LAPORAN KEMAJUAN 70 %

PENELITIAN HIBAH DISERTASI DOKTOR

Ir. Eri Samah, MP

NIDN. 0028085920

Produksi Kompos Dari Sampah Kota Melalui Penggunaan

Bakteri Selulolitik Adaptif Dari Tanah Masam dan Evaluasi

Aktifitas Enzim Selulase

Penelitian ini Didanai oleh DIPA Direktorat Jendral Pendidikan Tnggi Tahun

Ajaran 2015 No: 023.04.1.673453/2015, tertanggal 14 November 2015, Sesuai

dengan surat perjanjian (kontrak) Pelaksanaan Hibah Penelitian Doktor :

005/K1.1.1/AT.1/2015, tanggal 10 Maret 2015

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS PEMBINAAN MASYARAKAT

INDONESIA (UPMI) MEDAN

30 JUNI 2015

Kode / Nama Rumpun Ilmu

168 / Bioteknologi Pertanian dan Perkebunan

1

RINGKASAN

Sampah merupakan suatu momok yang tidak putus-putusnya, pada hal jika dikelola

dengan baik akan menjadi bahan yang sangat berguna salah satunya menjadi kompos

berkualitas. Tujuan penelitian ini adalah : 1). Mengisolasi isolat jenis selulolitik dari tanah

masam dan bahan organik yang mampu medegredasi bahan organik 2). Mendapatkan enzim

selulase dari bakteri selulolitik yang berkemampuan mendegradasi sampah oragnik yang

mengandung selulosa. Penelitian ini dilakukan dilaboratorium Bioteknologi, Hama Penyakit,

dan Rumah kaca, Fakultas Pertanian UNAND, dilakukan Maret 2014 sampai Desember

2041. Metode penelitian isolasi bakteri dari tanah masam dikultur pada media padat CMCase

dengan komposisi 2.5% Bacto Agar, 0.6% Pepton, 0.3% Pancreatic digest of Casein, 0.3%

Yeast extract, 0.3% Beef extract dan 0.001% Mg SO4, 2,5% cmc, 7 H2O, diautoklaf selama

24 jam pada suhu 370C . Setelah didapat isolat bakteri selulolitik dilanjutkan dengan isolasi

dan karakterisasi secara molekular. Pada tahun kedua keseluruhan isolat yang

memperlihatkan potensi akifitas silolitik yang tinggi dari masing-masing sampel akan

dikarakterisasi, baik secara morfologi, fisiologi maupun molekuler secara kualitatif sekuensing

dengan menggunakan sekuen gen 16S-rRNAdan secara kualitatif dengan PCR.

Key word : Isolasi, Bakteri selulolitik, Degradasi, component organik, Molekular

I. PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang

Sampah kota merupakan suatu masalah yang paling besar di Indonesia terutama

dikota-kota besar seperti Jakarta yang dapat menimbulkan banjir. Pada hal kalau dikelola

secara mantap sampah bukanlah masalah tapi suatu omset yang besar karena dapat

menghasikan pupuk yang berkualitas pengganti pupuk anorganik yang harga semakin tinggi.

Untuk mendapatkan pupuk yang berkualitas dengan memanfaatkan sampah kota sebagai

pengurainya bakteri selulolitik yang mampu mendegradasi serat-serat kasar menjadi pupuk

kompos yang berkualitas.

2

Sampah masih menjadi masalah di hampir semua kota di Indonesia. Mulai dari kota

kecil sampai kota metrolitan sekalipun. Berbagai alternatif penyelesaian sampah telah

diusahakan oleh berbagai pihak, tetapi tampaknya belum memberikan hasil yang

memuaskan. Oleh karena keprihatinan inilah, maka diteerapkan suatu teknologi terapan yang

diaplikasi dari berbagai teknologi canggih berbagai negara agar mendapatkan suatu teknik

pengolahan sampah yang benar‐benar sempurna dan bermanfaat guna. Teknologi ini

diutamakan untuk mengatasi masalah yang ditimbulkan oleh sampah harus meningkatkan

pengelolaan dan pemanfaatan nya menjadi kompos. Untuk merobah sampah menjadi kompos

bisa dilakukan dengan pendegrasian sampah serat menggunakan mikroorganisme salah

satunya bakteri pencerna selulosa (bakteri selulolitik).

Kemajuan teknologi dan penerapan aplikasinya secara tepat dan sederhana telah

berhasil dirancang dan diciptakan. Jadi sampah bukanlah menjadi momok bagi kita semua,

tetapi kita telah dapat melihat nya dari sisi pandang yang lain yaitu sampah merupakan

sumber tenaga baru dan mempunyai nilai ekonomis yang sangat tinggi. Dengan berbagai

produk yang dapat dihasilkan, maka berbagai alternatif pengolahan sebelumnya (seperti

pembuatan kompos saja, pembakaran, penimbunan) tentunya dapat dipertimbangkan

kembali.

Dengan mendapatkan bakteri selulolitik yang berpotensi mendegradasi serat kasar

diharapkan dapat menyelesaikan problem sampah yang merupakan pencemaran lengkungan

yang besar berubah menjadi sumber pupuk kompos yang berkualitas dan berwawasan ramah

lingkungan sebagai pengganti pupuk anorganik yang harganya semakin tinggi dan sering

langka dipasaran.

Kompos merupakan pupuk yang berasal dari limbah organik seperti sampah organik,

jerami, sekam, daun-daunan, rumput-rumputan, yang terjadi karena perlakuan manusia

dilakukan berupa penciptaan lingkungan mikro yang dikondisikan untuk pertumbuhan

mikroorganisme.

Kompos dianggap sangat perlu karena kebutuhan pupuk yang yang semakin

meningkat, ketiaadaan pupuk anorganik dipasaran sedangkan sumber pupuk melimpah ruah

seperti sampah. Berdasarkan keterangan diatas bakteri perombak celulosa atau silulolitik

untuk mendegredasi sampah belum dilakukan orang oleh sebab itu penulis akan mencoba

3

melakukan penelitian yang berjudul “ Produksi Kompos Dari Sampah Kota Melalui

Penggunaan Bakteri Selulolitik Unggul Pendegradasi dan Evaluasi aktifitas Enzim

Selulase ”.

1.2. Tujuan khusus

1. Untuk mendapatkan isolat bakteri selulolitik unggul pendegradasi dari tanah ultisol,

tanah gambut dan tanah sampah.

2. Mengetahui karakter morfologi, fisiologi, dan biokimia dari sejumlah isolat

bakteri selulolitik unggul pendegradasi

3. Mengidentifikasi secara molekuler bakteri seluloltik unggul perombak selulosa dari

tanah masam

4. Mendapatkan kompos dari sampah organik, tandan kosong sawit, dan ampas tebu

(bagasse)

1.3. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian diharapkan dapat bermanfaat untuk menyusun paket bioteknologi

dengan memanfaatkan mikroorganisme khususnya bakteri selulolitik unggul sebagai

pendegradasi sampah organik

1.3.Urgensi Penelitian

1. Menghasilkan teknologi pembuatan kompos melalui aplikasi bakteri-bakteri selulolitik

yang diambil dari tanah masam yang aktifitas pencerna selulosanya tinggi. Dengan

menghasilkan kompos berkualitas akan mengurangi penggunaan pupuk buatan pada

tanaman. Kompos juga mengurangi kerusakan lingkungan dan juga merupakan salah satu

teknik pertanian berkelanjutan. yang dapat menjawab masalah yang ditimbulkan kekurangan

pupuk oleh petani dan menjadikan pertanian organik.

