INDUKSI KALUS HAPLOID MELALUI KULTUR ANTERA

PADA BEBERAPA SPESIES JERUK (Citrus sp)

KAMSIA DORLIANA

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Induksi Kalus

Haploid Melalui Kultur Antera pada Beberapa Spesies Jeruk (Citrus sp) adalah

karya saya dengan arahan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk

karya apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal

atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain

telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian

akhir tesis ini.

Bogor, September 2011

Kamsia Dorliana

NRP A253080141

ABSTRACT

KAMSIA DORLIANA. Induction of Haploid Callus through Anther Cultured on

Citrus sp. Supervised by AGUS PURWITO & ALI HUSNI.

Anther culture is one method to produce haploid callus and plants. By the

doubling of their chromosome, double haploid plants can be generated and used to

produce F1 hybrids. Haploid callus can also be used as tissues for somatic

hybriditation to produce triploid Citrus and other non-conventional breeding

program. The objective of this research were to study microspore development of

four Citrus spesies (Tangerine Garut, Tangerine Batu 55, Siam and Pamelo),

effect of cold pretreatment, media type, and plant growth regulator on of callus

induction from citrus anther.

The development of microspores can be seen by measuring the ratio of the

size of the sepals and petals flower. Microspores that have high percentage of

uninukleat given different levels cold pretreatment to improve the ability to form

callus. After treated with cold pretreatment, callus was induced with various

formulations of media, resulting haploid callus then carried out chromosome

counting.

The results shown that the microspore uninucleat was highest (78,2% to

91,4%) in medium-size flowers with a ratio of the sepal: petal (1:4 - 2:6) mm in

flower Tangerine Garut, Tangerine Batu 55, Siam Citrus, and (6:14 - 6:17) mm in

flower Pamelo. Microspores uninucleat in Garut citrus flowers ranged from 78.2

to 91.4%, at tangerine Batu 55 flowers ranged from 78.2 to 85.6%, the citrus

flower Siam from 79.4 to 90.5%, and citrus flower Pamelo ranged from 78.2 to

85.4% of the take total microspores. Cold pretreatment of anther for 5 days was

able to inducted callus citrus keprok Garut up to 2%.

MT medium + 3 mg / l BAP + 500 mg / l extract malt on solid media were

able to induce callus 14.5% in tangerine Batu 55, while the treatment of liquid

media is only able to induce callus up to 4.5%, and solid + liquid media

treatments able to induce callus 3.6%. The data is observed when the culture aged

6 weeks after planting. The best medium to induce callus Siam Citrus are MT

medium + 3 mg / l 2,4-D + 500 mg / l extract malt, is able to induce callus up to

1,6%. MT medium with 3 mg/l BAP and with 1 mg/l NAA was able to induce

callus Pamelo up to 2,6%. Chromosome counting is performed to determine

ploidy level of callus produced. The result showed that all chromosome of the

anther derived callus was 9 as half of diploid chromosome.

Keywords: microspore development, cold pretreatment,chromosome

RINGKASAN

KAMSIA DORLIANA, Induksi Kalus Haploid Melalui Kultur Antera pada

Beberapa Spesies Jeruk (Citrus sp). Dibawah bimbingan Dr. Ir. AGUS

PURWITO sebagai ketua Komisi Pembimbing dan Dr. ALI HUSNI sebagai

anggota Komisi Pembimbing.

Kultur antera merupakan salah satu metode kultur jaringan untuk

menghasilkan kalus atau tanaman haploid. Penggandaan kromosom akan

menghasilkan tanaman double haploid yang dapat digunakan sebagai tetua dalam

pemuliaan konvensional untuk menghasilkan hibrida F1 atau untuk bahan dalam

program pemuliaan tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kalus

haploid pada beberapa spesies jeruk. Penelitian ini diawali dengan studi

perkembangan inti mikrospora pada keempat spesies jeruk (Keprok Garut, Keprok

Batu 55, Siam, dan Pamelo). Perkembangan mikrospora dapat dilihat dengan

mengukur perbandingan ukuran sepal dan petal masing - masing bunga untuk

mendapatkan ukuran bunga yang mempunyai mikrospora inti tunggal yang

banyak. Mikrospora yang mempunyai banyak inti tunggal diberi berbagai tingkat

praperlakuan suhu dingin untuk meningkatkan kemampuan antera jeruk

membentuk kalus. Setelah mendapatkan praperlakuan dingin terbaik kemudian

dilakukan induksi kalus pada antera dengan berbagai formulasi media, dan untuk

mengetahui kalus yang dihasilkan antera merupakan kalus haploid maka

dilakukan analisis kromosom.

Perkembangan inti mikrospora ditandai dengan perubahan morfologi

bunga melalui bertambah panjangnya ukuran sepal dan petal bunga. Hasil

penelitian pada percobaan pengamatan inti mikrospora menunjukkan bahwa

mikrospora yang mempunyai inti tunggal (uninukleat) tertinggi berada pada

bunga ukuran sedang dengan perbandingan ukuran sepal : petal (1:4 – 2:6) mm

pada bunga jeruk keprok Garut, keprok Batu 55, dan jeruk Siam, (6:14 - 6:17) mm

pada bunga jeruk Pamelo. Mikrospora inti tunggal yang terdapat pada bunga jeruk

keprok Garut berkisar 78,2 - 91,4%, pada bunga jeruk keprok Batu 55 berkisar

78,2 - 85,6%, pada bunga jeruk Siam 79,4 – 90,5%, dan pada bunga jeruk Pamelo

78,2 – 85,4% dari total mikrospora yang diamati. Pada percobaan pemberian

praperlakuan suhu dingin pada antera selama selang waktu tertentu menunjukkan

bahwa praperlakuan dingin selama 5 hari merupakan praperlakuan terbaik agar

antera jeruk keprok Garut dapat diinduksi menjadi kalus sebanyak 2% pada

pengamatan 6 minggu setelah tanam.

Kuncup bunga jeruk keprok Batu 55, jeruk Siam, dan jeruk Pamelo diberi

praperlakuan dingin (10oC) selama 5 hari, kemudian antera dikulturkan dalam

berbagai formulasi media dengan tujuan untuk mendapatkan kalus yang berasal

dari mikrospora. Data yang didapat menunjukkan media MT + 3 mg/l BAP + 500

mg/l ekstrak malt dengan perlakuan media padat mampu menginduksi kalus

14,5% pada antera jeruk keprok Batu 55, sedangkan perlakuan media cair hanya

mampu menginduksi kalus 4,5 %, dan perlakuan media padat + cair hanya mampu

menginduksi kalus 3,6%. Data tersebut diamati pada saat kultur berumur 6

minggu setelah tanam.

Data yang didapat pada percobaan induksi kalus terhadap antera jeruk

Siam menunjukkan media terbaik untuk menginduksi kalus pada antera jeruk

Siam berada pada media MT + 3 mg/l 2,4-D + 500 mg/l ekstrak malt, karena

mampu menginduksi kalus sebanyak 1,6% sedangkan perlakuan media MT + 5

mg/l 2,4-D + 500 mg/l ekstrak malt hanya mampu menginduksi kalus 0,8%, dan

MT + 7 mg/l 2,4-D + 500 mg/l ekstrak malt hanya mampu menginduksi kalus

0,8%. Data tersebut diamati pada saat kultur berumur 4 minggu setelah tanam.

Berdasarkan percobaan induksi kalus pada antera jeruk Pamelo diperoleh

data yang menunjukkan persentase kalus tertinggi berada pada media MT + 3

mg/l BAP + 1 mg/l NAA + 500 mg/l ekstrak malt sebanyak 2,6%, sedangkan

perlakuan media lain tidak mampu menghasilkan terbentuknya kalus, hanya

memberikan respon membengkak. Analisis kromosom dilakukan untuk

mengetahui tingkat ploidi kalus yang dihasilkan. Kalus yang dihasilkan

merupakan kalus haploid yang berasal dari mikrospora karena mempunyai jumlah

kromosom berkisar 9.

Kata kunci: Kromosom, perkembangan mikrospora, praperlakuan dingin

©Hak Cipta Milik IPB, tahun 2011

Hak Cipta Dilindungi Undang-undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencamtumkan

atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,

penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau

tinjauan suatu masalah; dan sebagian besar pengutipan tersebut tidak merugikan

kepentingan.yang.wajar.IPB.

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya Tulis

dalam bentuk apapun tanpa seizin IPB.

INDUKSI KALUS HAPLOID MELALUI KULTUR ANTERA

PADA BEBERAPA SPESIES JERUK (Citrus sp)

KAMSIA DORLIANA

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Mayor Pemuliaan

dan Bioteknologi Tanaman

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

Judul Tesis: Induksi Kalus Haploid Melalui Kultur Antera Pada Beberapa Spesies

Jeruk (Citrus sp)

Nama : Kamsia Dorliana

NRP : A253080141

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Agus Purwito, M.Sc, Agr Dr. Ir. Ali Husni, M.Si

Ketua Anggota

Diketahui

Koordinator Mayor Dekan Sekolah Pascasarjana

Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman

Dr. Ir. Trikoesoemaningtyas, M.Sc Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr.

Tanggal Ujian: 8 September 2011 Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas

rahmat-Nya dalam penyelesaian tesis ini yang merupakan syarat untuk mendapat

gelar Magister di Institut Pertanian Bogor (IPB), dengan judul “Induksi Kalus

Haploid Melalui Kultur Antera pada Beberapa Spesies Jeruk (Citrus sp)”.

Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Dr. Ir. Agus Purwito,

Msc. Agr dan Dr. Ali Husni, Msi atas bimbingan, saran, ilmu, waktu serta

perhatiannya dalam pelaksanaan penelitian sampai penulisan tesis ini dapat selesai

dengan baik. Terima kasih juga disampaikan kepada dekan sekolah Pascasarjana

IPB, Dr. Ir. Trikoesomaningtyas selaku ketua Program studi Pemuliaan dan

Bioteknologi Tanaman IPB, seluruh staf pengajar, dan semua teknisi yang telah

memberikan bantuan selama penulis belajar di IPB.

Ucapan terima kasih dan penghargaan yang mendalam penulis sampaikan

kepada ayah Domu Sitanggang dan ibu Hotnauli Siagian yang setia mendoakan,

membimbing, dan mengarahkan saya menjadi anak lebih baik.

Penelitian ini dilakukan di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan

Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-Biogen) Bogor. Untuk itu,

penulis menyampaikan terima kasih kepada kepala Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian atas izin yang

diberikan kepada penulis untuk melaksanakan penelitian di BB-Biogen.

Terimakasih juga diucapkan kepada Dr. Ir. Ika Mariska, APU sebagai ketua

Kelompok Peneliti dan kepada semua peneliti serta teknisi BB-BIOGEN Bogor.

Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada bapak Ujang Hapid dan bapak

Joko yang telah banyak membantu penulis dalam pembuatan preparat dalam

analisis jumlah kromosom.

Bogor, September 2011

Kamsia Dorliana

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Aek Nabara, Sumatera Utara pada tanggal 8 Agustus

1985 dari pasangan Ayah Domu Sitanggang dan ibu Hotnauli Siagian. Pendidikan

sekolah dasar diselesaikan di SD Negeri 1 Aek Nabara pada tahun 1996, Sekolah

lanjutan tingkat pertama lulus di SMP Katolik Santo Yosep Aek Kanopan pada

tahun 1999, dan sekolah menengah atas lulus dari SMA Katolik Bintang Timur

Pematang Siantar tahun 2002. Penulis melanjutkan pendidikan tinggi jurusan

Biologi di Universitas Kristen Indonesia (UKI) dan mendapat gelar sarjana pada

tahun 2007. Pada tahun 2008 penulis melanjutkan pendidikan pascasarjana (S-2)

di Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman Institut Pertanian Bogor

(IPB).

i

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL

DAFTAR GAMBAR

DAFTAR LAMPIRAN

PENDAHULAN

Latar Belakang..........................................................................

Tujuan Penelitian......................................................................

Hipotesis...................................................................................

Kerangka Pemikiran.................................................................

1

1

3

3

3

TINJAUAN PUSTAKA

Klasifikasi Jeruk........................................................................

Morfologi Bunga jeruk………………………………………..

Kultur Antera.............................................................................

Faktor yang Mempengaruhi Kultur Antera...............................

Perkembangan Mikrospora........................................................

Media yang digunakan pada Kultur Antera...............................

Kultur Antera pada Tanaman Jeruk...........................................

6

6

10

10

13

16

18

19

METODOLOGI PENELITIAN

Waktu dan Tempat Penelitian....................................................

Bahan dan Alat..........................................................................

Metode Penelitian……………………………………………..

1. Studi Tahapan Perkembangan Inti Mikrospora

Antera Jeruk...........................................................

2. Studi Praperlakuan Lama Penyimpanan

Antera Terhadap Kemampuan Induksi Kalus.......

21

21

21

21

21

22

ii

3. Induksi Kalus Antera Jeruk Keprok Batu 55,

Jeruk Siam dan Jeruk Pamelo..............................

4. Analisis Kromosom.............................................

22

24

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kondisi Umum Percobaan...................................................................

Studi Tahapan Perkembangan Inti Mikrospora Antera Jeruk Keprok

Garut, Keprok Batu 55, Jeruk Siam, dan Pamelo................................

Studi Lama Praperlakuan Penyimpanan Antera Terhadap

Kemampuan Induksi Kalus Keprok Garut…………………………..

Induksi Kalus pada Antera Keprok Batu 55, jeruk Siam dan jeruk

Pamelo...................................................................................................

Analisis Kromosom...............................................................................

PEMBAHASAN UMUM

25

25

26

31

33

40

41

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan..............................................................................................

Saran....................................................................................................

44

44

44

DAFTAR PUSTAKA.......................................................................... 45

LAMPIRAN...................................................................................... ..

51

iii

DAFTAR TABEL Halaman

1. Perkembangan Inti mikrospora jeruk keprok Garut, keprok Batu

55, jeruk Siam................................................................................

2. Perkembangan Inti Mikrospora Jeruk Pomelo ............................

27

30

3. Pengaruh Praperlakuan dingin terhadap kemampuan induksi

kalus jeruk keprok Garut...............................................................

31

4. Pengaruh Jenis Media Terhadap Respon Antera Jeruk keprok

Batu 55…………………………………………………………..

5. Pengaruh 2.4-D Terhdap Respon Antera Jeruk Siam…………...

34

36

6. Induksi Kalus Pada Antera Jeruk Pamelo....................................

38

iv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1. Bagan alir untuk mendapatkan galur murni melalui kultur

antera.........................................................................................

5

2. Perbandingan morfologi daun jeruk keprok Garut,

keprok Batu 55, jeruk Siam dan jeruk Pamelo.........................

7

3. Morfologi bunga jeruk keprok Garut, keprok Batu 55, jeruk Siam, dan jeruk Pamelo........................

8

4. Morfologi buah jeruk keprok Garut, keprok Batu 55, jeruk Siam, dan jeruk Pamelo........................

9

5. Morfologi umum Bunga Jeruk……………………………….

6. Tahapan perkembangan mikrospora........................................

10

17

7. Kondisi umum di laboratorium Biologi Sel dan Jaringan BB-Biogen.................................................................

