laporan kemajuan penelitian -...

LAPORAN AKHIR

PENELITIAN UNGGULAN PERGURUAN TINGGI

Pengaruh Ko-ekspresi Sec4p Pichia pastoris Terhadap Tingkat Sekresi

-Amilase Saccharomycopsis fibuligera oleh

Pichia pastoris rekombinan

Tahun ke-1 dari rencana 2 tahun

Ketua Peneliti

Dr. Shabarni Gaffar, M.Si. (NIDN: 0025047105)

Anggota Peneliti

Dr. Yeni Wahyuni Hartati (NIDN: 0024097101)

DIBIAYAI OLEH:

DIPA BLU Nomor 023.04.2.189726/2013Tanggal 5 Desember 2012

Sesuai dengan Keputusan Rektor Unpad No. 7632/UN6.RKT/KU/2013

Tanggal 1 Februari 2013

UNIVERSITAS PADJADJARAN

NOVEMBER, 2013

3

DAFTAR ISI

LEMBAR PENGESAHAN....................................................................................... 2

DAFTAR ISI ............................................................................................................. 3

DAFTAR GAMBAR................................................................................................. 5

DAFTAR TABEL..................................................................................................... 6

DAFTAR LAMPIRAN............................................................................................ 7

RINGKASAN ........................................................................................................... 8

PRAKATA................................................................................................................ 10

BAB I. PENDAHULUAN ........................................................................................ 11

1.1. Latar belakang dan permasalahan yang akan diteliti .................................... 11

1.2. Permasalahan yang akan dikaji .................................................................... 12

BAB II. KAJIAN PUSTAKA ................................................................................... 14

2.1. Jalur sekresi protein ...................................................................................... 13

2.2. Eksositosis .................................................................................................... 15

2.3. Protein Sec4p ................................................................................................ 16

2.4. Peran Sec4p dalam penargetan dan penambatan vesikel sekresi ................. 18

2.5. Jalur sinyal dari Sec4p dalam mengarahkan vesikel ke proses fusi ............ 21

2.6. Sistem ekspresi P. pastoris dan vektor pPIC3.5K untuk P. pastoris ......... 22

BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN............................................ 25

3.1. Tujuan Khusus............................................................................................... 26

3.2. Penelitian pendahuluan yang telah dilakukan................................................ 27

BAB IV. METODE PENELITIAN ......................................................................... 29

4.1. Disain Penelitian .......................................................................................... 29

4.2. Metoda Penelitian ......................................................................................... 29

4.2.1. Amplifikasi SEC4 P. pastoris dan subkloning dalam E. coli............ 29

4.2.2. Karakterisasi pJET1.2-SEC4 rekombinan ........................................ 30

4.2.3. Penentuan urutan Nukleotida SEC4 dalam pJET1.2─SEC4 ........... 32

4.2.4. Kloning fragmen SEC4 menggunakan vektor pPIC3.5K ............... 32

4.2.5. Penentuan urutan nukleotida SEC4 dalam pPIC3.5K-SEC4............ 33

4.2.6. Transformasi P. pastoris menggunakan plasmid pPIC3.5K-SEC4... 33

4.2.7. Seleksi dan karakterisasi transforman P. pastoris............................. 34

4.2.7. Ekspresi -amilase dan ko-ekspresi Sec4p....................................... 34

4

4.2.8. Analisis aktivitas -amilase.............................................................. 35

4.2.9. Karakterisasi -amilase dan Sec4p intra dan ekstraselular............... 35

4.3. Bagan alir penelitian...................................................................................... 36

BAB V. HASIL YANG DICAPAI............................................................................ 38

5.1. Amplifikasi SEC4 P. pastoris dan subkloning dalam E. coli........................ 38

5.2. Konstruksi plasmid pPIC3.5K-SEC4 dan kloning dalam E. coli.................. 39

5.3. Isolasi plasmid pPIC3.5K-SEC4 dari E. coli TOP10F’ dan linearisasi....... 42

5.4. Uji kuantitatif P. pastoris WT-68 dan WT-78.............................................. 44

5.5. Transformasi P. pastoris menggunakan plasmid pPIC3.5K-SEC4.............. 45

5.6. Seleksi dan karakterisasi transforman P. pastoris ...................................... 46

5.7. Ekspresi -amilase oleh P. pastoris rekombinan......................................... 47

5.8. Aktivitas -amilase hasil ekspresi................................................................ 49

5.9. Kadar protein............................................................................................... 51

VII. KESIMPULAN DAN SARAN........................................................................ 54

7.1. Kesimpulan................................................................................................... 54

7.2. Saran............................................................................................................. 54

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................. 55

LAMPIRAN.............................................................................................................. 57

5

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Diagram jalur sekresi protein................................................................... 14

Gambar 2.2 Siklus aktivasi/inaktivasi dan translokasi protein Rab............................. 17

Gambar 2.3 Tahapan lanjut eksositosis pada membran plasma................................... 19

Gambar 2.4 Kompleks eksosis.................................................................................... 20

Gambar 2.5 Model jalur sinyal Sec4p dalam peranannya meregulasi proses

eksositosis................................................................................................ 22

Gambar 2.6 Peta vektor pPIC3.5K.............................................................................. 24

Gambar 2.7 Urutan multiple cloning sites pada vektor pPIC3.5K............................. 24

Gambar 3.1 Amplikon SEC4...................................................................................... 27

Gambar 4.1 Bagan alir penelitian tahap 1................................................................... 36

Gambar 4.2 Bagan alir penelitian tahap 2................................................................... 36

Gambar 5.1 Produk PCR gen SEC4 dan koloni transforman

E. coli [pJET1.2-SEC4].......................................................................... 38

Gambar 5.2 Hasil restriksi plasmid pJET1.2-SEC4 dengan enzim EcoRI................. 39

Gambar 5.3 Hasil restriks pJET1.2-SEC4 dan vektor pPICK3.5K dengan

enzim EcoR1............................................................................................ 39

Gambar 5.4 Koloni E. coli [pPIC3.5K-SEC4] yang diremajakan............................... 40

Gambar 5.5 Peta plasmid pPIC3.5K-SEC4 hasil konstruksi........................................ 40

Gambar 5.6 Homologi urutan nukleotida SEC4 hasil subkloning dengan

urutan SEC4 nomor NCBI...................................................................... 41

Gambar 5.7. Hasil isolasi plasmid pPIC3.5K-SEC4.................................................... 42

Gambar 5.8 Hasil linearisasi plasmid pPIC3.5K-SEC4.............................................. 44

Gambar 5.9 Hasil uji aktivitas -amilase secara kualitatif......................................... 44

Gambar 5.10 Koloni P. pastoris[ALP1-SEC4] hasil transformasi................................ 45

Gambar 5.11 Koloni P. pastoris[ALP1-SEC4] pada media YPD padat........................ 46

Gambar 5.12 Seleksi fenotipe His+................................................................................ 47

Gambar 5.13 Hasil peremajaan transforman P. pastoris............................................... 47

Gambar 5.14 Densitas optik P. pastoris [ALP1-68/SEC4] dan [ALP1-78/SEC4]....... 49

Gambar 5.15 Hasil reaksi penentuan aktivitas dengan metoda DNS............................ 50

Gambar 5.16 Hasil uji aktivitas a-amilase dengan metoda DNS................................... 51

6

DAFTAR TABEL

Tabel 5.1 Pengaruh ko-ekspresi Sec4p terhadap level ekspresi -amilase..................... 52

Tabel L1. Penentuan serapan standar glukosa dengan metoda DNS............................... 61

Tabel L.2 Aktivitas P. pastoris [ALP1-68/SEC4]............................................................ 62

Tabel L.3 Aktivitas P. pastoris [ALP1-68]..................................................................... 62

Tabel L.4 Aktivitas P. pastoris [ALP1-78]...................................................................... 62

Tabel L.5 Aktivitas P. pastoris setelah transformasi [ALP1-78/SEC4]........................... 62

Tabel L.6 Kurva Standar Protein...................................................................................... 64

Tabel L.7 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-68]............................................ 65

Tabel L.8 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-68/SEC4].................................. 66

Tabel L.9 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-78]........................................... 66

Tabel L.10 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-78/SEC4]................................ 66

7

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Instrumen penelitian..................................................................................... 57

Lampiran 2. Evaluasi capaian luaran kegiatan.................................................................. 58

Lampiran 3. Sertifikat seminar nasional........................................................................... 59

Lampiran 4. Abstrak seminar nasional.............................................................................. 60

Lampiran 5. Penentuan Serapan Standar Glukosa............................................................ 61

Lampiran 6. Penentuan Aktivitas -amilase dengan Metoda DNS.................................. 62

Lampiran 7. Penentuan kadar protein............................................................................... 64

Lampiran 8. Biodata ketua dan anggota peneliti.............................................................. 67

8

RINGKASAN

Produksi -amilase rekombinan oleh sistem ekspresi P. pastoris dapat

dimanfaatkan untuk berbagai industri. Enzim -amilase dibutuhkan oleh industri pangan,

tekstil, farmasi dan bioetanol. Inang ekspresi yang dapat mensekresikan protein keluar sel

lebih disukai karena memudahkan proses pemurnian. Protein yang akan disekresikan ke

luar sel akan melalui suatu jalur sekresi protein yang melibatkan banyak protein dan

kompartemen di dalam sel. Sec4p merupakan suatu protein Rab yang berperan penting

dalam tahap akhir sekresi protein. Protein ini berfungsi untuk menargetkan vesikel

sekresi yang membawa protein yang akan disekresikan ke membran plasma pada proses

pasca-Golgi untuk kemudian mengalami penggabungan dengan membran plasma dan

mensekresikan protein yang dikandungnya ke luar sel. Ko-ekspresi Sec4p dalam suatu

inang ekspresi ragi diketahui dapat meningkatkan tingkat sekresi protein asing.

Penelitian ini bermaksud untuk mempelajari pengaruh ko-ekspresi protein Sec4p P.

pastoris terhadap tingkat sekresi -amilase S. fibuligera oleh P. pastoris. Pada penelitian

pendahuluan yang telah dilakukan, gen SEC4 yang berukuran 615 pb telah diamplifikasi

dari genom P. pastoris dengan metoda PCR dan di subkloning menggunakan vektor

pJET1.2 dalam inang E. coli.

Pada penelitian ini fragmen SEC4 hasil subkloning telah ditentukan urutan

nukleotidanya dengan metoda Dye terminator. Selanjutnya fragmen SEC4 di kloning

mengggunakan vektor ekspresi pPIC3.5K untuk P. pastoris menghasilkan plasmid

rekombinan pPIC3.5K-SEC4. Plasmid pPIC3.5K-SEC4 dikarakterisasi melalui

pemotongan dengan enzim restriksi dan penentuan urutan nukleotida. Plasmid

pPIC3.5K-SEC4 selanjutnya digunakan untuk mentransformasi P. pastoris rekombinan

yang telah mengandung gen pengode -amilase (ALP1) S. fibuligera.

Inang P. pastoris [ALP1/SEC4] digunakan untuk mempelajari pengaruh ko-

ekspresi Sec4p terhadap tingkat sekresi -amilase oleh P. pastoris rekombinan.

-Amilase hasil ekspresi dianalisis aktivitasnya dan ditentukan kadar proteinnya, serta

dibandingkan dengan hasil ekspresi tanpa ko-ekspresi Sec4p. Ko-ekspresi Sec4p

diharapkan meningkatkan level sekresi -amilase oleh P. pastoris. Inang P. pastoris

yang mensekresikan -amilase level tinggi dapat digunakan untuk produksi enzim

-amilase yang dapat diaplikasikan untuk berbagai industri, seperti industri pangan,

farmasi, tekstil dan detergen.

9

Hasil penelitian yang telah diperoleh dan dilaporkan pada laporan ini adalah: Gen

SEC4 berhasil diamplifikasi dari genom P. pastoris menggunakan metode PCR. Fragmen

SEC4 dengan ukuran 615 pb diligasi ke vektor pJET1.2 menghasilkan plasmid

rekombinan pJET1.2-SEC4 dan disubkloning dalam E. coli TOP10F’. Gen SEC4 dari

plasmid pJET1.2-SEC4 yang telah dikarakterisasi, dipotong menggunakan enzim

restriksi EcoR1. Fragmen SEC4 hasil pemotongan dengan enzim EcoR1 diligasi ke

vektor pPIC3.5K menghasilkan vektor ekspresi rekombinan pPIC3.5K-SEC4 dan

selanjutnya dikloning dalam E. coli TOP10F’. Hasil analisis restriksi dan penentuan

urutan nukleotida gen SEC4 dalam plasmid pPIC3.5K-SEC4 hasil kloning menunjukkan

bahwa vektor ekspresi yang mengandung gen SEC4 berhasil dikonstruksi dan gen SEC4

dengan ukuran 615 pb memiliki urutan nukleotida yang identik dengan urutan SEC4

P. pastoris di Genbank. .

Selanjutnya gen SEC4 telah berhasil diintroduksi ke dalam P. pastoris [ALP1]

sehingga diperoleh P. pastoris [ALP1-SEC4]. Hasil analisis aktivitas -amilase pada

supernatan P. pastoris [ALP1-SEC4] menunjukkan ko-ekspresi Sec4p meningkatkan

level sekresi -amilase 2x lipat dibanding tanpa ko-ekspresi. Berdasarkan hasil penelitian

diperoleh waktu induksi yang paling optimum adalah 72 jam, dengan aktivitas spesifik

36, 91 U/mg.

10

PRAKATA

Segala puji bagi Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya

kepada kami tim peneliti untuk melaksanakan penelitian dan menyelesaikan penulisan

Laporan Akhir Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi tahun 2013 berjudul ”Pengaruh

Ko-ekspresi Sec4p Pichia pastoris Terhadap Tingkat Sekresi -Amilase

Saccharomycopsis fibuligera oleh Pichia pastoris rekombinan”.

Pada kesempatan ini perkenankanlah peneliti mengucapkan terima kasih yang

sebesar-besarnya kepada :

1. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional atas

dana yang telah disediakan sehingga penelitian ini dapat terlaksana.

2. Universitas Padjadjaran dan Lembaga Penelitian UNPAD atas pengelolaan

administrasi yang baik bagi proyek penelitian ini.

3. Dekan Fakultas MIPA, Ketua Jurusan Kimia, serta kepala Laboratorium

Penelitian Jurusan Kimia, yang telah menyediakan fasilitas bagi peneliti untuk

melaksanakan penelitian ini.

4. Semua pihak yang telah banyak membantu dalam pelaksanaan penelitian ini.

Akhir kata dengan penuh harapan dan rasa optimis, mudah-mudahan hasil

penelitian ini dapat memberikan kontribusi ilmu pengetahuan di bidang biologi molekul

khususnya dalam kajian produksi enzim rekombinan.

Bandung, November 2013

Penulis

11

BAB I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang dan Permasalahan yang akan Diteliti

Tingkat ekspresi sekresi protein rekombinan dalam suatu inang ekspresi

dipengaruhi oleh banyak faktor, diantaranya adalah jenis kodon yang digunakan dari gen

yang diekspresikan; jumlah gen yang digunakan; efisiensi dan kekuatan promoter;

efisiensi sinyal translasi; jenis peptida sinyal; proses dan pelipatan protein di dalam

retikulum endoplasma dan badan Golgi; faktor lingkungan dalam sekresi ekstraseluler;

serta hidrolisis protein oleh protease. Modifikasi salah satu atau beberapa faktor yang

mempengaruhi ekspresi protein dilaporkan dapat meningkatkan sekresi protein.

Gaffar (2011) melaporkan bahwa kombinasi manipulasi genetik yang meliputi

modifikasi peptida sinyal, peningkatan jumlah kopi gen dan ko-ekspresi protein yang

berperan dalam pelipatan protein di retikulum endoplasma dapat meningkatkan sekresi

α-amilase Saccharomycopsis fibuligera (Sfamy) oleh Pichia pastoris hingga 20 kali lipat

dibandingkan dengan P. pastoris wildtype. Produksi Sfamy dan protein rekombinan lain

oleh P. pastoris dapat dioptimalkan dengan memperhatikan faktor-faktor lainnya, salah

satunya adalah faktor lingkungan dalam sekresi ekstraseluler.

Protein yang akan disekresikan ke luar sel akan melalui suatu jalur sekresi protein

yang melibatkan organel sel dan protein pembantu. Secara garis besar, protein yang baru

terbentuk akan melewati retikulum endoplasma (RE), kompleks Golgi, dan kemudian

menuju membran plasma untuk selanjutnya disekresikan ke luar sel. Transportasi protein

antar kompartemen di dalam sel dimediasi oleh suatu vesikel.

Salah satu protein yang berperan pada sekresi ekstraseluler adalah Sec4p.

