14

METODOLOGI

Penelitian ini terdiri atas tiga percobaan yaitu:

1. Studi regenerasi tanaman hijau pada kultur antera padi

2. Analisis genetik karakter agronomi pada padi

3. Evaluasi karakter agronomi galur-galur padi haploid ganda hasil kultur antera

Pembentukan Materi Genetik

Waktu dan Tempat Penelitian

Pembentukan materi genetik terdiri atas dua kegiatan yaitu penanaman

tetua dan persilangan di antara tetua untuk mendapatkan benih F1. Pembentukan

materi genetik untuk Percobaan 1 dan Percobaan 2 dilakukan pada bulan Januari-

Juni 2008 di Kebun Percobaan Muara, Balai Besar Penelitian Padi, Bogor.

Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan untuk pembentukan materi genetik adalah benih

padi Fatmawati (varietas PTB), BP360E-MR-79-2 (galur harapan PTB), dan dua

padi gogo lokal Pulai Buru yaitu Fulan Telo Gawa (FTG) dan Fulan Telo Mihat

(FTM). Fulan Telo Gawa mempunyai warna beras putih, sedangkan Fulan Telo

Mihat mempunyai warna beras merah. Fulan Telo Gawa dan Fulan Telo Mihat

dipilih sebagai tetua karena mempunyai karakter antara lain umur agak genjah,

malai panjang dan pengisian gabah yang baik, sedangkan Fatmawati dan BP360E-

MR-79-2 adalah varietas dan galur harapan padi sawah tipe baru yang mempunyai

karakter antara lain tanaman tegak, batang kekar dan malai lebat, tetapi pengisian

gabah kurang baik (Lampiran 2).

Metode Penelitian

Materi genetik yang digunakan dalam Percobaan 1 dan Percobaan 2

adalah tetua yang berasal dari padi gogo lokal dan padi sawah tipe baru serta F1

hasil persilangan resiprok antara padi gogo lokal dengan padi sawah tipe baru.

Padi gogo lokal Fulan Telo Gawa dan Fulan Telo Mihat masing-masing

disilangkan dengan Fatmawati dan BP360E-MR-79-2 secara resiprok sehingga

15

diperoleh delapan persilangan, yaitu (1) Fulan Telo Gawa/Fatmawati, (2) Fulan

Telo Gawa/BP360E-MR-79-2, (3) Fulan Telo Mihat/Fatmawati, (4) Fulan Telo

Mihat/BP360E-MR-79-2, (5) Fatmawati/Fulan Telo Gawa, (6) Fatmawati/Fulan

Telo Mihat, (7) BP360E-MR-79-2/Fulan Telo Gawa dan (8) BP360E-MR-79-

2/Fulan Telo Mihat.

Pembentukan populasi F1 diawali dengan penanaman tetua persilangan.

Benih tetua disemai dalam bak ukuran 30 cm x 50 cm, kemudian bibit

dipindahtanam ke lapangan setelah berumur 21 hari. Bibit tetua ditanam di

lapangan dengan jarak tanam 25 cm x 25 cm, satu bibit per lubang tanam.

Penanaman tetua diulang tiga kali dengan interval waktu dua minggu untuk

sinkronisasi pembungaan saat persilangan. Tanaman dipupuk dengan 200 kg/ha

Urea, 100 kg/ha SP36 dan 100 kg/ha KCl. Setelah tanaman berbunga, tanaman

yang dijadikan tetua betina dipindahkan ke dalam pot dan dibawa ke rumah kaca

untuk dibuang bunga jantannya (kastrasi). Stadia bunga yang baik untuk

diemaskulasi adalah pada saat benang sari berada pada pertengahan bunga. Stadia

ini menunjukkan bahwa bunga akan mekar dalam 1-2 hari. Bunga digunting

dengan kemiringan 600, kemudian benang sari dikeluarkan dengan cara dihisap

dengan menggunakan pompa penghisap (putik tidak boleh rusak). Malai yang

sudah diemaskulasi ditutup dengan kertas minyak dan diberi label.