26

8. Perkembangan inti mikrospora jeruk........................................ 28

9. Perbandingan ukuran sepal dan petal bunga jeruk Pamelo dan bunga Jeruk siam.........................................

29

10. Respon antera jeruk keprok Garut............................................. 32

11. Respon antera jeruk keprok Batu 55..........................................

12. Respon antera jeruk Siam..........................................................

35

37

13. Respon antera jerukPomelo....................................................... 39

14. Perbandingan kromosom jeruk haploid dan diploid.................. 40

v

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Komposisi Pembuatan Media MT……………………………….

51

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Jeruk (Citrus sp) merupakan salah satu genus dari famili Rutaceae yang

mempunyai nilai ekonomi paling tinggi (Karsinah et al. 2002). Pada umumnya

buah jeruk banyak disukai masyarakat karena rasanya yang manis menyegarkan

dan kulitnya yang mudah dikupas serta mengandung vitamin C yang tinggi

(Helmiyesi 2009). Indonesia merupakan salah satu produsen jeruk yang

mempunyai potensi cukup besar untuk memenuhi kebutuhan konsumen di dalam

dan di luar negeri. Meskipun demikian produksi jeruk nasional belum mencukupi

kebutuhan konsumen karena produksi jeruk mengalami penurunan dari 2. 625.

884 ton pada tahun 2007 menjadi 2.467.632 ton pada tahun 2008 (Badan Pusat

Statistik 2010). Oleh sebab itu Indonesia masih termasuk negara pengimpor jeruk

terbesar kedua di ASEAN setelah Malaysia.

Upaya untuk meningkatkan produksi dan kualitas jeruk selain perluasan

areal pertanaman, juga dapat dilakukan melalui program pemuliaan tanaman

dengan menggunakan benih hibrida yang berdaya hasil tinggi dan berkualitas baik

secara genetik maupun daya tumbuhnya. Benih hibrida dapat diperoleh dari

persilangan galur murni yang digunakan sebagai tetua. Untuk memperoleh galur

murni dapat dilakukan melalui pemuliaan secara konvensional, yaitu dengan cara

selfing yang dilanjutkan dengan proses seleksi. Namun penerapan teknik ini

membutuhkan waktu yang lama (Somantri dan Ambarwati 2001). Oleh sebab itu,

dibutuhkan suatu metode yang dapat mempersingkat waktu untuk memperoleh

galur murni.

Salah satu alternatif untuk dapat memperoleh galur murni dalam waktu

yang relatif singkat adalah melalui kultur antera. Kultur antera merupakan salah

satu teknik kultur jaringan yang mengkulturkan atau menanam antera sehingga

diperoleh tanaman haploid. Kultur antera dapat menghasilkan embrio maupun

menghasilkan kalus yang dapat diregenerasikan menjadi tanaman haploid, dan

jika dilakukan penggandaan kromosom akan dihasilkan tanaman double haploid

yang homozigot. Tanaman double haploid dapat digunakan sebagai tetua dalam

pemuliaan konvensional untuk menghasilkan hibrida F1. Selain untuk

kepentingan pemuliaan konvensional, kalus atau tanaman haploid juga dapat

2

digunakan sebagai sumber jaringan haploid untuk fusi protoplas dan pemuliaan

non konvensional lainnya dalam upaya menghasilkan tanaman unggul.

Kultur antera sudah banyak berhasil diterapkan pada banyak tanaman,

diantaranya pada tanaman padi (Zhang dan Oifeng 1993; Dewi dan Purwoko

2001) dan tomat (Zagorska et al. 1998). Faktor - faktor yang mempengaruhi

keberhasilan induksi kalus dari kultur antera diantaranya: (1) penentuan fase

perkembangan mikrospora yang responsif, (2) perlakuan cekaman suhu atau

sumber karbon, (3) komposisi media yang sesuai, dan (4) kondisi inkubasi kultur

yang mendukung (Thomas dan Davey 1975).

Salah satu faktor penting yang mempengaruhi produksi tanaman haploid

melalui kultur antera adalah tahap perkembangan mikrospora. Pada sebagian

besar jenis tanaman, antera hanya responsif selama fase uninukleat dari

perkembangan polen. Sebaliknya, pada tanaman tembakau respon optimum

ditemukan pada beberapa saat sebelum, selama dan sesudah fase mitosis pertama

dari polen (akhir fase uninukleat hingga awal binukleat dari polen).

Faktor lain yang menentukan keberhasilan kultur antera ialah pra-

perlakuan terhadap antera sebelum kultur antera. Sebelum diintroduksikan pada

lingkungan in vitro, antera dapat diberi praperlakuan cekaman seperti pemberian

manitol, pemberian temperatur (rendah dan tinggi), pemberian osmotik,

pemberian nitrogen dan pemberian karbohidrat (Kyo dan Harada 1986; Immonen

dan Antilla 1999). Dengan praperlakuan cekaman, proses metabolisme pada

jaringan akan terhenti untuk sementara. Setelah periode waktu tertentu jaringan

tersebut mulai berkembang lagi dengan lintasan metabolisme yang baru apabila

berada pada kondisi lingkungan yang mendukung (Immonen dan Antilla 1999).

Praperlakuan cekaman juga berperan dalam pembelokan jalur perkembangan

gametofitik ke arah sporofitik untuk menghasilkan embrio atau tunas. Tanpa

cekaman mikrospora akan berkembang menjadi polen masak yang normal.

Cekaman dapat diaplikasikan pada level tanaman utuh, kuncup bunga, antera atau

langsung pada mikrospora (Touraev et al. 1997).

Komposisi media dasar, dan teknik isolasi merupakan faktor penting lain

yang mempengaruhi keberhasilan kultur antera. Optimasi media terseleksi

umumnya dilakukan untuk meningkatkan kemampuan medium dalam

3

menginduksi pembentukan kalus, embrio, maupun regenerasi eksplan yang

dikulturkan. Media dalam kultur jaringan tanaman umumnya terdiri dari

komponen hara makro, mikro, vitamin, asam amino, gula, bahan organik, bahan

pemadat (agar), dan zat pengatur tumbuh.

Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah: (1) untuk mempelajari perkembangan inti

mikrospora pada beberapa spesies jeruk, (2) mempelajari pengaruh lama

praperlakuan dingin (10oC) terhadap kemampuan induksi kalus jeruk, (3) untuk

mempelajari respon berbagai spesies jeruk terhadap formulasi media induksi

kalus.

Hipotesis

Hipotesis penelitian ini adalah: (1) terdapat perkembangan inti mikrospora

yang berbeda pada berbagai ukuran bunga tanaman jeruk, (2) terdapat lama

praperlakuan dingin yang dapat menginduksi kalus antera jeruk dalam jumlah

terbanyak, (3) terdapat respon antera jeruk yang mengkalus terhadap formulasi

media kultur yang digunakan.

Kerangka Pemikiran

Salah satu upaya untuk mendapatkan galur murni yaitu melalui kultur

antera. Melalui kultur antera akan dihasilkan kalus yang dapat diregenerasikan

menjadi tanaman haploid. Kalus haploid dapat digunakan sebagai bahan dalam

pemuliaan non konvensional. Penggandaan kromosom pada tanaman haploid akan

menghasilkan tanaman double haploid. Kultur antera dapat dilakukan secara

langsung dimana mikrospora yang terdapat pada antera langsung beregenerasi

menjadi embrio, dan secara tidak langsung dimana antera terlebih dahulu dinduksi

untuk menghasilkan kalus, kemudian kalus diregenerasikan menjadi planlet. Pada

penelitian ini antera di arahkan untuk menghasilkan kalus sebagai sumber jaringan

haploid untuk program pemuliaan tanaman.

Antera yang responsif untuk membentuk kalus atau embrio adalah antera

yang mengandung mikrospora dengan inti tunggal (uninukleat) yang tinggi.

4

Mikrospora yang berada pada fase uninukleat ditandai dengan keberadaan inti

yang berada di tengah. Oleh sebab itu, sebelum antera diinduksi pada lingkungan

in vitro, terlebih dahulu dilakukan pengamatan perkembangan inti mikrospora

berdasarkan ukuran sepal dan petal bunga dengan tujuan untuk mendapatkan

mikrospora dengan persentase inti tunggal yang banyak.

Bunga yang mengandung mikrospora dengan inti tunggal yang banyak

diberi praperlakuan dingin (10oC) untuk membelokkan jalur perkembangan

gametofitik ke arah sporofitik. Induksi kalus dapat ditingkatkan melalui perlakuan

optimasi media, kemudian kalus yang diperoleh dianalisis berdasarkan metode

praperlakuan lengkap untuk mengetahui jumlah kromosom. Bagan alir penelitian

untuk mendapatkan kalus haploid dapat dilihat pada Gambar 1.

5

Gambar 1. Bagan alir penelitian yang dilakukan

Kultur Antera

Studi perkembangan inti mikrospora

jeruk keprok Garut, keprok Batu 55,

Siam, dan Pamelo

Mikrospora dengan

inti satu

(uninukleat) >70%

Praperlakuan dingin (10oC) selama 1,

3,5 dan 7 hari pada bunga jeruk

keprok Garut

Lama praperlakuan

terbaik untuk

menginduksi kalus

Kalus Optimasi media untuk mendapatkan

kalus jeruk keprok Batu 55, Siam dan

Pamelo.

uji

Analisis kromosom

6

TINJAUAN PUSTAKA

Klasifikasi Jeruk

Jeruk merupakan tanaman asli buah tropika yang berasal dari Asia

terutama India dan Indo-Cina (Webber 1967; Chapot 1975). Sejak ratusan tahun

yang lalu, jeruk sudah tumbuh di Indonesia baik secara alami maupun yang

dibudidayakan. Jeruk yang ada di Indonesia didatangkan dari Amerika dan Italia

oleh orang Belanda (Khan 2007). Daerah - daerah yang terkenal sebagai daerah

pusat jeruk di Indonesia diantaranya Garut (Jawa Barat), Tawamangu (Jawa

Tengah), Batu (Jawa Timur), Tejakula (Bali), Selayar (Sulawesi Selatan),

Pontianak (Kalimantan Barat), Brastagi (Sumatera Utara) dan Soe (Nusa

Tenggara Timur) (Martosupono et al. 2007).

Jeruk keprok merupakan salah satu jenis jeruk yang sudah lama dikenal

dan dibudidayakan oleh masyarakat Indonesia serta diperdagangkan di pasar

internasional. Jenis jeruk lain yang banyak dibudidayakan di Indonesia antara lain

jeruk Siam, dan jeruk Pamelo. Van Steenis (1975) mengklasifikasikan jeruk

sebagai berikut: (1) Divisi: Spermatophyta, (2) Sub divisi: Angiospermae, (3)

Kelas: Dicotyledonae, (4) Ordo: Rutales, (6) Keluarga: Rutaceae, (7) Genus:

Citrus, (8) Spesies: Citrus sp. Aspek - aspek penting yang membedakan antara

spesies jeruk keprok, jeruk Siam, dan jeruk Pamelo adalah terletak pada habitus

tanaman, morfologi daun, bentuk dan ada tidaknya sayap daun, morfologi bunga,

morfologi buah, dan morfologi biji (Martasari dan Hardiyanto 2003).

Jeruk Keprok merupakan jenis pohon dengan tinggi 2 - 8 meter. Tangkai

daun bersayap sangat sempit sampai tidak bersayap dengan panjang 0,5 - 1,5 cm.

Helaian daun berbentuk bulat telur memanjang atau berbentuk lanset dengan

ujung tumpul, tepinya bergerigi beringgit sangat lemah dengan panjang 3,5 - 8 cm

(Gambar 2). Bunganya mempunyai diameter 1,5 - 2,5 cm, berkelamin dua, daun

mahkotanya putih (Gambar 3). Buahnya berbentuk bola tertekan dengan panjang

5 - 8 cm, tebal kulitnya 0,2 - 0,3 cm dan daging buahnya berwarna oranye

(Gambar 4). Rantingnya tidak berduri, habitus tegak, kulitnya mudah dikupas,

bersifat poliembriogenik, kotiledon berwarna hijau, dan tangkai daunnya selebar 1

- 1,5 mm (Badan Litbang Departemen Pertanian 2005). Jeruk keprok mengandung

7

berbagai macam senyawa kimia diantaranya tangeraxanthin, tangeritin,

tryptophan, tyrosine, nobiletin, cis-3-hexenol, cis-carveol, dan citric-acid.

Tangeritin dan nobiletin merupakan senyawa methoxyflavone dan

polymethoxyflavon yang mempunyai potensi sebagai antikanker (Tang et al.

2009).

Gambar 2. Morfologi daun: A. Jeruk Keprok Garut; B. Jeruk keprok Batu 55;

C. Jeruk Siam; D. Jeruk Pamelo.

Jeruk keprok merupakan tanaman asli Melayu tetapi sekarang

penyebarannya hampir terdapat pada semua daerah tropis dan subtropis di dunia.

Temperatur optimal pertumbuhan tanaman antara 25 - 30 oC namun ada yang

masih dapat tumbuh normal pada 38 oC. Semua jenis jeruk tidak menyukai tempat

yang terlindung dari sinar matahari. Kelembaban optimum untuk pertumbuhan

jeruk keprok sekitar 70 – 80% (Khan 2007).

Salah satu varietas atau jenis jeruk lain yang banyak disukai oleh

masyarakat adalah jeruk Siam. Jenis jeruk ini banyak disukai masyarakat karena

rasanya yang lebih manis dibanding jeruk keprok. Secara garis besar, jeruk Siam

dan jeruk keprok sulit dibedakan karena mempunyai aroma daun yang sama,

ukuran bunga dan buah yang hampir sama (Gambar 3 dan 4), akan tetapi buah

jeruk Siam lebih sulit dikupas kulitnya dibandingkan dengan buah jeruk Keprok.

Jeruk Siam juga berbeda dengan jeruk Keprok karena mempunyai ranting yang

berduri, habitus tegak menyebar, daunnya bersayap dengan ukuran lebih kecil

dibanding daun jeruk keprok (Gambar 2), monoembrionik, dan kotiledon

berwarna putih. Jeruk Siam mempunyai bentuk bunga seperti lonceng, jumlah

bunga terdiri dari 8-10 buah / tandan (Badan Litbang Pertanian 2005).

D B A C

8

Gambar 3. Morfologi bunga: A. Jeruk keprok Garut; B. Keprok Batu 55; C. Jeruk

Siam; D. Jeruk Pamelo.

Jeruk Pamelo merupakan salah satu jenis buah jeruk besar yang sudah

lama dikenal di Indonesia dan diduga merupakan salah satu jenis tanaman asli

Indonesia (Purwanto et al. 2003). Jeruk Pamelo mempunyai bentuk daun ovale

atau elliptic ovale yang berukuran besar dan bersayap (Gambar 2). Jeruk Pamelo

mempunyai ukuran bunga yang lebih besar jika dibandingkan dengan bunga jeruk

Keprok dan jeruk Siam. Bentuk buah jeruk Pamelo berukuran besar dan

mempunyai kulit buah yang tebal (Gambar 3), habitus tegak menyebar dan

cenderung bersifat monoembrioni.