Peningkatan level Sec4p dalam inang ekspresi ragi dapat meningkatkan sekresi protein

asing. Hal ini dibuktikan melalui penelitian yang dilakukan oleh Shi-Hwei dan koleganya

(2004) yang melibatkan overekspresi SEC4 Pichia pastoris dalam manipulasi genetik

terhadap sistem ekspresi P. pastoris yang telah mengandung gen asing. Dari hasil studi

ini dilaporkan adanya peningkatan level sekresi protein glukoamilase hingga mencapai

100 kali. Meskipun fungsi Sec4p di P. pastoris jarang dibahas dalam hal perannya

dalam sekresi protein, urutan asam amino Sec4p dari P. pastoris mirip dengan urutan

Sec4p ragi lain pada domain yang terlibat dalam pengikatan dan hidrolisis nukleotida.

Penelitian tersebut membuktikan bahwa Sec4p memiliki kontribusi peran yang penting

dalam proses produksi protein rekombinan, khususnya dalam proses sekresi protein.

12

Sec4p merupakan protein berukuran 24 kDa yang dikode gen SEC4 dari

Saccharomyces cerevisiae. Protein ini termasuk keluarga protein Rab dari protein

pengikat GTP yang merupakan regulator penting pada semua aktivitas peredaran

vesikuler. Sec4p berperan penting dalam tahap akhir sekresi protein, berfungsi untuk

menargetkan vesikel sekretori ke membran plasma pada proses pasca-Golgi dalam

sekresi protein pada ragi.

Menurut Cowan (1996), sebagian besar (sekitar 45%) enzim yang digunakan di

industri merupakan enzim hasil rekayasa, baik rekayasa pada tingkat genetik maupun

protein. Salah satu metode yang umum digunakan dalam rekayasa genetik adalah dengan

cara kloning, yaitu dengan memindahkan gen pengode enzim atau protein tertentu ke

suatu inang dengan tujuan gen tersebut akan mengalami perbanyakan di dalam sel inang.

Penelitian-penelitian selanjutnya berkembang ke arah peningkatan tingkat ekspresi

protein rekombinan dari suatu inang ekspresi.

Berdasarkan latar belakang tersebut, penelitian ini bermaksud mempelajari

pengaruh ko-ekspresi Sec4p P. pastoris terhadap tingkat sekresi -amilase S. fibuligera

oleh P. pastoris rekombinan. Gen SEC4 mengode protein Sec4p yang berperan pada

sekresi protein ke luar sel ragi. Sec4p berikatan dengan vesikel sekresi yang berisi

protein yang akan disekresikan dan membantu mengarahkannya ke membran plasma.

Ko-ekspresi Sec4p dalam inang ekspresi ragi telah terbukti dapat meningkatkan level

sekresi glukoamilase Rizhopus orizae (Shi-Hwei et al., 2005).

1.2. Permasalahan yang akan dikaji

Berdasarkan latar belakang yang telah diungkapkan, maka permasalahan yang

akan dikaji dalam penelitian ini adalah:

1. Apakah gen SEC4 Pichia pastoris dapat dikonstruksi dalam vektor ekspresi untuk

P. pastoris dan dikloning dalam E. coli.

2. Bagaimana homologi urutan nukleotida gen SEC4 Pichia pastoris hasil kloning

dalam E. coli dengan urutan gen SEC4 NCBI (nomor akses: XM_002492307.1).

3. Apakah gen SEC4 P. pastoris berhasil di ko-ekspresikan dalam inang P. pastoris

yang telah membawa gen ALP1.

4. Bagaimana pengaruh ko-ekspresi Sec4p terhadap tingkat ekspresi -amilase oleh

P. pastoris rekombinan.

13

Enzim -amilase bekerja menghidrolisis ikatan -1,4-glikosidik dalam pati untuk

menghasilkan maltosa dan oligosakarida berbagai ukuran. Enzim -amilase banyak

digunakan dalam berbagai industri, dengan demikian pengembangan produksi -amilase

perlu dilakukan. Sistem ekspresi Pichia pastoris banyak digunakan untuk memproduksi

protein rekombinan karena tingkat ekspresinya yang tinggi, mudah dilakukan untuk

peningkatan skala produksi, adanya modifikasi pasca translasi, serta mampu

mensekresikan protein heterolog. Sampai saat ini, Indonesia masih mengimpor enzim ini

dari beberapa negara, karena belum adanya industri yang memproduksi enzim ini.

Padahal Indonesia memiliki sumber mikroba penghasil -amilase yang melimpah dan

telah banyak dilaporkan, salah satunya adalah Saccharomycopsis fibuligera (Gaffar,

2011). -Amilase S. fibuligera merupakan salah suatu enzim ekstraseluler yang mampu

memecah pati mentah sehingga dapat menghemat energi dalam pemrosesan pati, dengan

demikian memiliki potensi untuk dikembangkan dan diaplikasikan dalam industri. State

of the art dari penelitian ini adalah penggunaan sistem ekspresi P. pastoris untuk

produksi enzim -amilase dan mempelajari faktor-faktor yang mempengaruhi tingkat

sekresi protein, pada proposal ini yang menjadi kajian utama adalah yaitu protein Sec4p

yang berperan pada transport protein ke luar sel.

14

BAB II. KAJIAN PUSTAKA

2. 1 Jalur Sekresi Protein

Protein larut (soluble protein) dan protein membran disintesis dalam ribosom yang

terikat pada retikulum endoplasma (RE) kasar dan kemudian bergerak ke tujuan akhir

dari masing-masing protein melalui jalur sekresi. Pada sel eukariot, jalur sekresi protein

melibatkan suatu migrasi vesikuler. Sebuah prinsip mengatur semua lalu-lintas peredaran

protein dalam jalur sekresi, yaitu transportasi protein dari satu kompartemen ke

kompartemen lain yang dibatasi membrane, dimediasi oleh vesikel. Vesikel ini akan

mengumpulkan protein "kargo" dalam bentuk bud atau tunas vesikel yang timbul dari

suatu membran kompartemen, kemudian protein kargo dikirim ke kompartemen

berikutnya melalui fusi vesikel dengan membran kompartemen target (Lodish et al,

2003).

Sekresi protein merupakan suatu proses kompleks yang melibatkan banyak organel

dan molekul pembantu (Gambar 2.1). Secara garis besar, protein yang akan disekresikan

akan melalui jalur sekresi protein dimana protein yang baru terbentuk akan melewati

retikulum endoplasma, kompleks Golgi, dan kemudian menuju membran plasma untuk

selanjutnya disekresikan ke luar sel (Oliveira et al., 2010; Salminen & Novick, 1989).

Gambar 2.1 Diagram jalur sekresi protein. Setelah protein disintesis oleh ribosom di RE kasar,

protein yang akan disekresikan dikemas dalam vesikel dan dikirim ke komples

Golgi (1), kemudian protein yang siap untuk disekresikan akan dikemas dalam vesikel sekresi dan diarahkan ke membran plasma (2)(3), vesikel sekresi berfusi

untuk mengeluarkan protein kargo (4) (Lodish et al, 2003).

Protein

disekresikan ke

luar sel

Vesikel sekresi

seksekresi

Vesikel Golgi

aparatus

RE kasar

15

Transportasi protein yang dimediasi oleh vesikel melibatkan beberapa protein

untuk menjalankan proses pertumbuhan tunas vesikel dan fusi membran, diantaranya

yaitu (Lodish et al., 2003):

1. Protein pelapis. Berfungsi untuk mengarahkan vesikel yang mengandung protein

kargo ke kompartemen tujuannya masing-masing. Contohnya COPI (dari cis-

Golgi ke RE/vesikel retrograde), COPII (dari RE kasar ke Golgi/vesikel

anterograde), Clathrin (dari membran plasma dan jaringan trans-Golgi ke

endosom).

2. Protein reseptor integral membran soluble N-ethylmaleimide-sensittive factor

attachment protein receptors (SNARE). Berfungsi dalam proses fusi vesikel

dengan membran target. Terdiri atas v-SNARE yang terletak pada vesikel dan t-

SNARE yang terletak pada membran target.

3. Protein Rab (protein pengikat GTP). Berfungsi dalam proses perakitan protein

pelapis dan penargetan vesikel ke membran target.

Protein pada jalur sekresi yang ditujukan untuk kompartemen lain selain retikulum

endoplasma dan Golgi (protein yang akan diskresikan), pada akhirnya akan sampai pada

jaringan kompleks membran dan vesikel yang disebut sebagai jaringan trans-Golgi

(trans-Golgi network/TGN). Protein yang ditujukan untuk disekresikan ke luar sel akan

diarahkan ke membran plasma melalui vesikel sekresi yang tumbuh dari TGN, vesikel ini

kemudian akan berfusi dengan membran plasma dan mengeluarkan protein kargo ke luar

sel melalui proses eksositosis (Lodish et al., 2003).

2. 2. Eksositosis

Eksositosis adalah mekanisme perpindahan molekul (protein dan polisakarida,

hormon, neurotransmitter, dll) melintasi membran plasma dari dalam ke luar sel (sekresi)

dengan cara menggabungkan (fusi) vesikel berisi molekul dengan membran plasma.

Vesikel yang lepas dari Golgi aparatus dipindahkan oleh sitoskeleton ke membran

plasma. Ketika membran vesikel dan membran plasma bertemu, kandungan vesikelnya

kemudian disekresikan ke luar sel (Campbel et al., 2002; Madigan et al., 2006).

Proses eksositosis adalah langkah penting dalam mengeluarkan enzim-enzim dan

protein-protein lain yang berguna untuk proses fisiologis di luar sel atau untuk

mengeluarkan molekul-molekul yang membantu komunikasi antar sel satu dengan sel

http://id.wikipedia.org/wiki/Protein

http://id.wikipedia.org/wiki/Polisakarida

http://id.wikipedia.org/wiki/Membran_plasma

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Vesikula&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Aparatus_Golgi&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/wiki/Sitoskeleton

16

yang lain. Eksositosis terbagi atas jalur sekresi konsitutif dan jalur sekresi yang

diregulasi (Thomas, 2009);

1. Jalur sekresi konstitutif. Vesikel sekresi konstitutif membawa protein yang

disekresikan sel secara terus menerus. Vesikel ini berasal dari sisi trans-Golgi,

bergerak sepanjang lintasan mikrotubulus, dan dengan segera berfusi dengan

membran plasma melepaskan isinya. Beberapa protein yang tidak saling berkaitan

dapat dikemas dalam vesikel sekresi konstitutif tunggal.

2. Jalur sekresi yang diregulasi. Vesikel sekresi pada jalur ini juga berasal dari sisi

trans-Golgi, namun vesikel ini akan berfusi dengan membran plasma apabila sel

menerima sinyal sekresi. Vesikel sekresi ini seringkali mengandung protein

hormon, enzim pencernaan, dan neuro-peptida, tergantung pada jenis selnya.

2.3 Protein Sec4p

Analisis biokimia telah mengidentifikasi beberapa faktor yang diperlukan untuk

transportasi vesikuler melalui Golgi aparatus. Analisis genetik jalur sekresi ragi

mengungkapkan 26 gen yang produknya diperlukan untuk transportasi protein dari

retikulum endoplasma ke membran plasma. Sepuluh dari gen-gen tersebut mengatur

peredaran vesikuler dari Golgi aparatus ke membran plasma pada tahap lanjut sekresi

protein. Salah satu dari sepuluh gen ini, SEC4, mengkode protein pengikat GTP yang

berasosiasi dengan sisi sitoplasmik dari vesikel sekresi dan membran plasma. Protein

Sec4 (Sec4p) diperlukan pada eksositosis konstitutif pada ragi dan mengalami siklus

antara membran plasma dan vesikel sekresi. Siklus lokalisasi Sec4p dirangkai dengan

siklus pengikatan dan hidrolisis GTP yang berfungsi untuk mengontrol peredaran

vesikuler (Salminen & Novick, 1989).

Gen SEC4 dari Saccharomyces cerevisiae mengkode protein pengikat GTP

(Sec4p) berukuran 24 kDa yang memainkan peran penting dalam tahap akhir sekresi

protein. Sec4p termasuk ke dalam keluarga protein Rab dari protein pengikat GTP yang

merupakan regulator penting pada semua aktivitas peredaran vesikuler. Sec4p berperan

penting untuk menargetkan vesikel sekresi ke membran plasma pada proses pasca-Golgi

pada sekresi protein ragi (Shi-Hwei et al., 2004; Walworth et al., 1989).

Selama proses sekresi protein, Sec4p tertahan (anchored) pada membran vesikel

melalui geranil-geranilasi pada C-terminal dan selanjutnya diangkut ke membran plasma

setelah docking vesikel. Analisis genetik menunjukkan bahwa Sec4p berperan pada awal

17

proses dari eksosis, sebuah efektor untuk Sec4p, dan menargetkan vesikel sekresi situs

eksositosis dalam ragi (Shi-Hwei et al., 2004).

Siklus antara bentuk inaktif dan bentuk aktif protein Rab dimediasi oleh

hidrolisis GTP (aktivitas GTPase) dan pertukaran GTP menjadi GDP pada protein.

Siklus aktivasi, inaktivasi, dan translokasi diatur oleh setidaknya tiga jenis regulator,

yaitu: GDP/GTP exchange factor (GEF), GDP dissociation inhibitor (GDI), dan GTPase-

activating protein (GAP). Dalam sitosol, protein Rab dipertahankan dalam bentuk inaktif

(mengikat GDP) oleh aktivitas GDI. Rab-GDP dilepaskan terlebih dahulu dari GDI

dengan mekanisme yang masih belum diketahui, dan kemudian dikirim ke kompartemen

membran spesifik; protein Rab selanjutnya diubah menjadi bentuk Rab yang terikat GTP

(Rab-GTP) dengan bantuan GEF. Bentuk Rab-GTP ini kemudian berinteraksi dengan

efektor hilir (downstream). Setelah itu, Rab-GTP dikonversi ke bentuk Rab-GDP oleh

suatu protein GAP. Bentuk Rab-GDP yang dihasilkan ini terletak pada membran dan

kemudian dapat membentuk kompleks dengan GDI sehingga akan kembali ke sitosol

sebagai kompleks protein (Rab-GDP)-GDI (Gambar 2.2). Dari penjelasan di atas dapat

diketahui bahwa karakteristik dari protein Rab adalah siklus asosiasi-disosiasi

membrannya berhubungan dengan siklus pertukaran GDP-GTP pada protein tersebut

(Rothman, 1996; Takai et al., 2001).

Gambar 2.2 Siklus aktivasi/inaktivasi dan translokasi protein Rab. Siklus ini mengatur protein

Rab dalam bentuk aktif-inaktif dan lokalisasinya pada membran-sitosol (Takai et al., 2001)

Sebagai protein Rab, Sec4p berosilasi antara bentuk inaktif yang mengikat GDP

dan bentuk aktif yang mengikat GTP, dengan demikian Sec4p berfungsi sebagai molekul

pertukaran untuk mengatur pengiriman vesikel. Sec4p diaktifkan oleh Sec2p, dan

Membran target

vesikel

18

bersama dengan Sec2p, Sec4p berasosiasi secara reversibel dengan vesikel sekresi dan

kompleks protein eksosis pada membran plasma, dengan demikian vesikel dapat

diarahkan menuju situs sekresi. Sec2p adalah protein GEF (GDP/GTP exchange factor)

yang bekerja pada protein Sec4p ragi, dan keduanya berpartisipasi dalam transportasi

vesikel sekresi menuju membran plasma (Chavrier et al., 1990).

2.4 Peran Sec4p dalam Penargetan dan Penambatan Vesikel Sekresi

Eksositosis yang melibatkan proses docking dan fusi vesikel, merupakan proses

yang penting dalam pelepasan protein kargo ke luar sel. Dalam perjalanannya menuju

tujuan akhir, vesikel akan ditambatkan ke membran plasma yang kemudian akan

diarahkan ke arah fusi vesikel sekresi dengan membran plasma. Komponen kunci yang

terlibat dalam proses penambatan ini adalah kompleks protein eksosis dan GTPase kecil,

dan fusi vesikel pada membran plasma meliputi keterlibatan protein reseptor SNARE.

(Orlando & Guo, 2009).

Eksosis adalah suatu protein kompleks yang bertindak sebagai faktor docking,

terdiri dari delapan subunit lestari yang terlibat dalam docking vesikel eksositik : Sec3p,

Sec5p, Sec6p, Sec8p, Sec10p, Sec15p, Exo70p dan Exo84p (Gambar 2.3). Kompleks

protein ini pada awalnya diidentifikasi pada ragi S. cerevisiae, dimana eksosis telah

terbukti berperan penting untuk eksositosis. Enam protein 'Sec', dinamakan demikian

karena mutasi dalam gen mereka menghambat proses sekresi, berinteraksi secara fisik

satu sama lain (Walworth et al., 1989; Lipschutz & Mostov, 2002).

Eksosis terlibat dalam pengarahan vesikel ke situs yang tepat pada membran

plasma. Eksosis berfungsi untuk mengarahkan dan mengirimkan vesikel ke situs docking

pada membran plasma yang kemudian dilanjutkan dengan reaksi perakitan SNARE dan

fusi vesikel. Semua komponen eksosis merupakan suatu protein hidrofilik yang

berinteraksi satu sama lain untuk membentuk kompleks periferal yang berasosiasi dengan

membran plasma. Kompleks eksosis berfungsi sebagai kompleks penambat yang

memediasi koneksi awal antara vesikel sekresi dan membran plasma sebelum docking

dan fusi. Meskipun sudah jelas bahwa eksosis memainkan peranan sentral dalam

eksositosis, namun masih sedikit yang diketahui tentang bagaimana proses ini

dikendalikan (Orlando & Guo, 2009; Brennwald, 2000; Guo et al., 1999).