2. Untuk mendapatkan formulasi yang cocok dalam mengaplikasikan Bakteri seluloliltik

pendegradasi yang unggul pada kompos perkotaan, dan limbah organik. Dengan pembuatan

formulasi bakteri selulolitik pendegradasi dari limbah organik juga dapat mendapat unsure

hara yang terkandung dalam limbah tersebut.

3. Untuk mendapatkan kompos berkualitas. Kompos berkualitas adalah yang benyak

mengandung unsur hara makro dan mikro seperti Nitrogen, Phosfor, Kalium, Magnesium,

sulfur. Kandungan unsur hara kompos tidak setinggi kandungan unsur pupuk anorganik, akan

4

tetapi manfaat pupuk organik lebih banyak seperti disamping penambahan unsur hara juga

memperbaiki sifat fisik dan kimia tanah.

1.4. Luaran yang diharapkan

a. disertasi (draf disertasi) yang telah disetujui pembimbing; dan

b. publikasi ilmiah dalam jurnal bereputasi internasional.

c. teknologi tepat guna.

d. buku ajar.

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Sampah dan Masalahnya

Sampah adalah bahan terbuang atau dibuang yang telah berkurang nilai ekonomisnya yang

berasal dari kegiatan rumah tangga, perdagangan, industri dan kegiatan pertanian. Sampah

yang berasal dari rumah tangga atau tempat perdagangan biasa dikenal dengan sampah

municipal yang tidak berbahaya. Sampah bervariasi dan berasal dari berbagai sumber.

Sampah organik (biasa disebut sebagai sampah basah) dan sampah anorganik (sampah

kering). Sampah basah atau organik adalah sampah yang berasal dari makhluk hidup, seperti

daun-daunan, sampah dapur, dan lain-lain. Sampah jenis ini biasanya dihasilkan dari

pepohonan yang terdapat di lingkungan kampus dan juga kantin-kantin fakultas serta warung

makan yang berada di sekitarnya. Sampah ini dapat membusuk dan terurai secara alami serta

dapat diolah lebih lanjut menjadi kompos. Sampah kering atau anorganik, yaitu sampah yang

tidak mudah membusuk, seperti plastik wadah pembungkus makanan, kertas, plastik mainan,

botol dan gelas minuman, kaleng, kayu, dan sebagainya. Sampah ini dapat dijadikan sampah

komersil atau sampah yang laku dijual untuk dijadikan produk lainnya. Beberapa sampah

anorganik yang dapat dijual adalah plastik wadah pembungkus makanan, botol dan gelas

bekas minuman, kaleng, kaca, dan kertas, baik kertas koran, HVS, maupun karton. Sampah

bahan berbahaya beracun (B3) merupakan hasil dari laboratorium, pelayanan kesehatan,dan

industri.(Agustin., 2008)

2.2. Bakteri perombak selulosa

Molekul selulosa merupakan polimer lineir yang dibangun unit-unit D-glukosa

dengan ikatan β-1,4 glikosida dengan rumus mulekul (C6H10O5)n dan struktur kimianya

5

dapat dilihat pada Gambar 1 (Bequin and Aubert, 1994). Molekul selulosa merupakan rantay

yang terdiri dari D-glukosa. Jumlah unit glukosa setiap molekul selulosa berkisar 300 –

15.000 unit, terdapat berbagai berkas-berkas melilit merip tali yang terikat satu sama lainnya

dengan ikatan Hidrogen. Rantai molekul selulosa tersusun sejajar dan dipengaruhi oleh

adanya ikatan hidrogen antara gugus hidroksil. Dengan adanya ikatan hidrogen antar gugus

hidroksil maka terjadilah orientasi memanjang. Apabila susunannya teratur, terbentuk daerah

kristalin dan apabila susunan kurang teratur terbentuk daerah amorf (Routh, 1977;Volk and

Wheeler, 1989).

Dengan mendapatkan bakteri selulolitik yang berpotensi mendegredasi serat kasar

diharapkan dapat meyelesai problem sampah yang merupakan pencemaran lingkungan yang

besr berubah menjadi sumber pupuk organik kompos yang berkualitas dan berwawasan

ramah lingkungan

Populasi mikroorganime pengurai didalam tanah terbagi atas empat kelompok besar

yaitu, jamur, actinomyces dan protozoa. Bakteri merupakan kelompok yang paling banyak

jumlahnya, serta mampu memanfaatkan bahan-bahan organik yang berbeda. Bakteri sebagai

pengurai bahan yang mengandung celulosa diantaranya Achromobacter, Angioscoccus,

Bacillus, Cellfalcicula, Cellulomonas dan Sporocytohaga; hemiselulosa: Achromobacter,

Bacillus, Pseudomonas, Sporocytohaga dan Vibrio serta protein dan kitin Bacillus,

Clostridium dan Pseudomonas (Alexander,1997).

Jusfah, Rangkuti dan Mucktar(1995), dan Yusuf (2000) menjelaskan bahwa

ditemukan 7 genus bakteri pengurai serasah yang terdapat dihutan Lembah Anai dan hutan

gambut Pesisir Selatan. Genus bakteri tersebut adalah Bacillus, Achromobacter,

Actinobacillus,

Streptococcus,Chromobacterium dan Pseudomonas yang aerob dan Clostridium yang

anaerob. Selanjutnya Yusuf (2000) melaporkan bahwa bakteri Bacillus ditemukan hampir

disemua lokasi dan merupakan jumlah terbanyak pada serasah hutan gambut Kab. Pesisir

Selatan dari 7 jenis bakteri yang ditemukan. Pada pembiakan dalam medium NA (Natrium

Agar) koloni bakteri Bacillus bewarna putih berkilat, bentuk bulat, oval sampai tidak

beraturan, permukaan koloni datar bergerigi dan tersebar dipermukaan medium. Pada uji

6

pewarnaan gram ditemukan bakteri tersebut gram positif dan sel berbentuk batang dengan

ukuran lebar 1-2 µ dan panjang 1 µ

Rismijanah, Indriani, Pitriyanti (2002), melaporkan penggunaan enzim selulase-

hemiselulase pada proses deinking kertas koran bekas dapat meningkatkan derajat putih

lembaran sekitar 10,2-17,5% dibandingkan blanko.

2.3.Molekul Selulosa Sebagai Komponen Serat Kasar Tanaman

Molekul selulosa merupakan polimer linier yang dibangun unit-unit D-glukosa dengan ikatan

-1.4 glikosida dengan rumus molekul (C6H10O5)n dan struktur kimianya dapat dilihat pada

Gambar 1 (Bequin dan Aubert, 1994; Gielkens, Dekkers, Visser, dan Graaff, 1999; Han, Yoo,

dan Kang, 1995). Molekul selulosa merupakan rantai yang terdiri dari D-glukosa. Jumlah

unit glukosa setiap molekul selulosa berkisar 300 – 15.000 unit, terdapat sebagai berkas-

berkas melilit mirip tali yang terikat satu sama lainnya dengan ikatan hidrogen. Rantai

molekul selulosa tersusun sejajar dan dipengaruhi oleh adanya ikatan hidrogen antara gugus

hidroksil. Dengan adanya ikatan hidrogen antar gugus hidroksil maka terjadi orientasi

memanjang. Apabila susunannya teratur, terbentuk daerah kristalin dan apabila susunannya

kurang teratur terbentuk daerah amorf (Routh, 1977; Volk dan Wheeler, 1989).

H OH

HOHO

O

H

H

O

(6) CH2OH

H(2)(1)O

OH

OH

H

H

H

CH2OH

H

O

H

H

OH

H

OH

CH2OH

H

O

H

O

H

CH2OH

O

OH

CH

H

H

HH

Gambar 1. Struktur kimia selulosa (Bequin dan Aubert, 1994)

Kandungan kristalin selulosa bisa berobah dari daerah asalnya dan oleh suatu perlakuan

(Hoshino, Kdana, Sasaki, dan Nisizawa, 1992). Selulosa yang terkandung dalam cotton

diperkirakan terdiri dari 70% kristalin dan kandungan ini bisa bervariasi pada cotton komersil

antara 30 - 70% (Fan, Lee, dan Beardmore, 1980; Wood, 1988).

