kromatografi partisi - rara | my daily days · pdf filekomponen/solut antara fase diam cairan...
TRANSCRIPT
KROMATOGRAFI PARTISI
Definisi : Teknik kromatografi berdasarkan partisi
komponen/solut antara fase diam cairan pada
permukaan penyangga padat dengan fase gerak
Fase diam tidak saling campur dengan fase gerak
Komponen terpisah karena masing-masing memiliki
koefisien partisi yang berbeda
KROMATOGRAFI PARTISI
Fasa diam: Cairan yang melapisi partikel penyangga
Fasa gerak: Cairan yang tidak dapat campur dengan fasa diam
tidak dapat teradsorpsi pada penyangga fasa diam
Sampel: Berbeda kelarutannya dalam fasa diam
Komponen yang lebih besar kelarutannya dalam fasa diam
tertahan lebih lama
Koefisien partisi (Kd) = [X]A/[X]B
● Berubah bila suhu berubah
● Nisbah konsentrasi zat terlarut dalam dua pelarut yang
tidak saling campur, pada saat kesetimbangan
Penyangga:
kieselguhr, selulosa, silika gel , alumina
C8, C18
konsentrasi zat terlarut dalam fasa diam
koefisien partisi = ---------------------------------------------------
konsentrasi zat terlarut dalam fase gerak
Bila suatu zat mempunyai Kd = 5 diperlukan fasa gerak
sebesar 5x volume kolom untuk mengelusi seluruh senyawa
keluar dari kolom
Volume kolom dibuat sekecil
mungkin sesuai dengan yang
benar-benar dibutuhkan untuk
pemisahan komponen
Semakin sedikit fase gerak yang diperlukan, semakin
sedikit pelarut yang harus diuapkan; proses pemekatan
semakin cepat
Analat mengandung A (Kd=1) dan B
(Kd=0,67), fasa mobil P
Jika masing-masing ada 1000 molekul, ada fase
gerak masing-masing terpartisi
Asumsi : Vd =Vg
A : 500 pada fasa diam, 500 pada fasagerak
B: 400 pada fasa diam, 600 pada fase gerak
Elusi lebih lanjut(tambahan fasa gerak segar)
Zat terpartisi lebih
lanjut A250-250 (fd-fg)
B: 160-240 dan 240-360 (fd-fg)
Seluruh zat A maupun B terelusi terpisah
P
A+ P
B+P
A P
P
P
B
P
Ilustrasi mekanisme partisi (pemisahan )
dalam kolom, Koefisien Partisi dan Teori Pelat
Fasa diam: hidrofilik
Fasa gerak : hidrofobik
Pasangan fasa diam dan fasa gerak: daya saling melarutkan
kecil
Kromatografi partisi fasa normal
Kromatografi partisi fasa terbalik
Fasa diam: hidrofobik
Fasa gerak : hidrofilik
Pemisahan ion-ion logam
1 2 3 4 5
I
II
A =1
A= 0,5
Soal : Berapa fraksi A pada saat fase gerak “mengisi “ pelat no 4 Berapa untuk solut B bila Kd B = 0.6
0.5 0.125
0.25 0.25
0.25 0.25 0.125 0.25 0.25
0.125 0.125
Solut A (nilai (Kd=1) terdistribusi dalam fase diam (kolom I) dan fase gerak (kolom II)
Perkembangan dalam kolom saat dua analit dipisahkan
Konsentrasi analit pada berbagai jarak dari titik injeksi
Kolom partisi • Fase diam dan fase gerak merupakan zat
cair
• Pada kolom partisi umumnya suatu pelarut
tidak campur air diadsorpsi pada suatu
padatan inert, sebagai cairan fasa diam
• Larutan analit ditempatkan pada bagian atas
kolom, kemudian dicuci dengan pelarut
kedua hingga analit keluar dari kolom
• Pelarut kedua= fase gerak = eluen =bisa
berupa campuran pelarut mungkin juga
yang mengandung bufer
MK KROMATOGRAFI I
D3 ANALISIS KIMIA
kuliah minggu ke 8
KROMATOGRAFI
ADSORPSI
KROMATOGRAFI ADSORPSI
♦ Jenis dan sifat adsorbent
♦ Jenis dan sifat eluen
♦ Kelakuan kromatografi zat
♦ Reaksi samping pada kromatografi
♦ Kromatografi adsorpsi berbagai zat
Adsorbent • Sifat :
1. Polaritas relatif : Kekuatan untuk mengadsorpsi spesies tertentu.
2. Kapasitas adsorpsi : jumlah gr solut yang dapat diadsorpsi per gr adsorbent
1.Polaritas adsorbent polar tertentu (untuk mengadsorpsi gugus polar) -COOH > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > =C=O >
-COOR > -OCH3 > -CH=CH-
Untuk Arang (charcoal)?