Tanaman jeruk tumbuh baik pada pH tanah antara 5 - 6, pada pH yang

lebih tinggi sering terjadi defisiensi hara terutama unsur mikro Zn, Cu, Mn, dan

Fe. Tanah yang mengandung kadar boron serta memiliki kadar garam tinggi

merupakan jenis tanah yang kurang baik bagi pertumbuhan tanaman jeruk.

Perbanyakan tanaman jeruk secara konvensional dapat dilakukan secara generatif

maupun vegetatif. Perbanyakan secara generatif dapat dilakukan dengan

menggunakan biji, namun akan menghasilkan buah yang beragam dan sering

tidak bersifat unggul walaupun berasal dari pohon induk yang unggul, sedangkan

perbanyakan tanaman jeruk secara vegetatif dapat dilakukan dengan

A B

C D

9

menggunakan cabang, batang, akar dan daun melalui setek, cangkok dan okulasi.

Namun tingkat keberhasilannya dipengaruhi oleh cara perbanyakan, waktu

melakukan perbanyakan, dan keterampilan pelaksana (Sukarmin 2008).

Gambar 4. Morfologi buah: A. Jeruk keprok Garut; B. keprok Batu 55; C. Jeruk

Siam; D. Jeruk Pamelo.

Upaya untuk menghasilkan buah jeruk yang bersifat unggul dan seragam

dapat dilakukan melalui pembentukan tanaman haploid melalui kultur antera.

Melalui kultur antera dapat diperoleh tanaman haploid atau embrio haploid, dan

jika dilakukan penggandaan kromosom akan diperoleh tanaman haploid ganda

yang homozigot (Morrison dan Evans 1988). Pembentukan tanaman haploid

melalui kultur antera dapat dilakukan melalui jalur tidak langsung yaitu melalui

pembentukan kalus terlebih dahulu. Kalus merupakan kumpulan sel amorphous

yang terjadi pada sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus-menerus.

Tujuan kultur kalus adalah untuk memperoleh kalus dari penanaman eksplan pada

B A

D C

10

lingkungan terkendali. Kalus diharapkan dapat memperbanyak massa selnya

secara terus-menerus (Gunawan 1992).

Morfologi Bunga Jeruk

Bunga jeruk merupakan bunga lengkap yang terdiri atas tangkai bunga

(pedicel), sepal (caliyx), petal (corolla), kepala putik (stigma), style, bakal buah

(ovary), kepala sari (antera), filamen (Gambar 5). Bagian – bagian bunga dapat

digunakan sebagai eksplan dalam pemuliaan secara kultur jaringan. Salah satu

tujuan yang mengggunakan bagian bunga sebagai eksplan yaitu untuk

mendapatkan tanaman haploid karena tanaman haploid merupakan tanaman yang

mempunyai kromosom sama dengan gamet. Bagian – bagian bunga yang dapat

digunakan untuk menghasilkan tanaman haploid yaitu bagian bunga yang

merupakan alat reproduksi yaitu mikrospora, antera, atau bakal buah.

Kultur Antera

Kultur antera merupakan salah satu teknik kultur in vitro yang dapat

menghasilkan tanaman haploid. Tanaman haploid adalah tanaman yang

mempunyai jumlah kromosom sama dengan jumlah kromosom gametnya, yakni

mempunyai jumlah kromosom sembilan untuk tanaman jeruk (Bajaj 1983). Jika

petal sepal

bakal buah

filamen

antera

tangkai

bunga

Gambar 5. Morfologi umum bunga jeruk

11

dilakukan penggandaan kromosom akan diperoleh tanaman double haploid

homozigos (galur murni).

Tujuan dari kultur antera adalah untuk mendapatkan tanaman haploid

unggul yang akan dipergunakan untuk merakit kultivar-kultivar baru (Wattimena

1992). Kultur antera akan menghasilkan tanaman homozigot dalam waktu yang

singkat sehingga proses selfing (6-8 generasi) dalam pemuliaan konvensional

dapat dihilangkan dan program pemuliaan dapat dilakukan lebih singkat (Taji et

al. 2002).

Kultur antera memiliki beberapa keuntungan diantaranya: (1) tanaman

homozigot diperoleh dalam waktu relatif singkat (2) efisiensi seleksi, (3)

memperluas variabilitas genetik melalui produksi variasi gametoklonal, (4) gen

resesif dapat terekspresi (Zapta 1990). Keberhasilan kultur antera untuk

mendapatkan tanaman haploid pertama kali dilaporkan oleh Guha dan Maheswari

(1966) pada tanaman Datura innoxia, dimana kepala sari Datura innoxia yang

ditanam pada media yang mengandung kasein hidrolisat, IAA, kinetin, suplemen

air kepala, dan ekstrak anggur dapat menghasilkan embrio pada umur 6 minggu

setelah tanam. Keberhasilan kultur antera selanjutnya dilaporkan oleh Bourgin

dan Nitsch (1967) pada tanaman Nicotiana tabacum.

Ayed et al (2010) melaporkan pengaruh praperlakuan terhadap

keberhasilan kultur mikrospora pada tanaman Triticum turgidum. Praperlakuan

tediri dari delapan perlakuan: (1) Praperlakuan suhu dingin selama 5 hari, (2)

pemberian 0,3M manitol pada suhu 40C selama 12 hari, (3) pemberian 0,3M

manitol pada suhu 40C selama 7 hari, (4) pemberian 0,7M manitol pada suhu 4

0C

selama 5 hari, (5) pemberian PEG 1,5% pada suhu 40C selama 5 hari, (6)

pemberian PEG 1% pada suhu 40C selama 15 hari, (7) pemberian PEG 1% pada

suhu 40C selama 10 hari, dan (8) kontrol. Berdasarkan hasil penelitian tersebut

diperoleh bahwa praperlakuan dingin (40C) selama 5 hari merupakan praperlakuan

yang paling efektif untuk menginduksi terbentuknya embrio pada mikrospora

Triticum turgidum. Sebaliknya pada mikrospora cabai merah besar peningkatan

induksi embriogenesis dapat dilakukan dengan memberikan praperlakuan pada

suhu panas (33oC) selama empat hari dapat menghasilkan proembrio cabai merah

besar sebanyak 30% (Indrianto et al. 2004).

12

Teknik kultur antera relatif sederhana, cepat dan efisien dalam

menghasilkan jaringan atau tanaman haploid pada kebanyakan spesies (Bajaj

1983; Bhojwani dan Radzan 1993). Faktor terpenting dan kritis pada kultur antera

adalah penentuan tingkat perkembangan polen yang tepat untuk dijadikan eksplan

sehingga androgenesis dapat terjadi (Bajaj 1983). Berdasarkan hasil penelitian

yang telah dilakukan oleh Dus et al. (2002) pada kultur antera jagung, diketahui

mikrospora yang berada pada tahapan perkembangan inti mid-uninucleat

merupakan tahapan perkembangan mikrospora yang paling responsif untuk

menginduksi terbentuknya embrio sebanyak 8,54%

Shirdelmoghanloo et al. (2009) menyatakan bahwa keberhasilan kultur

antera dalam pembentukan embrio pada kultur mikrospora juga dipengaruhi oleh

faktor praperlakuan dan faktor media. Berdasarkan hasil penelitian yang

dilakukan oleh Shirdelmoghanloo et al. (2009) pada kultur mikrospora Triticum

aestivum, dapat diketahui bahwa dengan memberikan kombinasi praperlakuan

dingin (4oC) dan manitol (0,3M) selama 3 minggu dapat menghasilkan jumlah

embrio tertinggi yaitu berkisar 112 embrio per malai dibandingkan tanpa

praperlakuan (kontrol) yang hanya mampu menghasilkan embrio berkisar 43 per

malai. Media perlakuan terbaik untuk menginduksi embrio Triticum aestivum

tersebut adalah media MT dengan penambahan ZPT 0,2 mg/l 2,4-D + 0,2 mg/l

kinetin + 1 mg/l IAA dengan jumlah embrio yang dihasilkan yaitu 190 per malai.

Antera mengandung serbuk sari (polen), sehingga kultur antera berarti

mengikutsertakan polen didalamnya. Polen akan beregenerasi menjadi tanaman

haploid yang tidak memiliki pasangan kromosom yang homolog sehingga pada

saat meiosis berlangsung, kromosom - kromosomnya tidak berpasang pasangan,

seperti halnya pada tanaman diploid, sehingga individu – individu haploid untuk

tanaman diploid bersifat steril. Oleh sebab itu perlu dilakukan penggandaan

kromosom untuk mendapatkan tanaman yang fertil dengan menggunakan bahan

kimia seperti penggunaan kolkisin yang sifatnya dapat menginduksi poliploidi

(Bhojwani dan Razdan 1993; Croughan 1995; Ferrie dan Keller 1995).

Selain secrara sitologi, tanaman haploid dapat dibedakan dengan tanaman

diploid dengan cara morfologi terutama pada saat tanaman tersebut sudah

dipelihara dalam rumah kaca. Perbedaannya terdapat pada tinggi tanaman, warna,

13

ukuran daun, perkembangan akar, dan vigor tanaman. Muswita (2003)

menyatakan pada tanaman cabai haploid, ukuran daun lebih kecil dibandingkan

dengan tanaman diploid dan bersifat steril.

Penggunaan tanaman haploid ganda (double haploid) dalam pemuliaan

akan lebih efisien dalam mengidentifikasi genotipe - genotipe superior karena

tanaman tersebut akan mengekspresikan semua sifat-sifatnya. Manfaat dari

tanaman haploid ganda: (1) sebagai tetua untuk mendapatkan hibrida F1, (2)

pemuliaan mutasi karena dapat dilakukan untuk skrening mutan dominan dan

resesif pada generasi pertama setelah perlakuan mutagen, (3) bahan tanaman

dalam penembakan gen, dan (4) seleksi transgen (Lentini et al. 1995).

Faktor yang mempengaruhi keberhasilan kultur antera

1. Genotipe tanaman donor

Genotipe dari antera memegang peranan penting dalam menentukan

berhasil atau tidaknya kultur antera. Hasil penelitian Hoque et al. (2007) pada

tanaman Trapa sp melaporkan dari 18 genotipe tanaman yang diuji, hanya 15

genotipe tanaman yang memiliki kemampuan untuk diinduksi membentuk kalus.

Hal tersebut menjelaskan bahwa tiap-tiap genotipe tanaman memiliki respon yang

berbeda dalam hal kemampuannya dalam menginduksi kalus.

Munarso et al. (2008) dalam penelitiannya menyatakan bahwa, setiap

genotipe (kombinasi persilangan) mempunyai kemampuan yang berbeda dalam

menghasilkan kalus. Pada penelitiannya yang menggunakan eksplan antera padi

dapat diketahui jumlah kalus terbanyak dihasilkan oleh IR58025A/BP51-1, rata-

rata tiga butir kalus/cawan petri, IR68897A/RHS412 menghasilkan 2-3 butir

kalus/cawan petri, IR62829A/MTU 9992 menghasilkan tiga butir kalus/cawan

petri, sedangkan IR68886A/Bio-9 menghasilkan satu butir kalus/cawan petri.

Kemampuan antera dalam menghasilkan kalus sangat beragam diantara keempat

genotipe yang dipergunakan. Persentase induksi kalus tertinggi diperoleh dari

IR58025A/BP51-1 sebesar 2,70%, lebih tinggi dari IR68897A/RHS412 (2,04%),

IR62829A/MTU 9992 (1,56%),dan IR68886A/Bio-9 (0,91%).

14

2. Komposisi media kultur

Salah satu faktor paling penting yang berkaitan dengan pertumbuhan dan

morfogenesis dari jaringan tanaman adalah komposisi dari media kultur. Media

dalam kultur jaringan tanaman umumnya terdiri dari komponen hara makro, hara

mikro, vitamin, asam amino atau suplemen nitrogen lainnya, gula, bahan organik,

bahan pemadat (agar) dan zat pengatur tumbuh. Optimasi media terseleksi

umumnya dilakukan untuk meningkatkan kemampuan medium dalam

menginduksi pembentukan kalus, embrio, maupun regenerasi eksplan yang

dikultur (Hu dan Zeng 1984).

Menurut Sugiri dan Anton (2006), media kultur jaringan dibedakan

menjadi media dasar dan media tambahan. Komposisi media dasar mengandung

hara baik makro maupun mikro, sumber energi dan vitamin yang jumlah dan

jenisnya tergantung dari penemunya. Komposisi media tambahan dapat berupa

vitamin, senyawa organik komplek atau zat pengatur tumbuh. Zat pengatur

tumbuh khususnya auksin dan sitokinin adalah suatu zat organik utama yang

mengendalikan proses morfogenesis di dalam teknik kultur jaringan.

Media dasar yang sering digunakan untuk kultur antera pada jeruk adalah

media Murashige and Tucker (Geraci dan Starrantino 1990; Deng et al. 1992;

Froelicher dan Ollitrault 2000). Berdasarkan hasil penelitian Gioi et al. (2002)

untuk induksi kalus antera padi, antera ditanam pada tiga media dasar yaitu MS,

LS dan N6, diperoleh hasil bahwa persentase rata-rata tertinggi antera yang dapat

terinduksi menjadi kalus (35,3%) terdapat pada antera yang ditumbuhkan pada

media dasar N6. Media kultur jaringan tanaman disamping menyediakan unsur

hara makro dan hara mikro juga diberi karbohidrat yang pada umumnya berupa

gula untuk menggantikan karbon. Hasil yang lebih baik pada kultur antera akan

diperoleh apabila kedalam media tersebut ditambahkan vitamin-vitamin, asam

amino, atau zat pengatur tumbuh.

3. Kondisi tanaman (eksplan)

Umur dan kondisi fisiologis eksplan sering mempengaruhi keberhasilan

kultur antera. Secara umum, respon yang paling baik berasal dari bunga pertama

yang dihasilkan oleh tanaman, dan antera yang dikulturkan harus berasal dari

bunga yang masih kuncup. Berbagai faktor lingkungan yang mempengaruhi

15

pertumbuhan tanaman donor juga mempengaruhi tanaman dihaploid yang

dihasilkan. Intensitas cahaya, lama penyinaran dan suhu diketahui mempengaruhi

jumlah tanaman dihaploid yang dihasilkan pada beberapa spesies. Kondisi

pertumbuhan optimum yang spesifik berbeda antara tanaman yang satu dengan

yang lainnya. Secara umum hasil terbaik akan diperoleh dari tanaman yang

pertumbuhannya sehat dan vigor (Nasir (2002).

4. Pra perlakuan antera

Salah satu faktor yang menentukan keberhasilan induksi embriogenesis

mikrospora ialah praperlakuan terhadap antera sebelum inisiasi kultur. Sebelum

diintroduksikan pada lingkungan in vitro, antera dapat diberi praperlakuan

cekaman seperti pemberian manitol pada suhu rendah selama periode waktu

tertentu (Kyo dan Harada 1986; Immonen dan Antilla 1999). Perlakuan cekaman

menyebabkan proses metabolisme pada jaringan akan terhenti untuk sementara

dan setelah periode waktu tertentu jaringan tersebut akan mulai berkembang lagi

dengan lintasan metabolisme yang baru apabila berada pada kondisi lingkungan

yang mendukung (Immonen dan Antilla 1999).