Enzim selulase mendegradsi selulosa dengan memutus ikatan glikosida polimer linier unit-

unit D-glukosa. (Han et al., 1995). Bagian kristalin dari selulosa sukar dan tidak mudah

bereaksi dengan enzim endo-selulase tetapi daerah amorphous dengan mudah dihidrolisis

oleh enzim endo atau exo- selulase atau larutan asam (Sinitsyn, Gusakov, dan Yu Vlasenko,

7

1990). Molekul selulosa dapat mengikat air yang teradsorbsi pada gugus hidroksil yang

disebabkan oleh terbentuknya ikatan hidrogen.

2.4. Enzim Selulase

Enzim selulase termasuk enzim hidrolase yang dapat mengkatalisis reaksi hidrolisis

pemutusan ikatan -1.4 glikosida yang terdapat dalam molekul selulosa. Semua enzim

selulase yang diproduksi dalam kondisi aerob merupakan enzim ekstraseluler yang terbebas

dari sel-sel bakteri serta bekerja secara sinergis terhadap materi selulosa (Lynd, Weimer, Zyl,

dan Pretorius, 2002). Selulase merupakan nama umum atau trivialnya, sedangkan nama

sistematikanya adalah -1.4-glukan-4-glukanohidrolase. Enzim selulase sesungguhnya

merupakan komplek enzim yang terdiri dari 3 komponen utama yaitu endo--glucanase (EC

3.2.1.4), exo--glucanase atau selobiohidrolase (EC 3.2.1.91), dan -glucosidase atau

selobiase (EC 3.2.1.21), yang bekerja secara bertahap atau bersama-sama menguraikan

selulosa menjadi unit glukosa (Gerhartz, 1990; Wood dan Bhat, 1988). Reese, Siu dan

Levinson (1972) memperkirakan cara kerja masing-masing komponen enzim adalah 1)

Endo-β-glucanase, 1,4--D-glucan glucanohydrolase, CMCase, Cx: memutus secara random

rantai selulosa yang terdiri dari glukosa dan sello-oligo sakarida. 2). Exo-β-glucanase, 1,4-

-D-glucan cellobiohydrolase, Avicelase, C1: menyerang bagian luar selulosa pada ujumg

non reduksi dengan selobiosa sebagai struktur utama. 3). -glucosidase, cellobiase:

menghidrolisis selobiosa menjadi glukosa. Secara umum total aktivitas selulase merupakan

daya larut cotton, kertas saring atau Avicel oleh enzim endoglucanase, exoglucanase dan -

glucosidase, dan ketiga substrat ini tinggi kandungan selulosa kristalinnya sehingga sangat

baik untuk menentukan aktivitas selulase selulosa yang tinggi kandungan kristalinnya (Wood

dan Bhat, 1988). Untuk lebih jelasnya urutan kerja dari enzim-enzim ini dapat dilihat pada

Gambar 2.

Kerja sel bakteri dalam mendegradasi selulosa mempunyai pola yang cukup komplek

dimana dimulai dari pertumbuhan dan perbanyakkan sel sampai pertumbuhan sel berhenti

dan sel mengalami kematian (Hou, Li, Wu, Yan, Yan, dan Gao, 2004). Untuk lebih jelasnya

aktifitas dari sel-sel tersebut dapat dilihat Gambar 3. Pertumbuhan bakteri dimulai dengan

perbanyakan sel dan penempelan sel disepanjang benang-benang fibril selulosa (Gambar.

8

3A), beberapa tonjolan (0.1 - 0.2 μm) muncul dipermukaan sel yang berkontak langsung

dengan benang-benang fibril (Gambar.3B), terjadi degradasi selulosa yang menghasilkan

gula reduksi yang digunakan untuk perbanyakan sel sehingga terbentuk koloni sel (Gambar.

3C), degradasi terjadi pada sel yang berkontak langsung dengan benang-benang fibril,

sedangkan sel yang dekat dengan benang-benang fibril tetapi tidak saling bersentuhan,

benang-benang fibrilnya masih utuh (Gambar. 3D), dengan habisnya selulosa atau produk

selulolitik yang dapat didegradasi maka pertumbuhan sel berhenti dan sel mengalami

kematian (Gambar. 3E), tonjolan (0.1- 0.2μm) yang muncul pada permukaan sel-sel

Sorangium hanya ada pada saat sedang dalam pertumbuhan(Gambar. 3F)

Gambar 2. Skema rangkaian selulolisis (Reese et al.,1972).

Chundakkadu (1999) melaporkan bahwa aktivitas enzim yang dihasilkan Bacillus

subtilis strain-CBTK 106 pada medium kulit pisang yang telah dilengkapi dengan sumber C

dan N serta beberapa mineral selama 72 jam adalah carboxyl methyl cellulose (CMCase) 9.6

IU/gds, Filter Paperase (FPase) 2.8 IU/gds dan cellobiase 4.5 IU/gds.

CELLULASE ENZYMES Amorphous regions Crystalline regions

Endo-B-glucanase Cx CMCase

Exo-B-glucanase C1, Avicelase

Cx / C1

A.

B.

C.

D.

B-Glucosidase Glucose

9

Gambar 3. Pola kerja sel bakteri Sorangium dalam medegradasi selulosa (Hou et al.,

2004)

Penentuan aktivitas enzim selulase didasarkan pada kemampuan enzim selulase

menghidrolisis selulosa menjadi glukosa, dan glukosa yang terbentuk ditentukan dengan

metoda Somogy-Nelson (Somogy, 1952). Ringkasan reaksinya adalah sebagai berikut :

Selulosa selulase glukosa

Cu+2 + glukosa Cu2O + glukoloat

Cu2O + Na arsenomoblidat komplek warna biru

Seleksi bakteri Bacillus sp selulolitik secara kualitatif dilakukan dengan melihat kemampuan

bakteri mendegradasi selulosa pada medium CM-cellulose; hydroxyethylcellulose; cotton

dan amorphous cellulose (Wood, 1988). Seleksi berdasarkan nisbah zona bening terhadap

diameter koloni yang ditanam selama 48 jam pada medium CM-cellulose;

hydroxyethylcellulose; cotton dan amorphous cellulose (Coughlan, 1988). Untuk melihat

zona beningnya agar lebih jelas dilakukan penuangan 5 ml reagen congo red 0,1 %

dipermukaan medium selama 24 jam (Kluepfel, 1988).

10

2.5. Karakterisasi Molekuler

Isolasi DNA merupakan teknik yang pertama sekali diketahui sebelum melakukan tindakan

kegiatan molecular selanjutnya. Prinsip dasar isolasi DNA adalah uapaya untuk

membebaskan materi-materi genetik dari dinding sel dan ikatan protein-protein histon yang

pertama sekali terletak di dalam inti sel dengan mengupayakan tingkat keruakan baik

mekanis maupun fisik seminimal mungkin terhadap materi genetik tersebut (Jamsari, 2007).

Hal-hal penting yang harus diperhatikan dalam kegiatan isolasi DNA yaitu: 1).