19

Gambar 2.3 Tahapan lanjut eksositosis pada membran plasma. (1) vesikel sekresi yang mengandung protein Rab (bulatan merah), subunit kompleks eksosis (bulatan

hijau), dan v-SNARE (lengkungan merah) diarahkan sepanjang sitoskeleton

(garis merah) ke membran plasma melalui sebuah motor (bulatan biru). (2) vesikel ditambatkan ke membran plasma melalui interaksi kompleks eksosis.

(3)(4) t-SNARE (lengkungan biru) pada membran plasma berikatan dengan v-

SNARE pada vesikel, perakitan kompleks SNARE ini selanjutnya akan mengacu pada fusi vesikel dengan membran plasma (Orlando & Guo, 2009).

Sejumlah GTPase kecil mengatur eksosis. GTPase pertama yang ditemukan untuk

berinteraksi dengan eksosis yang adalah Sec4p. Analisis genetik membuktikan bahwa

Sec4p berperan pada awal proses eksositosis pada ragi. Sec4p dan Sec2p akan

mengontrol perakitan kompleks eksosis yang diperlukan untuk menambatkan vesikel ke

membran plasma (Orlando & Guo, 2009; Guo et al., 1999).

Aktivasi Sec4p oleh Sec2p diperlukan untuk pengiriman vesikel sekresi yang

terpolarisasi. Sec4p dalam bentuk aktif (Sec4p-GTP) dapat membantu pergerakan vesikel

sekresi yang tergantung pada myosin sepanjang kabel aktin. Namun, bagaimana vesikel

yang mengandung Sec4p terhubungkan dengan motor myosin belum diketahui secara

pasti. Sec4p dan Sec2p kemudian akan berinteraksi dengan salah satu komponen

kompleks eksosis, yaitu Sec15p, yang akan mengarahkan transportasi vesikel sekresi ke

membran plasma (Grosshans et al., 2006b; Chavrier et al., 1990).

Sec15p membutuhkan Sec10p untuk berasosiasi dengan kompleks eksosis. Sec10p

diperlukan untuk menghubungkan Sec15p ke kompleks yang tersisa. Sec15p berikatan

langsung dengan Sec10p. Pengikatan subkompleks Sec10p/Sec15p ke seluruh eksosis ini

dimediasi oleh interaksi Sec10p dengan Sec5p. Sec5p juga membuat mata rantai dengan

Membran plasma plaplasma

Vesikel

Vesikel

Vesikel

Vesikel

20

Exo70p, Sec6p dan Sec3p. Jadi, Sec5p tampaknya berada pada inti kompleks. Sec5p juga

mempunyai peranan penting dalam menghubungkan Sec3p ke Sec8p, mungkin melalui

asosiasi Sec5p dengan Sec6p dan Sec6p dengan Sec8p. Sec3p mungkin juga terikat

langsung ke Sec8p atau Sec6p (Gambar 2.4) (Guo et al., 1999).

Gambar 2. 4 Kompleks eksosis. Gambaran penambatan vesikel ke membran plasma melalui interaksinya dengan kompleks eksosis. Subunit komponen eksosis digambarkan

dengan bulatan biru, GTPase digambarkan dengan bulatan merah. GTPase ini

dapat meregulasi aktivasi dan polarisasi eksosis pada membran plasma. Sec4p

berikatan dengan vesikel sekresi dan berinteraksi dengan Sec15p pada eksosis (Orlando & Guo, 2009).

Dua subunit eksosis yaitu: Exo70p dan Sec3p, berfungsi sebagai penanda yang

terdapat di membran plasma. Komponen eksosis lainnya bergabung dengan vesikel

sekresi bergerak sepanjang kabel aktin dan kemudian diarahkan ke membran plasma

dimana Exo70p dan Sec3p berada. Perakitan kompleks eksosis dapat menambatkan

vesikel sekresi ke membran plasma. Exo70p dan Sec3p berikatan dengan membran

plasma melalui suatu ikatan lipid, ikatan ini lestari dari mulai ragi hingga mamalia.

Interaksi ini penting untuk perekrutan Exo70p, Sec3p, dan komponen eksosis lainnya ke

membran plasma untuk penambatan vesikel (Orlando & Guo, 2009).

Perakitan kompleks eksosis dapat terjadi selama proses docking vesikel, dan

kelainan pada Sec4p dapat mempengaruhi perakitan kompleks eksosis. Belum diketahui

apakah semua protein eksosis terakit di dalam sel. Ada kemungkinan bahwa mutasi pada

Sec4p akan mempengaruhi perakitan subunit eksosis dengan Sec3p pada membran target.

Pada sel wild type, Sec3p bermigrasi secara eksklusif di kompleks eksosis. Perekrutan

protein eksosis untuk kemudian diarahkan ke Sec3p membutuhkan Sec4p yang

Vesikel

Membran plasma

21

fungsional. Penempatan Sec3p ke situs eksositosis adalah tidak tergantung pada lalu

lintas membran yang sedang berlangsung, sementara komponen lainnya dari eksosis

memerlukan fungsi Sec4p untuk penempatannya (Guo et al., 1999).

Penempatan Sec3p ke domain tertentu pada membran plasma dan interaksi

Sec15p dengan Sec4p-GTP menunjukkan bahwa kompleks eksosis memainkan peran

penting dalam docking dan fusi membran yang diarahkan oleh Rab/GTPase. Sec4p

memiliki peranan dalam mengaktivasi perakitan komponen eksosis tersebut ke Sec3p,

yang menandai lokasi sekresi (Guo et al., 1999).

2.5 Jalur Sinyal dari Sec4p dalam Mengarahkan Vesikel ke Proses Fusi

Protein Rab juga mempengaruhi proses fusi vesikel melalui peranannya dalam

meregulasi perakitan kompleks protein reseptor SNARE. Setelah vesikel sekresi

tertambat pada membran plasma melalui interaksi Sec4p-GTP dengan kompleks protein

eksosi, vesikel sekresi akan diarahkan ke proses penggabungan protein reseptor SNARE

yang terdapat pada vesikel sekresi (v-SNARE) dengan protein reseptor SNARE yang

terdapat pada membran plasma (t-SNARE). v-SNARE dan t-SNARE akan membentuk

kompleks trans-SNARE yang mengarah pada proses fusi vesikel dengan membran

plasma (Grosshans et al., 2006a; Grosshans et al., 2006b).

SNARE merupakan protein transmembran yang bagian C-terminalnya tertahan

pada membran dan domain N-terminalnya menghadap ke sitosol. SNARE diperlukan

pada tahap fusi membran pada sebagian besar proses transportasi intraseluler. Untuk

terjadinya fusi, protein SNARE pada membran donor dan target harus membentuk suatu

kompleks trans-SNARE. Pada ragi, perakitan kompleks SNARE antara SNARE vesikel

sekresi (Sncp) dan SNARE membran plasma (Ssop dan Sec9p) terjadi pada tahap lanjut

dari reaksi eksositosis (Grote et al., 2000).

Sec4p berperan dalam regulasi perakitan SNARE melalui efektornya yang lain

dalam proses fusi vesikel, yaitu Sro7p. Sro7p akan berikatan dengan Sec9p yang

merupakan SNARE pada membran plasma target dan memediasi fusi vesikel dengan

membran plasma (Grosshans et al., 2006a).

Terdapat dua jalur sinyal dari Sec4p yang saling bertemu dalam mengarahkan

vesikel ke proses fusi pada ragi (Gambar 2.5). Vesikel sekresi (V) berikatan dengan Rab

GTPase Sec4p dan Sec2p (GEF Sec4p). Sec2p akan menjaga Sec4p tetap berada dalam

bentuk aktifnya. Kemudian proses penambatan vesikel pada eksositosis terjadi dengan

22

adanya interaksi antara Sec4p pada vesikel dengan Sec15p yang merupakan salah satu

subunit dari eksosis, interaksi ini diperlukan untuk perakitan kompleks eksosis. Eksosis

Sec1p berikatan dengan kompleks t-SNARE, tetapi tidak dengan Ssop bebas, kemudian

akan berinteraksi dengan Sec1p, yang diperlukan untuk mengubungkannya dengan

fungsi SNARE pada proses eksositosis (Grosshans et al., 2006a).

Gambar 2. 5 Model jalur sinyal Sec4p dalam peranannya meregulasi proses eksositosis

(Grosshans et al., 2006a).

Sro7p yang merupakan efektor lain dari Sec4p, meneruskan sinyal dari Sec4p ke

fungsi SNARE melalui interaksinya dengan t-SNARE eksositik Sec9p. Sro7p

berasosisasi dengan eksosis melalui intraksinya dengan subunit Exo84p pada eksosis.

Tanda panah pada gambar di atas mengindikasikan interaksi fisik yang mungkin terjadi

(Grosshans et al., 2006a; Grote et al., 2000).

2.6 Sistem ekspresi P. pastoris dan vektor ekspresi pPIC3.5K untuk P. pastoris

Penggunaan sistem ekspresi P. pastoris memberikan keuntungan dibandingkan

dengan sistem ekspresi lain. Sistem ini merupakan satu-satunya sistem yang

menggabungkan keuntungan penggunaan E. coli (tingkat ekspresi tinggi, mudah

dilakukan peningkatan skala produksi, dan murah) dengan sistem ekspresi eukariot

(adanya komponen pelipatan protein dan modifikasi pasca-translasi) (Glick & Pasternak,

2003).

Ekspresi protein asing pada P. pastoris membutuhkan tiga tahap penting, yaitu:

insersi gen ke vektor ekspresi, introduksi vektor ekspresi ke genom P. pastoris, dan

23

pengujian galur yang mempunyai potensi untuk mengekspresikan produk gen asing

(Gaffar, 2010b).

Sama seperti S. cerevisiae, transformasi P. pastoris akan menghasilkan integrasi

kaset ekspresi ke kromosom pada lokus spesifik untuk menghasilkan transforman yang

stabil secara genetik. Integrasi dapat dilakukan dengan dua cara. Cara yang paling

sederhana adalah dengan memotong vektor pada sisi yang unik dalam gen penanda

(seperti HIS4) atau pada fragmen promotor AOX1 (Romanos, 1995; Gaffar, 2010b).

Pemotongan vektor P. pastoris dalam urutan yang sama dengan genom inang, akan

menstimulasi peristiwa rekombinasi homolog yang merupakan target yang efisien untuk

integrasi vektor ke lokus genom (Cregg & Madden, 1988).

Vektor ekspresi P. pastoris pada umumnya memiliki format yang sama. Semua

vektor ekspresi telah didisain sebagai shuttle vektor E. coli/P. pastoris, yang

mengandung titik awal replikasi untuk mempertahankan plasmid di E. coli dan marker

fungsional di satu atau kedua organisme. (Cregg et al., 1985)

Vektor pPIC3.5K (Gambar 2.6) merupakan vektor ekspresi berukuran 9004 bp

yang dirancang untuk memungkinkan identifikasi dari gen sisipan secara in vivo dalam

genom Pichia pastoris. Vektor ini mempunyai gen penanda yang berfungsi sebagai

marker penyeleksi transforman di E. coli dan P. pastoris, yaitu resisten kanamisin di

E. coli dan resistan geneticin di P. pastoris. Selain itu vektor ini juga memiliki gen

marker HIS4 untuk seleksi menggunakan media yang mengandung histidin. Gen histidin

dehidrogenase (HIS4) fungsional dapat digunakan sebagai marker penyeleksi setelah

transformasi ke dalam P. pastoris his4 (galur yang defisien histidin dehidrogenase)

melalui metode transformasi integrasi yang dipilih. Vektor ini merupakan vektor ekspresi,

memiliki kaset ekspresi yang terdiri dari fragmen AOX1 yang mengandung urutan

promoter 5’ dan urutan pendek fragmen AOX1 yang mengandung urutan yang

dibutuhkan untuk terminasi transkripsi. Di antara urutan promotor dan terminator

terdapat multiple cloning site (MCS) untuk insersi urutan pengode gen asing (Gambar

2.7) (Invitrogen, 2006).

24

Gambar 2.6 Peta vektor ekspresi pPIC3.5K (Invitrogen, 2006).

Gambar 2.7 Urutan multiple cloning sites pada vektor pPIC3.5K (Invitrogen, 2006).

25

BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN

Meningkatnya kebutuhan berbagai industri terhadap produksi protein rekombinan

yang tinggi mendorong dilakukannya berbagai upaya untuk meningkatkan tingkat sekresi

protein rekombinan dengan cara rekayasa di tingkat genetika. Menurut Shi-Wei et al.

(2004), tingkat sekresi suatu protein oleh suatu sel inang dapat dipengaruhi oleh beberapa

faktor, yaitu : (1) jenis penggunaan kodon dari gen yang diekspresikan, (2) jumlah gen

yang digunakan, (3) efisiensi dan kekuatan promotor, (4) efisiensi sinyal translasi, (5)

jenis peptida sinyal, (6) proses dan pelipatan di dalam retikulum endoplasma dan badan

Golgi, (7) faktor lingkungan dalam sekresi ekstraseluler, dan (8) hidrolisis protein oleh

protease.

Dalam jalur sekresi protein, eksositosis merupakan suatu proses penting yang

melibatkan transportasi vesikular pasca-Golgi untuk mensekresikan protein ke luar sel.

Proses eksositosis diregulasi oleh suatu protein anggota keluarga protein kecil Rab

GTPase, Sec4p. Sec4p merupakan protein berukuran sekitar 24 kDa yang berperan dalam

menargetkan vesikel sekresi ke membran plasma pada proses pasca-Golgi dalam sekresi

protein pada ragi.

Pada penelitian terdahulu dari kelompok kami, telah dipelajari pengaruh peptida

sinyal dan ko-ekspresi Protein Disulfida Isomerase terhadap tingkat sekresi -amilase

Saccharomycopsis fibuligera dalam P. pastoris dan diperoleh 20x peningkatan sekresi

(Gaffar et al, 2009; Gaffar et al 2011). Tujuan penelitian ini adalah untuk mempelajari

pengaruh ko-ekspresi SEC4 terhadap tingkat sekresi -amilase S. fibuligera oleh

P. pastoris.

Penelitian ini merupakan rangkaian penelitian yang dikembangkan oleh kelompok

ekspresi protein rekombinan menggunakan sistem ekspresi P. pastoris. Pada penelitian

terdahulu dari kelompok kami telah dibuktikan bahwa peptida sinyal, jumlah kopi gen

dan pelipatan protein mempengaruhi level sekresi protein. Penelitian ini secara khusus

akan mempelajari pengaruh protein yang berperan pada sekresi ekstraselular, yaitu Sec4p

terhadap tingkat sekresi -amilase S. fibuligera oleh sistem ekspresi P. pastoris.

Penelitian ini akan menghasilkan inang P. pastoris yang mengandung tambahan

gen SEC4 dan gen ALP1 serta mensekresikan -amilase level tinggi. Pada penelitian

terdahulu telah diperoleh P. pastoris yang mengandung gen ALP1 dan mensekresikan

-amilase S. fibuligera. Sec4p berperan pada sekresi protein ekstraselular, sehingga

26

tambahan ko-ekspresi Sec4p pada inang P. pastoris yang telah mengandung gen ALP1

akan menambah jumlah Sec4p yang dapat membantu sekresi -amilase oleh P. pastoris.

Ko-ekspresi Sec4p diharapkan akan meningkatkan sekresi -amilase oleh P. pastoris.

Hasil penelitian ini akan dipublikasikan pada jurnal nasional terakreditasi.

Inovasi dari penelitian ini adalah dihasilkan galur P. pastoris rekombinan yang

mengandung tambahan gen SEC4 dan ALP1. Ko-ekspresi Sec4p oleh inang P. pastoris

diharapkan dapat meningkatkan sekresi -amilase oleh P. pastoris rekombinan. Manfaat

dari penelitian ini secara khusus adalah diperolehnya informasi pengaruh ko-ekspresi

protein Sec4p terhadap tingkat sekresi -amilase S. fibuligera oleh P. pastoris, dan

diperolehnya galur P. pastoris yang dapat memproduksi -amilase S. fibuligera level

tinggi. Secara umum, inovasi dari penelitian ini adalah penggunaan sistem ekspresi

P. pastoris untuk produksi enzim rekombinan dari mikroba galur lokal, dan mempelajari

faktor-faktor yang mempengaruhinya. Manfaat jangka panjang dari penelitian ini adalah

sangat bermanfaat dalam rangka produksi enzim rekombinan lain menggunakan system

ekspresi P. pastoris.