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Tang et al. (2007) pada

antera Mamordica charantia diperoleh hasil bahwa antera dari varietas Bixiu,

Dabai, Changhai dan Pangniu yang dipergunakan sebagai eksplan yang disimpan

pada suhu 40 C selama 24 jam menghasilkan persentase kalus paling tinggi

masing-masing sebesar 73,16 %; 69,89 %; 60,32 % dan 62,01 % apabila

dibandingkan dengan antera yang disimpan pada suhu yang sama (40C) selama 0,

48, 72, 96, dan 120 jam. Berdasarkan penelitian tersebut, antera yang disimpan

selama lebih dari 120 jam tidak menghasilkan kalus dan berakibat pada kondisi

antera yang menjadi kecoklatan dalam 1 minggu.

Praperlakuan cekaman juga berperan dalam pembelokan jalur

perkembangan gametofitik ke arah sporofitik untuk menghasilkan embrio.

Keberhasilan pembelokan jalur perkembangan gametofitik ke arah sporofitik telah

berhasil dilakukan Dus et al. (2002) dengan memberikan praperlakuan dingin

10oC selama 14 hari pada antera tanaman jagung dapat meningkatkan jumlah

embrio jagung. Tsay (1982) juga mengemukakan hal yang sama, bahwa dengan

16

memberikan praperlakuan nitrogen 15 mM dapat meningkatkan embrio dari

mikrospora tanaman tembakau. Tanpa cekaman mikrospora akan berkembang

menjadi polen masak yang normal.

Produktivitas kultur antera pada beberapa spesies tanaman dipengaruhi

oleh perlakuan pemberian suhu pada kuncup bunga sebelum proses sterilisasi dan

isolasi antera. Produktivitas tanaman dihaploid tembakau yang dihasilkan sering

meningkat dengan perlakuan penyimpanan kuncup bunga pada suhu 7 - 8 oC

selama 12 hari (Sunderland dan Robert 1979).

5. Tingkat perkembangan mikrospora

Antera hanya responsif selama fase uninukleat dari perkembangan polen

pada sebagian besar jenis tanaman. Sebaliknya, pada tanaman tembakau respon

optimum ditemukan pada beberapa saat sebelum, selama dan sesudah fase mitosis

pertama dari polen (akhir fase uninukleat hingga awal binukleat dari mikrospora)

(Hidaka et al. 1984). Embriogenesis mikrospora dilakukan dengan cara

membelokkan perkembangan gametofitik kearah sporofitik untuk menghasilkan

embrio dan tanaman melalui embriogenesis (Touraev et al. 1997). Pra perlakuan

stres berperan dalam pembelokan jalur perkembangan tersebut, tanpa stres

mikrospora akan berkembang menjadi pollen masak yang normal (Heberle 1999).

Stres dapat berupa temperatur (rendah dan tinggi), osmotik, pemberian

nitrogen dan karbohidrat. Stres dapat diaplikasikan pada level tanaman utuh,

kuncup bunga, antera atau langsung pada mikrospora. Palmer dan Keller (1997)

menyebutkan bahwa temperatur tinggi dapat mempengaruhi embriogenesis

mikrospora tembakau, datura, brasika dan cabai, sedangkan Touraev et al. (1997)

dalam penelitiannya mendapatkan bahwa pemberian karbohidrat dan nitrogen

dapat meningkatkan mikrospora yang embriogenik pada tembakau.

Perkembangan Mikrospora

Proses terbentuknya mikrospora dalam mikrosporangia pada antera

disebut dengan mikrosporosis. Terbentuknya mikrospora ditandai dengan

perubahan – perubahan yang terjadi pada antera. Antera mempunyai bentuk sel-

sel yang hampir sama pada waktu masih muda, kecuali sel-sel epidermis. Pada

keempat sudut antera kemudian mulai terbentuk ruangsari (inculamentum) yang

17

mempunyai banyak sekali sel yang disebut dengan mikrospora atau pollen mother

cell (Raven et al. 1992).

Polen mengalami pembelahan meiosis yang terdiri dari dua tahap. Tahap

pertama adalah pembelahan meiosis I, merupakan pembelahan reduksi karena dari

satu sel dengan 2n kromosom membentuk dua sel dengan (n) kromosom.

Pembelahan tahap kedua adalah pembelahan mitosis, yaitu dari satu sel dengan

(n) kromosom menjadi dua sel dengan (n) kromosom, sehingga pembelahan

reduksi dari 1 sel 2n kromosom menjadi 4 sel dengan (n) kromosom. Keempat sel

yang terjadi sampai dewasa masih berlekatan terus dinamakan pollentetrad.

Kemudian pollentetrad yang berlekatan melepaskan diri sehingga terbentuk

pollen dengan inti satu. Polen inti satu yang masih muda dinamakan fase

uninukleat, dimana polen sudah mempunyai satu inti vegetatif dan satu vacuola,

kemudian inti sel membelah menjadi dua gamet jantan, yang besar dinamakan inti

vegetatif dan yang kecil disebut inti generatif yang dikenal dengan fase binukleat

seperti terlihat pada Gambar 6 (Suryowinoto 1996).

Gambar 6. Tahapan perkembangan inti mikrospora (Suryowinoto 1996)

Polen yang masih muda atau mikrospora yang terkandung dalam antera

dapat secara langsung beregenerasi membentuk embrio atau membentuk kalus

yang selanjutnya dapat diinduksi untuk bergenerasi menjadi tanaman dengan

pengaruh zat pengatur tumbuh yang terkandung dalam media tanam. Dengan

aplikasi teknik tersebut, tanaman dihaploid dapat diregenerasikan secara langsung

18

dari gamet jantan maupun betina tanpa melalui proses pembuahan (Bhojwani dan

Radzan 1993).

Media yang digunakan pada Kultur Antera

Androgenesis dapat diinduksi pada media sederhana seperti yang

dikembangkan oleh Nitsch untuk polen tanaman tembakau dan beberapa spesies

lainnya. Media yang umum digunakan untuk sebagian besar spesies adalah

Murashige dan Skoog dan N6 (Chu 1978) atau variasi kedua media tersebut.

Media perlu diperkaya dengan senyawa organik komplek seperti ekstrak kentang,

air kelapa dan kasein hidrolisat. Pada sebagian besar spesies tanaman, sukrosa

yang digunakan dalam media antara 2 - 3% sementara untuk beberapa spesies lain

khususnya tanaman serealia responnya lebih baik apabila konsentrasi gulanya

lebih tinggi (hingga 15%). Pada kultur antera jeruk, sumber karbohidrat yang

banyak digunakan adalah sukrosa 5% (Hidaka 1987; Froelicher dan Ollitrault

2000).

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Tang et al. (2007) pada

antera Balsam pear, diperoleh hasil bahwa pembentukan kalus tertinggi diperoleh

apabila pada media ditambahkan 2.4 D 0,5 mg/l dan BA 2 mg /l yaitu sebesar

79,42 %. Penggunaan konsentrasi 2,4-D 1,0 mg/l yang dikombinasikan dengan

kinetin 0,1 mg/l sampai 0,3 mg/l merupakan konsentrasi yang paling optimal

untuk menginduksi kalus. Penggunaan konsentrasi 2,4-D yang rendah (0,1 mg/l

dan 0,5 mg/l) menyebabkan sel - sel tanaman belum mampu meningkatkan

kemampuan jaringan untuk melakukan diferensiasi (Syahid et al. 2007).

Prahardini dan Sudaryono (1992) membuktikan bahwa penambahan 3

mg/l NAA dan 2 mg/l BA efektif untuk menginduksi kalus antera pepaya dimana

jumlah kultur per kalus meningkat seiring dengan peningkatan NAA dari 1 mg/l

sampai 3 mg/l. Berdasarkan kebutuhan zat pengatur tumbuh untuk pembentukan

kalus, maka dalam media tanam perlu ditambahkan auksin dan sitokinin. Interaksi

kedua zat ini mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis jaringan tanaman.

Inisiasi akar pada planlet, embriogenesis, dan inisiasi kalus umumnya terjadi

apabila perbandingan konsentrasi auksin terhadap sitokinin lebih tinggi,

19

sementara proliferasi tunas adventif dan aksilar terjadi apabila perbandingannya

lebih rendah (George et al. 2008)

Pikloram merupakan zat pengatur tumbuh yang termasuk ke dalam

kelompok auksin sintetik yang berperan dalam pembentukan dan pertumbuhan

kalus. Peranan pikloram telah diketahui dalam proliferasi kalus pada kultur

jaringan tanaman kina. Sumaryono dan Riyadi (2005) menyatakan proliferasi

kalus terbaik pada medium WP diperoleh dengan pemberian pikloram 15 atau 30

μM yang dikombinasikan dengan BAP 0,5 μM. Kalus pada medium WP ini

tumbuh dengan sangat cepat, bobot basah kalus meningkat 12 - 14 kali dari bobot

awal dalam waktu 6 minggu. Kalus yang diperoleh bertekstur remah, berwarna

putih dan tidak mudah mengalami pencokelatan walaupun disubkultur

berulangkali. Marlina (2009) juga menyatakan media MS + 2 mg/l pikloram + 2

mg/l tidiazuron + 2 mg/l zeatin memberikan pengaruh positif untuk induksi kalus

tanaman.

Kultur Antera pada Tanaman Jeruk

Penelitian pada tanaman jeruk secara kultur jaringan (in vitro) sudah

banyak dilakukan, dan pada umumnya menggunakan eksplan jaringan tanaman

yang masih muda karena sel – selnya masih aktif membelah. Salah satu penelitian

tanaman jeruk yang masih mempunyai tingkat keberhasilan yang rendah adalah

penelitian kultur antera. Keberhasilan kultur antera dipengaruhi oleh genotipe,

kondisi tumbuh tanaman donor, tingkat perkembangan mikrospora, pra perlakuan,

media, dan lingkungan yang mendukung (Wehr dan Wenzel 1993). Germana

(2000) dalam Maluszynski et al. 2003 menyatakan persentase kalus tertinggi

Citrus clementiana dihasilkan pada media MS + 5% sukrosa + 0,02 mg/l NAA.

Salah satu faktor yang mempengaruhi keberhasilan kultur antera adalah

praperlakuan sebelum kultur antera. Chen (1985) memberikan praperlakuan

dingin 3oC selama 0 - 25 hari pada bunga Citrus madurensis, dan praperlakuan

dingin (3oC) selama 5-10 hari merupakan praperlakuan terbaik untuk menginduksi

kalus dan embrio C. madurensis. Germana dan Chiancone (2003)

membandingkian efek pemberian temperatur tinggi (40 o

C) selama 24 jam dan

temperatur rendah (4 o

C) selama 10 hari Citrus clementina. Hasil penelitian

20

menyatakan pemberian temperatur rendah (4 o

C) selama 10 hari merupakan

praperlakuan yang terbaik untuk menginduksi kalus antera Citrus clementina.

Faktor lain yang mempengaruhi keberhasilan kultur antera adalah sumber

karbon. Hidaka (1987) melakukan penelitian kultur antera pada Citrus sinensis

dan Citrus aurentum dengan memberikan sukrosa (1, 3, 5, 7, dan 9)%. Hasil

penelitian menyatakan pemberian sukrosa 1% dapat menginduksi kalus dan

embrio Citrus sinensis sebanyak 30%, dan pemberian sukrosa 7% merupakan

konsentrasi yang paling baik untuk menginduksi kalus dan embrio Citrus

aurentum. Ling et al (1988) menyatakan bahwa persentase embrio tertinggi

(0,92%) diperoleh dengan pemberian 2mg/l IAA pada Citrus madurensis.

Berbeda dengan pernyataan Geraci and Starrantino (1990) yang menyatakan

pemberian 1 mg/l BAP dan 0,5 mg/l 2,4-D merupakan media terbaik untuk

menginduksi kalus dengan persentase tertinggi (25%) pada Citrus reticulata,

Citrus deliciosa, dan Citrus paradisi, sedangkan pada Citrus sinensis pemberian 1

mg/l NAA dan 1 mg/l BAP merupakan media terbaik untuk meninduksi kalus

sebanyak 44,2% (Drira dan Benbadis 1975).

21

METODOLOGI PENELITIAN

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan mulai bulan Desember 2009 sampai dengan

Januari 2011 di laboratorium kultur in vitro kelompok Peneliti Biologi Sel dan

Jaringan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan

Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor (BB-BIOGEN) dan di laboratorium kultur

jaringan Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian Institut

Pertanian Bogor.

Bahan dan Alat

Bahan tanam yang digunakan dalam penelitian ini adalah kuncup bunga

jeruk keprok Batu 55 (Citrus reticulata L), jeruk keprok Garut (Citrus reticulata

L), Jeruk Siam (Citrus sinensis L) dan jeruk Pamelo (Citrus maxima L). Peralatan

yang digunakan adalah Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), autoklaf, mikropipet,

alat-alat diseksi (pinset, gunting, dan skalpel), pH meter, botol kultur, peralatan

gelas, bunsen dan sprayer.

Metode Penelitian:

1. Studi tahapan perkembangan inti mikrospora antera jeruk

Bahan yang digunakan adalah kuncup bunga jeruk keprok Garut, keprok

Batu 55, dan jeruk Siam dengan perbandingan ukuran sepal : petal = kecil (1:2;

1:2,5; 1:3) mm; Sedang (1:4; 2:5; 2:6) mm; dan Besar (2:7; 2:8; 2:9) mm. Pada

kuncup bunga jeruk Pamelo mempunyai perbandingan ukuran sepal : petal = kecil

(6:10; 6:11; 6:12) mm; Sedang (6:14; 6:15; 6:17) mm; dan Besar (7:19; 7:20;

7:21) mm. Pengamatan mikrospora dilakukan dengan memecah kantung antera,

kemudian mikrospora diisolasi dan diletakkan di atas preparat lalu diberi aquadest

dua tetes. Penghitungan dilakukan secara mikroskopik dengan perbesaran 400x.

Tahap perkembangan mikrospora yang diamati adalah (1) persentase tahap inti

tunggal (uninucleate), (2) persentase tahap inti dua (binucleate), dan (3) tidak

teramati. Pengamatan mikrospora dilakukan empat kali bidang pandang

mikroskop, dan diulang minimal tiga kali untuk setiap ulangan.

22

2. Studi praperlakuan lama penyimpanan antera terhadap kemampuan

induksi kalus jeruk Keprok Garut

Rancangan lingkungan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap

(RAL) faktor tunggal yaitu praperlakuan penyimpanan pada suhu dingin (10oC)

dengan 4 taraf yaitu (1; 3; 5; dan 7) hari. Setiap perlakuan terdiri dari 5 ulangan,

dan setiap botol merupakan satu ulangan, dimana dalam satu botol berisi 10

antera. Pengamatan dilakukan sampai minggu ke-8.