Keutuhan ukuran molekul DNA, idealnya semakin besar molekul DNA yang dapat diisolasi

akan semakin baik, sebab akan mempermudah tindakan rekayasa genetik selanjutnya seperti

pemotongan secara enzimatis dalam pembuatan peta restriksi akan lebih memilki banyak

alternatif dubandingkan DNAyang sudah terputus-putus akibat kerusakan mekanis, fisis

maupun enzimatis yang terjadi selama proses isolas. 2). Efektifitas isolasi, setiap mikroba

mempunyai struktur dan komposisi kimia yang berbeda oleh sebab itu membutukan

pengembangan protokol yang lebih spesifik dalam proses isolasi DNA-nya. Oleh karena itu,

metode isolasi harus dilakukan secara empiris untuk menentukan besarnya konsentrasi

masing-masing senyawa kimia, serta mekanis lainnya yang diperlukan untuk dapat

menghasilkan efesiensi isolasi yang tinggi, sehingga konsentrasi molekul utuh yang dapat

diisolasi juga akan menjadi tinggi. 3).Kemurnian DNA hasil isolasi. Kemurniaan DNA

menjadi faktor yang sangat penting. Sering kali bahwa DNA yang diisolasi masih

mengandung senyawa-senyawa protein dalam jumlah tertentu, ataupun senyawa-senyawa

metabolik sekunder lainnya yang dapat menghambat efektifitas pencernaan secara enzimatis.

Oleh sebab itu tindakan pengontrolan kualitas DNA, dengan pemisahan secara

elektrophoresis segera setelah tahap isolasi dilakukan mutlak untuk dilaksanakan agar

kualitas DNA yang dihasilkan dapat diketahui sejak dini. 4). Praktis dan ekonomis. Metode

yang ideal adalah metode isolasi yang memilki prosedur langkah kerja yang sederhana, cepat

dan membuthkan biaya yang murah( Jamsari, 2007)

Isolasi DNA merupakan teknik yang pertama sekali diketahui sebelum melakukan tindakan

kegiatan molecular selanjutnya. Prinsip dasar isolasi DNA adalah uapaya untuk

11

membebaskan materi-materi genetik dari dinding sel dan ikatan protein-protein histon yang

pertama sekali terletak di dalam inti sel dengan mengupayakan tingkat keruakan baik

mekanis maupun fisik seminimal mungkin terhadap materi genetik tersebut (Jamsari, 2007).

Hal-hal penting yang harus diperhatikan dalam kegiatan isolasi DNA yaitu: 1).

Keutuhan ukuran molekul DNA, idealnya semakin besar molekul DNA yang dapat diisolasi

akan semakin baik, sebab akan mempermudah tindakan rekayasa genetik selanjutnya seperti

pemotongan secara enzimatis dalam pembuatan peta restriksi akan lebih memilki banyak

alternatif dubandingkan DNAyang sudah terputus-putus akibat kerusakan mekanis, fisis

maupun enzimatis yang terjadi selama proses isolas. 2). Efektifitas isolasi, setiap mikroba

mempunyai struktur dan komposisi kimia yang berbeda oleh sebab itu membutukan

pengembangan protokol yang lebih spesifik dalam proses isolasi DNA-nya. Oleh karena itu,

metode isolasi harus dilakukan secara empiris untuk menentukan besarnya konsentrasi

masing-masing senyawa kimia, serta mekanis lainnya yang diperlukan untuk dapat

menghasilkan efesiensi isolasi yang tinggi, sehingga konsentrasi molekul utuh yang dapat

diisolasi juga akan menjadi tinggi. 3).Kemurnian DNA hasil isolasi. Kemurniaan DNA

menjadi faktor yang sangat penting. Sering kali bahwa DNA yang diisolasi masih

mengandung senyawa-senyawa protein dalam jumlah tertentu, ataupun senyawa-senyawa

metabolik sekunder lainnya yang dapat menghambat efektifitas pencernaan secara enzimatis.

Oleh sebab itu tindakan pengontrolan kualitas DNA, dengan pemisahan secara

elektrophoresis segera setelah tahap isolasi dilakukan mutlak untuk dilaksanakan agar

kualitas DNA yang dihasilkan dapat diketahui sejak dini. 4). Praktis dan ekonomis. Metode

yang ideal adalah metode isolasi yang memilki prosedur langkah kerja yang sederhana, cepat

dan membuthkan biaya yang murah( Jamsari, 2007)

BAB III. METODE PENELITIAN

3.1. Isolasi, Seleksi dan Identifikasi bakteri Selulolitik.

Penelitian tahap pertama bertujuan untuk mendapatkan isolat murni bakteri pencerna selulosa

dengan cara isolasi seleksi, dan identifikasi, mikroba ultisol dekat kebun percobaan Unand

150 m dpl, Gambut Kataping dan Sampah organik Tempat Pembuangan Terakhir(TPA)

Lubuk Minturun Padang Sumatera Barat. Setelah isolat murni diperoleh, maka secara

12

bertahap isolat tersebut diperbanyak dengan menggunakan media khusus untuk pertumbuhan

Selulolitik.

3.1.1. Alat yang digunakan

Laminar air flow, tabung reaksi dengan tutup karet butyl, rak tabung. Pengaduk magnetik,

petri dish, lampu Bunsen, vorteks. hemositometer, hand counter, pH meter. Tabung

Erlenmeyer ukuran 50, 100, 250 dan 1000 mL Gelas ukur 25, 50, 100, 250, 500 dan 1000

ml, inkubator, oven, autoclaf, spectrometer, lemari es, spektrofotometer, fermentor

(inkubator), termometer, lampu pemanas, air pump (pompa udara), selang plastik, kapas dan

nampan plastik, aluminium foil

3.1.2. Bahan yang digunakan

Medium Blood Agar Merk Difco, terdiri dari : Beef herth infusion, Bacto, tryptose, Sodium

chlorida, Bacto agar. Nutrien Agar (NA) Merk Difco terdiri dari : Leb lemco powder, yeast

ekstrak, Pepton, Sodium chlorida, dan Bacto agar. Medium Selulolitik., terdiri dari : Beef

ekstrak, yeast ekstrak, Pepton digestic pancreatic of casein, Lactosa, dan MnSO4.4 H2O.

Pewarnaan Gram, terdiri dari : Ammonium oxalat, Crystal- violet, Lugol-iodin, Aceton,

Safranin. Pewarnaan spora, terdiri dari : Malachite green, dan Safranin. Bahan untuk uji

Biokimia, terdiri dari : Pati, kasein, gelatin, laktosa, sukrosa, glukosa, TSIA (Triple Sugar

Iron Agar), metil merah, Voge-Prokauer, Indol, Sitrat, Nitrat, NaCl, H2S. Urease, Katalase.

3.2. Metode Penelitian

Tahap pertama dilakukan isolasi dan seleksi mikroba dari ke 3 sampel. Tujuan isolasi adalah

untuk memperoleh bakteri selulolitik. Identifikasi lebih lanjut dilakukan terhadap spesies

dari bakteri terpilih yang dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Molecular Pertanian

Unand. Pengamatan untuk seleksi terhadap bakteri yang terpilih dari hasil isolasi meliputi

pemeriksaan mikroskopis dengan pewarnaan untuk menentukan sifat Gram, bentuk sel dan

letak spora. Uji biokimia dilakukan terhadap kelompok bakteri yang terpilih dari hasil seleksi

untuk membedakan spesies dalam satu genus yang sama. Kemudian dilihat kemampuan

bakteri Bacillus mendegradasi selulosa pada medium carboxyl methyl cellulose (CMC).