3.1 Tujuan Khusus

Maksud penelitian ini adalah mendapatkan transforman P. pastoris yang

mengandung tambahan gen SEC4 dan ALP1, serta mempelajari pengaruh ko-ekspresi

Sec4p terhadap tingkat sekresi -amilase oleh P. pastoris. Sedangkan tujuan khusus

penelitian ini adalah:

1. Konstruksi vektor ekspresi pPIC3.5K-SEC4 untuk Pichia pastoris dan kloning

dalam E. coli.

2. Mengetahui homologi urutan nukleotida gen SEC4 Pichia pastoris hasil kloning

dalam E. coli dengan urutan gen SEC4 NCBI (nomor akses: XM_002492307.1).

3. Mendapatkan transforman P. pastoris yang mengandung gen ALP1 dan gen

SEC4.

4. Mengkarakterisasi transforman P. pastoris.

5. Mengetahui pengaruh ko-ekspresi Sec4p terhadap tingkat ekspresi -amilase

S. fibuligera oleh P. pastoris rekombinan.

27

3.2 Penelitian Pendahuluan yang Sudah Dilaksanakan

Studi pendahuluan telah dilakukan amplifikasi gen SEC4 P. pastoris dengan

metoda PCR dan subkloning menggunakan vektor pJet1.2 dalam E. coli. Templat

diperoleh dari genom P. pastoris. Amplifikasi gen SEC4 dilakukan menggunakan primer

maju dan balik yang keduanya telah mengandung sisi pengenalan enzim restriksi EcoRI

(5’ G↓AATTC 3’) sehingga akan menghasilkan fragmen gen SEC4 yang memiliki sisi

pengenalan enzim EcoRI di ujung 5’ dan 3’-nya (Shi-Hwei et al., 2004). Adanya sisi

pengenalan enzim ini akan mempermudah dalam karakterisasi transforman yang

mengandung plasmid rekombinan serta mendapatkan dan menyisipkan fragmen gen

SEC4 yang diinginkan pada subkloning menggunakan vektor pJET1.2 maupun kloning

menggunakan vektor pPIC3.5K. Vektor pJET1.2 merupakan vektor linear yang tidak

memiliki sisi pengenalan EcoRI, sehingga pada saat plasmid rekombinan pJET1.2-SEC4

direstriksi menggunakan enzim ini akan dihasilkan dua fragmen, vektor pJET1.2 dan

SEC4. Sedangkan vektor pPIC3.5K merupakan vektor sirkular yang memiliki sisi

pengenalan EcoRI, sehingga pada saat vektor ini direstriksi menggunakan enzim EcoRI,

vektor ini akan komplemen dengan fragmen gen SEC4 hasil subkloning.

Tahapan reaksi PCR untuk amplifikasi gen SEC4 meliputi tahap denaturasi awal

pada suhu 95oC selama 5 menit; denaturasi pada suhu 95

oC selama 1 menit; penempelan

primer (annealing) pada suhu 51oC selama 1 menit; dan polimerisasi pada suhu 72

oC

selama 1 menit, reaksi PCR dilakukan sebanyak 30 siklus.

Gambar 3.1 Amplikon SEC4. (lajur 1) marker 1 kb, (lajur 2) SEC4.

28

Menurut literatur urutan DNA SEC4 dari NCBI (nomor akses:

XM_002492307.1), gen SEC4 memiliki 615 bp nukloetida. Amplikon SEC4

dikarakterisasi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1%. Hasil karakterisasi

memperlihatkan pita amplikon SEC4 (Gambar 2.11 lajur 2) berada diantara pita 500 bp

dan 750 bp, sehingga dapat disimpulkan bahwa pita lajur 2 pada gel agarosa merupakan

pita fragmen SEC4 yang berukuran ~615 pb.

Fagmen SEC4 hasil PCR selanjutnya telah diligasi ke vektor pJet1.2

menghasilkan plasmid rekombinan pJet1.2-SEC4. Plasmid ini telah digunakan untuk

mentransformasi E. coli TOP10F’, dan telah diperoleh transforman yang mengadung

plasmid rekombinan (data tidak diperlihatkan). Hasil karakterisasi melalui pemotongan

dengan enzim restriksi EcoR1 memperlihatkan bahwa fragmen SEC4 telah berhasil

disubkloning.

Jadi pada penelitian pendahuluan yang telah dilakukan, sudah diperoleh

transforman E. coli yang mengandung plasmid rekombinan pJet1.2-SEC4. Selanjutnya

pada penelitian ini akan dilakukan: (1) penentuan urutan nukleotida SEC4 hasil

subkloning; (2) Ligasi fragmen SEC4 ke vektor pPIC3.5K; (3) Transformasi E. coli

menggunakan plasmid pPIC3.5K-SEC4; (4) penentuan urutan nukleotida SEC4 hasil

cloning; (5) Transformasi P. pastoris menggunakan plasmid pPIC3.5K-SEC4; (6)

Karakterisasi dan seleksi tranforman P. pastoris; (7) Ekspresi -amilase dan ko-ekspresi

Sec4p; (8) Analisis aktivitas -amilase; (9) Karakterisasi -amilase dan Sec4p intra dan

ekstraselular.

29

BAB IV. METODE PENELITIAN

4.1 Desain Penelitian

Penelitian yang akan dilakukan merupakan ekspreimen laboratorium secara

kuantitatif, dengan rincian sebagai berikut:

1. Amplifikasi gen SEC4 dan subkloning dalam E. coli.

2. Karakterisasi dan penentuan urutan nukleotida SEC4 hasil subkloning

3. Ligasi fragmen SEC4 ke vektor pPIC3.5K menghasilkan plasmid pPIC3.5K-

SEC4

4. Transformasi E. coli menggunakan plasmid pPIC3.5K-SEC4

5. Penentuan urutan nukleotida SEC4 hasil kloning

6. Transformasi P. pastoris menggunakan plasmid pPIC3.5K-SEC4

7. Seleksi dan karakterisasi transforman P. pastoris

8. Ekspresi -amilase dan ko-ekspresi Sec4p

9. Analisis aktivitas -amilase dan penentuan kadar protein

10. Karakterisasi -amilase dan Sec4p intra dan ekstraselular.

4.2. Metodologi Penelitian

4.2.1 Amplifikasi SEC4 P. pastoris dan subkloning dalam E. coli.

Gen SEC4 P. pastoris diamplifikasi dengan teknik PCR. Campuran reaksi PCR

terdiri atas 1 μL hasil isolasi DNA genom P. pastoris; bufer PCR 1X; primer 5’Sec4f (5’-

TTGAATTCATGGCATCAAGAGGCACATCA-3’) 0,4 μM; primer 3’Sec4r (5’-TT

GAATTCTCAACAACAAGACGATTTGGT-3’) 0,4 μM (urutan yang digarisbawahi

merupakan urutan sisi pengenalan enzim restriksi EcoR1); dNTP 0,2 mM (Fermentas);

MgCl2 2,5 mM; 1,25 U enzim Taq DNA polymerase (Fermentas) dan air bebas nuklease

hingga 50 μL. Proses PCR dilakukan menggunakan mesin Mastercycler® 5330

(Eppendorf) sebanyak 30 siklus, dengan masing-masing siklus terdiri dari tahap-tahap

denaturasi templat pada suhu 95oC selama 1 menit, tahap penempelan primer (annealing)

pada suhu 51oC selama 1 menit, dan tahap pemanjangan primer pada suhu 72

oC selama 1

menit. Hasil PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agaros 1% (b/v), kemudian

dimurnikan menggunakan GeneJET Gel Extraction Kit (Fermentas). Fragmen DNA hasil

pemurnian, di analisis dengan elektroforesis agaros 1 %(b/v).

30

Setelah dimurnikan, hasil PCR diligasi ke vektor pJet1.2 (Fermentas). Reaksi

ligasi dilakukan dengan perbandingan molar antara vektor pJET1.2 dan insert gen SEC4

1:3. Campuran reaksi ligasi terdiri dari 10 μL buffer 2x reaksi; 5 μL purified SEC4 hasil

PCR; 1 μL (0.05 pmol ends) vektor pJET1.2; 1 uL blunting enzyme, air bebas nuklease

hingga 19 μL; dan 1 μL T4 DNA ligase. Volume total reaksi ligasi adalah 20 μL.

Campuran kemudian divortex dan disentrifugasi selama 3-5 detik. Campuran diinkubasi

pada suhu 22C selama 15 menit.

Vektor pJet1.2 yang telah membawa gen SEC4 (pJet1.2-SEC4) digunakan untuk

mentransformasi E. coli TOP10F’. Pembuatan sel kompeten dilakukan mengikuti

prosedur CaCl2 (Sambrook, et al., 1989). Sejumlah 5 μL DNA hasil ligasi ditambahkan

ke dalam tabung yang berisi 50 μL sel kompeten, kemudian diinkubasi selama 30 menit

pada suhu 4C, kemudian dilakukan heat shock pada suhu 42

C selama 90 detik.

Kemudian segera didinginkan di dalam es selama 10 menit. Campuran ini kemudian

ditambahkan 950 μL media LB cair dan diinkubasi pada suhu 37C selama 2 jam dengan

laju pengocokan 150 rpm. Kemudian disentrifugasi pada 12000 rpm selama 30 detik.

Sebanyak 900 μL supernatan dibuang, pelet sel diresuspensi dengan supernatan sisa

sebanyak 100 μL dan kemudian ditumbuhkan pada media LB padat yang telah

mengandung Tetrasiklin 15 μg/mL dan Ampicillin 100 μg/mL, kemudian diinkubasi

pada suhu 37C selama 16-18 jam.

Koloni transforman E. coli yang tumbuh berwarna putih dikarakterisasi melalui

isolasi plasmid rekombinan (Sambrook, et al., 1989), analisis restriksi menggunakan

EcoR1, kemudian ditentukan urutan nukleotidanya. Urutan nukleotida gen SEC4 hasil

isolasi dari E. coli TOP10F’ dengan konsentrasi DNA sekitar 100 ng/μL ditentukan

dengan metode dideoksi Sanger (Dye Terminator) di Macrogene (Korea). Primer yang

digunakan untuk sekuensing adalah pasangan primer pJetfor dan pJetref (primer

universal untuk vektor pJet1.2). Hasil sekuensing di jajarkan menggunakan program

Seqman DNAStar.

4.2.2. Karakterisasi pJET1.2-SEC4 rekombinan

a. Isolasi Transforman E. coli TOP10 F’ (pJET1.2-SEC4 ) dengan Metode Miniprep

Transforman E.coli TOP 10F’ yang mengandung pJET1.2─SEC4 diinokulasi

dalam LB cair 6 mL yang ditambahkan Tetrasiklin 15 μg/mL dan Ampicillin 100 ug/mL

selama 16-18 jam, 37oC, dengan laju pengocokan 150 rpm. Kemudian sejumlah kultur

31

transforman E.coli TOP 10F’ yang telah ditumbuhkan dimasukan ke dalam tabung

mikrosentrifugasi 1.5 mL lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 30

detik untuk mengumpulkan pelet. Pelet ditambahkan dengan 500 μL buffer STE (NaCl

0,1 M, tris–Cl 10 mM pH 8,0, EDTA pH 8,0), divortex hingga pelet larut, dan kemudian

disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 30 detik. Pelet diresuspensi dengan

larutan A sebanyak 300 μL, lalu ditambahkan dengan larutan III sebanyak 150 μL,

kemudian larutan diinversi. Campuran didiamkan selama 3 menit, kemudian

disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipipet sebanyak

400 μL ke tabung mikrosentrifugasi 1.5 mL baru. Supernatan ditambahkan dengan etanol

p.a 100% sebanyak 800 μL (2X volume supernatan), divortex selama 10 detik,

didiamkan selama 5 menit, dan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm

selama 5 menit. Pelet yang diperoleh dicuci dengan etanol p.a 70% sebanyak 1 mL,

divortex selama 10 detik, dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 3 menit.

Supernatannya dibuang, kemudian pelet dalam tabung mikrosentrifugasi dikeringkan di

dalam konsentrator. Pelet kemudian dilarutkan dengan 50 μL ddH2O steril. Larutan

kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v).

b. Pemurnian DNA Plasmid Hasil Isolasi dengan Metode Presipitasi Etanol

Larutan hasil isolasi ditambahkan natrium asetat 3M sebanyak 0.1 x volume dan

etanol p.a 100% 2 x volume, campuran larutan kemudian diinversi dan diinkubasi pada

suhu -20oC semalaman. Larutan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm

selama 30 menit pada suhu 4oC. Supernatan dibuang, pelet dicuci dengan penambahan

etanol p.a 70% sebanyak 5 x volume. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 12000

rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Supernatan dibuang, pelet kemudian dikeringkan di

dalam konsentrator. Pelet kemudian dilarutkan dengan 50 μL ddH2O steril. Larutan

kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v).

c. Restriksi Plasmid pJET1.2─SEC4

Sebanyak 10 uL plasmid pJET1.2-SEC4 hasil isolasi ditambahkan 2 uL buffer

EcoRI 10x, 2 uL enzim EcoRI (10 U/mL), dan air bebas nuklease hingga volume total

reaksi 20 uL. Kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 jam. Setelah itu

dikarakterisasi dengan elektroforesis gel.

32

4.2.3 Penentuan Urutan Nukleotida pJET1.2─SEC4

Urutan nukleotida gen SEC4 hasil isolasi dari E. coli TOP10F’ dengan

konsentrasi DNA sekitar 100 ng/μL ditentukan dengan Metode dideoksi Sanger (Dye

Terminator) di Macrogene (Korea) dengan menggunakan primer pJet-for dan pJet-rev.

4.2.4 Kloning Fragmen SEC4 dalam E. coli TOP10F’

a. Isolasi/ Restriksi Plasmid pJET1.2─SEC4 dan vektor pPIC3.5K

Koloni positif mengandung plasmid pJET1.2─SEC4 diisolasi dengan

menggunakan GeneJET Plamid Miniprep Kit (Fermentas) mengikuti prosedur. DNA

hasil isolasi dilarutkan dalam 50 uL ddH2O steril kemudian direstriksi dengan enzim

EcoRI dan dikarakterisasi dengan elektroforesis agarosa. Hal yang sama dilakukan pada

vektor pPIC3.5K.

b. Pemurnian fragmen SEC4 dan pPIC3.5K GeneJET Extraction Kit (Fermentas)

Masing-masing fragmen DNA (SEC4 dan pPIC3.5K) hasil restriksi pada gel

agarosa dimurnikan menggunakan GeneJET Extraction Kit (Fermentas) mengikuti

prosedur seperti sudah dijelaskan diatas.

c. Ligasi Fragmen DNA SEC4 dengan Vektor pPIC3.5K

Reaksi ligasi dilakukan dengan perbandingan molar antara vektor pPIC3.5K dan

insert gen SEC4 1:5. Campuran reaksi ligasi terdiri dari 2 μL buffer 10x reaksi; 1.22 μL

purified SEC4; 1 μL vektor pJET1.2; air bebas nuklease hingga 19 μL; dan 1 μL T4 DNA

ligase. Volume total reaksi ligasi adalah 20 μL. Campuran kemudian divortex dan

disentrifugasi selama 3-5 detik. Campuran diinkubasi pada suhu 220C selama 1 jam.

d. Transformasi E. coli TOP10F’ Menggunakan Plasmid pPIC3.5K-SEC4

Proses transformasi dimulai dengan pembuatan sel kompeten metoda CaCl2

(Sambrook et al., 1986). Sejumlah 5 μL DNA hasil ligasi digunakan untuk

mentransformasi E. coli TOP10 dengan metoda heat shock pada suhu 420C selama 90

detik. Transforman E. coli ditumbuhkan pada media LB padat yang telah mengandung

Tetrasiklin 15 μg/mL dan Ampicillin 100 μg/mL, kemudian diinkubasi pada suhu 370C

selama 16-18 jam.

e. Restriksi Plasmid pPIC3.5K─SEC4

Sebanyak 10 uL plasmid pJET1.2-SEC4 hasil isolasi ditambahkan 2 uL buffer

EcoRI 10x, 2 uL enzim EcoRI (10 U/mL), dan air bebas nuklease hingga volume total

33

reaksi 20 uL. Kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 jam. Setelah itu

dikarakterisasi dengan elektroforesis gel.

4.2.5 Penentuan Urutan Nukleotida pPIC3.5K─SEC4

Urutan nukleotida gen SEC4 dalam plasmid pPIC3.5K-SEC4 hasil isolasi dari E.

coli TOP10F’ dengan konsentrasi DNA sekitar 100 ng/μL ditentukan dengan Metode

dideoksi Sanger (Dye Terminator) di Macrogene (Korea) dengan menggunakan primer

5’AOX dan 3’AOX.