Kuncup bunga jeruk Keprok Garut yang mempunyai tahapan

perkembangan inti mikrospora uninukleat yang tinggi, dimasukkan ke dalam

tabung reaksi dan ditutup dengan aluminium foil, lalu tabung reaksi dimasukkan

ke dalam botol yang telah berisi air dan dimasukkan dalam lemari pendingin

(10oC) sesuai dengan perlakuan. Antera kemudian diisolasi dari kuncup bunga

dan ditanam pada media dasar Murashige dan Tucker (MT) yang ditambahkan 10

mg/l pikloram. Peubah yang diamati dalam percobaan ini adalah: jumlah antera

yang membesar / membengkak dan jumlah antera yang menghasilkan kalus.

3. Induksi kalus pada antera jeruk Keprok Batu 55, jeruk Siam dan jeruk

Pamelo

Antera jeruk Keprok Batu 55, jeruk Siam dan jeruk Pamelo yang telah

mendapatkan praperlakuan dingin (10oC) terbaik (5 hari) ditanam pada berbagai

komposisi media induksi kalus.

3.1 Jeruk keprok Batu 55

Rancangan yang digunakan adalah RAL faktor tunggal yaitu perlakuan

jenis media dengan 3 taraf yaitu; (1) Padat; (2) Padat + Cair; (3) Cair. Setiap

perlakuan terdiri atas 14 ulangan dimana setiap botol merupakan satu ulangan dan

dalam satu botol berisi 8 antera. Komposisi media yang digunakan adalah media

dasar MT + 3 mg/l BAP + 500 mg/l ekstrak malt. Media dipadatkan dengan

phytagel 2 g/l kecuali media cair, pH media diatur pada 5,8. Kultur diinkubasi

pada ruang gelap. Sub kultur dilakukan dua kali dalam sebulan sampai 4 kali sub

kultur pada media yang sama. Peubah yang diamati dalam percobaan ini adalah:

jumlah antera yang membengkak, dan jumlah antera yang menghasilkan kalus.

23

3.2 Jeruk Siam

Rancangan lingkungan yang digunakan adalah RAL faktor tunggal yaitu

perlakuan 2,4-D dengan 3 taraf yaitu: 3mg/l, 5 mg/l, dan 7 mg/l. Setiap perlakuan

terdiri dari 15 ulangan dimana setiap botol merupakan satu ulangan dan dalam

satu botol berisi 7 antera. Antera jeruk Siam ditanam pada media dasar MT + 500

mg/l ekstrak malt. Media dipadatkan dengan phytagel 2 g/l, pH media diatur pada

5,8 dan diinkubasi pada ruang gelap. Sub kultur dilakukan dua kali dalam sebulan

sampai 4 kali sub kultur pada media yang sama. Peubah yang diamati dalam

percobaan ini adalah: jumlah antera yang membengkak, dan jumlah antera yang

menghasilkan kalus.

3.3 Jeruk Pamelo

Rancangan lingkungan yang digunakan adalah RAL faktor tunggal yaitu

perlakuan media (3 mg/l BAP dan NAA) dengan 3 taraf yaitu: (1) 1 mg/l NAA;

(2) 2 mg/l NAA; (3) 3mg/l NAA. Setiap perlakuan terdiri dari 15 ulangan dimana

setiap botol merupakan satu ulangan dan dalam botol berisi 5 antera. Antera yang

ditanam adalah antera yang mengandung mikrospora dengan inti tunggal tinggi

dan telah mendapatkan praperlakuan dingin (10oC) diinduksi pada media dasar

MT + kombinasi (3 mg/l BAP dan NAA) + 500 mg/l ekstrak malt. Semua

perlakuan media dipadatkan dengan phytagel 2 g/l kecuali media cair, pH media

diatur pada 5,8 dan diinkubasi pada ruang gelap. Sub kultur dilakukan dua kali

dalam sebulan sampai 4 kali sub kultur pada media yang sama.

Semua hasil penelitian (studi praperlakuan lama penyimpanan pada antera

jeruk keprok Garut, induksi kalus pada jeruk keprok Batu 55 dan jeruk Siam serta

jeruk Pamelo) dianalisis dengan menggunakan analisis ragam (uji F) pada taraf

nyata (α) 5% dengan bantuan program SAS 9.1. Apabila hasil uji nyata,

dilanjutkan dengan uji wilayah berganda Duncan (Duncan’s Multiple Range Test-

DMRT).

24

Analisis Kromosom

Jumlah kromosom kalus jeruk dianalisis dengan menggunakan Metode

Pra-perlakuan Lengkap (Sastrosumarjo 2006). Kalus dimasukkan kedalam botol

yang berisi larutan 8-Hydroxyquinolin 0,002 M. Botol dimasukkan ke dalam

lemari pendingin (4oC) selama 90 menit, lalu kalus dikeluarkan dan dicuci dengan

air. Kalus yang telah dicuci dengan air, direndam dalam asam asetat 45% selama

10 menit kemudian dimasukkan dalam botol berisi campuran HCl dengan asam

asetat 45% perbandingan 3:1 selama 2 menit, lalu dipanaskan dalam waterbath

dengan suhu 60oC selama 2 menit.

Kalus dipindahkan ke gelas arloji, kemudian diteteskan aceto orcein 2%

dan biarkan selama 10 menit. Kalus diletakkan pada gelas objek, kemudian

diberikan 2 tetes aceto orcein 2% lalu ditutup dengan gelas penutup. Preparat

dilewatkan di atas api bunsen 2-3 kali kemudian preparat diketuk dengan pensil

berkaret (squash), lalu ditekan dengan ibu jari. Preparat siap diamati dibawah

mikroskop.

25

HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Kondisi Umum Percobaan

Sejumlah faktor lingkungan yang berpengaruh terhadap pertumbuhan dan

perkembangan kultur adalah suhu, cahaya, karbondioksida, oksigen, etilen, dan

kelembaban (Zulkarnain 2009). Read (1990) menyatakan bahwa faktor suhu

berpengaruh secara langsung terhadap perkembangan sel dan jaringan,

pembentukan organ tanaman, dan berkaitan erat dengan siklus perkembangan

tanaman. Suhu penyebab terjadinya morfogenesis tidak selalu sama pada setiap

spesies tanaman. Pada tanaman tomat, perlakuan suhu 19oC pada beberapa saat

dapat meningkatkan potensi regenerasinya. Sementara itu, pada eksplan tangkai

bunga Brassica napus pembentukan pucuk adventif terbaik diperoleh pada suhu

24oC. Laboratorium tempat dilakukannya penelitian sangat menjaga kestabilan

suhu ruang kultur supaya tetap terjaga pada kisaran 25 - 28oC (Gambar 7A).

Kestabilan suhu ruang kultur tersebut dibantu dengan kondisi Air Conditioner

(AC) yang tetap dihidupkan selama 24 jam.

Faktor lain yang mempengaruhi perkembangan eksplan ialah intensitas

cahaya. Intensitas cahaya selalu dijaga dengan baik agar tanaman dapat

melakukan morfogenesis. Penelitian yang tidak membutuhkan cahaya seperti

induksi kalus dilakukan di ruangan gelap. Laju fotosintesis pada kebanyakan

tanaman yang dikulturkan secara in vitro pada umumnya relatif rendah karena

kebutuhan karbohidrat sudah dipenuhi melalui suplai sukrosa dari medium.

Menurut George dan Sherrington (1984), pertumbuhan jaringan tanaman secara in

vitro membutuhkan cahaya untuk mendapatkan pertumbuhan dan morfogenesis

yang optimal. Sebaliknya untuk inisiasi pembelahan sel pada eksplan dan

pertumbuhan kalus tidak diperlukan adanya cahaya.

Faktor lingkungan lain yang menentukan keberhasilan kultur jaringan

adalah kelembaban. Kelembaban relatif di dalam ruangan sekitar 70%, namun

kebutuhan kelembaban di dalam wadah kultur mendekati 90%. George dan

Sherrington (1984) menyatakan bahwa embrioid Daucus carota tumbuh sangat

baik pada kelembaban 80 – 90% dan akan mati apabila kelembaban di bawah

60%. Kadar kelembaban yang terlalu tinggi di dalam wadah kultur dapat

26

menyebabkan terbentuknya daun – daun pucuk yang mengalami vitrifikasi (Read

1990).

Keberhasilan kultur jaringan dapat tercapai apabila media yang digunakan

tidak mengalami kontaminasi. Kontaminasi berasal dari eksplan atau media yang

digunakan. Kecilnya kontaminasi disebabkan oleh tersedianya autoklaf

bertekanan tinggi, sehingga dapat menyebabkan denaturasi pada mikroba. Selain

itu, ruang pembuatan media juga harus disterilkan secara periodik dengan

menggunakan formalin (Gambar 7B). Faktor lain yang menyebabkan kecilnya

angka kontaminasi adalah laminar air flow, karena sebelum digunakan laminar

selalu disterilkan dengan sinar UV (Gambar 7C). Jenis kontaminan yang

ditemukan berupa cendawan dengan hifa yang berwarna putih sedikit merah

muda, cendawan berwarna kehitaman, bakteri berwarna putih susu, dan bakteri

berwarna kuning susu. Jenis kontaminan tersebut dapat dikenali dari penampilan

fisiknya. Dari keempat jenis kotaminan yang ditemukan, cendawan yang

berwarna hitam yang paling cepat pertumbuhan dan perkembangbiakannya, dan

cendawan tersebut mampu menutupi seluruh permukaan media kultur. Akibatnya

eksplan tidak mampu tumbuh yang akhirnya akan mati.

Gambar 7. Kondisi umum laboratorium :A. Ruang kultur, B. Ruang pembuatan

media, C. Laminar air flow

2. Studi Tahapan Perkembangan Inti Mikrospora Antera Jeruk

Stadium perkembangan mikrospora merupakan faktor yang sangat penting

dalam menentukan keberhasilan induksi kalus pada kultur antera. Stadium

mikrospora yang paling responsif untuk membentuk embrio adalah stadium

uninukleat akhir (Dunwell 1996). Stadium uninukleat akhir ditandai dengan posisi

inti mikrospora berada di tepi karena terdesak oleh vakuola yang besar (Indrianto

C A B

27

et al. 2004). Hal ini sesuai dengan hasil penelitian yang telah dilakukan oleh

Wahidah (2010) yang menyatakan bahwa fase uninukleat akhir mempunyai

peluang yang lebih besar dalam mengiduksi terjadinya kalus pada kultur

mikrospora tanaman tembakau.

Tabel 1. Persentase perkembangan inti mikrospora pada jeruk keprok Garut,

keprok Batu 55, dan jeruk Siam pada ukuran rasio sepal dan petal yang

berbeda

Fase perkembangan mikrospora pada bunga dapat ditandai dengan

perubahan morfologi bagian bunga melalui bertambah panjangnya ukuran sepal

dan petal bunga. Secara umum hasil pengamatan menunjukkan bahwa terdapat

hubungan antara ukuran sepal dan petal bunga terhadap fase perkembangan inti

mikrospora. Bunga yang mempunyai ukuran sedang mengandung mikrospora inti

satu paling banyak baik pada bunga jeruk keprok Garut, keprok Batu 55, dan

jeruk Siam (Tabel 1). Pada bunga jeruk keprok Garut, persentase inti satu berkisar

antara 78,2 – 91,4%, bunga jeruk keprok Batu 55 mencapai 78,2 – 85,6% dan

bunga jeruk Siam berkisar 79,4 – 90,5% dari total mikrospora yang diamati.

Berdasarkan hasil pengamatan perkembangan inti mikrospora jeruk keprok

Garut, dapat diketahui bahwa bunga dengan ukuran kecil berdasarkan ukuran

sepal dan petal bunga mempunyai mikrospora terbanyak berada pada fase tetrad

(40,5 – 73,6)% dan tidak teramati (5,1 – 45,1) %. Inti mikrospora tidak dapat

Rasio bunga (mm) Sepal: Petal

Keprok Garut Keprok Batu 55 Siam Perkembangan inti mikrospora (%)

Tetrad

Inti satu

Inti dua

Tidak terama

ti

Tetrad Inti satu

Inti dua

Tidak terama

ti

Tetrad Inti satu

Inti dua

Tidak terama

ti KECIL

1 : 2 40,5 14,4 - 45,1 35,3 8,6 - 56,1 33,6 11,6 - 54,8

1 : 2,5 66,0 18,1 4,5 11,4 54,2 11,6 - 34,2 51,1 13,1 - 35,8

1 : 3 73,6 21,3 - 5,1 75,8 15,8 - 8,4 68,5 18,4 - 13,1

SEDANG

1 : 4 7,8 91,4 0,8 - 8,8 81,1 10,1 - 20,6 79,4 - -

2 : 5 10,1 85,5 4,4 - 5,4 85,6 9,0 - 3,5 90,5 6,0 -

2 : 6 19,4 78,2 2,4 - 13,4 78,2 8,4 - 17,6 82,4 - -

BESAR

2 : 7 - 9,3 78,4 12,3 1,4 21,3 77,3 - - 15,4 70,6 4,0 2 : 8 - 15,5 45,2 39,4 1,2 8,2 65,2 25,4 - - 10,3 89,7

2 : 9 2,4 8,2 76,4 3,0 1,2 7,1 75,3 15,4 3,9 8,2 76,4 1,5

28

diamati keberadaannya karena masih berupa mother cell kemudian kromosom

mengalami kondensasi di bagian tengah sel pada tahap sel induk polen (mother

cell) dan sel induk polen mengalami pembelahan meiosis membentuk tetrad

(Septiani 2008).

Bunga dengan ukuran sedang mempunyai mikrospora uninukleat banyak

berkisar 78,2 – 91,4%. Wahidah (2010) menyatakan bahwa stadium uninukleat

awal - tengah memiliki ciri-ciri mikrospora berbentuk bulat dengan vakuola yang

kecil dan pada stadium uninukleat akhir kedudukan inti makin ke pinggir dan

ukuran vakuola semakin besar bahkan menempati sebagian besar volume sel. Hal

tersebut sesuai dengan hasil penelitian Kosmiatin et al. (2009) pada bunga jeruk

keprok Garut, dimana bunga jeruk keprok dengan ukuran mahkota kuncup bunga

antara 5-6 mm, memiliki persentase mikrospora dengan inti tunggal terbanyak

yaitu berkisar antara 84,05 – 100%. Bunga dengan ukuran besar didominasi oleh

mikrospora binukleat berkisar 45,2 – 78,4%. Stadium binukleat dicirikan dengan

adanya 2 inti dalam mikrospora tersebut. Perkembangan inti mikrospora mulai

dari tetrad sampai tidak teramati dapat dilihat pada Gambar 8.

Gambar 8. Perkembangan inti mikrospora jeruk keprok Batu 55: A. Mikrospora

berada pada fase tetrad; B. Mikrospora dengan inti satu; C.

Mikrospora inti dua; D. Tidak teramati.

A B

D C

29

Ukuran sepal dan petal bunga dari ketiga jenis jeruk (Keprok Garut,

keprok Batu 55, dan jeruk Siam) mempunyai ukuran sepal dan petal bunga yang

tidak begitu berbeda sehingga mempunyai perkembangan inti mikrospora yang

hampir sama. Bunga dengan ukuran kecil didominasi oleh mikrospora yang

berada pada fase tetrad (35,3 – 75,8)% dan mother cell (8,4 – 56,1)%, bunga

ukuran sedang didominasi oleh mikrospora uninukleat (78,2 – 85,6)%, dan bunga

dengan ukuran besar didominasi oleh mikrospora inti dua (65,2 – 77,3)%.