Diuji dengan pewarna → jenuh
Arang aktif > silika gel > alumina asam >
alumina basa > Cr2O3 > ZnS > Al2O3 > CaF2 > CaO
Penggolongan adsorben ~ Kapasitas adsorpsi Lemah Medium Kuat
Sukrosa CaCO3 Mg Silikat aktif
Pati Ca3(PO4)2 Alumina aktif
Inulin Mg3(PO4)2 Arang aktif
Talc Mg Oksida aktif
Na2CO3
2. Kapasitas adsorpsi
me
nin
gk
at
Hesse:
Charcoal > silika gel > floridin > alumina asam > alumina basa > Cr2O3 > ZnS > Al2O3 > CaF2 > CaO
Adsorbent Anorganik • Alumina Al2O3
Δ Na aluminat
Na+ dapat ditukar dengan kation Alumina basa
- Biasa tercampur dgn Na karbonat & Nabikarbonat
- Kehalusan partikel ±7µ
- Dicuci dgn asam HCl
Cl- dapat ditukar dengan anion Alumina asam
Bauksit Al2(OH)4 Pemisahan hidrolisit chitin gula
• Magnesia MgO Pengganti alumina
Magnesium silikat Gula, steroid
Kalsium hidroksida karotenoid
Kalsium karbonat Xantophyl, pigmen lain
Dikalsium fosfat karoten
Trikalsium fosfat enzim
Kalsium oksalat antraquinon
Zinc karbonat karotenoid
Silika gel Sterol, asam lemak, gliserida, karbohidrat, asam amino
Adsorbent Organik
●Selulosa & turunannya:
●Pati
● Sukrosa
● Manitol
● Dekstran
Digunakan untuk pemisahan zat hidrofilik (asam
amino, asam nukleat, gula
Senyawa aromatik , pemanis, asam ketokarboksilat, antrakuinon
Adsorbent Spesifik
• Silika gel dengan lubang pori spesifik
Silika gel + zat (misal : metil orange)
• Kolom urea
• Kolom histon
• Kolom selulosa + azofenols
Asam lemak rantai lurus → adsorpsi
Asam lemak bercabang → lewat
DNA teradsorpsi, RNA tidak
enzim
ELUEN
Daya elusi ≈ adsorben
Adsorben polar
asam/basa > asam organik > piridin > air > metanol > etanol > propanol > aseton > dikloroetana > etil asetat > kloroform; dietil eter > diklorometana > benzena; toluena > karbon tetraklorida > sikloheksana > heksana > petroleum eter
Kemurnian eluen
Pengotor dalam eluen Elusi terganggu
●Pelarut organik : Kering; redestilasi
●Pelarut yang mengandung peroksida:
Pada kolom alumina, peroksida tertahan
●Pelarut berhalogen : Bila ada Na2CO3 /K2CO3
terbentuk HCl bebas
Fungsi fasa diam terganggu
Kelakuan kromatografi zat
Proses kromatografi:
Interaksi fasa diam-zat-fasa gerak
Sifat adsorben (fasa diam), sifat zat, dan sifat eluen berpengaruh
Posisi pita zat (pada kromatografi kolom)/spot (pada KLT) bervariasi
Sifat Adsorbent dan Struktur Kimia Zat yang diadsorpsi
Strain(1948): karotenoid
Posisi karotenoid pada kolom sukrosa, celite, magnesia
sukrosa celite magnesia
Zeaksantin Zeaksantin Rhodoksantin
Lutein Lutein Lycopene
Cryptoksantin Cryptoksantin Zeaksantin
Rhodoksantin Rhodoksantin Lutein
Lycopene Lycopen Cryptoksantin
β-carotene β-carotene β-carotene
α-carotene α-carotene α-carotene
….
……..
β-karotena α -karotena
Likopena
OH
OH
Zeaksantin
OH
OH Lutein
OH
OH Rubiksantin
Sukrosa: afinitas terhadap OH- > ikt ganda berkonjugasi
Kriptoksantin (1 OH) teradsorpsi lebih kuat daripada lycopene (+ 2 ikatan ganda) dan rodhoksantin ( + 2 CO + 1 ikatan ganda)
Magnesia: afinitas terhadap OH- < ikt ganda berkonjugasi
α dan β-carotene (Δ posisi 1=)
Zeaksantin dan lutein (Δ posisi 1=) terpisah
Lycopene(13=) teradsorpsi lebih kuat daripada zeaksantin (11= , 2OH)
celite sukrosa magnesia
Susunan Kimia dan Kromatografi
Kromatografi dengan media anorganik ~ adsorpsi
Daya untuk diadsorpsi : ~ ikatan ganda gugus OH
∑ Ikatan ganda ↑
∑ OH ↑ Adsorptivitas ↑
aldehid dan keton < alkohol
hidrokarbon < ester < keton/aldehid
asam dan basa > alkohol, tiol > aldehid, keton > zat berhalogen, ester > hidrokarbon tak jenuh > hidrokarbon jenuh
Gugus fungsi
R-COOH
R-CONH2
R-OH
R-NH2
R-NH-Ac
R-O-Ac
R-COOCH3
R-N(CH3)2R-O-B2
R-NO2
R-O-CH3
R-H
adsorb
abilitas ↑
Subtituen:
Halogen < nitro < arilamino < alkilamino < amino <asilamina < OH rantai samping < OH inti
Ikatan hidrogen menurunkan adsorbabilitas
CH3
O
O
O O
H
O
CH3
O O
H
CH3
O O
H O O
H
O
CH3
O O
H
O O
H
CH3
CH3
CH3 O
O
H3C HO
hidroksimetilantraquinon
Zat manakah yang lebih kuat teradsorbsi pada silika:
2-nitroresorsinol dan m/p-nitrofenol
2-hidroksiantraquinon dan 1,4,5,8-tetrakudroksiantraquinon
1 2
4
3
5 6
Kekuatan adsorpsi 1<2; 3<4; 5<6
Posisi Relatif Zona pada Kolom
• ~ adsorpsi ~ struktur kimia
sifat adsorbent
sifat eluen/solvent
1 2 3 4
• Efek solven → jenis
celite
sukrosa
petroleum/benzena
p/b + 25% aseton
klorofil b, neoksantin
neoksantin, klorofil b
1,2-dikloroetana
petroleum + 0,5% metanol
fukoksantin, violaksantin
violaksantin, fukoksantin
• Efek impuritis
sukrosa petroleum
petroleum + 0,5% amil alkohol
klorofil a, fukoksantin
fukoksantin, klorofil a
Sedikit alkohol dalam solvent
• Efek pH → senyawa polar
selulosa amonia
asam/netral
fluorosein, bromofenol biru
bromofenol biru, fluoroseein
• Efek konsentrasi
konsentrasi ↑ kecepatan gerak ↑
• Efek suhu
sukrosa 95O C
20O C
klorofil a, lutein
lutein, klorofil a
Posisi zona pada kolom
Reaksi Sekunder karena Adsorbent
• Alumina
Yang berisi alkali bebas reaksi sekunder
Saponifikasi gliserida Auto oksidasi asam lemak Deasetilasi gula Destruksi vitamin A,K Dekomposisi insektisida rotenon Hidrasi porifin Transformasi monosiklik keton bisiklik keton Isomerasi 10-nitroantron → 10-nitroantanol
• Silika
Isomerasi terpen hidrokarbon monogliserida sterol
• Charcoal
Aminolisis asam amino
Oksidasi
Dekomposisi
asam amino
Reaksi Sekunder
►SARINGAN MOLEKUL DAN JENISNYA
►ELUEN DAN SISTEM ELUSI
► APLIKASI KROMATOGRAFI EKSLUSI
► PENGERTIAN
PENGERTIAN
Kromatografi ekslusi/filtrasi/permeasi
Pemisahan molekul pada Kromatografi cairan berdasarkan perbedaan ukuran , bentuk molekul
Sampel
Molekul besar
Molekul kecilr
Bila terlalu besar, tidak masuk
ke pori eksklusi
awal elusi
Ekslusi
Ditolaknya partikel karena ukurannya lebih
besar dari pori sehingga tidak masuk pori
Limit ekslusi
Batas ukuran molekul terbesar yang
dapat dipisahkan pori gel filtrasi,
(ukuran yang lebih besar serentak ke
luar kolom)
Limit inkslusi
Batas ukuran molekul terkecil yang
dapat dipisahkan pori gel filtrasi,
(ukuran yang lebih kecil dielusi
serentak ke kuar kolom)
♦ Sephadex lipofilik
○ Sephadex LH-20 dan LE-60
○ Bila diperlukan pelarut organik
○ Fasa gerak: digunakan untuk sistem buffer aq, pelarut organik polar, campuran pelarut aq.
