alat-alat yang dibutuhkan, kemudian

menimbang bahan-bahan yang akan digunakan untuk pembuatan larutan NA,

yaitu Beef extract 0,3 gram, Pepton 0,5 gram, dan agar 1,5 gr. Lalu semua

bahan dicampur dengan gelas kimia dengan aquades 100 ml. kemudian

memanaskan gelas kimia berisi bahan dengan menggunakan hot plate with

magnetic stirrer hingga mendidih. Kemudian larutan dimasukkan ke dalam

tabung reaksi masing-masing 4 ml berisi larutan NB kemudian tutup

menggunakan kapas.

2. Nutrient Broth (NB)

Pertama-tama menyiapkan alat-alat yang dibutuhkan, kemudian

menimbang bahan-bahan yang akan digunakan untuk pembuatan larutan NB,

yaitu Beef extract 0,3 gram, Pepton 0,5 gram. lalu semua bahan dicampur

dengan gelas kimia dengan aquades 100 ml. kemudian memanaskan gelas kimia

berisi bahan dengan menggunakan hot plate with magnetic stirrer hingga hangat.

Kemudian larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing 4 ml berisi

larutan NB kemudian tutup menggunakan kapas.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Nutrien agar (NA)

Nutrien Broth (NB)

Perhitungan

Nutrient Agar (NA)

Keterangan :1. Kapas2. Tabung Reaksi3. Medium NA

Keterangan :1. Kapas2. Tabung Reaksi3. Medium NA

Nutrient Broth (NB)

B. Pembahasan

Media biakan adalah media steril yang digunakan untuk menumbuhkan

mikroorganisme. Media biakan terdiri dari garam organik, sumber energi

(karbon), vitamin dan zat pengatur tumbuh (ZPT). Selain itu dapat pula

ditambahkan komponen lain seperti senyawa organik dan senyawa kompleks

lainnya (Soeryowinoto, 1985).

Dalam praktikum kali ini media yang dibuat hanyalah media padat berupa

Nutrient Agar dan media cair berupa Nutrient Broth. Perbedaan secara umum

untuk kedua medium yaitu fisiknya, dimana NA berwujud padat, dan NB

berwujud cair.

Media padat digunakan untuk untuk mempermudah menglihatan karena

bakteri yang diam lebih mudah diamati. Sedangkan media cair digunakan untuk

pengamatan pergerakan bakteri.

Dalam pembuatan medium NA dan NB juga terletak perbedaan pada

bahan, karena terdapat fungsi dari masing – masing bahan.

1. Pepton, merupakan sumber utama nitrogen organik dan dapat pula

mengandung vitamin, karena dihasilkan dari bahan-bahan yang

mengandung protein daging, susu, kedelai, dan putih telur.

2. Beef extract, mempunyai nilai nutrisi yang tinggi, karena merupakan

substansi jaringan hewan yang larut dalam air yaitu karbohidrat, nitrogen

organik, vitamin dan mineral.

3. Agar, merupakan suatu karbohidrat kompleks yang diperoleh dari alga

laut yang berfungsi sebagai pemadat media, tetapi tidak merupakan

sumber nutrient.

IV. PENUTUP

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa :

1. Untuk membuat Nutrient Agar, digunakan bahan pepton, beef ekstract,

agar, dan aquades

2. Untuk membuat Nutrient Broth, digunakan bahan pepton, beef extract,

dan aquades

3. Untuk Nutrient Agar, didihkan menggunakan hotplate with magnetic

stirrer, dan untuk Nutrient Broth hanya hingga larut.

B. Saran

Asisten sebaiknya ditambah, agar tidak kewalahan saat praktikum.

V. DAFTAR PUSTAKA

Azizah. 2011. http://zhabioedu.blogspot.com/2011_07_24_archive.html Diakses tanggal 18 Maret 2012

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.

Fathir. 2009. http://fuadfathir.multiply.com/journal/item/2 Diakses tanggal 18 Maret 2012

Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.

Soeryowinoto, M. 1985. Budidaya jaringan dan manfaatnya. Fakultas Biologi. UGM. Yogyakarta.