Semakin panjang ukuran kuncup bunga maka stadium perkembangan

mikrospora semakin dewasa. Fase perkembangan inti mikrospora pada bunga

jeruk Siam dengan ukuran kecil paling banyak terdapat fase tetrad berkisar 33,6 –

68,5% dan fase yang tak teramati (mother cell) berkisar 13,1 – 54,8% dan yang

paling sedikit berada pada fase uninukleat berkisar 11,6 – 18,4% dan tidak

terdapat mikrospora yang berada pada fase binukleat. Bunga dengan ukuran

sedang mempunyai mikrospora paling banyak berada pada fase inti satu (79,4 –

90,5)% dan bunga dengan ukuran besar mempunyai mikrospora paling banyak

terdapat pada fase inti dua (10,3 -76,4)% dan tidak teramati atau sudah termasuk

kategori polen yang sudah matang berkisar 1,5 – 85,7%.

Bunga jeruk Pamelo mempunyai ukuran sepal dan petal yang lebih

panjang dan tebal dibandingkan dengan ketiga jenis jeruk (keprok Garut, keprok

Batu 55, dan jeruk Siam) seperti terlihat pada Gambar 9. Oleh sebab itu

perbandingan ukuran sepal dan petal untuk mengelompokkan bunga besar, sedang

dan kecil juga berbeda, akan tetapi persentase perkembangan inti mikrospora pada

bunga yang sudah dikelompokkan hampir sama (Gambar 9).

Gambar 9. Perbandingan ukuran sepal dan petal bunga: A. Jeruk Pamelo; B. Jeruk

Siam

sepal

petal

A

sepal

petal

B

30

Tabel 2. Persentase perkembangan inti mikrospora jeruk Pamelo pada fase tetrad,

inti satu, inti dua, dan tidak teramati

Berdasarkan pengamatan inti mikrospora pada tanaman jeruk pamelo

(Tabel 2), bunga yang dikelompokkan menjadi bunga kecil berdasarkan ukuran

sepal dan petal didominasi oleh mikrospora yang berada pada fase tetrad berkisar

(79,4 – 87,1)%, dan bunga dengan ukuran sedang didominasi mikrospora inti satu

berkisar (78,2 – 85,4)% serta bunga dengan ukuran bunga besar didominasi oleh

mikrospora inti dua (24,4 – 64,4)% dan tidak dapat diamati (1,2 – 75,6)%. Pada

bunga ukuran kecil dan bunga ukuran sedang tidak terdapat mikrospora yang

tidak dapat diamati posisi intinya, sedangkan pada bunga ukuran besar banyak inti

mikrospora yang tidak dapat diamati keberadaannya. Keberadaan inti mikrospora

tidak diamati karena terdapat banyak vakuola didalam mikrospora. Sangwan dan

Norreel (1996) menyatakan pada stadium binukleat akhir (inti dua) sudah dimulai

peristiwa amilogenesis. Setelah terjadi akumulasi amilum biasanya mikrospora

sudah tidak responsip lagi untuk diinduksi menjadi embrio. Tingginya persentase

mikrospora inti satu (uninukleat) pada bunga ukuran sedang dengan perbandingan

ukuran sepal : petal (6:14 - 6:17) menjadikan bunga dengan ukuran sedang yang

akan dijadikan eksplan untuk induksi kalus pada jeruk Pamelo.

Rasio bumga

(mm)

Sepal:Petal

Pomelo

Perkembangan inti mikrospora (%)

Tetrad Inti satu Inti dua Tidak

teramati

KECIL

6 : 10 79,4 15,3 5,3 -

6 : 11 87,1 12,3 0,6 -

6 : 12 82,4 13,4 4,2 -

SEDANG

6 : 14 18,6 78,2 3,2 -

6 : 15 15,8 81,2 3,0 -

6 : 17 12,6 85,4 2,0 -

BESAR

7 : 19 - 24,4 64,4 1,2

7 : 20 - - 24,4 75,6

7 : 21 - 13,6 61,2 25,2

31

3. Studi Lama Praperlakuan Penyimpanan Antera Terhadap Kemampuan

Induksi Kalus pada Jeruk Keprok Garut

Persentase keberhasilan induksi kalus haploid dari antera selain

dipengaruhi oleh fase perkembangan inti mikrospora, juga dipengaruhi oleh

praperlakuan terhadap antera sebelum kultur antera. Secara normal, mikrospora

akan berkembang menjadi alat reproduksi jantan pada tumbuhan. Praperlakuan

suhu dingin akan menghentikan proses tersebut sehingga mikrospora akan

berkembang menjadi embrio atau kalus.

Untuk menginduksi terbentuknya kalus haploid atau embrio yang berasal

dari mikrospora jeruk keprok Garut, kuncup bunga diberikan praperlakuan suhu

dingin (10oC) selama 1, 3, 5, dan 7 hari dan ditanam pada media MT dengan

penambahan 10 mg/l pikloram dan 500 mg/l ekstrak malt. Kuncup bunga diberi

perlakuan lama penyimpanan pada suhu dingin dengan tujuan untuk mendapatkan

lama praperlakuan terbaik dilihat dari respon antera yang membengkak dan

mengkalus.

Tabel 3. Pengaruh praperlakuan lama penyimpanan pada suhu dingin (10oC) pada

antera jeruk keprok Garut terhadap kemampuan induksi kalus

Umur

Kultur

(MST)

Lama Praperlakuan

(hari)

Respon Antera

membengkak berkalus

∑ % %

2

1 2,2b (22,0) (0,0)

3 3,8b (36,0) (0,0)

5 7,2a (72,0) (0,0)

7 3,0b (26,0) (0,0)

4

1 2,2b (22,0) (0,0) 3 3,8b (36,0) (0,0)

5 7,2a (72,0) (0,0)

7 3,0b (30,0) (0,0)

6

1 2,6b (26,0) (0,0)

3 4,0b (40,0) (0,0)

5 8,0a (80,0) (2,0)

7 3,4b (34,0) (0,0)

8

1 2,6b (28,0) (0,0)

3 4,0b (40,0) (0,0)

5 8,0a (84,0) (2,0) 7 3,4b (36,0) (0,0)

Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada setiap umur yang diamat

menunjukkan tidak berbeda nyata pada uju DMRT 5%. Media= Murashige and

Tucker (MT) + 10mg/l Pic + 500mg/l ekstrak malt, (1), (3), (5), dan (7) hari

32

Berdasarkan hasil pengamatan pada Tabel 3, diketahui bahwa antera jeruk

keprok Garut yang diberi praperlakuan suhu dingin (10oC) selama 5 hari

memberikan respon yang paling baik dilihat dari respon antera yang membengkak

dan yang mengkalus. Secara umum respon diawali dengan pembengkakan

kemudian diikuti dengan pembentukan kalus (Gambar 10).

Praperlakuan dingin (10oC) memberikan pengaruh terhadap peubah antera

yang membengkak. Hasil tertinggi pada peubah antera membengkak diperoleh

pada praperlakuan 5 hari pada semua umur kultur. Antera membengkak karena

terjadi pembelahan sel - sel pada mikrospora yang terdapat di dalam antera,

kemudian sel sel mikrospora tersebut akan berkembang menjadi kalus. Kalus

yang berada didalam antera akan memaksa dinding antera untuk pecah. Persentase

terbentuknya kalus tertinggi (2%) terjadi pada praperlakuan dingin selama lima

hari pada umur 6 minggu setelah tanam.

Gambar 10. Respon antera Keprok Garut: A. Membengkak, B. Mengkalus

Praperlakuan penyimpanan suhu dingin (10oC) selama 5 hari pada antera

jeruk keprok Garut merupakan praperlakuan terbaik karena mampu membentuk

kalus sebesar 2% pada umur 6 minggu setelah tanam, sedangkan praperlakuan

penyimpanan 1, 3, dan 7 hari tidak terdapat antera yang mampu terbentuk menjadi

kalus. Setelah 8 minggu antera cenderung menjadi coklat dan tidak mengalami

perkembangan bahkan sebagian besar antera menjadi mati. Penelitian yang

dilakukan oleh Savaskan et al. (1999) pada tanaman Hordeum vulgare L.

menunjukkan terdapat perbedaan yang signifikan antara antera yang diberi

praperlakuan dingin selama 21 hari dengan antera yang tidak diberi praperlakuan

A B

33

dingin. Antera yang diberi praperlakuan dingin selama 21 hari mampu

membentuk kalus berkisar 97,4%. Sedangkan antera yang tidak diberikan

praperlakuan dingin hanya mampu membentuk kalus 40,2%.

Perlakuan cekaman suhu dingin (4-9oC) pada mikrospora tanaman kedelai

varietas Wilis juga dilakukan oleh Budiana (2010) dengan memperoleh hasil

bahwa mikrospora yang diberi perlakuan suhu dingin (4-9oC) selama satu minggu

menunjukkan pengaruh lebih baik dibandingkan dengan pemberian cekaman suhu

ruangan (25-28oC) dan pemberian suhu panas (30 – 33

oC).

Rendahnya persentase terbentuknya kalus pada jeruk keprok Garut

kemungkinan disebabkan lamanya waktu simpan (7 hari) dalam lemari pendingin

sehingga menyebabkan kondisi bunga menjadi rusak (coklat), dan karena

komposisi media yang kurang tepat untuk menginduksi kalus jeruk keprok Garut.

Pemberian pikloram yang berlebihan pada media dapat menyebabkan kerusakan

sistem pertumbuhan jaringan karena pikloram merupakan herbisida yang bersifat

toksik (Karjadi & Buchory 2007). Marlina (2009) menyatakan Pemberian

pikloram 2 mg/l mampu menginduksi kalus dengan struktur remah pada eksplan

umbi.

4. Induksi Kalus pada Antera Keprok Batu 55, Jeruk Siam dan Jeruk

Pamelo

4.1 Induksi Kalus pada Antera Jeruk Keprok Batu 55

Antera jeruk keprok Batu 55 yang telah diberi praperlakuan suhu dingin

(10oC) selama lima hari dikulturkan pada media padat, media cair, dan media

padat + cair dengan komposisi media MT + 3 mg/l BAP + 500 mg/l ekstrak malt

memberikan respon yang berbeda - beda untuk setiap perlakuan. Zat pengatur

tumbuh ditambahkan untuk mendapatkan respon yang diinginkan berkaitan

dengan interaksi zat pengatur tumbuh yang digunakan dengan zat-zat endogen

yang terdapat dalam jaringan tumbuhan (Novak et al. 1986). Antera yang

dikulturkan pada media padat menunjukkan respon yang paling baik dilihat dari

respon antera yang membengkak dan mengkalus (Tabel 4).

B

34

Tabel 4. Pengaruh jenis media terhadap respon antera jeruk Keprok Batu 55

Umur kultur

(MST)

Jenis media Respon Antera

membengkak berkalus

∑ % %

2

Padat 5,1a (68,75) 9,9

Padat + Cair 5,2a (50,89) 3,4

Cair 3,9b (38,39) 2,7

4

Padat 5,9a (79,46) 13,8

Padat + Cair 5,3b (57,14) 4,5

Cair 5,1b (52,67) 3,6

6

Padat 6,2a (82,14) 14,5

Padat + Cair 5,9b (58,92) 4,5

Cair 4,9c (60,71) 3,6

8

Padat 6,2a (82,14) 14,5

Padat + Cair 5,9b (58,92) 4,5

Cair 4,9b (60,71) 3,6

Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada setiap umur yang diamati

menunjukkan tidak berbeda nyata pada uju DMRT 5%. Media: MT + 3 mg/l BAP

+ 500mg/l em.

Berdasarkan Tabel 4 diketahui, media padat mampu memberikan respon

berkalus yang paling baik dibanding perlakuan media dua lapis (padat+cair) dan

perlakuan media cair. Hal tersebut dapat dilihat dari persentase jumlah antera

yang membengkak dan persentase antera yang mengkalus. Sebelum antera

terinduksi menjadi kalus, maka terlebih dahulu diikuti oleh pertambahan volume

sel yang dapat dilihat dari kondisi antera yang membengkak (Gambar 11).

Pemberian 3 mg/l BAP pada media padat mampu menginduksi kalus

sebesar 14,5% pada pengamatan 6 minggu setelah tanam, sedangkan pemberian

3mg/l BAP pada media dua lapis (padat+cair) dan media cair hanya mampu

membentuk kalus 4,5% dan 3,6%. Hal tersebut kemungkinan disebabkan

komposisi hara dan ZPT pada media yang terlalu banyak (terdapat pada media

padat, juga media cair). Budiana (2010) menyatakan bahwa antera tanaman

kedelai yang ditanam pada media padat memberikan respon yang lebih baik

dibandingkan antera yang ditanam pada media sistem dua lapis.

Kalus yang dihasilkan oleh media padat berwarna putih dan remah,

sedangkan perlakuan media padat + cair dan perlakuan media cair cenderung

35

menghasilkan kalus berwarna coklat dan kurang memberikan respon yang baik

terhadap perkembangan antera jeruk keprok Batu 55. Hal tersebut juga didukung

Septiani (2008) yang menyatakan bahwa mikrospora kelapa sawit yang

dikulturkan pada media dua lapis dapat berkembang melalui proses gametofitik

hanya sampai pada tahap biselular, karena sel mikrospora pada tahap selanjutnya

mengalami kematian.

Gambar11. Respon antera jeruk Keprok Batu 55: A. Membengkak, B. Mengkalus

4.2 Induksi Kalus pada Antera Jeruk Siam

Pembelahan sporofitik pada mikrospora juga dipengaruhi oleh media

yang diberikan pada antera. Pembelahan sporofitik terjadi apabila sel – sel

mikrospora mampu membelah secara simetri dengan dua inti vegetatif atau lebih.

Pemberian 2,4-D dengan konsentrasi yang berbeda memberikan respon yang

berbeda pada antera jeruk Siam. Antera yang dikulturkan pada media MT dengan

perlakuan 3 mg/l 2,4-D memberikan respon yang paling baik untuk menginduksi

terbentuknya kalus (Tabel 5).

B A

36

Tabel 5. Pengaruh 2,4-D terhadap respon Antera Jeruk Siam

Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada setiap umur yang diamati

menunjukkan tidak berbeda nyata pada uju DMRT 5%.. Media: MT + 2,4-D + 500

mg/l em

Berdasarkan hasil pengamatan pada Tabel 5, terlihat bahwa konsentrasi

media 2,4-D memberikan pengaruh terhadap peubah antera membengkak. Hasil

tertinggi pada semua umur kultur pada peubah antera membengkak dihasilkan

oleh media 3 mg/l 2,4-D. Setelah antera membengkak, kemudian dinding antera

pecah dan kalus akan berproliferasi (Gambar 12).

Respon antera jeruk Siam sudah terlihat pada minggu ke-2 setelah tanam,

hal tersebut ditandai dengan terdapatnya antera yang membengkak berkisar 45,7%

pada media 3 mg/l 2,4-D, akan tetapi kalus mulai terbentuk setelah empat minggu

setelah tanam. Persentase kalus tertinggi berada pada media pemberian 3 mg/l

2,4-D dengan persentase kalus sebesar 1,6% sedangkan pemberian 2,4-D

sebanyak 5 mg/l dan 7 mg/l hanya mampu menginduksi kalus sebesar 0,8%.