4.2.6 Transformasi P. pastoris menggunakan plasmid pPIC3.5K-SEC4

a. Linearisasi plasmid pPIC3.5K-SEC4

Sebanyak 1-5 μg plasmid rekombinan pPIC3.5K-SEC4 dilinearisasi menggunakan

enzim restriksi BspE1. Campuran reaksi mengandung 1-5 μg plasmid rekombinan, 10

Unit BspE1 dan buffer Tango 1X. Restriksi dilakukan dalam volume 20 L, dan

diinkubasi pada suhu 37C selama 16 jam. Hasil restriksi di elektroforesis dengan gel

agarosa 1%.

b. Transformasi P. pastoris metode EasyCompTM

(Invitrogen, 2006)

Persiapan sel kompeten P. pastoris MS-20 [ALP1]. Koloni tunggal P. pastoris

MS-20 [ALP1] diinokulasi ke dalam 10 mL YPD. Kemudian ditumbuhkan semalam pada

suhu 28-30C dengan pengocokan pada 250 rpm. Sebanyak 500 μL kultur dipindahkan

ke dalam 10 mL media YPD baru dan diinkubasi pada suhu 28-30C dengan pengocokan

hingga mencapai OD0,6-1,0 (kira-kira 5 jam). Prosedur persiapan sel kompeten dilakukan

mengikuti protokol (Invitrogen, 2006).

Transformasi P. pastoris. Sebanyak 3 μg (volume 5 μL) plasmid pPIC3.5K–

SEC4 yang telah linear ditambahkan ke dalam suspensi sel kompeten. Kemudian

ditambahkan 1 mL larutan II dan dihomogenkan menggunakan vorteks. Setelah itu

diinkubasi pada suhu 30C selama 1 jam dalam penangas air. Campuran dihomogenkan

setiap 15 menit dengan vorteks. Kemudian dilakukan heat shock menggunakan heating

block atau penangas air pada suhu 42C selama 10 menit. Sel dipisahkan ke dalam dua

tabung 1,5 mL (kira-kira 525 μL per tabung), ditambah 1 mL media YPD cair. Sel

diinkubasi pada suhu 30C selama 1 jam, kemudian disentrifugasi pada 12000 g selama 5

menit pada suhu ruang, supernatan dibuang. Pelet diresuspensi dalam 500 μL larutan III

34

dan pelet digabungkan ke dalam satu tabung. Pelet disentrifugasi pada kecepatan 12000 g

selama 5 menit pada suhu ruangan lalu supernatan dibuang. Pelet diresuspensi dalam 150

μL larutan III. Semua transforman disebarkan pada cawan petri berisi media YPD padat.

Kemudian diinkubasi selama 3 sampai 10 hari pada suhu 30C (Invitrogen, 2006).

4.2.7 Seleksi dan karakterisasi tranforman P. pastoris

Seleksi transforman P. pastoris. Seleksi akan dilakukan dengan menumbuhkan

transforman dalam media padat MMH (minimal methanol medium+ histidin: YNB

1,34% (b/v), biotin 4x10-5

% (b/v), metanol 0,5% (v/v), histidin 0,004% (b/v) dan MM

(minimal methanol medium: YNB 1,34% (b/v), biotin 4x10-5

% (b/v), metanol 0,5% (v/v).

Galur His+ akan tumbuh normal pada kedua media, sementara galur His

- tumbuh normal

pada media MMH tetapi menunjukkan pertumbuhan lambat atau sama sekali tidak

tumbuh pada media MM.

Karakterisasi transforman P. pastoris. Karakterisasi dilakukan untuk mengetahui

apakah gen SEC4 dan gen ALP1 sudah terintegrasi ke kromosom P. pastoris.

Karakterisasi dilakukan dengan metoda PCR, menggunakan pasangan primer untuk

mengamplifikasi gen SEC4 dan ALP1 dan templat genom P. pastoris.

4.2.8 Ekspresi -amilase dan ko-ekspresi Sec4p

Satu koloni tunggal transforman P. pastoris diinokulasi dalam 10 mL media YPD

cair, dan diinkubasi semalam pada suhu 30C dengan pengocokan 200 g. Sebanyak 1 mL

kultur cair dipindahkan ke 10 mL media BMGY+ Histidin (buffered glycerol complex

medium: ekstrak ragi 1% (b/v), bakto pepton 2% (b/v), kalium fosfat 100 mM (pH 6),

YNB 1,34% (b/v), biotin 4x10-5

% (b/v), gliserol 1% (v/v)) menggunakan labu 100 mL.

Sel ditumbuhkan pada suhu 28–30C dalam inkubator pengocok 250 g hingga mencapai

OD600 = 6-10 (kira-kira 18-20 jam). Sel di panen dengan sentrifugasi pada 1500 – 3000 g

selama 5 menit pada suhu ruang. Supernatan didekantasi dan pelet sel diresuspensi dalam

25 mL media BMMH (buffered minimal methanol-histidin: YNB 1,34% (b/v), kalium

fosfat 100 mM pH 6, biotin 4x10-5

% (b/v), metanol 1% (v/v), histidin 0,004%)

menggunakan labu 250 mL. Labu ditutup dengan kapas steril dan inkubasi dilanjutkan

dengan pengocokan. Induksi dilakukan dengan menambahkan metanol dengan

konsentrasi akhir 0,75% setiap 24 jam, pada jam ke 24, 36, 72, 96, 120, dan 144.

Pengambilan sampel dilakukan setiap jam induksi dengan mengambil 1 mL kultur hasil

35

ekspresi dipindahkan ke dalam tabung mikro 1,5 mL. Sampel disentrifugasi pada

kecepatan maksimum selama 2-3 menit pada suhu ruang. Supernatan dan pelet disimpan

pada pendingin suhu -20C sampai siap untuk di uji (Invitrogen, 2006).

4.2.9 Analisis aktivitas -amilase

Hasil ekspresi protein pada supernatan dan pelet sel diuji aktivitas amilase intra

dan ekstraselularnya dengan metode DNS (Bernfeld, 1948) ditentukan kadar protein

(metode Lawry, 1975).

4.2.10 Karakterisasi -amilase dan Sec4p intra dan ekstraselular.

Sec4p intraselular P. pastoris dan -amilase hasil ekspresi intra dan ekstraseluler

P. pastoris akan dikarakterisasi dengan metoda SDS-PAGE (Sambrook et al., 1989).

menggunakan gel dengan komposisi 10% separating gel dan 4% stacking gel.

Persiapan supernatan: 50 μL supernatan dicampur dengan sampel bufer (Tris-Cl

50 mM, pH 6,8, gliserol 1% (v/v), β-merkapoetanol 100 mM, SDS 2% (b/v), bromofenol

biru 0,1% b/v) dan dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit dan didinginkan.

Persiapan pelet sel: Pelet sel diresuspensi dalam 300 μL aquadest, dan

ditambahkan 100 μL TCA 50%, diaduk segera. Sampel dibekukan pada suhu -80C

selama 30 menit. Sel disentrifugasi pada suhu ruang dengan kecepatan 14.000 g selama 5

menit. Pelet sel dicuci dua kali dengan 500 μL aseton 80% dingin, dilanjutkan dengan

sentrifugasi pada 14.000 g selama 5 menit pada suhu ruang. Supernatan dibuang dengan

hati-hati, dan pelet dibiarkan mengering. Pelet dilarutkan dalam 100 μL SDS 1% dalam

natrium hidroksida 0,1N. Kemudian ditambahkan sampel buffer (Tris-Cl 50 mM pH 6,8,

gliserol 1% v/v, β-merkaptoetanol 100 mM, SDS 2% b/v, bromofenol biru 0,1% b/v) dan

dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit dan didinginkan. Kemudian

dikarakterisasi dengan SDS-PAGE.

36

4.3 Bagan Alir Penelitian

38

BAB V. HASIL YANG DICAPAI

5.1 Amplifikasi SEC4 P. pastoris dan subkloning dalam E. coli.

Amplifikasi gen SEC4 dengan teknik PCR menggunakan pasangan primer

5’Sec4f dan 3’Sec4r menghasilkan fragmen berukuran 615 pb (Gambar 1a) sesuai

dengan panjang gen SEC4 P. pastoris di GenBank (nomor akses: XM_002492307.1).

Selanjutnya gen SEC4 telah berhasil disubkloning menggunakan vektor pJet1.2 dalam

E. coli (Gambar 1b). Sebanyak 104 koloni transforman E. coli telah diperoleh dan

diremajakan untuk pencarian koloni yang mengandung plasmid rekombinan.

a. b.

Gambar 5.1. (a) Produk PCR gen SEC4. (lajur 1) marker 1 kb, (lajur 2) SEC4. (b) Koloni

transforman E. coli [pJET1.2-SEC4].

Hasil isolasi plasmid dan karakterisasi dengan enzim EcoR1 diperoleh koloni

yang positif mengandung gen SEC4 (Gambar 2). Hasil restriksi plasmid yang

ditunjukkan pada Gambar 2 menunjukkan bahwa koloni 92 (lajur 6) positif mengandung

plasmid pJET-SEC4, ditunjukkan dengan adanya pita pada daerah ~3000 bp yang sesuai

dengan ukuran plasmid pJET1.2 dan pita pada daerah ~615 bp yang sesuai dengan

ukuran gen SEC4. Koloni 64 dan 68 (lajur 3 dan 4) diduga mengandung vektor pJET1.2

yang mengalami re-ligasi, ditunjukkan dengan pita plasmid yang tidak terpotong oleh

enzim EcoRI karena vektor pJET1.2 tidak memiliki sisi pengenal EcoRI. Namun,

seharusnya koloni ini tidak tumbuh pada media seleksi karena vektor pJET1.2 yang tidak

disisipi DNA sisipan akan mengekspresikan protein yang mematikan bagi transforman

E. coli. Diduga hal ini terjadi karena adanya kontaminasi nuklease. Kontaminasi ini dapat

39

merusak integritas dari gen mematikan dengan rusaknya ujung vektor pJET1.2 oleh

aktivitas nuklease. Hasil restriksi koloni 21 dan 50 (lajur 2 dan 5) menghasilkan plasmid

yang terpotong oleh enzim EcoRI, namun tidak menunjukkan pita spesifik pET1.2

maupun SEC4. Diduga hal ini terjadi karena proses restriksi yang kurang sempurna

sehingga menghasilkan plasmid pJET-SEC4 linear, ditunjukkan dengan pita yang terletak

diantara daerah ~3500 pb.

Gambar 5.2. Hasil restriksi plasmid pJET1.2-SEC4 dengan enzim EcoRI. (lajur 1) marker 1 kb,

(lajur 2) pJET-SEC4 koloni 21 cut/ EcoRI, (lajur 3) pJET-SEC4 koloni 64 cut/ EcoRI, (lajur 4) pJET-SEC4 koloni 68 cut/EcoRI, (lajur 5) pJET-SEC4 koloni 50

cut/ EcoRI, (lajur 6) pJET-SEC4 koloni 92 cut/EcoRI.

5.2 Kostruksi plasmid ekspresi pPIC3,5K-SEC4 dan kloning dalam E. coli

Gen SEC4 hasil subkloning dipotong dari plasmid pJet1.2-SEC4 menggunakan

enzim EcoR1. Pemotongan plasmid ini dengan enzim EcoR1 menghasilkan dua pita

DNA yaitu 3000 pb (vektor pJet1.2) dan 615 pb (gen SEC4). Sedangkan pemotongan

plasmid pPIC3.5K dengan enzim EcoR1 menghasilkan satu pita dengan ukuran 9000 pb

(Gambar 5.3)

Gambar 5.3. Hasil restriks pJET1.2-SEC4 dan vektor pPICK3.5K dengan enzim EcoR1. (lajur 1) marker 1 kb, (lajur 2) pPICK3.5K cut/ EcoR1, (lajur 3) pJET1.2-SEC4 cut/

EcoR1.

40

Fragmen 9000 pb (pPIC3.5K) dan 615 pb(SEC4) dipotong dari gel agaros,

kemudian dimurnikan menggunakan GeneJet Gel Extraction Kit (Fermentas). Kedua

fragmen DNA ini diligasi dengan perbandingan molar fragmen SEC4:vektor pPIC3.5K =

5:1. Hasil ligasi dikloning dalam E. coli TOP10F’ dan diperoleh 104 transforman E. coli

(Gambar 5.4).

a. b.

Gambar 5.4. Koloni E. coli [pPIC3.5K-SEC4] yang diremajakan.(a) koloni 1-52, (b) koloni 53-104.

Peta plasmid rekombinan pPIC3.5K-SEC4 hasil konstruksi diperlihatkan pada

gambar 5.5. Plasmid ini membawa dua gen marker seleksi yaitu gen pengode resistan

ampisilin dan kanamisin. Gen SEC4 berada dibawah kontrol promotor dan terminator

AOX1. Induksi ekspresi dilakukan dengan menambahkan penginduksi metanol.

Gambar 5.5 Peta plasmid pPIC3.5K-SEC4 hasil konstruksi

41

Hasil penentuan urutan nukleotida terhadap urutan gen SEC4 dalam plasmid

rekombinan pJet1.2-SEC4 menunjukkan bahwa gen SEC4 hasil subkloning homologi

100% dengan urutan gen SEC4 P. pastoris pada GenBank (nomor akses:

XM_002492307.1) (Gambar 5.6).

Gambar 5.6 Homologi urutan nukleotida SEC4 hasil subkloning dengan urutan SEC4

nomor NCBI. Warna merah menunjukkan tingkat homologi 100%.

42

5.3 Isolasi Plasmid pPIC3,5K-SEC4 dari E.coli TOP10F’ dan linearisasi

Plasmid pPIC3,5K-SEC4 diisolasi dari transforman E. coli TOP10F’ yang akan

digunakan untuk transformasi P. pastoris. E. coli TOP10F’ [pPIC3,5K-SEC4]

ditumbuhkan dalam media LB cair yang mengandung antibiotik tetrasiklin dan ampisilin.

Setelah diinkubasi selama semalam diperoleh kultur E. coli TOP10F’ [pPIC3,5K-SEC4].

Penambahan antibiotik bertujuan untuk seleksi koloni transforman. E. coli TOP10F’

yang telah mengandung plasmid rekombinan pPIC3.5K-SEC4 akan resisten terhadap

antibiotik ampisilin karena vektor pPIC3.5K memiliki gen pengode resistensi kanamicin/

ampisilin. Selain itu transforman juga resisten terhadap antibiotik tetrasiklin karena

E.coli TOP10F’ membawa gen pengode resisten tetrasiklin, sehingga, hanya E.coli yang

mengandung plasmid rekombinan pPIC3.5K-SEC4 yang akan tumbuh.

Plasmid rekombinan pPIC3,5K-SEC4 diisolasi dari E. coli TOP10F’

menggunakan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Sebagai pembanding digunakan

plasmid pPIC3.5K yang diisolasi dengan metode yang sama. Hasil isolasi plasmid

pPIC3.5K dan pPIC3,5K-SEC4 dari E. coli TOP10F’ dikarakterisasi dengan agarosa 1%

(b/v). Plasmid pPIC3,5K-SEC4 mempunyai ukuran ~9615 pb. Hasil isolasi ditunjukkan

pada Gambar 5.7.

Gambar 5.7 Hasil isolasi plasmid pPIC3,5K-SEC4 dengan High Pure Plasmid Isolation

Kit (Roche). (lajur 1) plasmid pPIC3,5K, (lajur 2) Ladder DNA 1 kb, (lajur

3) plasmid pPICK3.5K-SEC4.

Pada Gambar 5.7 terlihat pita DNA plasmid pada gel agarosa membentuk lebih

dari satu pita. Adanya beberapa pita pada satu jalur menunjukkan DNA plasmid berhasil

diisolasi. DNA plasmid memiliki konformasi superkoil yang berbeda-beda seperti

1 2 3

43

supercoiled monomer, supercoiled dimer, nicked circular, dan lain-lain (Jazwinski and

Edelman, 1982), sehingga akan menghasilkan beberapa pita DNA pada gel agarose. Pita

plasmid pPIC3.5K terletak lebih bawah dibandingkan plasmid pPICK3.5K-SEC4.

Menurut literatur gen SEC4 P. pastoris dari NCBI (nomor akses: XM_002492307.1)

memiliki 615 bp nukleotida dan mendapat tambahan plasmid pPICK3.5K yang memiliki

ukuran ~9000 pb, sehingga ukuran pPICK3.5K-SEC4 menjadi ~9615 pb. Hasil ini

menguatkan dugaan bahwa transforman E. coli TOP10F’ telah membawa plasmid

rekombinan pPIC3.5K-SEC4.

Vektor pPIC3.5K merupakan vektor ekspresi untuk P. pastoris berukuran 9004

bp. Vektor P. pastoris pada umumnya dirancang sebagai plasmid integrasi untuk

mencegah masalah ketidakstabilan plasmid selama pertumbuhan jangka panjang. Kaset

ekspresi diintegrasi ke genom P. pastoris pada lokus spesifik untuk menghasilkan

transforman yang stabil secara genetik. Integrasi dapat dilakukan dengan dua cara. Cara

yang paling sederhana adalah dengan memotong vektor pada sisi yang unik dalam gen

penanda (seperti HIS4) atau pada fragmen promotor AOX1 (Romanos, 1995; Gaffar,

2010). Pemotongan vektor P. pastoris dalam urutan yang sama dengan genom inang,

akan menstimulasi peristiwa rekombinasi homolog yang merupakan target yang efisien

untuk integrasi vektor ke lokus genom (Cregg & Madden, 1988).