○ Fraksinasi lipid, steroid, asam lemak, hormon, vitamin
MEDIA GEL FILTRASI/SARINGAN MOLEKUL
● Sephadex ♦ Cross linking (CL) dextran-epiklorohidrin
CL Nomor G Swelling
♦ Swelling (penggembungan) dipengaruhi oleh:
Derajat CL, Kekuatan ion,
pH, Jumlah bahan organik modifier
♦ Aplikasi: protein, peptida, asam nukleat, polisakarida
♦ Kestabilan pada pH tertentu
G-10 sp G-25 stabil pada pH 2-13 G-50 sp G-200 satabil pada pH 2-10
♦ Fasa gerak: larutan garam aq
dekstran
Ephichlorohydrin
1kloro,2,3 ephoxypropana
● Sephacryl
♦ Dextran alil dan N,N'-metilena-bis-akrilamida
♦ Tersedia dalam bentuk pre-swollen
♦ Fasa gerak: mengandung pelarut organik, surfaktan mis 1%SDS, urea 8M, guanidin hidroklorida 6M
♦ sepachryl S-400 dan S-500: pemisahan polisakarida
dan makromolekul lain
♦ Sepachryl S-1000: pemisahan fragmen restriksi DNA,
polisakarida sangat besar,
proteoglikan
● Superdex
● Biogel
♦ agarosa dan dextran
♦ Fraksinasi protein dengan laju alir tinggi
♦ Biogel A: CL agarosa
♦ Biogel B: CL poliakrilamida
Kisaran
Bobot molekul
Kisaran
Bobot molekul
Sephadex globular linier globular linier
G-10 <700 <700 Sepharosa
G-15 <1500 <1500 6B/CL-6B 104 – 4x106 104 – 1x106
G-25 Coarse 1000-5000 100-5000 4B/Cl-4B 6x104 – 2x107 3x104 – 5x106
Medium 2B/CL-2B 7x104 - 4x107 10x104 -
2x107
Fine
Superfine Sephacryl
G-50 Coarse 1500-30000 500-10000 S-200 Spfn 5000– 25x104 1000-8x104
Medium S-300 Spfn 10000-1.5x106 2000-4x105
Fine S-400 Spfn 20000-8x106 10000-2x106
Superfine S-500 Spfn 40000-2x107
G-75 3000-80000 1000-50000 S-1000 Spfn 5x105->108
Superfine 3000-70000
G-100 4000-150000 1000-100000
Superfine 4000-100000
G-150 5000-300000 1000-150000
Superfine 5000-150000
G-200 5000-600000 1000-200000
Superfine 5000-250000
Soal era create
• Gel dengan kemampuan memisahkan pada
kisaran BM lebih rendah akan memiliki nomor G
lebih kecil untuk sephadex sementara untuk
sephacryl akan memiliki nomor S lebih tinggi
(benar atau salah)
• Kisaran BM pemisahan molekul untuk suatu tipe
gel tertentu lebih besar untuk molekul globular
dibandingkan molekul linier (benar atau salah)
Sephadex
40-120 μm (G-10, G-15, G75-200 bukan superfine) 100-300 μm (coarse), 50-150 μm (medium), 20-80 μm (fine) dan 10-40 μm (superfine)
● Ukuran partikel
Coarse
Medium
Fine
Superfine
Untuk filtrasi yang perlu laju alir cepat pada tekanan rendah
Untuk tujuan preparatif
Untuk kolom dengan resolusi tinggi dan KLT
● Stabilitas kimia sephadex
○ tidak larut dalam semua pelarut (kecuali telah terdegradasi)
○ Stabil dalam air, larutan garam, pelarut organik,
larutan basa dan asam lemah.
○ Pada larutan asam kuat, ikatan glikosida pada matrix
gel terhidrolisis
○ Tidak berubah sifat dalam HCl 0,1 M selama 1-2 jam,
dan dalam HCl 0,02M selama 6 bulan.