Persilangan dilakukan hari berikutnya pada pukul 10.00-12.00. Bunga

jantan diambil dari pertanaman di lapangan dengan cara memotong malai yang

sebagian bunganya sudah pecah. Pengambilan malai dilakukan pada pukul 08.00-

09.00. Malai dari lapangan ini kemudian diletakkan dalam bak berisi air dalam

ruang persilangan. Ruang persilangan merupakan ruang tertutup yang diberi

lampu tembak (4 x 100 watt) dengan jarak + 2.5 m dari malai sehingga suhunya

lebih tinggi dibanding suhu lapangan (35-40 0C). Hal ini bertujuan untuk

mempercepat pecahnya bunga. Penyerbukan dilakukan dengan cara menggoyang-

goyangkan malai tetua jantan di atas malai tetua betina yang sudah dikastrasi.

Bunga yang sudah diserbuki ditutup dengan kertas minyak dan diberi label. Hasil

persilangan (benih F1) dapat dipanen 3 minggu setelah persilangan dilakukan.

Setelah dijemur 2 hari dan dibuang sekamnya, benih dioven dalam kantong kertas

16

pada suhu + 45 0C selama 3 hari. Benih F1 ini dapat ditanam 15 hari setelah

panen.

Percobaan 1. Studi Regenerasi Tanaman Hijau pada Kultur Antera Padi

Waktu dan Tempat Penelitian

Percobaan 1 dilakukan pada bulan September 2008 sampai April 2009.

Penanaman bahan eksplan dilakukan di rumah kaca Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Bogor,

sedangkan kegiatan kultur antera dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan,

Kelompok Peneliti Biologi Sel dan Jaringan, Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Bogor.

Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam Percobaan 1 adalah varietas dan galur

harapan padi sawah tipe baru yaitu Fatmawati dan BP360E-MR-79-2, padi gogo

lokal Pulau Buru yaitu Fulan Telo Gawa dan Fulan Telo Mihat, dan F1 hasil

persilangan resiprok varietas/galur padi sawah tipe baru dengan padi gogo lokal,

yaitu: (1) Fulan Telo Gawa/Fatmawati, (2) Fulan Telo Gawa/BP360E-MR-79-2,

(3) Fulan Telo Mihat/Fatmawati, (4) Fulan Telo Mihat/BP360E-MR-79-2, (5)

Fatmawati/Fulan Telo Gawa, (6) Fatmawati/Fulan Telo Mihat, (7) BP360E-MR-

79-2/Fulan Telo Gawa dan (8) BP360E-MR-79-2/Fulan Telo Mihat. Media kultur

antera yaitu N6 (Chu 1978) untuk induksi kalus dan MS (Murashige dan Skoog

1962) untuk regenerasi dan perakaran.

Metode Penelitian

Percobaan kultur antera dilakukan dengan menggunakan rancangan acak

lengkap yang terdiri atas 25 ulangan. Perlakuan yang digunakan adalah 12

genotipe padi yang terdiri atas empat genotipe tetua dan delapan genotipe F1.

Setiap ulangan merupakan satu cawan petri yang berisi antera dari 25 buah bulir

bunga (spikelet). Sumber eksplan yaitu empat genotipe tetua dan delapan genotipe

17

F1 ditanam dalam pot masing-masing 20-30 tanaman, 2 tanaman/pot. Pelaksanaan

kultur antera mengikuti metode Dewi (2003).

a. Pembuatan media

Media dasar yang digunakan adalah N6 untuk induksi kalus dan media

MS untuk regenerasi dan perakaran. Komposisi kimia kedua media yang

digunakan dapat dilihat pada Lampiran 3.