Vektor pPIC3.5K sendiri memiliki sisi restriksi yang unik untuk melinearkan

vektor pada lokus AOX1 dan HIS4 untuk integrasi yang efisien kedalam genom P.

pastoris. Pada penelitian ini, linearisasi dilakukan pada lokus HIS4 karena lokus AOX1

telah terintegrasi gen ALP1. Terdapat tiga sisi restriksi unik yang dimiliki vektor

pPIC3.5K agar menjadi linier yaitu SacI (dari Streptomyces achromogenes), SalI (dari

Streptomyces albus), dan BspEI (dari Bacillus species) (Invitrogen, 2006). Pada

penelitian ini digunakan enzim restriksi BspEI untuk melinierkan plasmid pPIC3.5K-

SEC4 pada lokus HIS4. Enzim BspEI ini memiliki sisi pemotongan 5’T↓CCGGA3’

(BioLabs, 2007). Gen SEC4 tidak memiliki sisi pengenal BspEI sehingga gen SEC4

tidak terpotong. Hasil linierisasi plasmid pPIC3,5K─SEC4 oleh enzim BspEI ditunjukkan

pada Gambar 5.8.

44

Gambar 5.8 Hasil linierisasi plasmid pPIC3.5K─SEC4. Lajur 1 Ladder DNA 1 kb, lajur 2

pPIC3.5K─SEC4/BspEI.

5.4 Uji Kualitatif P. pastoris WT-78 dan WT-68

Uji kualitatif perlu dilakukan untuk memastikan bahwa koloni P. pastoris yang

akan dipakai mengekspresikan α-amilase. Uji kualitatif P. pastoris dilakukan dengan

menggunakan media YPD (yeast-peptone-dextrose) padat yang ditambah pati. Hasil

pengamatan (Gambar 5.9) menunjukkan bahwa koloni P. pastoris [ALP1-78] dan P.

pastoris [ALP1-68] mampu mensekresikan α-amilase keluar sel. Hal ini ditunjukkan oleh

adanya daerah bening di sekeliling koloni P. pastoris setelah dilakukan penambahan

larutan KI/I2. Daerah bening tersebut terbentuk karena tidak adanya pati yang

membentuk kompleks dengan KI/I2 karena pati telah dihidrolisis oleh -amilase yang

disekresikan oleh P. pastoris, sedangkan daerah biru menunjukkan adanya pati yang

masih tersisa dalam media pertumbuhan sehingga membentuk kompleks dengan iodium.

Gambar 5.9 Hasil uji aktivitas -amilase secara kualitatif dalam media padat yang

mengandung 2% pati dan 0,5% metanol. (1) P. pastoris [ALP1-78], (2)

[ALP1-68].

2

2

~ 9615 pb 10.000 bp

6000 bp

3000 bp

1500 bp

1000 bp

750 bp

500 bp

1

1

45

5.5 Transformasi P. pastoris menggunakan pPIC3.5K–SEC4 dengan metode

EasyCompTM

(Invitrogen).

Vektor rekombinan pPIC3,5K─SEC4 yang telah linier kemudian digunakan untuk

mentransformasi P. pastoris[ALP1-68] dan [ALP1-78] dengan Metode EasyComp™

(Invitrogen). Prosedur transformasi dilakukan mengikuti prosedur Invitrogen. Kemudian

transforman P. pastoris [ALP1-68/SEC4] dan [ALP1-78/SEC4] ditumbuhkan pada

media YPDS (yeast-peptone-dextrose-sorbitol) padat dan di inkubasi selama 3 hari,

sehingga diperoleh koloni P. pastoris [ALP1-78/SEC4] dan [ALP1-68/SEC4] yang dapat

dilihat pada Gambar 5.10.

Gambar 5.10 Koloni P. pastoris [ALP1-SEC4] hasil transformasi. (1) P. pastoris [ALP1-

68/SEC4], (2) P. pastoris [ALP1-78/SEC4].

Hasil transformasi yang ditumbuhkan pada media YPDS padat tidak

ditemukan koloni tunggal, maka koloni hasil transformasi diambil menggunakan jarum

oase lalu digores ulang pada media YPDS padat untuk memperoleh koloni tunggal.

Hasil pertumbuhan pada media YPDS tidak ditemukan koloni tunggal dikarenakan

konsentrasi dari transforman terlalu pekat, sehingga koloni-koloni tunggal tidak

terbentuk. Gambar hasil pertumbuhan transfoman Pichia pastoris pada media YPDS

dapat dilihat pada Gambar 5.11.

1 2

46

Gambar 5.11 Koloni P. pastoris [ALP1/SEC4] pada media YPD padat.

5.6 Seleksi dan Karakterisasi Transforman P. pastoris

a. Uji Resistensi Terhadap Geneticin

Hasil uji geniticin yang dilakukan terhadap P. pastoris [ALP1-SEC4]

menunjukkan bahwa transforman P. pastoris resisten terhadap geniticin (2,5mg/mL).

Transforman P. pastoris [ALP1-SEC4] ditumbuhkan pada media YPD cair selama

semalam, kemudian densitas optiknya diukur dan diperoleh sebesar 2,653 untuk P.

pastoris [ALP1-78/SEC4] dan 2,578 untuk P. pastoris [ALP1-68/SEC4]. Kemudian

ditambahkan antibiotik geneticin dengan konsentrasi akhir 2,5 mg/mL ke dalam kultur,

lalu diinkubasi selama semalam (16-18 jam), kemudian diukur OD-nya sebesar 2,664

untuk [ALP1-78/SEC4] dan 2,581 untuk [ALP1-68/SEC4]. Adanya produk gen resisten

kanamisin dari Tn903 yang dibawa oleh plasmid pPIC3.5K menyebabkan P. pastoris

resistens terhadap geniticin (Invitrogen, 2004), sehingga tranforman P. pastoris akan

resisten terhadap antibiotik geneticin yang artinya gen pengode resisten terhadap

geneticin telah terintegrasi ke genom P. pastoris.

b. Seleksi Fenotif His+ Pada Transforman P. pastoris

Seleksi fenotif His+ transforman P. pastoris dilakukan dengan cara

menumbuhkan koloni tunggal P. pastoris pada media YPD cair selama semalam,

kemudian dipindahkan ke media YPD padat yang telah mengandung Histidin dengan

konsentrasi 0,004 mg/mL dan media YPD padat yang tidak mengandung histidin.

Kemudian diinkubasi selama 2-3 hari pada suhu 30ºC. Transformasi menggunakan

plasmid [pPIC3.5K─SEC4] akan merubah fenotip P. pastoris [ALP1-68]/His- maupun P.

pastoris [ALP1-78] His- menjadi His

+ karena vektor ekspresi pPIC3.5K yang digunakan

membawa lokus HIS4. HIS4 mengode histidinol dehidrogenase yang merupakan salah

satu enzim yang terlibat dalam biosintesis histidin. Galur His+ akan dapat tumbuh pada

47

media yang tidak mengandung histidin sedangkan galur His- tidak dapat tumbuh pada

media yang tidak mengandung histidin. Gambar 5.12 menunjukan bahwa transforman P.

pastoris [ALPI-78/SEC4] maupun [ALPI-68/SEC4] dapat tumbuh pada media yang tidak

mengandung histidin, sehingga fenotipnya adalah His+.

Gambar 5.12 Seleksi fenotif His+. 1 merupakan P. pastoris dengan penambahan

Histidin, 2 merupakan P. pastoris tanpa penambahan Histidin

5.7. Ekspresi -amilase oleh P. pastoris rekombinan

a. Peremajaan P. pastoris Rekombinan

Koloni hasil transformasi yang telah ditumbuhkan pada media YPD padat

selanjutnya diremajakan dalam media YPD cair. Peremajaan ini dilakukan untuk

memperoleh koloni yang lebih muda dengan densitas optik P. pastoris masih berada

pada fase log pertumbuhan sekitar 10-12 (Triana,2010). Kultur diinkubasi selama 16-18

jam pada suhu 28-30°C dan kecepatan pengocokan 185 rpm. Gambar 5.13 menunjukkan

sel P. pastoris yang telah diremajakan.

Gambar 5.13 Hasil peremajaan P. pastoris (1) [ALPI-68/SEC4] dan (2) [ALPI-78/SEC4]

.

2

1 2

YPD padat dengan

histidin YPD padat tanpa

histidin

1 2

48

b. Induksi Ekspresi α-Amilase oleh P. pastoris Rekombinan

P. pastoris [ALP1] yang diperoleh dari hasil penelitian (Gaffar 2011) digunakan

sebagai pembanding untuk mempelajari pengaruh ko-ekspresi SEC4 terhadap level

sekresi α-amilase. Koloni P. pastoris ditumbuhkan pada media YPD cair dan diambil

sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam 10 mL media BMGY (Buffered Glycerol-

complex Medium: ekstrak ragi 1% (b/v), bakto pepton 2% (b/v), kalium fosfat 100 mM

pH 6, YNB 1,34% (b/v), biotin 4x10-5

% (b/v), gliserol 1% (v/v)) menggunakan labu 100

mL. Komponen yang terdapat pada media ini berperan dalam mengontrol pH media,

menurunkan aktivitas protease dan meningkatkan biomassa (Invitrogen, 2004). Media

BMGY ini mengandung gliserol karena sel P. pastoris dengan cepat dapat mencapai

densitas sel yang tinggi pada kultur yang mengandung gliserol. Media BMGY tidak

mengandung metanol karena pada fase pertumbuhan ini hanya bertujuan untuk

memperbanyak sel P. pastoris sehingga metanol sebagai penginduksi belum

ditambahkan. Inkubasi dilakukan pada suhu 28-30°C dengan kecepatan 200 rpm agar sel

dapat tumbuh optimal. Kultur yang diinkubasi selama 16-18 jam mencapai OD600

(densitas optik yang diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada λ600) sekitar 9-

10. Hasil ini sangat tinggi bagi beberapa mikroorganisme namun tidak bagi P. pastoris.

Inokulum dari media BMGY disentrifugasi untuk memisahkan supernatan dan

pelet. Supernatan didekantasi dan pelet sel P. pastoris diresuspensi dalam 25 mL media

BMMH (buffered minimal methanol histidine: YNB 1,34% (b/v), kalium fosfat 100 mM

pH 6, biotin 4x10-5

% (b/v), metanol 1% (v/v), histidin 0,004%) menggunakan labu 250

mL. Labu ditutup dengan kapas steril dan inkubasi dilanjutkan dengan pengocokan.

Inkubasi dilakukan pada suhu 28-30°C dengan kecepatan pengocokan 185 rpm,

pertumbuhan di atas 32oC selama fase induksi dapat mengganggu ekspresi protein dan

dapat menyebabkan kematian sel (Invitrogen, 2004). Induksi dilakukan dengan

menambahkan metanol dengan konsentrasi akhir 0,75% setiap 24 jam, pada jam ke 24,

36, 72, 96, 120, dan 144. Pengambilan sampel dilakukan setiap jam induksi dengan

mengambil 1 mL kultur hasil ekspresi dipindahkan ke dalam tabung mikro 1,5 mL.

Sampel disentrifugasi pada kecepatan maksimum selama 2-3 menit pada suhu ruang.

Supernatan dipindahkan ke tabung lain, supernatan dan pelet disimpan pada pendingin

-20C sampai siap untuk diuji.

49

c. Densitas Optik Selama Masa Ekspresi

Densitas optik dapat menunjukkan tingkat pertumbuhan sel. Spektrofotometer

digunakan untuk analisis ini, densitas optik diukur pada panjang gelombang 600 nm.

Gambar 5.14 di bawah ini menunjukkan densitas optik P. pastoris [ALPI-68/SEC4] dan

P. pastoris [ALPI-78/SEC4] selama waktu induksi. OD tertinggi diperoleh pada jam ke-

72, yaitu 24,15 pada P. pastoris [ALPI-78/SEC4] dan 22,95 pada P. pastoris [ALPI-

68/SEC4] .

Gambar 5.14 Densitas optik P. pastoris [ALPI-68/SEC4] dan [ALPI-78/SEC4] yang

ditumbuhkan pada media yang mengandung 0,75% metanol sebagai

penginduksi.

5.8 Aktivitas α-Amilase Hasil Ekspresi

Metode penentuan aktivitas α-amilase dilakukan dengan metode DNS (Asam 3,5-

Dinitrosalisilat). Sampel diambil tiap 24 jam dari kultur BMMH, kemudian disentrifugasi

untuk memisahkan supernatan dan pelet sel. Supernatan yang mengandung α-amilase di

tentukan aktivitasnya dengan metoda DNS, dimana pada prinsipnya metode DNS

menciptakan suasana alkali agar gula pereduksi dapat mereduksi asam 3,5-dinitrosolisilat

(DNS) membentuk senyawa 3-amino-5-nitrosalisilat, yang menyerap cahaya secara kuat

pada panjang gelombang 500 nm (Shaw et al., 1995).

Pada metode DNS ini, satu unit aktivitas enzim α-amilase didefenisikan sebagai

sejumlah enzim yang dapat menghasilkan 1 µmol gula pereduksi dalam waktu 10 menit

(Miller, 1959). Amilase akan bekerja memotong substrat pati sehingga dihasilkan

beberapa produk berupa oligosakarida, maltosa dan glukosa yang merupakan gula

0

5

10

15

20

25

30

0 24 48 72 96 120 144

De

nsi

tas

Op

tik

Waktu (Jam)

[ALPI-78/SEC4]

[ALPI-68/SEC4]

50

pereduksi. Berdasarkan prosedur uji aktivitas metode DNS proses pemanasan bertujuan

untuk mengaktivasi reaksi reduksi oksidasi antara gula pereduksi yang terbentuk setelah

reaksi enzimatik dengan DNS sehingga gugus aldehid bebas pada gula pereduksi akan

teroksidasi menjadi gugus karboksilat. Hasil reaksi reduksi oksidasi di atas akan

mengubah DNS yang semula berwarna kuning menjadi berwarna coklat, sehingga

semakin banyak gula pereduksi yang dihasilkan pada reaksi enzimatik, maka warna

larutan setelah pemanasan juga akan semakin coklat pekat. Setelah itu diukur serapannya

pada panjang gelombang 500 nm yang merupakan panjang gelombang optimum untuk

senyawa DNS yang telah tereduksi menjadi berwarna coklat (Gambar 5.15).

Gambar 5.15 Hasil reaksi penentuan aktivitas dengan metoda DNS, (1) [ALPI-78/SEC4],

(2) [ALPI-68/SEC4]

Gambar 5.16 merupakan kurva hasil uji aktivitas α-amilase P. pastoris [ALPI-

78/SEC4] dan P. pastoris [ALPI-68/SEC4] dengan pembanding P. pastoris [ALPI-78]

dan P. pastoris [ALPI-68] dengan metode DNS. Berdasarkan gambar 5.16 dapat

disimpulkan bahwa aktivitas α-amilase S. filbuligera R64 pada P. pastoris [ALPI-

68/SEC4] dan P. pastoris [ALPI-78/SEC4] meningkat dua kali lipat bila dibandingkan

dengan hasil ekspresi pada P. pastoris [ALP1-78] dan P. pastoris [ALP1-68]. Aktivitas

tertinggi diperoleh pada jam ke 72 yaitu sebesar 522,1022 U/mL untuk [ALP1-68/SEC4]

dan 543,7005 U/mL untuk [ALP1-78/SEC4].

1 2

51

Gambar 5.16 Hasil uji aktivitas amylase dengan metode DNS dari P. pastoris [ALPI

78/SEC4] dan P. pastoris [ALPI-68/SEC4] dengan pembanding P.

pastoris [ALPI-78] dan P. pastoris [ALPI-68]

Aktivitas tinggi seiiring dengan tingginya densitas sel selama masa induksi

(Gambar 5.15). Pengukuran pada panjang gelombang 600 nm (OD600) menunjukkan

bahwa densitas sel P. pastoris [ALP1-SEC4] ketika dipanen dari media BMGY berada

pada kisaran nilai 10-23. Nilai OD600 10 merupakan nilai densitas optik yang sangat

tinggi bagi sejumlah mikroorganisme, namun hal ini tidak berlaku bagi P. pastoris.

P. pastoris mampu untuk hidup pada densitas sel yang lebih tinggi lagi (Inan & Meagher,

2001).

Hasil ko-ekspresi protein Sec4 terhadap ekspresi α-amilase S. fibuligera oleh

P. pastoris sesuai dengan hasil yang diperoleh penelitian-penelitian lain yang juga

meneliti pengaruh ko-ekspresi protein Sec4 terhadap ekspresi protein rekombinan.

Penelitian yang dilakukan Shi-Hwei dan koleganya (2004) menunjukkan bahwa

overekspresi protein Sec4 dapat menghasilkan peningkatan produksi protein

glukoamilase pada Rhizopus Oryzae. Dalam studi yang dilakukan oleh Shi-Hwei dan

koleganya ini, dilaporkan peningkatan produksi glukoamilase hingga dua kali lipat

dengan melakukan manipulasi genetik yang melibatkan overekspresi SEC4.