Perlakuan 2,4-D sebanyak 3 mg/l memperlihatkan respon antera yang paling baik

kemungkinan konsentrasi 2,4-D sebanyak 3 mg/l merupakan konsentrasi paling

tepat untuk menginduksi kalus jeruk Siam, sedangkan pemberian 2,4-D pada

konsentrasi 5 mg/l dan 7 mg/l kurang efektif untuk menginduksi kalus Siam.

Umur Kultur Media 2,4-D

(mg/l) (MST)

Respon Antera

membengkak Berkalus

∑ (%) (%)

2 MST

3 3,2a (45,7) 0

5 1,5b (14,3) 0

7 1,3b ( 9,5) 0

4 MST

3 3,2a (49,5) 1,6

5 1,5b (21,9) 0,8

7 1,3b (21,9) 0,8

6 MST

3 3,2a (62,8) 1,6

5 1,5b (30,5) 0,8

7 1,3b (25,7) 0,8

8 MST

3 4,8a (69,5) 1,6

5 2,6b (35,2) 0,8

7 2,0b (26,7) 0,8

37

Percobaan induksi kalus pada antera jeruk Siam dengan menggunakan

zat pengatur tumbuh 2,4-D memperlihatkan respon yang lebih lambat dibanding

dengan antera jeruk Keprok Batu 55. Pada antera jeruk Siam kalus terbentuk

mulai minggu ke empat setelah tanam berkisar 1,6% pada media 3 mg/l 2,4-D,

sedangkan pada antera jeruk Keprok Batu 55 kalus sudah terbentuk pada minggu

kedua setelah tanam berkisar 9,9% dengan formulasi media MT + 3mg/l BAP +

500 mg/l ekstrak malt (padat).

Gambar 12. Respon antera jeruk Siam: A. Membengkak, B. Mengkalus

4.3 Induksi Kalus pada Antera Jeruk Pamelo

Antera jeruk Pamelo mempunyai ukuran yang lebih panjang dibandingkan

dengan ukuran antera jeruk keprok Batu 55 dan jeruk Siam. Antera jeruk Pamelo

yang telah diberikan zat pengatur tumbuh berupa kombinasi BAP dan NAA akan

memberikan respon yang berbeda dengan antera jeruk keprok Batu 55 dan jeruk

Siam yang telah diberikan BAP dan 2.4-D. Benzyl Adenine (BA) merupakan zat

pengatur tumbuh jenis sitokinin yang sudah banyak digunakan dalam kultur

jaringan. Mariska et al. (1987) menyatakan BAP merupakan zat pengatur tumbuh

sintetik yang mempunyai daya rangsang yang lebih lama dan tidak mudah

dirombak oleh sistem enzim dalam tanaman.

B A

38

Tabel 6. Induksi Kalus pada Antera Jeruk Pamelo

Umur Kultur Media 3mg/l BAP

(MST) dan NAA (mg/l)

Respon Antera

membengkak berkalus

∑ (%) (%)

2 MST

1 1.7 (30,6) 0

2 1,3 (17,3) 0

3 1,5 (21,3) 0

4 MST

1 2,4a (44,0) 0

2 1,4b (26,7) 0

3 1,7b (32,0) 0

6 MST

1 3,0a (53,3) 0

2 1,7b (34,7) 0

3 1,6b (32,0) 0

8 MST

1 3,4a (58,7) 2,6

2 2,2b (42,7) 0

3 2,1b (40,0) 0

Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada setiap umur yang diamati

menunjukkan tidak berbeda nyata pada uju DMRT 5%. MST: Minggu Setelah Tanam

Berdasarkan hasil pengamatan (Tabel 6) terlihat bahwa pemberian

kombinasi 3 mg/l BAP dan NAA tidak memberikan pengaruh pada peubah respon

antera membengkak pada pengamatan minggu ke 2 setelah tanam. Pengaruh baru

terlihat pada pengamatan 4, 6, dan 8 minggu setelah tanam. Tingginya respon

antera yang membengkak pada penambahan 1 mg/l NAA disebabkan karena

pemberian 1mg/l NAA dan 3 mg/l BAP merupakan kombinasi zat pengatur

tumbuh yang diinginkan oleh antera jeruk pamelo dalam perkembangannya. Hal

tersebut dapat dilihat dari tingginya respon antera jeruk Pamelo yang

membengkak sebanyak 57,7%, kemudian antera berkembang menjadi kalus 2,6%

(Gambar 13). Berbeda dengan perlakuan kombinasi 3 mg/l BAP dengan (2 dan 3)

mg/l NAA yang dianggap bukan merupakan konsentrasi zat pengatur tumbuh

yang diinginkan oleh antera pamelo dalam perkembangannya.

Asam naftalena asetat (NAA) merupakan senyawa dari golongan auksin

yang mampu menginduksi terjadinya pembengkakan sel dan elongasi pada

jaringan. Kalus mulai terbentuk pada minggu ke 8 pada media kombinasi 3 mg/l

BAP dengan 1 mg/l NAA. Lamanya waktu yang dibutuhkan untuk membentuk

kalus diduga karena jeruk pamelo mempunyai dinding antera yang lebih tebal

39

mengakibatkan susahnya mikrospora untuk menyebabkan pecahnya dinding

antera.

Penambahan BAP dan NAA secara kombinasi pada dasarnya telah

berhasil dilakukan terhadap induksi kalus pada beberapa spesies tanaman.

Wulandari et al. (2004) menyatakan bahwa kombinasi 10 mg/l NAA dan 10 mg/l

BAP mampu menginduksi kalus dengan bobot basah tertinggi 0,25 gram pada

tanaman jeruk manis sedangkan perlakuan kontrol tidak mampu menginduksi

kalus. Hal tersebut berbeda dengan hasil penelitian pada antera jeruk Pamelo.

Antera jeruk Pamelo yang telah diberikan kombinasi 3 mg/l BAP dan 1 mg/l

NAA memberikan respon paling baik dilihat dari jumlah antera yang

membengkak dan mengkalus. Namun kombinasi media tersebut tidak mampu

menginduksi terbentuknya embrio secara langsung pada antera jeruk Pamelo.

Savaskan (1999) mengatakan bahwa media terbaik untuk menginduksi

terbentuknya embrio tanaman Barley pada kultur antera terdiri dari kombinasi 2

mg/l NAA dan 1 mg/l BAP. Pemberian 1 mg/l NAA merupakan media terbaik

untuk menginduksi kalus embriogeni pada kultur antera jeruk Trovita (Hidaka

1984).

Gambar 13. Respon antera pamelo: A. Mengkalus, B. Perbesaran dengan

mikroskop

B A

40

5. Analisis kromosom

Tingkat ploidi kalus jeruk keprok Batu 55 diketahui melalui analisis

kromosom. Berdasarkan hasil pengamatan kromosom menurut metode

praperlakuan lengkap (Sastrosumarjo 2006), diketahui bahwa kalus yang

dihasilkan merupakan kalus haploid yang berasal dari mikrospora jeruk keprok

Batu 55. Hal tersebut dapat dilihat dari jumlah kromosom kalus yang dihasilkan

adalah sebanyak 9. Jumlah kromosom tersebut merupakan setengah dari jumlah

kromosom tanaman normal pada jeruk Keprok Batu 55 (2n=2x=18).

Jumlah kromosom kalus yang berasal dari jeruk Keprok Batu 55 dapat

diamati dengan jelas, sedangkan jumlah kromosom kalus jeruk keprok Garut,

jeruk Siam dan Pamelo tidak dapat diamati. Jumlah kromosom tidak dapat diamati

kemungkinan karena sampel yang digunakan (kalus dan antera membengkak)

sudah tidak bersifat meristem, ditandai dengan warna kalus dan antera yang

berwarna kecoklatan. Hal tersebut sesuai dengan analisis kromosom dengan

menggunakan akar. Akar yang digunakan untuk analisis kromosom adalah akar

yang bersifat meristem atau akar yang masih aktif melakukan pembelahan

mitosis, letaknya berada pada ujung akar. Apabila sampel yang digunakan berasal

dari jaringan yang sudah tua, maka kromosom sudah tidak dapat diamati.

Perbedaan jumlah kromosom pada tanaman jeruk diploid dengan jumlah

kromosom jeruk haploid dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Perbandingan kromosom jeruk diploid dan haploid (A. Kromosom

diploid, B. Kromosom haploid).

B A

41

PEMBAHASAN UMUM

Salah satu faktor penting yang mempengaruhi keberhasilan kultur antera

adalah perkembangan inti mikrospora. Mikrospora yang responsif untuk

membentuk kalus atau embrio haploid adalah mikrospora yang berada pada fase

uninukleat akhir (Datta 2005). Fase uninukleat akhir ditandai dengan keberadaan

inti berada di tepi. Mikrospora yang berada pada fase uninukleat akhir merupakan

fase transisi dalam siklus sel, sehingga peka terhadap cekaman. Perkembangan

inti mikrospora ditandai dengan perubahan morfologi bunga melalui

bertambahnya ukuran sepal dan petal bunga.

Bunga jeruk keprok Garut, keprok Batu 55, dan jeruk Siam mempunyai

perkembangan inti mikrospora yang hampir sama. Persentase uninukleat tertinggi

pada ketiga jenis jeruk tersebut berada pada bunga ukuran sedang dengan

perbandingan ukuran sepal : petal (1:4 – 2:6)mm berkisar 78,2 – 91,4% pada

bunga jeruk keprok Garut, 78,2 – 91,4% pada bunga jeruk keprok Batu 55, dan

79,4 – 90,5 % pada bunga jeruk Siam. Hal tersebut sesuai dengan hasil penelitian

Kosmiatin et al. (2009) pada bunga jeruk keprok Garut, dimana bunga jeruk

keprok dengan ukuran mahkota kuncup bunga antara 5-6 mm, memiliki

persentase mikrospora dengan inti tunggal terbanyak yaitu berkisar antara 84,05 –

100%.

Jeruk Pamelo mempunyai ukuran kuncup bunga yang lebih panjang

dibanding ketiga jenis jeruk (keprok Garut, keprok Batu 55, dan jeruk Siam),

sehingga mempunyai perkembangan mikrospora yang berbeda. Persentase

mikrospora uninukleat tertinggi (78,2 – 85,4)% pada bunga jeruk Pamelo berada

pada bunga ukuran sedang dengan perbandingan ukuran sepal : petal (6:14 – 6:17)

mm. Dengan diketahuinya perkembangan inti mikrospora tersebut dapat

memudahkan teknis pelaksanaan kultur antera jeruk, karena ketepatan fase

perkembangan mikrospora merupakan salah satu parameter yang penting untuk

keberhasilan kultur antera jeruk (Chuong et al. 1988).

Kuncup bunga yang mempunyai mikrospora pada tahapan uninukleat

tertinggi diberi praperlakuan suhu dingin (10oC) dengan tujuan untuk pembelokan

jalur perkembangan gametofitik menuju jalur perkembangan sporofitik.

42

Berdasarkan hasil pengamatan pada antera jeruk keprok Garut yang telah diberi

praperlakuan suhu dingin (10oC) selama (1, 3, 5, dan 7) dan ditanam pada media

MT + 10 mg/l Pikloram + 500 mg/l ekstrak malt, diketahui tidak terdapat antera

yang mampu membentuk embrio, dan persentase terbentuknya kalus jeruk juga

masih rendah. Ketidak mampuan mikrospora membentuk embrio kemungkinan

karena kombinasi praperlakuan suhu dingin dan komposisi media yang kurang

tepat untuk perkembangan antera jeruk keprok Garut. Kemungkinan lain karena

tanaman jeruk mempunyai dinding antera yang tebal, sehingga dinding antera

tidak mudah untuk pecah.

Disamping fase perkembangan mikrospora dan praperlakuan sebelum

kultur antera, media juga merupakan faktor yang memperngaruhi tingkat

keberhasilan kultur antera. Optimasi media dilakukan untuk mendapatkan kalus

dengan jumlah yang banyak. Auksin dan sitokinin merupakan zat pengatur

tumbuh yang sering ditambahkan dalam media tanam karena mempengaruhi

pertumbuhan dan organogenesis dalam kultur jaringan (Wulandari 2004). Antera

yang responsif terhadap media mengalami perubahan secara morfologi yang dapat

diamati melalui membesarnya ukuran antera. Media yang digunakan untuk

menginduksi kalus jeruk keprok Batu 55 adalah media MT + 3 mg/l BAP + 500

mg/l ekstrak malt dengan perlakuan jenis media (padat, cair, padat + cair). Media

yang paling berpengaruh terhadap respon antera adalah jenis media padat. Hal

tersebut kemungkinan karena komposisi media padat mempunyai konsentrasi hara

makro dan mikro yang tidak berlebihan untuk perkembangan antera, sedangkan

pada media dua lapis terdapat komposisi media hara makro dan mikro yang

berasal dari media padat dan media cair sehingga konsentrasinya berlebihan.

Budiana 2010 menyatakan pada media dua lapis dibutuhkan komposisi media

hara makro dan mikro yang lebih sederhana, tetapi mempunyai kandungan

vitamin yang lengkap. Pada induksi kalus antera jeruk jeruk Siam dengan

komposisi media MT + 3,5,dan 7 mg/l 2,4-D + 500 mg/l ekstrak malt diperoleh

bahwa pemberian 3 mg/l 2,4-D merupakan media yang paling diinginkan oleh

antera jeruk Siam untuk membentuk kalus (1,6%). Sementara pada antera jeruk

Pamelo diberi kombinasi media 3 mg/l BAP dan 1, 2, 3 mg/l NAA. Persentase

kalus tertinggi diperoleh pada media MT + 3 mg/l BAP + 1 mg/l NAA sebanyak

43

2,6%. Rendahnya persentase kalus kemungkinan karena komposisi media yang

kurang tepat dan sumber karbon atau konsentrasi glukosa (3%) yang tidak sesuai

untuk perkembangan antera. Faktor lain yang mengakibatkan rendahnya produksi

kalus pada kultur antera jeruk adalah karena dinding antera pomelo mempunyai

ukuran yang lebih tebal dan susah untuk pecah, sehingga mikrospora tidak mampu

keluar dan berinteraksi langsung dengan media.

44

SIMPULAN DAN SARAN

SIMPULAN

1. Ukuran bunga sedang dengan perbandingan ukuran sepal:petal (1:4 – 2:6) mm

pada bunga jeruk keprok Garut, keprok Batu 55, jeruk Siam dan (6:14 –

6:17)mm pada bunga jeruk Pamelo mempunyai mikrospora uninukleat paling

tinggi.

2. Prapelakuan lama penyimpanan 5 hari merupakan praperlakuan terbaik untuk

menginduksi kalus antera jeruk keprok Garut.

3. Persentase kalus jeruk keprok Batu 55 tertinggi dihasilkan pada media padat

(MT + 3mg/l BAP + 500mg/l ekstrak malt), jeruk Siam pada media MT + 3

mg/l 2,4-D + 500 mg/l ekstrak malt dan untuk jeruk Pamelo pada media MT +

3 mg/l BAP + 1 mg/l NAA + 500 mg/l ekstrak malt.