3.3. Cara Kerja Isolasi, Seleksi dan Identifikasi bakteri selulolitik

3.3.1. Isolasi dan Seleksi bakteri selulolitik

13

PEWARNAAN GRAM

TANAH SAMPEL

MEDIA NATRIUM AGAR

Sampel cuplikan tanah diambil pada kedalaman 0 - 5 cm dan diameter 5 cm dengan metode

Purposive Sampling dari tanah Ultisol, tanah gambut dan tanah sampah. Sebanyak 1 g dari

masing-masing sampel diencerkan sampai 10-5 CFU/g dengan NaCl fisiologis. Dari hasil

pengenceran diambil 1 ml kemudian ditumbuhkan pada medium padat Blood Agar selama

24 jam pada suhu 370C. Dilakukan isolasi dan reaksi pewarnaan terhadap beberapa macam

mikroba yang tumbuh, jika mikroba tersebut merupakan Gram positif, berbentuk batang dan

mempunyai spora maka bakteri tersebut di kategorikan sebagai bakteri yang mempunyai

famili yang sama (grup I) yaitu famili Bacillaceae (Prescott, 1993; Buchanan dan Gibbons,

1974). Dilakukan uji biokimia terhadap grup I terpilih untuk menentukan genus dari bakteri

tersebut apakah genus Bacillus, Clostridium dan lain-lainnya.

14

IDENTIFIKASI BAKTERI

SELULOLITIK

MEDIA SELEKTIF SELULOLITIK

(CARBOXYMETHYLCELULASE

UJI KIMIA

AGAR MIRING PETRI DISH

Gambar 4. Diagram alir isolasi dan seleksi bakteri

Selanjutnya genus terpilih ditumbuhkan pada medium padat CMC dengan komposisi

15 CMC 2.5% Bacto Agar, 0.6% Pepton, 0.3% Pancreatic digest of Casein, 0.3% Yeast

extract, 0.3% Beef extract dan 0.001% Mg SO4. 7 H2O selama 24 jam pada suhu 370C

(Cowan dan Stell’s, 1985). Koloni yang pertumbuhannya bagus dipilih untuk perbanyakan

biakan murni dengan menggesekkan dua ose stok koloni ke dalam agar miring dan petri yang

berisi medium NA (Cappucino 1987). Untuk lebih jelasnya urutan kerja isolasi dan seleksi

dapat dilihat pada Gambar 4. Dari hasil isolasi dan seleksi ini selanjutnya dilakukan

identifikasi spesies dengan melakukan uji primer secara makroskopis dan mikroskopis, dan

uji sekunder (biokimia) terhadap bakteri selulolitik.

3.2. Identifikasi bakteri Selulolitik

Identifikasi spesies lebih lanjut dilakukan uji primer secara makroskopis dan mikroskopis,

dan uji sekunder (biokimia) terhadap bakteri selulolitik. Secara makroskopis diamati warna,

bentuk, permukaan dan pinggir koloni. Secara mikroskopis dilihat reaksi pewarnaan Gram,

bentuk dan ukuran sel. Uji biokimia, meliputi uji hidrolisis pati, kasein, gelatin, fermentasi

gula (laktosa, sukrosa, glukosa), TSIA (Triple Sugar Iron Agar), metil merah, VP (Voge-

15

Prokauer), indol, H2S, urease, penggunaan sitrat, katalase, uji pergerakan dan uji toleransi

terhadap lingkungan dengan menumbuhkan isolat pada medium pH 4,0 dan 7,0 serta NaCl 5

dan 7,0 %. Reaksi-reaksi yang terjadi pada uji biokimia, hasilnya dicocokkan dengan kunci

identifikasi (Buchanan dan Gibbons 1974; Holt et al. 1994; Cappuccino dan Sherman 1987;

Atlas 1993).

Seleksi bakteri selulolitik dilakukan dengan melihat kemampuan bakteri

mendegradasi selulosa secara kualitatif pada medium CMC (Coughlan, 1988). Seleksi

berdasarkan nisbah zona bening terhadap diameter koloni yang ditanam selama 48 jam pada

medium CMC (Sigma). Untuk melihat zona beningnya agar lebih jelas dilakukan uji

kualitatif dengan penuangan 5 ml reagen congo red 0,1 % dipermukaan medium CMC selama

24 jam (Kluepfel, 1988). Semakin luas zona bening yang dihasilkan menunjukkan semakin

tinggi aktivitas selulase yang dihasilkan. Selanjutnya bakteri yang menghasilkan zona bening

yang paling luas dimurnikan untuk dilakukan identifikasi spesies dari bakteri tersebut.

3.4. Karakteristik Molekuler

3.4.1.Isolasi DNA

Isolat-isolat yang memperlihatkan kemampuan aktifitas mencernakan selulosa selanjutnya

dipilih berdasarkan kriteria laju kecepatan pertumbuhan, dan kapasitas selulolitik. Isolat-

isolat terpilih selanjutnya diproses untuk analisis DNA. Analisis DNA dilakukan dengan

menggunakan prosedur yang dapat diperoleh pada website:

http://lyco.lvcoming.edu/~newman . Sebanyak 6 ml kultur cair masing-masing isolat bakteri

disentrifugasi untuk mendapatkan pelletnya. Pellet yang diperoleh diresuspensi kembali

menggunakan 500 ul buffer TE (Tris-EDTA), dan divortex sampai homogen. Kemudian

ditambahkan 50 ul 10% SDS, 50 ul proteinase K (10 mg/ml). Inkubasi selama 1 jam pada

suhu 37°C. Tambahkan 500 ul campuran Phenol:Chlorofom (1:1) dan sentrifus pada 14.000

rpm selama 5 menit, ambil supernatan dan lakukan hal tersebut sekali lagi. Supernatant yang

diperoleh selanjutnya ditambahkan 5 ul Rnase'A (5 mg/ml) dan inkubasi pada suhu 37°C

selama 30 menit. Larutan selanjutnya dipresipitasi dengan Isopropanol sebanyak 2x volume

dan ditambahkan 40 ul 3 M ammonium asetat selanjutnya diinkubasi selama 5 menit pada

suhu ruang. Pellet ' diambil melalui .sentrifugasi dan dikeringkan menggunakan heater block

pada suhu 55°C selama 10 menit. Pellet diresuspensi kembali menggunakan buffer 1xTE

16

sebanyak 100 ul. Larutan DNA yang diperoleh selanjutnya dianalisi kwalitas dan

kwantitasnya.

3.4.2.Analisis Kwalitas dan Kwantitas DNA

Larutan DNA yang diperoleh selanjutnya dipersiapkan untuk analisis kwalitas dan kwantitas

menggunakan teknik elektrophoresis. Gel agarose dengan konsentrasi 0,75% digunakan

sebagai matriks untuk analisis elektrophoresis. Gel agarose yang masih mencair ditambah

dengan senyawa ethidium bromida (5mg/m!) dan dibiarkan mengeras pada lemaris asam.

Larutan DNA sebanyak 2 ul digunakan sebagai sampel analisis dengan meloadingnya

bersama 1xBPB (Bromophenol Blue). Pada sumur gel yang lain disertakan pula DNA-A

dengan konsetrasi yang telah diketahui (25-50 ng/ul) dan digunakan sebagai referens acuan

penentuan konsentrasi. Elektrophoresis dirunning pada tegangan 100 V selama 1 jam

menggunakan buffer 0,5 TBE (Tris-Boric-Acid). Setelah selesai gel dipapari dengan sinar

UV di bawah perangkat dokumentasi. Data visualisasi disimpan dalam bentuk data digital

dan digunakan untuk analisis kwalitas dan kwantitas DNA. Jika diperlukan analisis kwalitatif

akan dilanjutkan dengan uji restriksi menggunakan enzim EcoRI. Dari uji kwantitatif yang

dilakukan menggunakan teknik elektrophoresis ini akan diperoleh informasi konsentrasi

DNA yang diperoleh per µl ataupun konsentrasi DNA total yang diperoleh hasil isolasi. DNA

yang diperoleh selanjutnya diencerkan sampai konsentrasi 5 ng/pl yang digunakan sebagai

DNA kerja. Sisa larutan DNA digunakan sebagai larutan stock cadangan pada analisis

selanjutnya.