5.9 Kadar Protein

Kadar protein ditentukan dengan metoda Lawry. Larutan standar protein BSA

(Bovine Serum Albumin) dibuat dalam bufer fosfat 20 mM dengan konsentrasi (25, 50, 75,

0 50

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600

0 24 48 72 96 120 144

Akt

ivit

as (

U/m

l )

Waktu ( Jam)

[ALPI-68/SEC4]

[ALPI-68]

52

100, 125, 150, 200, dan 300) μg/mL. Metoda Lowry dapat mengukur kandungan protein

sampel yang rendah. Uji Lowry menggunakan reaksi Biuret dimana Cu2+

(dalam suasana

basa) yang terdapat pada pereaksi C bereaksi dengan ikatan peptida pada protein

menghasilkan warna biru. Vorteks dilakukan agar larutan tercampur sempurna sehingga

larutan yang ada didalamnya dapat bereaksi dengan baik. Kemudian ditambah dengan

pereaksi D (larutan fosfomolibdat-fosfowolframat) dikocok dan didiamkan selama 30

menit. Larutan fosfomolibdat-fosfowolframat yang merupakan kompleks campuran

garam anorganik ini (pereaksi D) akan bereaksi dengan residu tirosin dan triptopan pada

protein menghasilkan warna biru-hijau. Karena kandungan kedua macam asam amino

tersebut bervariasi pada berbagai macam protein, maka intensitas warna yang

ditimbulkan per miligram proteinpun berbeda (Sudarmadji, 1984). Kemudian diukur

serapannya pada λ750 nm karena panjang gelombang tersebut adalah panjang gelombang

maksimum untuk BSA sebagai larutan standar protein. Hasil penelitian menunjukkan

bahwa kadar protein terbesar diperoleh pada jam ke-72 dimana kadar protein [ALP1-

78/SEC4] sebesar 13,63 mg/mL dan kadar protein [ALP1-78] sebesar 12,72 mg/mL

sedangkan kadar protein [ALP1-68/SEC4] sebesar 14,54 mg/mL dan kadar protein

[ALP1-68] sebesar 13,63 mg/mL . Adanya ko-ekspresi protein Sec4 berpengaruh

terhadap besarnya kadar protein.

Tabel 5.1 bberikut ini memperlihatkan perbandingan hasil ekspresi α-amilase S.

fibuligera R64 pada P. pastoris [ALPI-68] dan P. pastoris [ALPI-78 ] dengan ko-ekspresi

protein Sec4 atau tanpa ko-ekspresi. Hasil yang diperbandingkan meliputi OD600 pada

saat induksi, aktivitas, kadar protein dan aktivitas spesifik.

Tabel 5.1 Pengaruh ko-ekspresi protein Sec4 terhadap level ekspresi -amilase oleh

P. pastoris [ALPI-78/SEC4] dan P. pastoris [ALPI-68/SEC4]

Pic

hia

past

ori

s

Wak

tu I

nd

uk

si

Op

tim

um

(Jam

)

Tin

gk

at

Per

tum

bu

han

Sel

(O

D6

00)

Kad

ar

Pro

tein

(mg/m

L)

Ak

tivit

as

(U/m

L)

Ak

tivit

as

Sp

esif

ik (

U/m

g)

[ALP1-68] 72 20,55 13,63 321,36 23,57 [ALP1-68/SEC4] 72 22,95 14,54 485,47 33,38

[ALP1-78] 72 19,38 12,72 315,46 24,80 [ALP1-78/SEC4] 72 24,15 13,63 503,18 36,91

53

Level sekresi merupakan jumlah atau banyaknya α-amilase yang disekresikan

keluar sel. Untuk mengetahui peningkatan level sekresi, maka seharusnya ditentukan

aktifitas dan kadar protein secara intraselular dan ekstraselular. Dalam peneltian ini

hanya dilakukan pengukuran aktivitas enzim α-amilase dan kadar protein secara

ekstraselular (pada supernatan). Shi wei et al., pada tahun 2004 juga melakukan hal yang

sama.

Pada Tabel 5.1 terdapat aktivitas spesifik. Aktivitas spesifik adalah banyaknya

aktivitas enzim dalam setiap miligram protein. Aktivitas spesifik merupakan salah satu

parameter yang menunjukkan kualitas enzim.

Perhitungan aktivitas spesifik:

Aktivitas spesifik (U/mg) = Aktivitas (U/mL)

Kadar Protein (mg/mL)

Berdasarkan data yang diperoleh, aktivitas spesifik yang diperoleh tidak terlalu

besar, hal ini berarti kualitas enzim α-amilase yang disekresikan tidak terlalu bagus. Hal

ini didukung juga kadar protein yang dihasilkan cukup besar. Aktifitas spesifik P.

pastoris [ALPI-68/SEC4] pada penelitian ini sebesar 485,47 U/mL, sedangkan kadar

protein yang diekspresikan sebesar 14,54 mg/mL dan aktifitas spesifik P. pastoris

[ALPI-78/SEC4] sebesar 503,18 U/mL, sedangkan kadar protein diekspresikan sebesar

13,63 mg/mL. Menurut teori, P. pastoris merupakan ragi yang mampu memproduksi

protein heterolog dengan tingkat ekspresi yang tinggi (Cereghino & Cregg, 2000) dan

mensekresikan sangat sedikit proteinnya sendiri (Glick & Pasternak, 2003). Namun,

pada peneltian ini kadar protein yang dihasilkan cukup besar. Hal ini berarti terdapat

protein lain yang disekresikan oleh P. pastoris selain α-amilase yang menyebapkan kadar

protein lebih besar.

Dengan adanya ko-ekspresi protein Sec4 dalam P. pastoris maka akan

meningkatkan jumlah SEC4 secara intraselular. Sec4p berperan sebagai transport vesikel

untuk menargetkan vesikel sekresi ke membran plasma pada proses pasca-Golgi dalam

sekresi protein pada ragi dan selanjutnya protein akan disekresikan ke luar sel.

Peningkatan level Sec4p dalam suatu inang ekspresi, akan meningkatkan jumlah protein

asing yang disekresikan.

54

BAB VII. KESIMPULAN DAN SARAN

7.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan :

1. Gen SEC4 Pichia pastoris berhasil diamplifikasi dengan metode PCR dari genom

P. pastoris dan disubkloning dengan vektor pJET1.2 dalam Escherichia coli.

2. Hasil penentuan urutan nukleotida menunjukkan bahwa urutan nukleotida gen

SEC4 hasil subkloning memiliki homologi 100% dengan urutan nukleotida gen

SEC4 nomor aksesi XM_002492307.1 (NCBI).

3. Gen SEC4 P. pastoris telah berhasil dikonstruksi dalam vektor ekspresi untuk

P. pastoris (pPIC3.5K-SEC4) dan dikloning dalam E. coli.

4. Transforman P. pastoris [ALP1-SEC4] telah berhasil diperoleh

5. Hasil analisis aktivitas a-amilase menunjukkan ko-ekspresi Sec4p meningkatkan

level sekresi a-amilase 2x lipat dibanding tanpa ko-ekspresi.

7. 2 Saran

1. Perlu dilakukan penentuan aktivitas -amilase intraselular untuk mengetahui level

-amilase intraselular.

2. Perlu dilakukan karakterisasi Sec4p intraselular P. pastoris untuk mengetahui

peningkatan konsentrasi Sec4p dalam P. pastoris.

55

DAFTAR PUSTAKA

Brennwald, P. 2000. Reversal of Fortune: Do Rab GTPases Act on the Target

Membrane? The Journal of Cell Biology. 149(1):1–3.

Campbell, N. A., Reece, J. B., & Mitchell, L. G. 2002. Biologi, Edisi Kelima, Jilid I.

Erlangga. Jakarta.

Chavrier, P., Vingron, M., Sander, C., Simons, K. & Zerial, M. 1990. Molecular Cloning

of YPT1/SEC4-Related cDNAs from an Epithelial Cell Line. Molecular And

Cellular Biology. 10(12): 6578-6585

Cregg, J. M. & Madden, K. R. 1988. Development of the metylotrophic yeast Pichia

pastoris, as a host system for the production of foreign protein. Dev. Ind.

Microbiol. 29:33-41.

Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y., & Madden, K. R. 1985. Pichia pastoris as

a host system for tansformation. Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385

Fermentas, 2010. Molecular Biology Catalog and Product Application Guide. Canada.

Gaffar, S. 2011. Pengaruh Kombinasi Manipulasi Genetik terhadap Tingkat Sekresi α-

amilase S. fibuligera R64 dalam Pichia pastoris. Disertasi Program Pasca Sarjana

Universitas padjadjaran. Bandung.

Gaffar, S. 2010a. Bioteknologi Molekul, Aplikasi dan Teori. Widya Padjadjaran.

Bandung.

Gaffar, S. 2010b. Produksi Protein Rekombinan dalam Sistem Ekspresi Pichia pastoris.

UNPAD PRESS.

Glick, B. R., & Pasternak , J. J. 2003. Molecular biotechnology, principles and

applications of recombinant DNA. ASM press. Washington DC.

Grosshans, B. L., Andreeva, A., Gangar, A., Niessen, S., Yates, J. R., Brennwald, P., &

Novick, P. J. 2006a. The yeast lgl family member Sro7p is an effector of the

secretory Rab GTPase Sec4p. The Journal of Cell Biology. 172(1):55–66.

Grosshans, B. L., Ortiz, D. & Novick, P. J. 2006b. Rabs and their effectors: Achieving

specificity in membrane traffic. PNAS. 103(32):11821–11827.

Grote, E., Carr, C. M. & Novick, P. J. 2000. Ordering the Final Events in Yeast

Exocytosis. The Journal of Cell Biology. 151(2):439–451.

Grote, E. & Novick, P. J. 1999. Promiscuity in Rab–SNARE Interactions. Molecular

Biology of the Cell. 10:4149–4161.

Guo, W., Roth, D., Walch-Solimena, C. & Novick, P. J. 1999. The exocyst is an effector

for Sec4p, targeting secretory vesicles to sites of exocytosis. The EMBO Journal.

18(4):1071–1080.

Invitrogen. 2004. A manual of methods for expresion of recombinant proteins in Pichia

Pastoris. California.

Koolman, J., & Roehm, K. H. 2005. Color Atlas of Biochemistry. Second Edition.

Thieme Stuttgart. New York.

Lipschutz, J. H. & Mostov, K. E. 2002. Exocytosis: The Many Masters of the Exocyst.

Current Biology. 12:R212–R214.

Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, Krieger, Scott, Zipursky, S. L. & Darnell, J.

2003. Molecular Cell Biology. Fifth edition. W.H.Freeman & Co Ltd.

Madigan, M. T., Martinko, J. M., & Brock, T. D. 2006. Brock Biology of

Microorganisms. 11th Ed. Pearson Prentice Hall. New Jersey.

Oliveira, D.L., Nakayasu, E. S., Joffe, L. S., Guimara˜es, A. J., & Sobreira, T. J. P. 2010.

Characterization of Yeast Extracellular Vesicles: Evidence for the Participation of

56

Different Pathways of Cellular Traffic in Vesicle Biogenesis. PLoS ONE 5(6):

e11113.

Orlando, K. & Guo, W. 2009. Membrane Organization and Dynamics in Cell Polarity.

Biol. 1:a001321.

Romanos, M. A. 1995. Advances in the use of Pichia pastoris for high-level gene

expression. Curr. Opin. Biotechnol. 6:527-533

Rothman, J. E. 1996. The protein machinery of vesicle budding and fusion. Protein

Science. 5:185-194.

Salminen, A. & Novick, P. J. 1989. The Sec15 Protein Responds to the Function of the

GTP Binding Protein, Sec4, to Control Vesicular Traffic in Yeast. The Journal of

Cell Biology. 109:1023-1036.

Shi-Hwei, L., Wei-I, C., Chia-Chin, S., & Chang, M. D. 2004. Improved secretory

production of glucoamylase in Pichia pastoris by combination of genetic

manipulations. Biochemical and Biophysical Research Communications.

326:817–824

Takai, Y., Sasaki, T., & Matozaki, T. 2001. Small GTP-Binding Proteins. Physiological

Reviews. 81:1.

Thomas, G. H. 2009. Intracellular Compartments-Exocytosis, Endocytosis, and the

Lysosome. https://wikispaces.psu.edu/display/230/Intracellular+Compartments-

Exocytosis,+Endocytosis, and+the+Lysosome#Intracellular

Compartments-Exocytosis%2CEndocytosis%2CandtheLysosome-Exocytosis

Walworth, N. C., Goud, B., Alisa, K. K. & Novick, P. J. 1989. Mutational analysis of

SEC4 suggests a cyclical mechanism for the regulation of vesicular traffic. The

EMBO Journal. 8(6)1685 – 1693.

57

LAMPIRAN 1

INSTRUMEN PENELITIAN

No. Nama Alat Kegunaan

1. Thermocycler Polymerase Chain Reaction

2. Automatic DNA sequencer Sekuensing DNA

3. Sentrifugasi Pemisahan

4. Spektrofotometer Pengukuran konsentrasi DNA

5. Elektroforesis DNA Karakterisasi DNA

6. SDS-PAGE Karakterisasi protein

7. Autoklaf Sterilisasi

8. shaker inkubator Pertumbuhan kultur

9. Vacuum concentrator Pemekatan DNA

10. Water Bath Inkubasi

11. Oven inkubator Pertumbuhan kultur

58

LAMPIRAN 2

EVALUASI CAPAIAN LUARAN KEGIATAN

Ketua : Shabarni Gaffar

Perguruan Tinggi : Universitas Padjadjaran

Judul : Pengaruh Ko-ekspresi Sec4p Pichia pastoris

Terhadap Tingkat Sekresi -Amilase

Saccharomycopsis fibuligera oleh Pichia pastoris

rekombinan

Waktu kegiatan : Tahun ke 1 dari rencana 2 tahun

Luaran yang direncanakan dan capaian tertulis dalam proposal awal

Artikel jurnal ke-1 Nama Jurnal

Terakreditasi

Nama jurnal

bereputasi

Internasional

Nama jurnal yang dituju impact

factor untuk jurnal, judul artikel Jurnal Natur Indonesia

Status naskah

- Draft artikel

- Sudah dikirim ke jurnal

- Sedang ditelaah

- Sedang direvisi

- Revisi sudah dikirim ulang

- Sudah diterima

- Sudah terbit

V Ekspresi protein faktor sekresi, Sec4p, dalam

Pichia pastoris dan

pengaruhnya terhadap tingkat produksi protein

rekombinan oleh Pichia

pastoris.

1. Seminar Shabarni Gaffar, Siti N. Inayah dan Yeni W. Hartati,

Konstruksi vektor ekspresi rekombinan yang

mengandung protein faktor sekresi Pichia pastoris dan kloning dalam Escherichia coli. Seminar Nasional

Unpak-Unpad, Bogor, 28 Juni 2013. Proceeding sudah

terbit ISBN 978-602-14503-1-4

2. HKI -

3. TGG -

4. Rekayasa social -

5. Pembelajaran/pemberdayaan

masyarakat

-

6. Buku Ajar

7. Lainnya -

JIKA LUARAN YANG DIRENCANAKAN TIDAK TERCAPAI, URAIKAN

ALASANNYA:


Ketua Peneliti

Dr. Shabarni Gaffar, M.Si

59

LAMPIRAN 3

SERTIFIKAT SEMINAR NASIONAL

Hasil penelitian ini telah di seminarkan pasa seminar Nasional, dan proceedingnya sudah

terbit.

60

LAMPIRAN 4

ABSTRAK SEMINAR NASIONAL

61

LAMPIRAN 5

Penentuan Serapan Standar Glukosa

Tabel L1. Penentuan serapan standar glukosa dengan metoda DNS

Konsentrasi glukosa (mM) Absorbansi

1 0,066

1,5 0,141

2 0,178

2,5 0,288

3 0,334

3,5 0,392

4 0,478

4,5 0,572

5 0,612

5,5 0,696

6 0,748

6,5 0,825

Gambar L.1 Kurva standar glukosa. 50 μL glukosa dengan berbagai konsentrasi

ditambah 50 μL reagen DNS, dididihkan selama 10 menit, setelah dingin

volume dicukupkan menjadi 1 mL dengan penambahan ddH2O.

