lampiran - digilib.unila.ac.iddigilib.unila.ac.id/2024/14/lampiran-lampiran.pdf · penyusunan...

LAMPIRAN

Lampiran 1. Road-map Penelitian

Persiapan Penelitian

Persiapan wadah dan ikan uji

Bak ukuran 40x30x30cm sebanyak 4 buah dicuci,

didesinfeksi, dan dikeringkan

Diletakkan secara acak dan diberi label

Diisi air dengan padat tebar ikan kakap putih 10 ekor/bak.

Adaptasi ikan selama 7 hari

Pencampuran pakan dengan jintan hitam

Pakan buatan ditimbang sebanyak 1 kg.

Serbuk jintan hitam dicampurkan pada pakan, ditambahkan

putih telur sebagai binder dan diaduk.

Pellet dikeringkan dengan cara diangin-anginkan.

Pelaksanaan Penelitian

Pemberian pakan yang dicampur

imunostimulan

Pakan diberikan selama 42 hari pemeliharaan

Frekuensi 2x/hari, pukul 08.00 dan 16.00 WIB

Uji Tantang

Uji tantang pada hari ke-38

Penyuntikan filtrat VNN ke tubuh semua ikan uji

secara intra peritoneal (i.p) dengan dosis 0,1 ml/ekor.

Pengambilan Darah

Pengambilan sampel darah pada hari ke- 0, 7, 14, 21

dan 4 hari setelah uji tantang

Jarum suntik dan microtube dibilasdengan EDTA 10%

Darah diambil dari 5 ekor ikan, dipilih secara acak

pada setiap bak, lalu disimpan di microtube

Parameter pengamatan

Hematologi

Hematokrit

Total Leukosit

Diferensial Leukosit

Uji Fagositosis

Kualitas Air

Suhu

pH

DO

Salinitas

Analisis Data

Deskriptif

Penyusunan Laporan

Pembuatan Filtrat VNN

Beberapa organ dari kerapu tikus yang positif terserang VNN

Organ tersebut digerus dengan mortar kemudian dimasukkan

dalam mikrotube dan ditambah PBS

Mikrotube disentrifuse dengan keepatan 12000 rpm selama

10 menit kemudian disaring dengan milipore

Filtrat disuntikkan kepada kerapu dengan dosis 0‚ 1ml/ekor

yang sehat untuk diamati gejala terserangnya VNN

Ikan yang menunjukkan gejala diambil organnya untuk dibuat

filtrat kembali dan dapat disimpan dalam freezer -81oC

SR‚ RPS dan MTD

Lampiran 2. Data Pengamatan Darah

1. Total Leukosit

Total Leukosit A1 A2 A3 A4

Pengamatan Hari ke-0 26400 27500 30800 28600





2. Diferensial Leukosit

a. Persentase Monosit

Monosit A1 A2 A3 A4






b. Persentase Limfosit

Limfosit A1 A2 A3 A4






c. Persentase Neutrofil

Neutrofil A1 A2 A3 A4






3. Persentase Hematokrit

Hematokrit A1 A2 A3 A4

Pengamatan Hari ke-0 46.15 36.5 33.33 35.39




Pengamatan Hari ke-42 66 59.61 54.71 41.92

61

Lampiran 3. Tahap Pemeriksaan Profil Darah

1. Pengambilan Darah

Jarum suntik dan

mikrotube 1,5 ml disiapkan

Dibilas dengan larutan EDTA

10% sebanyak 1/3 dari darah yang

diambil

Darah ikan diambil

melalui vena caudalis

Darah disimpan dalam

mikrotube 1,5 ml

62


2. Perhitungan Total Leukosit

Kaca penutup dipasang

pada haemacytometer

Dilanjutkan dengan

menghisap larutan turk

hingga skala 11

(pengenceran 1:20)