4. Kalus yang dihasilkan dari antera jeruk keprok Batu 55 merupakan kalus yang

berasal dari mikrospora karena mempunyai jumlah kromosom sebanyak 9,

sedangkan kromosom yang berasal dari kalus jeruk Keprok Garut, jeruk Siam

dan jeruk Pamelo tidak dapat diamati.

SARAN

Regenerasi kalus antera jeruk keprok Garut, keprok Batu55, jeruk Siam,

dan jeruk Pamelo perlu dilakukan untuk mendapatkan tanaman haploid

45

DAFTAR PUSTAKA

Ayed OS, Buyser JD, Picard E, Trifa Y, Amara S. 2010. Effect of pre-treatment

on isolated microspores culture ability in durum wheat (Triticum

turgidum subs. durum). Journal of Plant Breeding 2: 030 – 038

Badan Pusat Statistik. 2010

Bajaj YP. 1983. In Vitro Production of Haploids. London: Kluwer Academic

Publishers.

Badan Penelitian dan Pengembangan Departemen Pertanian. 2005. Prospek dan

Arah Pengembangan Agribisnis Jeruk. Balitbangtan Deptan. Jakarta

Bhojwani SS, Razdan MK. 1993. Plant Cell Tissue Culture. Amsterdam: Elsevier

Bourgin JP, Nitsch JP. 1967. Obtention de nicotiana haploides a partir d‟etamine

cultivees in vitro. Physiol 114: 75 -78

Budiana. 2010. Induksi pembelahan sporofitik mikrospora kedelai melalui kultur

antera pada sistem media dua lapis [Tesis]. Bogor: Program

Pascasarjana Institut Pertanian Bogor

Chapot H. 1975. Citrus Technical Monograph. Ciba-Geigy: Agrochemical

Chen Z. 1985. A study on induction of plants from Citrus pollen. Fruit Varieties

39: 44–50

Chu CC. 1978. The N6 medium and its applications to anther culture of cereal

crops. Science Press 54: 43 - 50

Chuong PV, Deslauriers C, Kott LS, Beversdorf WD. 1988. Effect of donor

genotype and bud sumpling on microspore culture of Brassica napus.

CJ Bot 66: 1653 – 1657

Croughan TP. 1995. Anther Culture for Double Haploid Production. New York:

Cambridge University Press

Datta KS. 2005. Factors controlling development and its application in crop

improvement for androgenic haploids. Current Science 89: 1870 – 1878

Deng ZA, Xiao SY, Zhang WC. 1992. Pollen derived plantlets from anther culture

of Ichang papeda hybrids and trifoliate orange. Hort. Sci: 190–192.

Dewi I, Purwoko B. 2001. Kultur antera untuk mendukung program pemuliaan

tanaman padi. Bul. Agron. 29: 59 – 63

Drira N, Benbadis A. 1975. Anther culture of Citrus sinensis. Biotechnology 28:

132–140.

46

Dunwell JM. 1996. In Vitro Haploid Production in Higher Plants. Netherlands:

Kluwer Academic Publishers.

Dus UR, Hadiuzzaman S, Sakker H. 2002. Effects of microspore stage, pre- and

post temperature and donor‟s environtment on maize (Zea mays L.)

anther culture response. Plant Tissue Cult. 12: 37-47.

Ferrie AMR, Keller WA. 1995. Microspore culture for haploid plant production.

Biotechnology. 155-164

Froelicher Y, Ollitrault P. 2000. Effects of the hormonal balance on Clausena

excavate androgenesis. Acta Horticulturae 535: 139–146

George EF, Sherrington PD. 1984. Plant Propagation by Tissue culture. England:

Exegetics Limited

Geraci G, Starrantino A, Recupero, Ruso F. 1982. Spontaneous triploidy in

progenies of monoembryonic hybrids of Clementine „Commune x King

of Siam‟. Genet Agri 36: 113–8

Geraci G, Starrantino A. 1990. Attempts to regenerate haploid plants from in vitro

cultures of Citrus anthers. Acta Horticulturae 280: 315–320

Germana MA, Chiancone B. 2003. Gynogenetic haploids of Citrus after in vitro

pollination with triploid pollen grains. Plant Cell, Tissue and Organ

Culture 66: 59–66

George EF, Hall M, Klerk G. 2008. Plant Propagation by Tissue Culture.

Netherlands: Springer

Gioi, Tanh D, Vuong D. 2002. Effect of different media and genotypes on anther

cultre efficiency of F1 plants drived from crosses between IR64 and

new plant type rice cultivars. Omorice 10: 107-109

Guha S, Maheswari SC. 1966. Cell Division and Differentiation of Embryos in

the Pollen Grains of Datura In Vitro. London: Nature

Gunawan L. 1992. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Bogor: Departemen

Pendidikan dan Kebudayaan Institut Pertanian Bogor

Heberle BE. 1999. Isolated pollen culture in Tobacco. Plant Reprod 2 : 1-10.

Helmiyesi H, Rini P, Erma S. 2009. Pengaruh lama penyimpanan terhadap kadar

gula dan vitamin C pada buah jeruk Siam (Citrus nobilis

var.microcarpa). Anatomi dan fisiologi 16: 33-37.

Hidaka T. 1984. Induction of plantlents from anthers of Trovita orange (Citrus

sinensis Osbeck). Hort. Sci 53:1-5

47

HidakaT. 1987. Effects of sucrose concentration, pH of media, and culture

temperature on anther cultureof Citrus sp. Japan Journal of Breeding

34: 416–422

Hoque A, Kumar Biswas M, Alam S. 2007. Variation of callus through anther

culture in water chesnut (Trapa sp.). Turkey Jounal Biology 31: 41-45.

Hu H, Zeng J. 1984. Development of New Varietas via Anther Culture. New

York: Worth Publisher

Immonen S, Antilla H. 1999. Cold pretreatment to enhance green plant

regeneration from rye anther culture. Biotechnology 57: 121-127

Indrianto A, Endang S, Surifah F. 2004. Produksi galur murni melalui induksi

embriogenik mikrospora cabai merah dengan stres. Zuriat 15: 133-139

Karjadi AK, Buchory A. 2007. Pengaruh komposisi media dasar, penambahan

BAP dan pikloram terhadap induksi tunas bawang merah. J.Hort. 18 :

1-9

Karsinah, Sudarsono, Setyobudi L, Aswidinnoor H. 2002. Keragaman genetik

plasma nutfah jeruk berdasarkan analisis penanda RAPD. Jurnal

Bioteknologi Pertanian 7: 8-16

Khan I. 2007. Citrus Genetics, Breeding, and Biotechnology. London:

Oxfordshire

Kosmiatin M, Purwito A, Husni A. 2009. Induksi kalus pada antera jeruk Keprok.

Prosiding Simposium dan Kongres PERIPI V1: 475-484.

Kyo M, Harada H. 1986. Control of the development pathway of tobacco in vitro.

Planta 168: 427–432.

Lentini ZP, Reyes CP, Roca WM. 1995. Androgenesis of highly recalcitrant rice

genotypes with maltose and silver nitrate. Plant Science 110: 127-138.

Ling J, Iwamasa M, Nito N. 1988. Plantlet regeneration by anther culture of

Calamondin (C. madurensis Lour). Japan Journal of Breeding 38: 312–

320.

Maluszynski M, Kasha KJ, Forster BP, Szarejko I. 2003. Doubled Haploid

Production in Crop Plants. London: Kluwer Academic Publishers

Mariska I, Gati E, Sukmadjaya D. 1987. Kultur masa tunas dan tangkai daun pada

tanaman Geranium secara in vitro. Teknologi Pertanian 13: 41-45.

Marlina M. 2009. Teknik perbanyakan Lili dengan kultur jaringan. Teknologi

Pertanian 14: 6-8.

48

Martasari C, Hardiyanto H. 2003. Teknik identifikasi varietas jeruk. Balai

Penelitian Jeruk dan Buah Subtropika. 10: 6 – 12.

Martosupono M, Semangun H, Sunbanu BY. 2007. Budidaya Jeruk Keprok Soe

di Kabupaten Timor Tengah Selatan. AGRIC 18: 87 – 102

Morrison RA, Evans DA. 1988. Haploid plants from tissue culture. Biotechnology

6: 684 - 690.

Munarso K, Yuniati P, Dewi I, dan Suwarno. 2008. Regenerasi tanaman dengan

kultur antera beberapa persilangan padi hibrida. Penelitian pertanian

tanaman pangan 27: 15 - 17.

Muswita. 2003. Kultur anter dan analisis tanaman cabai (Capsicum annum L.)

haploid dan dihaploid [Tesis]. Bogor : Institut Pertanian Bogor.

Nasir M. 2002. Bioteknologi dan Molekuler. Yogyakarta: Kanisius

Novak FJ, Havel L, Dolezel J. 1986. Handbook Plant Cell Culture. New York:

Chapman & Hall.

Palmer CE, Keller WA. 1997. Pollen Embryos. Dalam: Sowhney VK, Shivanna

KR. Pollen Biotechnology For Crop Production and Improvement.

USA: Cambridge Univ

Prahardini I, Sudaryono T. 1992. Induksi kalus pada antera pepaya. Teknologi

Pertanian 13: 10 - 15.

Purwanto E, Endang Y, Djati W. 2003. Keragaman plasma nutfah jeruk besar

(Citrus maxima Merr) berdasarkan karakter morfologi. Bioteknologi

Pertanian 7 : 13 – 17

Raven PH, Evert RF, Eichhorn SE. 1992. Biology of Plants. New York: Worth

Publisher

Read PE. 1990. Environtment Effects in Micropropagation dalam: Zulkarnain.

2009. Kultur Jaringan Tanaman. Jakarta: Bumi Aksara

Sangwan RS, Norreel BS. 1996. Cytological and Biochemical Aspects of In Vitro

Androgenesis in Higher Plants. Netherlands: Kluwer Academic

Publishers.

Sastrosumarjo S. 2006. Sitogenetika Tanaman. Institut Pertanian Bogor

Savaskan C, Sjarejko I, Toker M. 1999. Callus production and plant regeneration

from anther culture of some turkish Barley cultivars. Journal of Botany

23: 359 – 365

49

Septiani P. 2008. Perkembangan mikrospora dan induksi pembelahan sporofitik

pada kultur antera kelapa sawit [Skripsi]. Bogor : Institut Pertanian

Bogor.

Shirdelmoghanloo H, Moieni A, Mousavi A. 2009. Effect of embryo induction

media and pretreatments in isolated microspore culture of hexaploid

wheat (Triticum aestivem L. Cv. Falat). African Journal of

Biotechnology 8: 6134 - 6140

Somantri IH, Ambarwati DA. 2001. Kultur antera, teknik penyelamatan embrio

dan rekayasa genetik untuk menunjang pemuliaan tanaman padi. Bul.

Agron. 29: 94 - 99

Sugiri, Anton M. 2006. Pembentukan kalus embrioid kultur ovary pisang melalui

beberapa komposisi media kultur. Makalah individu, semester genap

2005 pengantar falsafah Sains (PPS702) program S3 : 1-8.

Sukarmin. 2008. Teknik perbanyakan berbagai macam setek daun jeruk varietas

JC (Japanche citroen). Teknik Pertanian 13: 59 - 61.

Sumaryono, Riyadi I. 2005. Pertumbuhan biak kalus dan suspensi sel tanaman

kina (Cinchona ledgeriana Moens). Menara Perkebunan. 73: 1 - 11.

Sunderland N, Roberts M. 1979. Cold pretreatment of excised flower buds in float

culture of tobacco anthers. Oxford Journals 43: 405 - 414

Suryowinoto M. 1996. Pemuliaan Tanaman Secara In Vitro. Yogyakarta :Kanisius

Syahid, Fatimah S dan Kristina N. 2007. Induksi dan regenerasi kalus keladi tikus

(Typonium flagell). Jurnal litri. 13: 142-146.

Taji A, Kumar P, Lakshmanan A. 2002. In vitro Plant Breeding. New York.

Haworth Press

Tang Y, Huanxiu L, Bin L, Hong L. 2007. Callus formation from anther culture in

balsam pear (Momordica charantia L.). Agric. Sci 6: 308-312.

Thomas E, Davey MR. 1975. From Single Cell to Plants. London: Wykehem

publication.

Touraev A, Vicente O, Bors H. 1997. Initiation of microspore embryogenesis by

stress. Plant Sci. 2: 298–300.

Tsay H. 1982. The microspore development and haploid embriogenesis of anther

culture with five nitrogen doses to the donor tobacco plants. Agris

China 31: 001 – 013

50

Van Steenis CG. 1975. Flora Voor de Scholen. New York: Haworth Press

Wahidah B. 2010. Pengaruh cekaman pelaparan dan suhu tinggi terhadap induksi

embriogenesis mikrospora tembakau. Jurnal Biologi 14: 1 - 6

Wattimena GA. 1992. Bioteknologi Tanaman. Institut Pertanian Bogor

Webber HJ. 1967. History and Development of the Citrus Industri. New York:

Oxfordshire UK.

Wehr B, Wenzel G. 1993. Andro and Parthenogenesis. London: Chapman & Hall

Wulandari S, Syafii W, Yossilia. 2004. Respon eksplan daun tanaman jeruk manis

(Citrus sinensis L.) secara in vitro akibat pemberian NAA dan BA.

Jurnal Biogenesis 1: 21 - 21

Zagorska NA, Shtereva A, Dimitov BD, Kruleva MM. 1998. Induced

androgenesis in tomato (Lycopersicon esculentum Mill). Plant cell 17:

968 - 975.

Zapta FJ. 1990. Tissue Culture Tehniques. Philippines

Zhang C, Qifeng C. 1993. Genetic studies of rice (Oryza sativa L) anther culture

response. Plant cell 34: 177-182.

Zulkarnain H. 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Jakarta: Bumi Aksara

51

LAMPIRAN

1. Komposisi media Murashige and Tucker (satuan dalam mg/L)

Senyawa

Konsentrasi

dalam media

MT(mg/L)

Konsentrasi

dalam larutan

stok (mg/L)

Volume yang

dipakai per liter

media (ml)

Makro 50

KNO3 1900 38000

NH4Cl - -

NH4NO3 1650 33000

(NH4 )2.SO4 - -

MgSO4.7H2O 180.54 3610

CaCl2.2H2O 332.02 6640

NaH2PO4.2H2O - -

K2HPO4 170.00 3400

KH2PO4 - -

KCl - -

Mikro 10

MnSO4.4H2O 16.90 1690

ZnSO4.7H20 8.600 860

CuSO4.5H2O 0.025 2,5

CoCl2.6H2O 0.025 2,5

KI 0.830 83

H3BO3 6.200 620

Na2MoO4.2HO 0.250 25

FeNaEDTA 36.70 3670 10

Myo inositol 100.00 10000 10

Vitamin

Nicotinic acid

-

-

1

Pyridoxine HCl 10.00 10000

Thiamine HCl 10.00 10000

Biotin - -

Folic acid - -

Nicotinamide 5.00 5000

pH

Gula

Phytagel

5.8 5,8

30.000mg

2.000mg