3.4.3. Amplifikasi DNA menggunakan primer gen 16S-rRNA

Kegiatan ini bertujuan untuk mengetahui identitas spesifik isolat terpilih berdasarkan struktur

nukleotid dari gen 16S-rRNA. Amplifikasi dilakukan menggunakan primer universal 27F:

5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' dan 1525R: 51- AAGGAG-GTGWTCCARCC-3'.

Pada kondisi tertentu jika primer 1525R tidak berfungsi maka akan digunakan primer

alternatif GM4: 5'- TACCTTGTTACGACTT-3'. PCR dilakukan pada volume 25 ul

17

menggunakan RTG-PCR Kit (GE-Health care-UK) dengan komposisi cocktail, 1 bead RTG-

PCR, 2 ul DNA templet, 2u! campuran kombinasi primer (5 pmol/ul) serta 21 ul ddH2O. PCR

dilaksanakan pada kondisi sebagai berikut :

Aktifitas Suhu

Waktu Jumlah siklus

Denaturasi awal 94°C

3 rhenit

Denaturasi 94°C

1 menit "1

Annealing . 57°C

1 menit f 30 siklus

Ekstensi 72°C

1 menit

Ekstensi akhir 72°C

5 menit

4°C

QO

Hasil amplifikasi yang diharapkan sebesar fragmen tunggal 1500 bp dikontrol menggunakan

teknik elektrophoresis sebagaimana diuraikan pada bagian sebelumnya. Untuk keperluan

pengecekan keberhasilan amplifikasi digunakan produk PCR sebanyak 5 ul. Sedangkan

sisanya sebanyak 20 ul untuk keperluan sekuensing.

3.4.4 Analisis Sekuen Gen 16S-rRNA

Sekuensing dilakukan di PT Charoen Phokphand Indonesia di Jakarta. Produk PCR sebanyak

20 ul dikirimkan bersama 10 ul salah satu primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen

16S-rRNA. Konsentrasi primer yang digunakan adalah 5 ul. Hasil sekuens diedit dan

dianalisis menggunakan BLAST pada database publik NCBI

(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTj untuk melihat kesamaan homologinya dengan sekuens

16S-rRNA dari bakteri yang lain. Dengan prosedur tersebut kita dapat langsung menentukan

spesies bakteri yang diperoleh, bahkan juga sampai pada level strainnya.

BAB IV. HASIL PENELITIAN 70%

4.1. Pengambilan Sampel dan Isolasi Bakteri Selulolitik.

Lokasi pengambilan sampel dari tanah ultisol kebun percobaan Unand Padang, tanah

Gambut Ketaping Padang, dan sampah kota TPA Lubuk Minturun Padang. Kegiatan

isolasi bakteri dilakukan cara pengenceran bertingkat Gambar 1, dan dilanjutkan dengan

penggoresan guna mendapatkan koloni tunggal bakteri. Kegiatan isolasi bakteri dilakukan

18

dengan mengkulturkan pada media Nutrient Agar (NA) dan diiinkubasi selama 2-3 hari pada

suhu kamar. Jumlah isolat bakteri tungal dari 3 lokasi didapat 120 isolat (Tabel 1)

Tabel 1. Informasi lokasi pengambilan sampel dan jumlah isolate yang diperoleh.

No Lokasi Pengambila

Sampel

Jumlah isolate (koloni)

1 Tanah Ultisol Unand 41

2 Tanah Gambut Kataping 48

3 Sampah Kota TPA Lubuk Minturun 31

Total isolat yang didapatkan 120

Dari Tabel 1 menunjukkan bahwa masing-masing lokasi diperoleh jumlah isolate yang

berbeda, ini menunjukkan bahwa factor biotik dan abiotik sangat mempengaruhi jumlah

isolat yang diisolasi. Faktor biotik jenis bakteri itu sendiri persaingan dalam mencari makan,

dan sebagai pemangsa bakteri itu sendiri atau pemangsa mikro organisma lain. Faktor abiotik

seperti suhu, pH tanah. Pertumbuhan bakteri memerlukan kisaran suhu dan pH tertentu.

4.2. Isolasi dan Seleksi Bakteri Selulolitik

Kegiatan isolasi dan seleksi bakteri selulolitik dilakukan dengan menggunakan media

spesifik Carboxy methyl Cellulase (CMC) . Isolat bakteri yang telah didapat dari tanah

sampel dikultur pada media CMC kemudian diinkubasi selama 5 – 10 hari kemudian

digenangi selama 15 menit dengan larutan congoRed dan dibersihkan dengan larutan NaCl

1 M. Adanya aktifitas selulolitik bakteri secara kualitatif akan dicirikan terbentuknya zona

bening (clear zone) disekeliling koloni bakteri yang tumbuh pada media selektif CMC

(Gambar 3). Zona bening secara kuantitatif menunjukkan besar kecilnya kemampuan bakteri

dalam mendegradasi selulosa. Berdasarkan uji aktifitas selulolitik seperti ( Gambar 3),

terdapat 24 isolat yang menunjukkan adanya aktifitas selulolitik dari 120 sampel yang diuji

(Tabel 1).

19

Gambar 4. Bakteri yang mempunyai aktifitas selulolitik yang ditandai

terbentuknya zona bening (a), disekelilng koloni bakteri (b)

Berdasarkan uji aktifitas selulolitik seperti ( Gambar 4), terdapat 24 isolat yang

menunjukkan adanya aktifitas selulolitik dari 120 sampel yang diuji (Tabel 1). Proporsi

bakteri selulolitik yang didapat masing-masing lokasi adalah 16 isolat dari tanah Ultisol, 8

isolat dari tanah Gambut, sedangkan dari kompos kota TPA tidak terdapat. Hal ini bias

disebabkan oleh beberapa factor biotik jenis bakteri itu sendiri. ada yang menghasilkan enzim

selulase, kinase, ataupun racun. factor abiotik seperti suhu dapat mempengaruhi aktifitas

enzim, semakin tinggi suhu semakin meningkat aktifitas enzim tetapi suhu terlalu tinggi

dapat merusak enzim.Menurut Mendel et al., (1976) cit Susilawati et al., (2007). Suhu

optimum bagi kerja enzim 50-60oC dan menurut Sen et al., (1982) cit Susilawati et al., (2007

enzim CMCase

Tabel 2. Isolat bakteri selulolitik setelah uji aktifitas bakteri media Carboxy methyl Cellulase

(CMC)

No Kode Isolat Diameter Koloni

Bakteri Selulolitik

(mm)

Diameter Zona Bening

Bakteri Selulolitik

(mm)

Indeks BS

1 U4 9 21 2.33

2 U5 27.67 34,00 1,23

3 U6 27,67 54,67 2,00

4 KM1 11.00 11,00 1,00

5 KM13 16.67 21,67 1,30

6 KM14 18.67 18,67 1,00

a

b

20

7 KM25 10,33 44,00 4,25

8 KM30 14,33 25,00 1,74

9 KM36 7,66 7,66 1,00

10 KM42 13,33 13,33 1,00

11 KM44 16,67 16,67 1,00

12 SR15 9.33 17,00 1,82

13 SR18 10.00 10,00 1,00

14 JM1 18.67 29,67 1,59

15 SR75 13.00 47,33 3,64

16 PR32 10,00 20,00 2,00

17 G-1 21.67 30,67 1,42

18 G-3 28.67 33,67 1,17

19 G-4 10.66 10,00 1,00

20 G-7 23,33 28,33 1,21

21 G-8 10,00 22,00 2,20

22 G-10 20,33 27,33 1,34

23 G-11 16,67 25,00 1,50

24 G-12 33,00 34,00 1,03

mempunyai suhu optimum 40-55O C. Bahan-bahan kimia juga dapat membunuh bakteri

tertentu seperti bakteri selulolitik bias mati atau rusak karena pembuangan bahan kimia

disampah kota TPA.