Haemacytometer dan kaca penutupnya

dibersihkan dengan etanol

Sampel darah dihisap dengan pipet

berskala hingga skala 0,5

Pipet digoyangkan selama 3 menit

agar bercampur homogen

Empat tetesan pertama dibuang

63

Tetesan berikutnya

dimasukkan ke dalam

haemacytometer

Dibiarkan selama 3

menit agar leukosit

mengendap

Bilik hitung diletakkan di

bawah mikroskop

menggunakan perbesaran

lemah

Perhitungan dilakukan pada 4 kotak

besar haemocytometer

64


3. Perhitungan Diferensial Leukosit

Diletakkan setetes darah

kerapu tikus

Kaca pemulas disentuhkan

pada tetesan darah

kemudian digeser

Kaca obyek yang telah diulas darah

dikeringanginkan dan siap diwarnai

Kaca Obyek dibersihkan dengan

etanol

Sediaan apus darah diletakkan di baki

dengan sediaan apus di sebelah atas

65

Sediaan tersebut digenangi dengan

methanol secukupnya selama 5-10 menit

Kemudian dilanjutkan untuk

digenangi dengan giemsa selama 25

menit

Dibilas dengan akuades

dan dikeringkan

Gelas obyek diamati dibawah

mikroskop dengan perbesaran kuat

Berbagai jenis leukosit dihitung sepanjang sediaan

apusan darah dan dihentikan bila jumlahnya

mencapai 100 sel

66


4. Pengukuran Hematokrit

Sampel darah kerapu tikus

disiapkan

Darah disedot dengan

menggunakan tabung

hematokrit

Salah satu bagian ujung tabung

disumbat menggunakan lilin dan

diberi label

Tabung dibungkus dengan tissue dengan

cara digulungkan

67

Dimasukkan ke dalam tabung

valcon

Dimasukkan ke dalam mesin

sentrifuse pada kecepatan 3500

rpm selama 15 menit

Setelah disentrifuse tabung hematokrit diukur

menggunakan penggaris

68

Lampiran 4. Uji Aktivitas Fagositosis

Bakteri yang telah dilemahkan

dan sel darah putih kerapu tikus

dicampurkan ke dalam

microdilution plate dengan

perbandingan 1:1

Dilakukan pipeting agar homogen dan

diinkubasi selama 4 jam

Diambil sekitar 50µl kemudian

diteteskan diatas gelas obyek untuk

di ulas

Dilakukan pewarnaan menggunakan giemsa dan

diamati dibawah mikroskop

69

Lampiran 5. Uji Tantang

Filtrat VNN yang telah diisolasi dari

kerapu tikus

Dilakukan injeksi VNN terhadap kerapu tikus

sebanyak 0,1 ml secara intraperitonial

Ikan dipelihara dan diamati hingga

menunjukkan gejala terinfeksi VNN

70

Lampiran 6. Pembuatan Isolat Bakteri Vibrio alginolyticus yang Dilemahkan

Bakteri dicuci dengan PBS

sebanyak 3 kali

Divortex selama ± 1 menit

Disentrifuse pada 3000 rpm selama

15 menit

Bakteri V. alginolyticus di kultur pada media semi solid atau TSA

Bakteri dipanen dan diinkubasi dengan formalin

1‚5% selama 24 jam

Kepadatan Bakteri dihitung menggunakan standar McFarland

hingga didapat kepadatan 107 sel/ml

71

Lampiran 7. Pembuatan Isolat VNN

Beberapa organ diambil dari ikan yang

positif terinfeksi VNN

Organ tersebut digerus dengan mortar

Organ yang sudah digerus dimasukkan ke dalam

microtube dan ditambahkan dengan PBS steril 1ml

Microtube disentrifuse dengan kecepatan 12000 rpm

selama 10 menit

72

Air hasil saringan diambil

sebanyak 1 ml menggunakan

spuit

Kerapu tikus disuntikkan isolat

VNN secara intraperitonial

Hasil sentrifuse disaring menggunakan milipore

0‚45 µm dan dimasukkan kedalam microtube

Ikan dipelihara dan diamati hingga

muncul gejala klinis serangan VNN

Organ- organ ikan yang terserang VNN diambil dan

dibuat isolat yang lebih banyak untuk disimpan dalam

freezer suhu -81o C

lampiran - digilib.unila.ac.iddigilib.unila.ac.id/2024/14/lampiran-lampiran.pdf · penyusunan...

Documents