○ pereaksi yang bersifat oksidator merusak struktur gel
● Stabilitas fisika sephadex
○ dapat disterilisasi, 30 menit, 120oC. Pemanasan dengan T>1200C sephadex rusak membentuk karamel
○ Derajat ikatan silang tinggi (G-10 dan G-15), kaku, hanya untuk laju alir rendah
○ Derajat ikatan silang rendah (G-200 & G-150) dapat dipadatkan
● Sifat kromatografis sephadex
○ selektivitas
○ Penyimpangan sifat
Tiap tipe G punya batas kisaran BM berbeda
• Molekul kecil pada G dengan ikatan silang tinggi (G-10 & G-15) mengalami penyimpangan elusi, tidak selalu seperti aturan elusi
▪ Molekul dengan BM>limit ekslusi tertinggi, tidak ditahan, keluar lebih dulu
▪ Molekul kecil masuk ke pori gel, ditahan dan keluar lebih dulu yang berukuran besar
▪ Molekul-molekul < limit eksklusi terkecil, masuk ke pori gel, ditahan sangat lama dan keluar paling akhir tanpa pemisahan jelas
•Ada interaksi ionik dan interaksi aromatik
Senyawa aromatik berinteraksi dengan sephadex & terelusi paling akhir
Diatur dengan mengubah kekuatan ionik dan pH, dapat dihilangkan dg pelarut fenol-asam asetat-air & urea 8M
(Interaksi bertambah bila pelarutnya metanol dan etanol)
Gugus karboksil pada sephadex ; interaksi dengan contoh bermuatan
Zat bermuatan positif ditahan, negatif keluar (tidak ditahan)
Dihilangkan dengan pelarut berkekuatan ionik tinggi (>0,02M)
APLIKASI KROMATOGRAFI EKSKLUSI
● Analisis campuran molekul dengan BM berbeda
● Desalting
● Penentuan Bobot molekul
○ Pemisahan rafinosa, maltosa, glukosa, menggunakan sphadex, pH 7 laju alir 5 ml/menit, eluen H2O
○ Pembebasan garam dan senyawa berBM rendah dari molekul makro
○ Bobot molekul protein, dextran, etilenaglikol
○ Pemisahan berbagai protein/enzim
○ Pemisahan asam nukleat dari nukleotida
70
90
110
130
150
170
190
210
230
250 Volu
me e
lusi (m
L)
104 105 106
Bobot molekul
Gambar: volume eluesi sebagai fungsi dari bobot molekul protein pada sephedex G-200, pH 7,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
Ve
/V0
Blue dextran
sukrosa
Kurva kalibrasi untuk penetapan bobot molekul
pada kromatografi ekslusi
Preparasi Kolom Filtrasi Gel
● Sephacryl, superdex, superosa, sepharosa
Preswollen tapi mengandung etanol20% sebagai pengawet Perlu dilarutkan dalam eluen sebelum dimasukkan ke kolom
● Sephadex, Bio-Gel-P
Harus digembungkan/dikembangkan dulu dengan eluen dalam waktu tertentu
Sephadex G10 2-3 3 1
Sephadex G15 2,5-3,5 3 1
Sephadex G25 4-6 6 2
Sephadex G50 9-11 6 2
Sephadex G75 12-15 24 3
Sephadex G100 15-20 28 5
Sephadex G150 18-20*; 20-30 72 5
Sephadex 200 20-25*; 30-40 75 5
Bio-GelP-2 3 4
Bio-Gel P-4 4 4
Bio-Gel P-6 6,5 4
Bio-Gel P-10 7,5 4
Bio-Gel P-30 9 4
Bio-Gel P-60 11 4
Bio-Gel P-100 12 4
Jenis gel Volume
pack
(ml/g ±10%
Waktu hidrasi (jam)
20oC 100oC
Saringan Molekul Anorganik: Zeolit
Struktur Zeolit:
○Molekul tetrahedral yang bergabung, ada rongga rongga besar yang dihubungkan oleh saluran kecil.
○Penampang lintang saluran kecil menentukan ukuran molekul yang dapat masuk ke rongga
○ Ukuran & posisi ion logam (mis Na, Ca) dalam kristal
zeolit & jaringan rangka tetrahedral alumina silikat zeolit,
menentukan diameter efektif saluran kecil
◊ tipe saringan molekular 5A: 4A yang punya K & Ca sbg pengganti Na)
Etana, alkohol 4C, nasuk rongga
Siklopropana , senyawa aromatik tidak masuk rongga
◊ tipe 10X dan 13X: Na8(AlO2)80(SiO2)106
○Tipe zeolit
◊ tipe saringan molekular 4A: [Na12(AlO2)12(SiO2)12
molekul <4A spt H2O, CO2, H2S, SO2 dan hk 2C masuk ke rongga
Soal era create
• Waktu hidrasi dipengaruhi oleh suhu saat hidrasi
dilakukan, makin tinggi suhu makin lama waktu yang
diperlukan (benar atau salah)
• Bila ingin membuat kolom Sephadex G25 dengan
ketinggian 15 cm pada kolom gelas dengan diameter 1,5
(a) berapa gram sephadex yang dibutuhkan
• Jawab : volume = luas diameter x tinggi kolom = R2 =
3.14 x 0.75 cm x 0.75 cm x 15 cm = 26.5 ml ; volume
paking 4-6 ml/g untuk menghasilkan 26,5 ml gel jadi
diperlukan = 26,5 ml x 1 gram resin kering/4-6 ml =
4.4-6,6 gram
• (b) berapa jumlah tersebut bila diameter kolom 3 cm
Soal kromatografi Ekslusi
Soal
Polifinil standar dengan berbagai bobot molekul
dianalisis melalui kromatografi ekslusi mengasilkan
data sebagaimana pada tabel
Suatu sampel yang mengadung polyfinil dianalisis
dan menghasilkan volume retensi sebesar 8.45
Perkirakan bobot molekul sampel
Soal penetapan bobot molekul dengan
kromatografi ekslusi
• Suatu kolom sephadex
G-70 dengan dimensi 25
x 35 cm2 memberikan
hasil sebagai Tabel
berikut :
• Tentukan bobot molekul
suatu zat yang terelusi
dengan volume eluen
76.5 ml
protein Mr Volume
eluen
(ml)
Ribonuklease 13.700 109.5
Aldolase 158.000 55.0
Blue dextran 2 x 107 53.1
Ovalbumin 4.7 x103 71.8
Pemisahan protein dengan
kromatografi ekslusi
protein Mr Volume eluen (ml)
Ribonuklease 13.700 109.5
Aldolase 158.000 55.0
Blue dextran 2 x 107 53.1
Ovalbumin 4.7 x 103 71.8
KROMATOGRAFI
PERTUKARAN ION
PERTEMUAN MINGGU 12,13 14
D3 KIMIA 2009
KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION
• PRINSIP
• BAHAN PENUKAR ION
• PEMILIHAN PENUKAR ION
• REGENERASI PENUKAR ION
• PEMBUATAN KOLOM PENUKAR ION DAN APLIKASI SAMPEL
• PEMISAHAN SENYAWA BM RENDAH
• PEMISAHAN SENYAWA BM TINGGI
• KROMATOGRAFI PERTUKARAN LIGAN
• Pemisahan molekul bermuatan berdasarkan kesetimbangan antar ion immobil dan ion mobil dengan muatan berlawanan
• Ion immobil berikatan kovalen dengan matrik polimer fasa diam;
• counter ion
– menetralkan ion immobil
– dapat dipertukarkan dengan ion bermuatan sejenis
• Penukar kation : ion immobil – /counter ion +
• Penukar anion : ion immobil +/ counter ion -
PRINSIP KROMATOGRAFI
PERTUKARAN ION
3B- PA
+ +
+ PA
+ +
+ 3A-
A- A-
A-
B-
B-
B-
+ + +
3N+ PK
- -
- PK
- -
- 3M+
M+ M+
M+
N+ N+
N+
+ + +
PRINSIP KROMATOGRAFI
PERTUKARAN ION
PA = Penukar Anion
PK = Penukar Kation
PA suatu penukar anion; terdiri dari matrik yang memiliki ion immobil (muatan + atau suatu kation). Kation ini dinetralkan dengan cara mengikat anion A- (suatu ion counter).