Pada Tabel 2 diperoleh 24 isolat yang memiliki aktifitas selulolitik. Tujuan dari kegiatan

ini untuk menyeleksi isolate bakteri selulolitik yang mempunyai indeks aktifitas selulolitik

yang tinggi, dengan cara mengukur diameter koloni bakteri (mm) dibagi dengan diameter

zona bening bakteri (mm) yang disebut indeks Pramono (1994). Isolat yang memiliki indeks

≥ 1,5 ditetapkan sebagai isolate yang terbaik. Dipreoleh 8 isolat bakteri selulolitik dari 24

isolat yang mempunyai indeks ≥ 1,5 (Tabel 2 dan Gambar 5)

Tabel 3. Ada 9 isolat Bakteri Selulolitik Degradasi yang mempunyai indeks ≥ 1,5

No Kode Isolat Diameter Koloni

(mm) BSD

Diameter Zona

Bening (mm) BSD

Indeks BSD

21

1 KM25 10,33 44,00 4,25

2 SR75 13,00 47,33 3,6

3 U-4 9,00 21,00 2.3

4 G-8 10,00 22,00 2,2

5 U-6 27,67 54,67 2,0

6 PR32 10,00 20,00 2,0

7 SR15 9,33 17,00 1,8

8 JM1 18,67 29,67 1,5

9 G-11 16,67 25,00 1,5

U-4

U-4

U-4

U-4

u-4

U-6

U-6

U-6

22

U-6 U-6

KM25

KM25

KM25

KM25

KM25

KM30

KM30

KM30

KM30

KM30

SR75

SR75

SR75

SR75

SR75

JM

JM

JM

JM

JM

4.3.Identifikasi Morfologi Bakteri Selulolitik.

Identifikasi merupakan kegiatan utama untuk membuat klasifikasi atau taksonomi.

Berdasarkan klasifikasi dan taksonomi keaneka ragaman hayati makhluk hidup dapat

dipelajari. Salah satu tahapan untuk identifikasi mikroba yaitu dengan mengamati cirri-ciri

morfologinya. Kegiatan identifikasi secara morfologi yang dilakukan bentuk koloni

bakterim, uji gram, dan uji pewarnaan.

Tabel 3. Dugaan spesies 9 isolat bakteri selulolitik berdasarkan pengamatan morfologi

Bentuk,Tepian,Elevasi,Warna,Gram,Pewarnaan

23

No Kode

Isolat

Warna Bentuk

mikroskop

Pewarnaan Uji Gram Spora Dugaan

Genus

1 U-3 Putih susu Batang Merah + Ada Bacillus

sp

2 U-7 Putih susu Batang Merah + Ada Bacillus

sp

3 U-8 Putih susu Batang Merah + Ada Bacillus

sp

4 U-12 Putih susu Batang Merah + Ada Bacillus

sp

5 U-14 Putih susu Batang Merah + Ada Bacillus

sp

6 U-15 Putih susu Batang Merah + Ada Bacillus

sp

7 U-16 Putih susu Batang Merah + Ada Bacillus

sp

8 G-5 Putih susu Batang Merah + Ada Bacillus

sp

9 G-7 Putih susu Batang Merah + Ada Bacillus

sp

U-4

U-6

KM25

24

Jm

Sr75

G-8

Pr-32

Sr18

U-4

U-6

KM25

KM30

25

SR75

JM

PR32Kn

KM13

G-1

G-8

KM18

KM42

Gambar Bentuk, Tepian, Warna, dan Elevasi BSD Media NA

4.4. Uji Biokimia

4.4.1. Uji Fermentasi Metode Hugh-Leifson

26

Kontrol Tabung

B

SR15

JM

KM30

G-1

U-4

U-6

KM25

G-8

SR75

PR32

Media Hugh-

Leifson

Gambar Fermentasi Oksidatif da Facultatif metode Hugh-Leifson

4.4.2. Uji Hidrolisis Pati

Kontrol

G-8

U-6

27

JM

U-4

PR32

KM25

G-1

G-8

4.4.3. Uji Hidrolisis Casein

Gambar Uji Hidrolisis Casein 11 isolat Bakteri Selulolitik Degardasi

U-4

U-6

KM25

SR75

28

JM

G-1

PR32

G-8

KM13

KM18

KM42

PR32Kn

Gambar Uji Hidrolisis Casein 11 isolat Bakteri Selulolitik Degardasi

7. Amplifikasi DNA menggunakan primer gen 16S-rRNA

1-1.U-4

2-2.U-6

3-3.KM25

4-4.KM30

5-5.SR75

6-6.JM

7-7.G-1

9-9.G-8

13-

13.PR32

Gambar Isolasi DNA 9 isolat ulangan 2 Gambar Amplifikasi (PCR) 9 isolat Ulangan

2

29

BAB V BIAYA DAN JADWAL PENELITIAN

5.1. Anggaran Biaya

Tabel 1 Format Ringkasan Anggaran Biaya Penelitian Disertasi Dosen yang Diajukan

No Jenis Pengeluaran

Biaya yang Diusulkan (Rp)

1

2

3

4

Gaji dan upah (Maks. 20%)

Anggaran Penunjang

Bahan habis pakai dan peralatan (40–50%)

Perjalanan (15–25%)

Lain-lain: publikasi, seminar, laporan

Rp. 10.000.000,-

Rp. 2.000.000,-

Rp. 25.000.000,-

Rp. 6.500.000,-

Rp. 6.500.000,-

Total keseluruhan anggaran Rp. 50.000.000,-

Hitung dalam huruf:” Lima puluh juta rupiah”

BAB V. JADWAL PELAKSANAAN PENELITIAN

Jadwal Kegiatan

No

Jenis Kegiatan Bulan

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 Isolasi bakteri selulolitik

2 Uji Morphologi

3 Uji Biokimia

4 Uji Aktifitas Enzim

5 Isolasi DNA Bakteri sellulolitik

6 Analisis Kwalitas dan Kwantitas

7 Amplifikasi DNA Menggunkan

primer gen 16S-rRNA

8 Analisis Sekuen Gen 16S-rRNA

9 Pengolahan Data Hasil Penelitian

10 Membuat Laporan

30

DAFTAR PUSTAKA

Ari Agustin, D.S.Y. 2008.Pengolahan Sampah Berwawasan Lingkungan. Jurusan Teknik

Informatika Fakultas Teknologi Informasi ITS Surabaya.

Arianto W., dan D. T. Djajawinata (2003). Penanganan Sampah Perkotaan Terpadu

Anonimus. Vol. 2008. www. Mapalui. Iformasi. Jejak. I/2,Juni 200

Anto Wibowo & Darwin T Djajawinata(2008). Penanganan Sampah Perkotaan Terpadu

Alexander, M. 1977. Introduction to Soil Microbiology. 2th.. Ed. Jhon Willey and Sons. New

York. Chicester. Brisbone Toronto

Atlas, R. M. and B. Richard. 1993. Interaction of microorganism with animals. In :

Microbiology: Fundamentals and Aplication. Addition-Wesley Publishing

Company.

Bequin, P and J.P. Aubert. 1992. Cellulases. In: Encyclopedia of Microbiology. Vol. 1.

Joshua Lederberg (ed). Academic Press, Inc. New York. pp. 467-477.

Bequin, P and J.P. Aubert. 1994. The Biological Degradation of Cellulose. FEMS Microbiol.

Rev. 13. Elsevier. pp. 25-58.

