KROMATOGRAFI

PENUKAR ION

Penukar kation

Penukar anion

Kromatografi penukar ion

Penukar kation Penukar anion

Matrik penukar kation dan anion

Material penukar ion

• Suatu padatan yang mengandung gugus – gugus bermuatan dan terikat secara kimia, yang dapat mengikat ion secara reversibel.

• Gugus-gugus yang bermuatan tersebut terikat pada suatu resin

Kromatografi penukar ion- Penukar kation- Penukar anion

Sampel protein dengan bermuatan yang berbeda dimasukkan ke dalam kolom kromatografi penukar ion, dielusi dengan bufer awal.

Mol/partikel sampel yang bermuatan sama dengan konterion akan menggantikan kedudukan konterion tsb, dan terikat pada matriks.

Mekanisme

Mol/part. sampe1 yang terikat dilepaskan dengan cara gradien konsentrasi atau gradien pH.

Semua partike1 yang terikat pada matriks akan dilepaskan secara berurutan berdasarkan kekuatan ikatannya.

Regenerasi, Kolom siap untuk digunakan lagi.

Mekanisme

a. Bahan pengisi kolom mempunyai gugus fungsional bermuatan yang diikatkan secara kovalen pada suatu matriks polimer yang diam

b. Gugus fungsional terikat secara tetap dan merupakan gugus-gugus ionik yang mengikat ion lawan dengan muatan berlawanan

c. Mekanisme reaksinya adalah pertukaran ion-ion sampel dan ion-ion fasa gerak dengan ion lawan pada fasa diam

RSO3- Na+ + K+ --------------- RSO3

- K+ + Na+ Cl-

Sifat-sifat penukar ion

1. Bersifat asam kuat misalnya yang memiliki gugus –SO3

2- dengan konter ionnya Na+, H+.

2. Bersifat basa lemah, misalnya gugus amino aromatik.

3. Bersifat basa kuat. misalnya yang memiliki gugus amino kuartener.

4. Bersifat asam lemah. misalnya yang memiliki gugus -COO- dengan konter ionnya Na+, H+.

Enzim yang stabil diatas titik isoelektriknya, menggunakan penukar anion.

enzim yang stabil dibawah titik. Isoelektriknya, menggunakan penukar kation.

Gambar Kurva muatan protein terhadap pH untuk pemilihan penukar ion (Pharmacia)

Pengembangan Gel Penukar Ion

• Karboksimetil selulosa (CMC) disuspensikan dalam NaOH 0,5 N selama 30 menit, setelah itu kemudian dicuci dengan air aquades sampai pH 8.

• Selanjutnya CMC disuspensikan dalam HCI 0,5 N selama 30 menit, kemudian dicuci dengan air aquades sampai pH netral. CMC yang telah dikembangkan kemudian disuspensikan dalam buffer dengan pH tertentu.

• Pengembangan untuk DEAE-Selulosa kebalikan dari

cara pengembangan CMC.

Contoh Pemisahaan enzim panisilinasilase pada koIom DEAE- selulosa

a. Pengembangan DEAE-SelulosaDEAE-Selulosa disuspensikan dalam HCI 0,5 N selama 30 menit, kemudian dicuci dengan air sampai pH netral. Selanjutnya DEAE-Selulosa disuspensikan dalam NaOH 0,5 N selama 30 menit Ialu dicuci dengan air sampai pH netral. DEAE-Selulosa yang telah dikembangkan kemudian disuspensikan dalam bufer posfat 0,01M pH 7.

Kolom gel yang telah disiapkan (20 x 2,5 cm) pada bagian bawahnya ditutup dengan menggunakan glass wol atau kapas. DEAE-selulosa yang telah disuspensikan selanjutnya dimasukkkan dengan hati-hati ke dalam kolom hingga diperoleh panjang DEAE-Selulosa 20 cm. Elusi terus dengan bufer yang sama.

Masukkan lewat dinding kolom dengan bantuan pipet enzim penisilinasilase kira-kira 2 ml.

Pada saat enzim telah memasuki DEAE~Selulosa tambahkan pengelusi sedikit-sedikit.

Enzim yang terelusi ditampung dalam fraksi-fraksi sebanyak 50 fraksi.

Fraksi-fraksi yang terkumpul diukur serapannya pada aniang gelombang 28O nm

Matriks Penukar Ion Gugus Fungsi Nama

Dextran

Kation kuatKation lemah

Anion lemah

SulfoprofilKarboksimetil

Dietilaminoetil

SP – SephadeksCM – Sephadeks

DEAE - Sephadeks

Selulosa

Kation

Anion

Karboksimetil

DietilaminoetilDietilaminoetil

CM – Selulosa

DEAE – SelulosaDEAE - Sephacel

Pemilihan Matriks Untuk Penukar Ion

Matriks untuk solute yang bermuatan polielektrolit pemilihannya lebih sulit dibandingkan dengan solute yg bermuatan tunggal.

Protein, enzim perrlu diperhatikan:Stabilitas molekul yang akan dipisahkan Spesifisifitas molekul yang akan dipisahkan.Ukuran molekul yang akan dipisahkan.

Kapasitas Total Pertukaran Ion

Kapasitas total pertukaran ion yaitu kemampuan penukar ion untuk mengikat ion-ion yang dapat ditukar, yang dinyatakan dalam meq/berat kering (g)

Matriks halus : luas permukaan besar dan kapasitas total besar

Matriks kasar: luas permukaan kecil dan kapasista total kecil