Pada reaksi pertukaran anion A- digantikan oleh anion B-, anion A- suatu ion mobil, B- pun disebut ion mobil karena kemudian dapat ditukar lagi dengan anion yang lain
anion lain yang kekuatan pengikatannya terhadap ion immobil lebih besar juga selanjutnya dapat mengusir B- dari posisi terikat (B lepas dari), demikian seterusnya dengan anion-anion lainnya.
PRINSIP KROMATOGRAFI
PERTUKARAN ION
Resin
Bahan fase diam dalam kromatografi pertukaran ion berupa manik terbuat dari kopolimer polistirena yang mengandung ikatan silang (cross linkage) divinil benzen
Suatu gugus bermuatan (gugus fungsional) terikat pada matrik/resin menentukan sifat bahan : sebagai PA atau PK; kuat atau lemah.
Jumlah ikatan silang menentukan sifat bahan resin, untuk pemisahan molekul Mr besar atau kecil
BAHAN KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION
Resin sintetik pertama
• Diaplikasikan pada proses demineralisasi,
pengolahan air, recovery ion dalam limbah
• Matriks hidrofobik
• Crosslinking tinggi porositas kecil tidak bisa
untuk protein/makromolekul
Untuk biologi:
• selulosa, hirofilik, tidak merusak protein
• Kapasitas rendah
BAHAN KROMATOGRAFI
PERTUKARAN ION
Contoh aplikasi PA dan PK pada
pengolahan/pemurnian air
Misal : Air
dengan ion Cl-
dan Na+
PA Air dengan
OH- Na+
PK
1
2
Air dengan
OH- Na+
3
Air dengan OH- H+
(air murni)
4
1. Reaksi pada kolom
penukar anion (PA)
Pemurnian air dengan resin penukar ion
2. Reaksi pada kolom
penukar kation
Rz+OH- +Cl- Rz+Cl-
+ OH-
Rz-H+ + Na+ Rz-Na+
+ H+
Rz+ OH- : resin penukar anion dengan
counter ion OH-
Rz+Cl : resin penukar anion dengan counter
ion Cl-
Terjadi pertukaran ion Cl oleh OH-, air
yang keluar kolom tidak mengadung Cl-
PK ?
Bahan penukar ion
X
X
X
Gugus fungsional bermuatan +
atau -
Matrix : silika, resin (polistirena,
polieter) polisakarida (selulosa,
dekstran, agarosa)
Tabel : Penukar ion yang umum, jenis penukar,
matrik, gugus fungsi dan contoh produk
berikut
tipe matrix Gugus fungsi Produk
komersial
Asam
lemah
(PK)
As poliakrilat
Polistiren
Selulosa
Dextran
Agarosa
-COO-
-CH2COO-
-CH2COO-
-CH2COO-
-CH2COO-
Asam
kuat
(PK)
Polistiren
Dextran
Polistiren
Polistiren
-SO3-
-CH2-CH2-CH2-SO3-
-CH2-CH2-SO3-
-CH2-CH2-CH2-SO3-
Amberlite,
SP-Sephad
Poros S
Poros SP
Penukar ion yang umum
tipe matrix Gugus fungsi Produk komersial
Basa
lemah
(PA)
Polistiren
Dekstrosa
Dekstran
Agarose
-CH2NH+R2
-CH2CH2NH+(CH2CH3)2
-CH2CH2NH+(CH2CH3)2
CH2CH2NH+(CH2CH3)2
Amberlite IR45
DEAE Sephacryl
DEAE Sepha
DEAE Sepha
Basa
kuat
(PA)
Polistiren
Selulosa
Dextran
Polistiren
-CH2N+(CH2)2
-CH2-CH2N+(CH2CH3)3
-CH2-CH2N+(CH2CH3)2
CH2-CH(OH)CH3
Kuarterner ionpolietilamin
Biorad AG-1
Cellex T
ClAE sephadex
Poros SP
Penukar ion yang umum
Gugus fungsional bermuatan
• Gugus asam kuat : RSO2O-, H+
• Gugus basa kuat : R-N+(R’)3,OH- Terionisasi sempurna
• Gugus asam lemah : RCOO-,H+
• Gugus basa lemah : amina (RN+H3,OH-)
Bahan penukar ion
sufonat gugus fungsional
pembentuk asam kuat ;
amonium kuarterner gugus
fungsional pembentuk basa
kuat terionisasi sempurna
Karbonil gugus fungsional pembentuk
asam lemah; amina gugus fungsional
pembentuk basa lemah terionisasi
sebagian, tergatung pH lingkungan
Gugus Fungsional Bermuatan
• Sifat penting penukar ion
• Jenis gugus : menentukan Tipe, kekuatan dan Kapasitas
• Gugus fungsi Penukar Anion (PA)
– amino etil (AE)
– dietilaminoetil (DEAE)
– quarternary aminoetil (QAE)
• Gugus fungsi Penukar Kation (PK)
– karboksimetil (CM)
– phospho
– sulphoproyl (SP)
penukar ion kuat terionisasi sempurna pada kisaran pH
yang luas, kapasitas tidak bergantung pH,
Bahan penukar ion
Gugus fungsi bermuatan
• AE --OCH2CH2NH3+
• DEAE --OCH2CH2NH+(CH2CH3)2
• QAE
--OCH2CH2N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3
• CM --OCH2COO-
• Phospho --PO4H2-
• SP --CH2CH2CH2SO3-
Bahan penukar ion
• Soal Bahan Penukar ion :
• Diketahui informasi suatu bahan penukar sebagai berikut: kopolimer stiren divinil benzen, gugus fungsional sulfonat contoh nama dagang Dowex 50 W X8 (kopolimer stiren dengan DVB 8%). Benar atau salah atau Mana yang benar dari pilihan berikut :
1. Jenis PK atau PA
2. Gugs fungsi kuat/ lemah