Media induksi kalus adalah media N6 yang diberi 2.0 mg/l NAA dan 0.5

mg/l kinetin, sedangkan media regenerasi kalus adalah media MS yang diberi

0.5 mg/l NAA dan 2.0 mg/l kinetin. Putresin (salah satu jenis poliamin) 10-3

M

dan sukrosa berturut-turut sebanyak 60 g/l dan 40 g/l ditambahkan ke dalam

media induksi kalus dan media regenerasi. Media perakaran adalah media MS

ditambah 0.5 mg/l IBA dan 10 g/l sukrosa. Pemadat yang digunakan adalah

agar phytagel TM

dengan pH media 5.8. Media disterilisasi dalam autoklaf

selama 20 menit pada suhu 120 0C tekanan 18-20 psi.

b. Pemilihan dan inkubasi eksplan

Malai yang diambil anteranya adalah malai yang masih dalam keadaan

bunting dengan jarak aurikel daun bendera dengan aurikel daun di bawahnya

7-10 cm (Gambar 2). Malai yang masih terselubung dicuci bersih kemudian

dibungkus dengan kertas tissue yang telah dibasahi dan aluminium foil.

Selanjutnya malai disimpan dalam ruang dingin bersuhu 5 0C selama 7-10

hari. Perlakuan suhu dingin berguna untuk menyeragamkan stadia polen

sehingga lebih banyak polen pada stadia uninukleat yang dapat digunakan.

Gambar 2. Malai dan spikelet yang dipakai dalam kultur antera

18

c. Sterilisasi eksplan

Malai dibuka selubungnya, kemudian spikelet (bulir) yang berada di

bagian tengah-atas dan berwarna kuning kehijauan diambil. Spikelet-spikelet

yang terpilih kemudian disterilkan dengan 20% Clorox (Bayclin dengan

kandungan NaCIO 5.25 %) selama 20 menit dan selanjutnya dicuci dengan air

steril. Pencucian dilakukan sebanyak dua kali. Sterilisasi eksplan ini dilakukan

dalam laminar air flow cabinet (LAF).

d. Penanaman atau inokulasi eksplan

Spikelet-spikelet yang sudah steril dipotong sepertiga bagian dari

pangkalnya dan dikumpulkan dalam cawan petri steril, kemudian spikelet

dijepit dengan menggunakan pinset dan diketuk-ketukkan pada cawan petri

yang berisi 25 ml media induksi kalus sehingga antera akan keluar dan jatuh

ke media. Setiap cawan petri berisi antera yang berasal dari 25-30 spikelet

atau berisi ± 150 butir antera. Kegiatan ini dilakukan dalam LAF.

e. Inkubasi kultur antera

Inkubasi antera dilakukan dalam ruang gelap bersuhu 25 ± 2 0C untuk

menginduksi keluarnya kalus yang berasal dari butir tepung sari (mikrospora)

dalam antera. Kalus biasanya muncul sekitar 3-4 minggu setelah inokulasi.

f. Regenerasi tanaman dari kalus

Kalus yang berukuran 1-2 mm dipindahkan ke dalam botol yang berisi

25 ml media regenerasi untuk merangsang keluarnya tunas. Tunas/tanaman

hijau yang tumbuh pada media regenerasi dipindahkan ke tabung kultur yang

berisi 15 ml media perakaran setelah mencapai tinggi 3-5 cm. Sekelompok

(cluster) tanaman yang tumbuh dari satu kalus tidak dipisahkan. Setelah akar

tumbuh sempurna, maka tanaman siap untuk diaklimatisasi.

g. Aklimatisasi

Aklimatisasi dilakukan dengan menanam planlet hasil kultur antera

dalam tabung reaksi berisi air selama ± 1 minggu, kemudian tanaman

19

dipindahkan ke dalam bak semai berisi tanah berlumpur selama 1 minggu.