Absorbansi diukur pada panjang gelombang 500 nm.

y = 0,1389x - 0,0766 R² = 0,9971

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 1 2 3 4 5 6 7

Ab

sorb

ansi

Konsentrasi Glukosa (mM)

62

LAMPIRAN 6

Penentuan Aktivitas -amilase dengan Metoda DNS

Tabel L.2 Aktivitas P. pastoris [ALP1-68/SEC4]

Tabel L.3 Aktivitas P. pastoris [ALP1-68]

Tabel L.4 Aktivitas P. pastoris [ALP1-78]

Tabel L.5 Aktivitas P. pastoris setelah transformasi [ALP1-78/SEC4]

Jam ke- A500 [Glukosa] Aktivitas

(U/mL)

OD600

0 0,06 0,983441 196,6883 13,05

24 0,142 1,573794 314,7588 19,25

48 0,241 2,286537 457,3074 21,75

72 0,286 2,610511 522,1022 22,95

96 0,207 2,041757 408,3513 19,85

120 0,201 1,99856 399,712 18,41

144 0,191 1,926566 385,3132 18,05

Jam ke- A500 [Glukosa] Aktivitas (U/mL) OD600

0 0,018 0,681066 136,2131 11,35

24 0,052 0,925846 185,1692 13,35

48 0,123 1,437005 287,401 18,55

72 0,147 1,609791 321,9582 20,55

96 0,118 1,401008 280,2016 18,15

120 0,085 1,163427 232,6854 15,65

144 0,063 1,00504 201,0079 13,37

Jam ke- A500 [Glukosa] Aktivitas OD600

0 0,028 0,75306 150,612 10,15

24 0,047 0,889849 177,9698 13,1

48 0,119 1,408207 281,6415 16,87

72 0,142 1,573794 314,7588 19,38

96 0,081 1,134629 226,9258 16,15

120 0,061 0,990641 198,1281 15,35

144 0,057 0,961843 192,3686 14,06

Jam ke- A500 [Glukosa] Aktivitas OD600

0 0,06 0,983441 196,6883 14,05

24 0,114 1,37221 274,442 16,05

48 0,208 2,048956 409,7912 20,9

72 0,301 2,718503 543,7005 24,15

96 0,276 2,538517 507,7034 22,7

120 0,192 1,933765 386,7531 20,1

144 0,133 1,508999 301,7999 17,25

63

Contoh Perhitungan Konsentrasi Glukosa

[glukosa] = Absorbansi + 0,0766

0,1389

= 0,114 + 0,0766

0,1389

= 1,37221 mmol

Perhitungan aktivitas α-amilase:

Aktivitas = [glukosa] x 1000 µL x Fp

10 menit Venzim

dengan : [glukosa] = konsentrasi glukosa hasil pemotongan enzim sampel yang

didapatkan dari plot serapan sampel ke dalam kurva baku

glukosa (µmol)

V enzim = volume enzim yang digunakan dalam reaksi enzimatik (mL)

FP = faktor pengenceran

Contoh perhitungan :

Aktivitas (U/mL) = [glukosa] x 1000 µL x Fp

10 menit Venzim

= 1,37221 x 1000μL x 100

10 menit 50μL

= 274,442 U/mL

64

LAMPIRAN 7

PENENTUAN KADAR PROTEIN

Pembuatan kurva baku

Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode Lowry dimana 0,1 mL sampel

ditambah 2,5 mL reagen Cu-Alkalis*. Kemudian divorteks dan dibiarkan selama 10

menit. Setelah 10 menit, campuran reaksi ditambah 0,25 mL reagen Follin-Ciocalteu,

dikocok, didiamkan 30 menit. Absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada 750

nm.

Dimana,

Reagen A: 2% Na2CO3 dalam 0,1 N NaOH

Reagen B: 0,5% CuSO4. 5H2O dalam 1% K-Na-Tartrat (garam Rocelle)

*Cu-Alkalis : Campuran Reagen A : Reagen B (50 : 1)

Tabel L.6 Kurva Standar Protein

BSA

(g/mL)

Absorbansi

(750)

0 0,000

25 0,039

50 0,073

75 0,110

100 0,136

125 0,171

150 0,192

200 0,233

300 0,326

65

Gambar L.2 Kurva Baku BSA

Contoh Perhitungan Kadar Protein

Dengan menggunakan metode regresi linear diperoleh persamaan garis :

Y = 0,0011X + 0,02

Dimana Y : serapan sampel

X : kadar protein (mg/mL)

Kadar protein(mg/mL) = absorbansi - 0,02

0,0011

= 0,031 – 0,02

0,0011

= 10,00 mg/mL

Uji Kadar protein sampel

Tabel L.7 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-68]

Absorbansi (l750) Kadar protein (mg/mL)

0,031 10,00

0,033 11,81

0,034 12,72

0,035 13,63

0,032 10,90

0,031 10,00

0,028 7,27

y = 0,0011x + 0,02 R² = 0,9843

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 50 100 150 200 250 300 350

Ab

sorb

ansi

(75

0)

Konsentrasi BSA (μg/mL)

66

Tabel L.8 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-68/SEC4]


0,028 7,27

0,031 10,00

0,034 12,72

0,036 14,54

0,033 11,81

0,032 10,90

0,03 9,09

Tabel L.9 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-78]


0,024 3,63

0,028 7,27

0,031 10,00

0,034 12,72

0,032 10,90

0,03 9,09

0,025 4,54

Tabel L.10 Kadar protein supernatan P. pastoris [ALP1-78/SEC4]


0,029 8,1818

0,031 10,00

0,032 10,90

0,035 13,63

0,033 11,81

0,03 9,09

0,028 7,27

67

LAMPIRAN 8

BIODATA KETUA DAN ANGGOTA PENELITI

KETUA PENELITI:

A. Identitas Diri

1. Nama Lengkap (dengan

gelar)

Dr. Shabarni Gaffar, M.Si (Perempuan)

2. Jabatan Fungsional Asisten Ahli

3. Jabatan Struktural -

4. NIP/NIK/ Identitaslain 19710425 200501 2 001

5. NIDN 00225047105

6. Tempat dan tanggal lahir Batang Buo, 25 April 1971

7. Alamat Rumah Komp. Anggrek Residence B12A, Jl Rumah

Sakit, Ujung Berung, Bandung.

8. Nomor Telepon/ Faks/ Hp 081573019025

9. Alamat Kantor Jl. Raya Bandung-Sumedang Km 21 Jatinangor,

45363

10. Nomor Telepon/ Faks 022-7794391/ 022-7794391

11. Alamat e-mail [email protected]

12. Lulusan yang telah

dihasilkan

S1 = 18 orang

S2 = 0

S3 = 0

13. Mata kuliah yang diampu 1. Biokimia I

2. Biokimia II

3. Bioteknologi

4. Teknik Penelitian Biokimia

5. Bioinformatika

B. Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan

Tinggi

Unand ITB Unpad

Bidang Ilmu Kimia Biokimia Biokimia

Tahun Masuk-Lulus 1990-1995 1996-1998 2006-2011

JudulSkripsi/Thesis/

Disertasi

Analisis parameter

pembentuk kerak

serta kualitas air untuk injeksi uap di

stasiun pengumpul

pusat I, III dan V, PT. Caltex Pacific

Indonesia,Duri.

Varian normal

fragmen 0,4 kB

daerah D-loop DNA mitokondria

manusia Indonesia

Pengaruh kombinasi

manipulasi genetik

terhadap tingkat sekresi -amilase S.

fibuligera R64 dalam

Pichia pastoris

Nama Pembimbing/

Promotor

Dr. Admin Alief Dr. Achmad

Saifuddin Noer

Prof. O. Suprijana

Prof. Soetijoso Soemitro

Dr. Dessy Natalia

Dr. Toto Subroto

68

C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian Pendanaan

Sumber Jumlah (Juta

Rp)

1. 2007 Peningkatan sekresi α-amilase melalui

manipulasi peptida sinyal dalam Pichia

pastoris

PHB Dikti

(ketua)

41,-

2. 2008 Produksi -amilase S. fibuligera dengan Peptida Sinyal Termodifikasi Dalam P.

pastoris

Reaserch Grant IMHERE

(ketua)

30,-

3. 2009 Penambahan faktor pelipatan protein

(PDI1) untuk meningkatkan sekresi α-

amilase dalam Pichia pastoris

PHB Dikti

Tahun 1

(ketua)

22,5,-

5. 2010 Koekspresi Protein Disulfida Isomerase

(PDI1) untuk meningkatkan sekresi α-


PHB Dikti

Tahun 2

(ketua)

35,-

6. 2011 Koekspresi Protein Disulfida Isomerase (PDI1) untuk meningkatkan sekresi α-


PHB Dikti Tahun 3

(ketua)

35,5,-

D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat Dalam 5 Tahun Terakhir

No. Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2008 Pembinaan kreativitas melalui peningkatan budaya

minat baca dalam sarana dan prasarana taman

bacaan kampung Rancakemit, kecamatan Solokan Jeruk, Kabupaten Bandung

LPPM

Unpad

5,-

E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No. Judul Artikel Ilmiah Volume/ Nomor/Tahun

Nama Jurnal

1 Phylogenetics analysis of marine and coastal species using 18S rRNA sequence

Volume 11, no.2, 2009

Bionatura

2 Deteksi urutan pendek DNA Salmonella Typhi

berdasarkan sinyal guanin target secara voltammetri

Volume 11,

no.3, 2009

Bionatura

3 Pengaruh konsentrasi penginduksi metanol serta sumber karbon sorbitol dan manitol terhadap

produksi -amilase Saccharomycopsis fibuligera R64 dalam Pichia pastoris.

Volume 5 No.3, 2012

Jurnal Kimia

Terapan

Indonesia

F. Pengalaman Penyampaian Makalah Secara Oral Pada Pertemuan / Seminar

Ilmiah Dalam 5 Tahun Terakhir

Nama Pertemuan Ilmiah / Seminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan

Tempat

1 International Seminat on Chemistry

Signal Peptide Modification of - November 2008, Kimia Unpad,

69

amylase Gene (ALPI) and

construction of pPICZA-MSALPI plasmid for improving secretory

production of a-amilase in Pichia

pastoris

Bandung

2 Seminar hasil penelitian unggulan Unpad

kelompok Ilmu Alam

Ekspresi dan sekresi -amilase Saccharomycopsis fibuligera R64 dalam Pichia pastoris rekombinan

menggunakan dua jenis peptida

sinyal

22 Oktober 2010, Unpad, Bandung

3 Seminar nasional Unpak-unpad

Konstruksi vektor ekspresi rekombinan yang mengandung

protein faktor sekresi Pichia pastoris

dan kloning dalam Escherichia coli

28 Juni 2013, Universitas

Pakuan, Bogor

G. Pengalaman Penulisan Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah Halaman

Penerbit

1 Produksi protein rekombinan dalam

sistem ekspresi P. pastoris (ISBN 978-602-8743-23-5)

2010 176 Unpad Press

2 Bioteknologi molekul, konsep dan

aplikasi. ISBN: 978-602-8323-46-8.

2010 93 Widya

Padjadjaran

H. Pengalaman Perolehan HKI Dalam 5 – 10 Tahun Terakhir

No. Judul/Tema HKI Tahun Jenis Nomor P/ID

1 Produksi protein rekombinan dalam sistem ekspresi

P. pastoris (ISBN 978-602-8743-23-5)

2013 Buku

2

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengna kenyataan, saya sanggup menerima risikonya.

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu

persyaratan dalam pengajuan Penelitian Hibah Bersaing.


Pengusul,

SHABARNI GAFFAR

70

Anggota Peneliti :

A. Identitas Diri

1. Nama Lengkap (dengan gelar) Dr. Yeni Wahyuni Hartati (Perempuan)

2. Jabatan Fungsional Lektor

3. Jabatan Struktural Koordinator dan Kepala Laboratorium Kimia

Dasar

4. NIP/NIK/ Identitaslain 19710924 199802 2 001

5. NIDN 0024097101

6. Tempat dan tanggal lahir Garut, 24 September 1971

7. Alamat Rumah Jl. Merkuri Utara No. 8, Margahayu Raya Bandung

8. Nomor Telepon/ Faks/ Hp 022-7561080/ - / 08122132349

9. Alamat Kantor Jl. Raya Bandung-Sumedang Km 21 Jatinangor,

45363

10 Nomor Telepon/ Faks 022-7794391/ 022-7794391

11. Alamat e-mail [email protected]

12. Lulusan yang telah dihasilkan S1 = 7 orang

S2 = 1 orang

S3 = -

13 Mata kuliah yang diampu 1. Kimia dasar 2. Analisis kimia

3. Teknik pengukuran Kimia

4. Kapita Selekta Kimia Analitik 5. Analisis Instrumentasi dan Biosensor

B. Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi

Universitas Padjadjaran

ITB Universitas Padjadjaran

Bidang Ilmu Kimia Biokimia Kimia Analisis

Tahun Masuk-Lulus 1990-1995 1996-1999 2005-2009

JudulSkripsi/Thesis/ Disertasi

Penentuan Rotenon dalam Biji Tephrosia

vogelii secara

Kromatografi Lapis Tipis -Densitometri

Studi Struktur Fungsi Gen Sup-45

Saccharomyces

cerevisiae Sensitif Paromomisin

Biosensor Voltammetri Untuk

Penentuan Urutan

Spesifik dan Mutasi Basa Tunggal pada

fragmen DNA

Nama Pembimbing/

Promotor

Prof. Dr. Ir.

Roekmiati Tjokronegoro

Prof. Dr.

Akhmaloka,

Dr. Muliawati

Sindumartha

Prof. Dr. Muljadji

Agma,

Prof. Dr. Siti

Rochani,

Prof. Dr. Husein

H. Bahti

mailto:[email protected]

71

C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian

Pendanaan

Sumber Jumlah (Juta

Rp)

1 2011 Pengembangan Biosensor DNA Tanpa

Indikator Eksternal untuk Deteksi Bakteri Patogen dalam Sampel Darah

(Tahun I)

Hibah

Bersaing (Ketua)

37.5

2 2009-2010 Pengembangan Biosensor DNA Tanpa

Indikator Eksternal untuk Deteksi

Mutasi Titik (Point Mutation) DNA Mitokondria pada Pasien Diabetes

Mellitus Tipe 2

Hibah

Bersaing

(Ketua)

50 +45

3 2008-2009 Studi Deteksi Urutan Spesifik DNA dan Mutasi Basa Tunggal pada Urutan DNA

secara Biosensor DNA Voltammetri

mengggunakan Elektrode Grafit

Hibah Penelitian

Doktor,

DIKTI

(Ketua)

32,5

4 2007 Isolasi dan karakterisasi gen pengode

fruktosil transferase dari bakteri asam

laktat susu fermentasi di Kabupaten Garut.

DIPA Unpad

(Ketua)

5

D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat Dalam 5 Tahun Terakhir

No. Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat

Pendanaan

Sumber Jml (Juta Rp)

1 2008 Sosialisasi Pembuatan Sabun Mandi Cair Dengan

Lendir Lidah Buaya (Aloe vera Linn)

BLU

Unpad

3,-

E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir

No. Judul Artikel Ilmiah Volume/

Nomor/Thn Nama Jurnal

1 Deteksi Urutan Pendek DNA Salmonella Typhi

Berdasarkan Sinyal Guanin Target Secara

Voltammetri

Vol 11 No 3,

November

2009

Bionatura, Unpad

F. Pengalaman Penyampaian Makalah Secara Oral Pada Pertemuan / Seminar

Ilmiah Dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan Ilmiah / Seminar Judul Artikel Ilmiah

Waktu dan

Tempat

1 Seminar Nasional XIII Jaringan Kerjasama

Kimia Indonesia,

Yogyakarta, 15 Juli 2010

Penentuan Kandungan Basa Guanin dan

Adenin dalam Urutan DNA secara Voltammetri Menggunakan Elektrode Grafit

Pensil

2010, Yogyakarta

72

2 International Seminar

on Chemistry, 2008

UNPAD

Electrochemical DNA hybridization sensors

for sequences recognition on graphite

electrodes

2008, Unpad

3 The second

International

Conference on Mathematics and

Natural Sciences

2008, ITB

Electrochemical DNA Biosensor for the Detection of Short DNA Sequences Related

to the Salmonella typhi

2008, ITB

4 1st

Regional

Conference on

Biosensor and

Biodiagnostics 2008, Kuala Lumpur,

Malaysia

Single Base Mismatch Detection on the

mtDNA A3243G Mutattion Using DNA Biosensor Based on Meldola’s Blue as the

Hybridization Indicator

2008, Kuala

Lumpur

5 Seminar Nasional

Himpunan Kimia

Indonesia SNHKI 2008

Deteksi Hibridisasi DNA Secara

Elektrokimia Pada Elektrode Pensil Grafit

Dengan Interkalator Redoks-aktif Meldola’s Blue

2008, Denpasar

7 Seminar Nasional

Himpunan Kimia

Indonesia SNHKI 2007

Biosensor Elektrokimia untuk Deteksi

Urutan DNA Tanpa Indikator Hibridisasi

2007, Jakarta

G. Pengalaman Penulisan Buku dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Buku Tahun Jumlah

Halaman Penerbit

1 Biosensor Elektrokimia Untuk Deteksi

Urutan Spesifik DNA

ISBN 978-979-3985-84-8

2010 158 Unpad Press

H. Pengalaman Perolehan HKI Dalam 5 -– 10 Tahun Terakhir

No. Judul/Tema HKI Tahun Jenis Nomor

P/ID 1

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan

dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata

dijumpai ketidaksesuaian dengna kenyataan, saya sanggup menerima risikonya.

Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu

persyaratan dalam pengajuan Penelitian Hibah Bersaing.


Pengusul,

YENI WAHYUNI HARTATI

laporan kemajuan penelitian -...

Documents