3. Lebih tinggi porositasnya dibandingkan kopolimer yang sejenis dengan 20%DVB
4. Dapat menukar Mg2+, tidak menukar Cl-
5. Afinitas terhadap Cd2+> K+
6. Kapasitas total ~ jumlah HSO3-/ gram bahan
7. Suatu bahan hidrifob/hidrofil
8. Matrik penukar bahan alami/ bahan sintetik
9. Kapasitas total pada pH 5 = kapasitas pada pH 10
Kapasitas Pertukaran
• Kemampuan untuk mengambil counter ion yang dapat ditukar
• Jumlah gugus bermuatan/gram penukar ion (kapasitas total)
• Kapasitas tersedia = kapasitas yang benar-benar ada saat perlakuan dipengaruhi oleh
– Gugus fungsional (ascessibility)
– Konsentrasi eluen
– Sifat counter ion
– Selektifitas gugus fungsi
– pH eluen (terutama untuk penukar ion lemah)
Kapasitas Pertukaran
• Kapasitas break through = kapasitas satu
kolom, dipengaruhi oleh laju eluen,
kapasitas meningkat dengan menurunnya
laju.
• Ukuran butir juga mempengaruhi
kapasitas
Kapasitas Pertukaran
• PA atau PK kuat
– Kapasitas tak bergantung pH
– Kapasitas pertukaran tetap
– Sulfonat dan amonium quarterner
• PA atau PK lemah
– Kapasitas bergantung pH
– COO- (CM) : penukar kation bila pH cukup tinggi untuk
disosiasi –COOH kisaran kerja pH 5 -14
– Amina tersier : penukar anion bila pH rendah (asam)
gugus bermuatan + pada N kisaran kerja pH 1 - 9
Kapasitas pertukaran
Ilustrasi Kapasitas tersedia dan kapaitas total:
• Suatu PK akan ditentukan kapasitas penukarannya terhadap ion Cd2+ yang terdapat dalam dua contoh yang berbeda, (1) air laut dan (2) larutan kadmium nitrat 50 ppm
• Kapasitas PK terhadap Cd2+ pada (1) > (2) sebab contoh 2 selain mengadung Cd2+ juga mengandung kation lain yang sama-sama dapat terikat pada gugus fungsional, (PK tidak selektif pada kation Cd)
• Bila digunakan PK lemah, kapasitas pada keduanya lebih besar pada pH 10 dibandingkan pada pH 3 (pada pH rendah ionisasi gugus fungsional pada matrik tidak sempurna
• Asam sangat lemah tidak ditahan oleh resin penukar anion dengan basa lemah
Kapasitas pertukaran
• Jumlah total ekivalen H+ yang
dipertukarkan per unit volume atau unit
massa resin
• Nilainya bergantung tahanan zat terlarut
sehingga hanya ion dengan kapasitas
tinggi saja yang digunakan untuk
pemisahan campuran yang kompleks/
karena kenaikan tahanan zat terlarut
Kesetimbangan pertukaran ion
• resin-H+ + K+ resin-K+ + H+
• Koefisien selektivitas kK/H
• Afinitas (pengikatan K oleh resin)
– muatan ion ( )
– ukuran ion tersovatasi ( )
– polarisabilitas ion ( )
K K/H (K+)r (H+)
(H+)r (K+) =
larutan larutan
Faktor pemisahan (retensi relatif) =
Misalnya K+ dan Na+ dengan resin-H+
K/Na = kK/H
kNa/H
kK/Na =
Kesetimbangan
pertukaran ion
= kd1
kd2
1, 2 = ion-ion
dalam campuran
, K/Na
Kasetimbangan pertukaran ion
Resin-H
NaCl
Resin-Na
HCl
Resin-H + NaCl Resin-Na + HCl
Donnan : Kesetimbangan antara bagian
dalam resin dengan larutan di luar
penggantian ion swelling
Kesetimbangan pertukaran ion
Kation anorganik
• Afinitas gol IA dan IIA meningkat dengan meningkatnya BA
• Hidrasi ion mengurangi afinitas
Anion Anorganik dan Organik
• Pada amberlite (poliamina) daya pertukaran hidroksida>sulfat>kromat>sitrat>tartrat>nitrat>arsenat>fosfat>molibdat>asetat=iodida=bromida>klorida>fluorida
• Reaksi resin-Cl + Na-borat semua Cl terdesorpsi tanpa diganti borat
Aturan umum afinitas pertukaran ion
• Pada C rendah dan T biasa, berlangsungnya pertukaran meningkat dengan meningkatnya valensi ion Na+<Ca2+<Al3+<Th4+ (Th4+ tertinggi peluang diikatnya oleh suatu PK)
• Pada C rendah dan T biasa, dan valensi ion sama, pertukaran meningkat dengan meningkatnya nomor atom ion Li+<Na+<K+= NH4
+<Rb+<Cs+<Ag+<Be2+<Mn2+<Mg2+= Zn2+<Cu2+=Ni2+< Cs2+<Ca2+<Sr2+<Ba2+
• Pada C tinggi, perbedaan potensial pertukaran ion yang berbeda valensi, berkurang bahkan adakalanya terbalik
• Pada T tinggi, dalam media non aq, atau C tinggi potensial pertukaran ion yang bermuatan sama akan sama
Aturan umum afinitas pertukaran ion
• Potensial pertukaran oleh ion H+ dan OH-
bervariasi sesuai dg sifat gugus fungsi dan
kekuatan asam/basa yang terbentuk antara
gugus fungsi dan ion tsb. Semakin kuat asam/
basa, semakin rendah potensial pertukaran.