Selama proses aklimatisasi, tanaman diperlakukan pada keadaan cahaya

dengan intensitas yang berangsur-angsur meningkat sehingga tanaman mampu

beradaptasi dengan kondisi lapang. Bibit padi hasil kultur antera kemudian

dipindahkan dari bak ke pot di rumah kaca.

h. Pengamatan

Pengamatan dilakukan terhadap lamanya inisiasi kalus, jumlah kalus

yang terbentuk, jumlah kalus yang menghasilkan tanaman, jumlah tanaman

hijau, jumlah tanaman albino, dan jumlah tanaman haploid ganda yang

dihasilkan.

i. Analisis data

Data primer yang diperoleh digunakan untuk mendapatkan persentase

antera yang membentuk kalus, persentase kalus terhadap jumlah antera,

persentase tanaman hijau terhadap jumlah tanaman total, persentase tanaman

albino terhadap jumlah tanaman total dan efisiensi setiap perlakuan dalam

menghasilkan tanaman hijau yaitu rasio tanaman hijau terhadap jumlah antera

yang diinokulasi. Data dianalisis dengan menggunakan sidik ragam, jika

terdapat perbedaan dilanjutkan dengan Uji Jarak Berganda Duncan (DMRT).

Percobaan 2. Analisis Genetik Karakter Agronomi pada Padi

Waktu dan Tempat Penelitian

Percobaan 2 dilakukan pada bulan Agustus-Desember 2008. Penanaman

bahan percobaan dilakukan di Rumah Kaca Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Cikeumeuh,

Bogor.

Bahan Penelitian

Bahan untuk Percobaan 2 adalah varietas dan galur harapan padi sawah

tipe baru yaitu Fatmawati dan BP360E-MR-79-2, padi gogo lokal Pulau Buru

20

yaitu Fulan Telo Gawa dan Fulan Telo Mihat, dan F1 hasil persilangan resiprok

varietas/galur harapan padi sawah tipe baru dengan padi gogo lokal yaitu: (1)

Fulan Telo Gawa/Fatmawati, (2) Fulan Telo Gawa/BP360E-MR-79-2, (3) Fulan

Telo Mihat/Fatmawati, (4) Fulan Telo Mihat/BP360E-MR-79-2, (5)

Fatmawati/Fulan Telo Gawa, (6) Fatmawati/Fulan Telo Mihat, (7) BP360E-MR-

79-2/Fulan Telo Gawa dan (8) BP360E-MR-79-2/ Fulan Telo Mihat.

Metode Penelitian

Percobaan dilakukan di rumah kaca menggunakan rancangan acak

kelompok dengan empat ulangan. Perlakuan yang digunakan adalah 12 genotipe

padi yang terdiri atas empat tetua dan delapan kombinasi persilangan. Benih padi

dari 12 genotipe yang digunakan disemai dalam bak yang berisi lumpur. Setelah

21 hari, bibit dipindahtanam dalam pot yang berisi tanah sawah, 1 bibit/pot.

Tanaman dipupuk dengan 200 kg/ha (5 g/pot) Urea, 100 kg/ha (2.5 g/pot) SP36

dan 100 kg/ha (2.5 g/pot) KCl. Pemeliharaan tanaman dilakukan berdasarkan

budidaya padi sawah. Penanaman dilakukan pada kondisi sawah dimaksudkan

untuk mengoptimalkan pertumbuhan tanaman karena tidak semua genotipe

mampu tumbuh baik pada kondisi gogo. Hal ini karena salah satu tetua yang

digunakan dalam persilangan berasal dari varietas/galur harapan padi sawah.

Pengamatan yang dilakukan meliputi:

- tinggi tanaman, diukur dari permukaan tanah sampai ujung malai

- jumlah anakan produktif, ditentukan dengan menghitung anakan yang

menghasilkan malai

- umur berbunga, dihitung dari saat tabur atau sebar benih sampai 50%

malai (bunga) dalam satu rumpun telah keluar

- umur panen, dihitung dari saat tabur atau sebar benih sampai 80% malai

telah matang

- panjang malai, diukur dari leher malai sampai ujung malai

- jumlah gabah isi dan hampa per malai, dihitung jumlah gabah bernas atau

berisi penuh dan gabah yang hampa (tidak berisi) tiap malai

- bobot 1000 butir gabah bernas

21

- hasil gabah per rumpun, dihitung dari bobot gabah kering bernas yang

berasal dari satu rumpun

- warna gabah, diketahui dari warna sekam (gabah)

- warna beras, diketahui setelah sekam dikupas.

Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam, uji jarak berganda

Duncan dan analisis komponen ragam (Singh dan Chaudhary 1979). Perhitungan

sidik ragam dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Analisis ragam rancangan acak kelompok

Sumber

Keragaman

Derajat Bebas Kuadrat Tengah Nilai Harapan

Ulangan (r) r-1 KTr

Genotipe (g) g-1 KTg Ve + rVg

Galat (e) (g-1)(r-1) KTe Ve

Rumus komponen ragam dan heritabilitas yang digunakan adalah sebagai berikut

(Singh dan Chaudhary 1979):

dimana:

Vg = ragam genotipe

Vp = ragam fenotipe

r = ulangan

X = rataan umum genotipe

KTe = kuadrat tengah galat

22

KTg = kuadrat tengah genotipe

H2

bs = heritabilitas arti luas

KVG = koefisien keragaman genetik

KVP = koefisien keragaman fenotip

Pengelompokan nilai heritabilitas arti luas menurut Stanfield (1983):

0.50 < h2<1.00 : tinggi

0.20 < h2<0.50 : sedang

h2 < 0.20 : rendah

Percobaan 3. Evaluasi Karakter Agronomi Galur-galur Haploid Ganda Hasil

Kultur Antera

Waktu dan Tempat Penelitian

Percobaan 3 dilakukan pada bulan Maret-Juni 2009. Penanaman bahan

percobaan dilakukan di Kebun Percobaan Babakan, Institut Pertanian Bogor.

Bahan Penelitian

Bahan untuk Percobaan 3 adalah benih dari 35 genoipe haploid ganda hasil

kultur antera padi (DH0) hasil persilangan resiprok Fulan Telo Gawa/Fatmawati

dan tiga genotipe kontrol (pembanding) yaitu Fatmawati, Fulan Telo Gawa dan

Limboto. Ketiga genotipe pembanding berturut-turut merupakan varietas padi

sawah tipe baru, padi gogo lokal Pulau Buru dan varietas padi gogo komersial.

Metode Penelitian

Percobaan dilakukan di lapangan dengan menggunakan rancangan

augmented (IRRI 1997; Baihaki 1999; Sharma 2006). Benih DH0 dari 35 galur

hasil kultur antera dan tiga varietas pembanding ditanam dalam baris pada kondisi

gogo, 2 baris/genotipe, 25 tanaman/baris, 1 benih/lubang dengan jarak tanam 20

cm x 20 cm. Pertanaman dibagi menjadi 7 blok, setiap blok terdiri atas 5 galur

DH0 dan 3 varietas kontrol. Tanaman dipupuk dengan 200 kg/ha Urea, 100 kg/ha

SP36 dan 100 kg/ha KCl. Pemeliharaan tanaman dilakukan berdasar budidaya

padi gogo.

23

Evaluasi karakter agronomi galur-galur padi haploid ganda dilaksanakan

di lapangan pada lahan gogo dengan tujuan melakukan pengujian terhadap daya

adaptasi galur-galur haploid ganda sehingga dapat dilakukan seleksi terhadap

galur-galur yang beradaptasi baik. Galur-galur yang terpilih dikelompokkan

menjadi dua yaitu galur padi gogo dan galur padi gogo tipe baru.

Pengamatan dilakukan terhadap karakter-karakter agronomi meliputi

tinggi tanaman, jumlah anakan produktif per rumpun, jumlah gabah per malai,

jumlah gabah isi malai, umur berbunga, umur panen, bobot 1000 butir biji bernas

dan hasil gabah kering per rumpun.