Brown, T.A. 1991. Pengantar cloning DNA. Yayasan Essentia Medica. Yogyakarta. 274 hal

Cappucino, J.G. and N. Sherman. 1987. Microbiology a Laboratory Manual. 2th Ed..

California. The Benjamins Columning Publishing Company.

Chundakkadu, K. 1999. Production of bacterial cellulases by solid state bioprocessing banana

wastes. J. Bioresource Technology. 69(3). 231-239.

Coughlan, M.P. 1988. Staining techniques for the detection of the individual components of

cellulolytic enzyme systemes. In: Wood, W.A. and Kellogg. S.T.(eds) Methods in

Enzymology, Vol. 160. Academic Press, London. pp. 135-144.

Cowan, S.T. and D. Still’s. 1973. Manual for the Identification of Medical Bacteria.

Cambridge University Press England.

31

Fan, L.T., Y.H. Lee, and D.H. Beardmore. 1988. Major chemical and physical features of

cellulosic materials as substrates for enzymatic hydrolysis. In: A. Fiechter, (ed)

Advances in Biochemical Engineering, Vol. 14.Springer-Verlag, Berlin, pp 101-

117.

Geharzt, W. 1990. Enzymes in Industry Production and Applications. ISBN 0-89573-937-2

U.S. pp 81-82.

Heck, J.X., S.H. Flores, P.H. Hertz and M.A.Z. Ayub. 2004. Optimization of cellulase-free

xylanase activity produced by Bacillus coagulans BL69 in solid- state cultivation.

J. Procbio. Doi:10.1016. Food Science and Technology Institute, Federal

University of Rio Grande do Sul State, Brazil.

Hoshino, E., T. Kanda, Y. Sasaki and K.Nisizawa. 1992. Adsorption, mode of action of exo-

and endo-cellulases from Irpex lacteus (Polyporus tulipiferae) on cellulose with

different crystalinities. Journal of Biochemistry 111,600-605.

Hou, P., Y. Li, B. Wu, Z. Yan, B. Yan, and P. Gao. 2004. Cellulolytic complex exists in

cellulolytic mycobacterium Sorangium. Enzyme and Microbial Technology.

Shandong University, Jinan. China.

Jamsari. 2007. Bioteknologi pemula prinsip dasar dan aplikasi analisis molekuler. Unri

Press. Pekanbaru. 193 hal.

Jusfah, J., D. Rangkuti and E. Muchtar. 1995. Inventory Microorganism as Litter

Decomposer in Lembah Anai. Annual Repport of Project. No. 7: 105-109. Japan

International Cooperation Agency (JICA). Andalas University . Indonesia.

Kluepfel, D. 1988. Screening of prokaryotes for cellulose- and hemicellulose- degrading

enzyme. In: Wood, W.A. and Kellogg. S.T.(eds) Methods in Enzymology, Vol.

160. Academic Press, London. pp. 180-186.

Kirchhof, G., V.M. Reis, J.I. Baldani, B. Eckert, J. Dobereiner, and A. Hartman. 1997.

Occurrence, physiological, and molecular analysis of endophytic diazotrophic

bacteria in gramineous energy plants. Plant and Soil 194:45-55.

Koumoutsi, A., X. Chen, A. Henne, H. Liesegang, G. Hitzeroth, P. Franke, J. Vater and R.

Borriss. 2004. Scanning electron micrograph of a pea root with adhering B.

amyloliquefaciens cells. Bacteriology. pp. 1084-1096, vol. 186,No. 4.

32

Lu, F. C. 1995. Toksikologi Dasar. Edisi Kedua. Universitas Indonesia Press, Jakarta.

Lynd, L.R., P.J. Weimer, P.H. Zyl and I.S. Pretorius. 2002. Microbial cellulose utilization:

fundamental and biotechnology. Microbiol Mol Biol Rev. 66:506-77.

Lestari. P, Susilowati. DN, dan Riyanti. EI. 2007. Pengaruh Hormon Asam Indol Asetat

yang Dihasilkan Azospirillum sp. terhadap Perkembangan Akar Padi. Jurnal

AgroBiogen 3(2):66-72.

Mandel, M., R. Andreotti and Roche 1976. Measurement of Saccarifying Cellulase.

Biotecnol. Bio. Eng. Simp. No. 26 : 21-23.

Muladno. 2002. Seputar teknologi rekayasa genetika. Penerbit Pustaka Wirausaha Muda.

Bogor. 123 hal.

Nasir. 2002. Bioteknologi Molekuler Teknik Rekayasa Genetik Tanaman. Penerbit PT.

Citra Aditya Bakti. Bandung. 296 hal.

Ozawa, T., O.Takahiro and N. Osama. 1996. Hemicelluloses in the Fibrous Residue of Sago

Palm. Proceeding of Sixth International Sago Symposium. Pekan Baru.

Prescott, S.C. and C. G. Dunn. 1982. Industrial Mocrobiology. McGraw-Hill Book Co., New

York.

Pritchett, W.L. 1979. Property and Management of Forest Soil. Jhon Willey an Sons.

New York.

Priest, F.G., M. Goodfellow, L.A. Shute and R.C.W. Berkeley. 1987. Bacillus

amyloliquefaciens sp.nov.,nom. Rev. Int. J. Syst. Bacteriol., 37, 69-71.

Reed, G. 1985. Enzymes in Food Processing. Academic Press. New York.

Reese, E.T., R.G.H. Siu and H. S. Levinson. 1950. in : W. M. Fogarty (ed). 1983. Microbial

Enzymes and Biotechnology. Applied Science Publ., London.

Rismijanah,J,I.N. Indriani, T.Pitriyanti . 2003. Penggunaan Enzim Selulase-Hemiselulase

pada Proses Deinking Kertas Koran Bekas. Jurnal Matematika dan Sains. Vol.8.

33

Tsao, G.T. 1978. Fermentation substrates from cellulolisic materials: Production of

Fermentable Sugar from Cellulolisic Materials. Cit. Pearlman,D. Dan G.T. Tsao. Annual

Reports on Fermentation Processes. Vol.2. Academic Press, New York.

Van der wal, P. 1979. Perspectives on bioconversion of organic residues for rural

communities in UNU Bioconversion of Organic Residues for Rural Communities.

Guatemala.

Volk, A.W. and F.M.Wheeler. 1989. Mikrobiologi. Jilid 2. Edisi 5. Erlangga, Jakarta

Wizna. 1997 and Y. Rizal. 2003. Isolasi, seleksi dan identifikasi bakteri Bacillus spp

selulolitik serasah hutan gambut Pesisir Selatan dan hutan Lembah Anai. Laporan

Penelitian Proyek Semi Que V tahap I. Fakultas Peternakan Unand. Padang.

Wood, T.M. 1988. Preparation of crystalline, amorphous, and dyed cellulose substrate. In :

Wood, W.A. and Kellogg. S.T.(eds) Methods in Enzymology, Vol. 160. Academic

Press, London. pp. 19-25.

Wood, T.M. and K.M. Bath. 1988. Methods for measuring cellulase activities. In: Wood,

W.A. and Kellogg. S.T.(eds) Methods in Enzymology, Vol. 160. Academic Press,

London. pp. 87-112.

Yusuf, S. 2000. Bakteri serasah yang terdapat di hutan gambut ditinjau dari segi daerah

tertutup dan terbuka. Skripsi Sarjana Biologi. FMIPA. Universitas Andalas. Padang

Hakim, M., J. Wijaya, dan R. Sudirja. 2006. Mencari Solusi Penanganan Masalah Sampah

Kota., Kerjasama Fakultas Pertanian UNPAD Dengan Direktorat Jenderal

Hortikultura Deptan Ri Bandung, Badan Kerja Sama Fakultas Pertanian Unpad dan

Emha Training Center.