• Pada penukar basa lemah, urutan pertukaran
OH-> SO42-, CrO4
2->sitrat, tartrat > NO3-> AsO4
3-
>PO43->MoO4
->asetat > I-, Br- = Cl-> F-.
Elusi
• Ion yang terikat pada resin dielusi dengan cara
– Displacement, oleh ion yang teradsorpsi lebih kuat
– Larutan pekat ion lain
– Pengkompleks
• Konstanta kesetimbangan distribusi ion antara larutan dan resin Kd Koefisien distribusi
Kd Ms/massa resin
Ml/vol. larutan = =
Ms
Ml massa-resin
V-larutan X
Ms dan Ml fraksi M dalam resin dan larutan
Faktor pemisahan
Kd1
Kd2
=
Regenerasi Resin
• Proses mengembalikan resin yang telah digunakan ke kondisi semula/sebelum digunakan
• Jumlah bahan organik yang tetap berasosiasi dengan penukar ion setelah elusi: kolom dicuci dengan buffer atau garam kuat mis (NaCl) setimbangkan lagi
• Kontaminan yang terikat kuat/ permanen pada resin bagian tersebut dibuang
• Sisa resin dikeluarkan cuci
Pengepakan kolom
Perhatikan bahan penukar ion :
1. Resin bekas jangan dibuangregenerasi simpan dalam wadah tertutup dan jaga tetap lembab
2. Pre Swell resin sebelum dipakai.
3. Resin kering akan mengembang dalam air (terutama 2x dan 4 x). Semakin tinggi derajat CL makin rendah pengembangannya
4. Resin direndam dalam air sampai volumenya tampak tidak bertambah lagi udara terjebak, lepas
5. Untuk pemisahan yang baik, gunakan resin yang kecil, semakin kecil pertukaran makin cepat.
Pengepakan kolom
6. Resin yg baru (dari botol) harus dibersihkan agar didapat hasil yang reproducible. Resin Pa. tidak perlu dibersihkan
Cara
Resin diekstraksi dalam soxhlet,
Mula-mula dengan HCl 2-3M, sampai ekstrak jernih dilanjutkan dengan NaOH 2-3 N, sampai ekstrak jernih, dengan etanol 95% sampai ekstrak jernih bilas resin dengan air sampai air bilasan netral dan bebas garam jaga kelembaban.
5 4
2
1
resin
air
air
Cara 1 3
Kolom diletakkan vertikal
1.Glasswool pd bagian bawah
2.Diisi air ½ kolom
3.Resin dimasukkan sedikit2
4.Air dialirkan balik udara
terusir
5.Aliran air dihentikan
6.Air yang berlebih
dikeluarkan sisakan
setinggi 2 mm
1.Glasswool pada
dasar kolom
2.Bubur kental resin
15-30 ml pelarut/ g
resin kering, 6 ml
pelarut/ g resin basah
3.Pelarut bubur
dikeluarkan
Cara 2 Bubur resin
1
3
Cara penyiapan Sampel
• Sampel padat bebas garam larutkan
dalam starting buffer atur pH
• Sampel padat bergaram larutkan dalam
starting buffer dialisis atau lewatkan
pada media permeasi gel molekul
besar bebas, garam terikat
• aplikasi
Aplikasi sampel
• Cara mengaplikasikan sampel ke kolom dapat memengaruhi pemisahan
• Sampel tidak dalam kesetimbangan dengan buffer awal bisa terjadi gradien garam pola elusi non reproducible
• Penambahan sampel tidak tepat puncak tidak simetris & recovery berkurang
• V dan C tidak sesuai dg kapasitas kolom resolusi buruk
• Cara :
Pemisahan senyawa ber-Mr tinggi
• Contoh pada pemisahan protein
– Mr besar,
– kestabilan ?
– Buffer anion (fosfat/asetat) bila pakai penukar kation; buffer kation (tris) untuk penukar anion
• Elusi
– Gradien pH, bila pH > pI protein lepas / utk PK
– Gradien garam selanjutnya perlu desalting
Aplikasi
Pemisahan senyawa ber-Mr rendah
Senyawa Mr rendah dengan muatan sama
• Kolom polistiren
• Kolom dengan partikel kecil
• Elusi pompa
– Isokratik
– Gradien
• Eluen
– ion
– gradien pH
Aplikasi
Pemisahan dan analisis asam amino dengan
Amino Acid Analyzer
• Digunakan kolom penukar kation asam kuat
• Cuplikan pada pH awal 2 asam amino +
• Elusi gradien, pH naik,
• Pada pH < pI asam amino sebagai kation, terikat pada resin PK
• Pada pH ≥ PI a.amino netral atau negatif (anion) maka tidak terikat lagi pada PK, terelusi – Asam amino asam & netral keluar berurutan pKa1.