Data dianalisis dengan analisis ragam sesuai metode augmented (Sharma

2006). Perhitungan sidik ragam augmented dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Analisis ragam rancangan augmented

Sumber Keragaman Derajat Bebas Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah

Blok (b) r-1 JKb KTb

Perlakuan (t) t-1 JKt KTt

Kontrol (c) c-1 JKc KTc

Genotipe (g) g-1 JKg KTg

Kontrol vs genotipe 1 JKcg KTcg

Galat (e) (c-1)(b-1) JKe KTe

Komponen ragam dan heritabilitas dihitung dengan menggunakan persamaan

berikut:

24

dimana:

FKg = faktor koreksi genotipe uji

Y. = nilai pengamatan keseluruhan genotipe uji

Yi = nilai pengamatan genotipe ke-i

g = jumlah genotipe uji

db = derajat bebas genotipe uji

JKg = jumlah kuadrat

KTg = kuadrat tengah genotipe uji

Vg = ragam genotipe

Vp = ragam fenotipe

Ve = ragam lingkungan

X = rataan genotipe uji

H2

bs = heritabilitas arti luas

KVG = koefisien keragaman genetik

KVP = koefisien keragaman fenotip

Rataan tersesuaikan (adjusted) genotipe haploid ganda yang diuji

diperoleh setelah dihitung pengaruh blok dengan rumus:

Pj = B – M

Nilai rataan tersesuaikan = Yi - Pj

dimana:

Pj = pengaruh blok ke-j

Bj = rata-rata kontrol dalam satu blok j

M = rata-rata umum kontrol

Yi = nilai pengamatan genotipe ke-i

25

Beda nyata terkecil (BNT) antara nilai rata-rata tersesuaikan masing-

masing karakter satu genotipe uji dengan rata-rata satu genotipe kontrol

ditentukan dengan rumus:

dimana:

BNT = beda nyata terkecil

KTE = kuadrat tengah galat

b = jumlah blok

c = jumlah kontrol

Data yang diperoleh juga dianalisis korelasi dan sidik lintas antara karakter

hasil gabah kering dengan karakter-karakter agronomi yang diamati (Singh dan

Chaudhary 1979; Poespodarsono 1988). Analisis sidik lintas dapat digambarkan

sebagai berikut:

Gambar 3. Hubungan antara karakter agronomi terhadap hasil (Y)

26

dimana:

Y = hasil gabah/rumpun

X1, X2, ... = karakter agronomi yang diamati

P1, P2, ... = koefisien lintas, yang menunjukkan pengaruh langsung

karakter agronomi terhadap hasil (Y)

r = korelasi antar karakter agronomi

Koefisien lintas P1Y, P2Y, ..., P6Y dihitung melalui persamaan berikut:

r1Y

r1.1 r1.2 r1.3 r1.4 r1.5 r1.6

P1Y

r2Y

r2.1 r2.2 r2.3 r2.4 r2.5 r2.6

P2Y

r3Y = r3.1 r3.2 r3.3 r3.4 r3.5 r3.6

P3Y

r4Y

r4.1 r4.2 r4.3 r4.4 r4.5 r4.6

P4Y

r5Y

r5.1 r5.2 r5.3 r5.4 r5.5 r5.6

P5Y

r6Y

r6.1 r6.2 r6.3 r6.4 r6.5 r6.6

P6Y

Seleksi dilakukan terhadap genotipe-genotipe haploid ganda yang diuji

untuk mendapatkan genotipe haploid ganda yang berpotensi sebagai galur padi

gogo maupun galur padi gogo tipe baru. Nilai diferensial seleksi karakter-karakter

agronomi yang diamati dihitung dengan rumus (Becker 1985):

S = Xs – X

dimana:

S = nilai diferensial seleksi

Xs = nilai rata-rata karakter agronomi genotipe yang terseleksi

X = nilai rata-rata karakter agronomi populasi