– Asam amino basa keluar terakhir
• Deteksi : reaksi ninhidrin
Aplikasi
Pemisahan aldehida, keton, alkohol
• ~CO + ion H-sulfit senyawa lainterikat
kuat pada anion ex,
• alkohol + H-sulfit
keton dan aldehid terpisah dari alkohol
• + air panas keton terpisah
• + NaCl, (aldehida keluar kolom terahir)
Aplikasi
Pemisahan asam • kekuatan terhadap anion ex kuat elusi
dengan asam kuat atau elusi gradien buffer & pH menurun asam paling lemah keluar paling cepat
• Asam2 amino kation ex as amino pH < pI kation
• Asam dengan kekuatan berbeda
• Anion ex lemah asam dengan Ka kecil sedikit terikat: bila Ka < K ex asam bebas, HCN, borat, fosfat, sulfat, HCl
Aplikasi
Pemisahan sakarida/gula
• Gula + ion borat kompleks (kestabilan =)
monosakarida > disakarida terpisah,
mono-sk (heksosa, pentosa, tetrosa)
dipisah buffer borat gradien pH 7-10
•
Aplikasi
Kromatografi pertukaran ligan
• Bentuk lain aplikasi kromatografi pertukaran ion contoh pemisahan macam2 kafein sbb :
• Resin-Cu2+ pertama mengikat ligan NH3 Resin-Cu(NH3)4
2+
• Analat suatu ligan yg membentuk kompleks lebih kuat lalu dialirkan ligan NH3 terganti
• R-Cu(HN3)42+ + 4kaf R-Cu(kaf)4
2+ + 4NH3
• Elusi dengan NH3 berlebih pengusiran kafein lagi : kafein yang kekuatan kompleksnya paling lemah akan terelusi paling dulu
• R-Cu(kaf)42+ + NH3 (berlebih) R-Cu(NH3)4
2+ + Kaf …
Aplikasi
Polimer/matrik penukar ion
dengan gugus sulfonat
CH=CH2 CH-CH n
n
Polistiren dg
gugus sufonat
SO3- SO3-
Bahan Penukar Ion
CH=CH2 CH-CH n
n
stiren
polistiren
Contoh Polimer /matrik
Bahan Penukar Ion
CL = Cross linkage
(= ikatan silang)
• Diperoleh dari kopolimerisasi
• Misal : divinil benzen (DVB) dan polistiren (PS)
CH=CH2
stiren
+
H2C-CH HC-----CH2
CH2 CH CH2
CH CH C2H CH C2H CH2
CH=CH2
CH=CH2
divinilbenzen
Dowex…X4 = polistiren
dengan 4% DVB
Bahan Penukar Ion
Aplikasi pertukaran ion
• 3 kelompok aplikasi ; pengolahan air, pemekatan dan pemisahan:
• Contoh terapan pemisahan:
• Dowex 2 untuk memisahkan campuran anion halogen dengan urutan F-,C-l,Br-, I- dengan NaNO3 pH 10,4 sebagai eluen
• Dowex 50 dan amberlite120 sulfonated untuk pemisahan golongan alkali dan alkali tanah; Li+,Na+,K+ dengan eluen HC l0,7 M
• Ca2+, Sr2+, Ba2+ eluen dengan eluen 1,2 M asam laktat
• Pengaruh pH terhadap pemisahan asam amino
• Tiga bentuk asam amino saling berkesetimbangan yang dipengaruhi pH, pada kondisi lebih basa dari PI asam amino bermuatan negatif, sebaliknya pada pH < PI
• Asam amino bermuatan negatif dipertukarkan dengan PA
Aplikasi pertukaran ion
R-C-C=O
O-
NH2
H
-H+
R-C-C=O
OH NH3
H
+
R-C-C=O
O-
NH3
H
+
+H+
pI pH < pI
Bentuk kation pada
suasana lebih asam
pH > pI
Bentuk anion pada pH .
> PI
Muata
n b
ers
ih p
rote
in
pH
2 4 6 8 10
+
-
TITIK ISOELEKTRIK
PA
PK
PA penukar Anion
PK penukar Kation
Cu Zn Co Fe
4 8 [HCl]
Larutan contoh yang mengandung ion-ion: Mn2+, Ni2+, Co2+, Cu2+,
Fe3+, Zn2+.dilalukan pada kolom penukar anion Dowex 1. Ion ion
Co2+, Cu2+, Fe3+, Zn2+ membentuk kompleks bermuatan negatif
dengan ligan Cl-, Mg2+ dan Ni2+ tidak. Diketahui koefisien distribusi
berbagai ion kompleks tersebut sebagai fungsi konsentrasi larutan
HCl seperti gambar berikut (Gambar 16.7, Cristian,ed 4):
Bagaimana urutan pemisahan kation-kation bila campuran
tersebut dimasukan ke dalam kolom berisi Dowex 1 yang direndam
dalam HCl 10 M dan dielusi menggunakan eluen larutan HCl
dengan konsentrasi yang semakin kecil (elusi bergradien)
Mn Ni
D = koefisien distribusi,
[M]s
[M]m D =
[M]s, konsentrasi ion logam
terikat di fase diam
[M]m konsentrasi ion logam
di fase gerak.
4 4 8 8
• Ni2+ bukan anion, akan terelusi paling dulu
dalam HCl 12 M, kemudian Mn2+ terelusi dalam
HCl 6M, Co2+ pada HCl 4M, Cu2+ pada HCl
2,5M, Fe3+ terelusi pada HCl 0,5M dan Zn2+
pada konsentrasi 0,05 M.
Jawab
Kesetimbangan pertukaran ion
Koefisien distribusi, D
atau Kd = [K+] pada larutan
[K+] pada resin
[RSO3-B+]s[H+]
Kex = konstanta pertukaran = --------------------
[RSO3-H+]s[Na+]
Kex >>> afinitas resin terhadap B+ besar B+ diikat H+,
dilepas
Informasi label pada bahan penukar ion
• Contoh : Strongly acidic, sufphonic acid, Na +, 20-50 mesh, medium porosity/8X, 4, meq/g dry.
• Penukar kation, asam sulfonat, kation untuk ditukar Na+, ukuran melewati 20 mesh, tidak pada 50 mesh
• 8X derajat ikatan silang, 8% DVB porositas medium
• Kapasitas pertukaran: 4,4 meq/g resin
Detektor kromatografi penukar ion
• Luaran suatu kolom penukar ion adalah
ion- ion analat dapat dideteksi dengan
konduktometer
Asam, amino basa asam amino basa
• Asam amino asam
• Asam aspartat : R = CH2COO-
• Asam glutamat : R = CH2-CH2COO-
• Asam amino basa
• Lisinina : R = (CH2)4NH2
• Arginina : R = (CH2)3NHC(NH2)(=NH)
• Histidina : R = CH2-C=CH
\ asama amino asam dan basa //
CH