Kromatografi Cair Tingkat TinggiI. Tujuan Percobaan Menganalisis secara kuantitatif kafein dalam berbagai jenis minuman ringan (sampel) dengan teknik HPLC

II. Teori DasarKafein adalah senyawa polar yang larut dalam metanol. Apabila kadar kafein ingin ditentukan dengan kromatografi, kafein harus diekstrak ke pelarut lain yang lebih non polar. Tapi apabila fasa dalam kromatografinya diubah dimana fasa diamnya non polar dan fasa geraknya polar (HPLC fasa terbalik), ekstraksi tersebut tidak perlu dilakukan. Eluen dari kolom monitor dalam bentuk absoban yang sebanding dengan konsentrasi kafein, sehingga konsentrasi kafein dapat ditentukan.HPLC (High Performance Liquid Chromatography) menggunakan fasa terbalik dimana sample dialirkan pada fasa diamnya dan dielusi, kemudian dibawa ke detector oleh fasa geraknya. Fasa diam HPLC berupa partikel silica yang ditutup silena. Eluennya bersifat polar seperti methanol dan air. Fasa geraknya tidak diperlukan dalam jumlah yang besar, sehingga komposisi suatu sample dapat diketahui tanpa harus mengekstraknya terlebih dahulu. Pada HPLC, waktu retensi akan meningkat dengan meningkatnya sifat non polar dari suatu senyawa.

III. Cara Kerja Mula-mula, kita membuat fasa geraknya (eluen) terlebih dahulu, yaitu 140 ml aquabidest, 1.4 ml H3PO4 5%, dan 60 ml methanol dicampurkan gelas ukur. Lalu dimasukkan ke dalam penangas ultrasonic (ultrasonic bath) untuk dihilangkan gas terlarutnya. Setelah itu, larutan standar 500 ppm kafein diambil sebanyak 5 ml, dimasukkan ke dalam 5 buah labu takar 10 ml kemudian diencerkan dengan eluen yang telah dibuat dengan konsentrasi masing-masing 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm. Selanjutnya larutan dengan konsentrasi masing-masing tersebut diinjeksikan ke dalam HPLC untuk dihasilkan kromatogramnya. Untuk larutan sampel, teh yang telah disaring dengan penyaringan biasa, diencerkan sebanyak 2x dan 5x sebagai acuan.

IV. Data Pengamatan 20 ppm

40 ppm

60 ppm

80 ppm

100 ppm

Sampel kopi

Sampel Teh

Sampel Kratingdaeng

V. Pengolahan Data A. Penentuan Konsentrasi Kafein Pada Sampel dengan Perbandingan Grafik StandarKafein [ppm]Area [mAU*s]Height [mAU]Waktu Retensi (min)

20881,68179,611,353

401891,52375,151,381

602662,44546,361,355

803059,67637,971,356

1004398,91930,781,358

Grafik

Dari grafik bisa ditentukan konsentrasi sampel :Luas puncak = y = 41,013 x + 118,06Konsentrasi ( C ) = x a. Konsentrasi Sampel Kopiy = 41,013 x + 118,068544,0752 = 41,013 x + 118,068544,0752 118,06 = 41,013 xX = 205,44 ppmkarena sampel diencerkan 5 kali, maka :Konsentrasi (C) = 205,44 ppm x 5 = 1027,23 ppm Konsentrasi kafein dalam sampel = 1027,23 ppm = 1027,23 mg/LJadi, berat kafein dalam kopi (diambil 1 L larutan)mg = ppm x 1L = 1027,23 mg/L x 1 L = 1027,23 mg = 1,027 gramb. Konsentrasi sampel Tehy = 41,013 x + 118,061529,492 = 41,013 x + 118,061529,492 118,06 = 41,013 xX = 34,41 ppmkarena sampel diencerkan 5 kali, maka :Konsentrasi (C) = 34,41 ppm x 5 = 172,05 ppm Konsentrasi kafein dalam sampel = 172,05 ppm = 172,05 mg/LJadi, berat kafein dalam teh (diambil 1 L larutan)mg = ppm x 1L= 172,05 x 1 = 172,05 mg = 0,172 gramc. Konsentrasi sampel Kratingdaengy = 41,013 x + 118,063418,0603 = 41,013 x + 118,063418,0603 118,06 = 41,013 xX = 80,462 ppmkarena sampel diencerkan 5 kali, maka :Konsentrasi (C) = 80,462 ppm x 5 = 402,311 ppm Konsentrasi kafein dalam sampel = 402,311 ppm = 402,311 mg/LJadi, berat kafein dalam Kratingdaeng (diambil 1 L larutan)mg = ppm x 1L= 402,311 x 1 = 402,311 mg = 0,402 gram

B. Berdasarkan grafik konsentrasi dengan tinggi

Dari grafik bisa ditentukan konsentrasi sampel :Tinggi puncak = y = 8,8258 x + 4,426Konsentrasi ( C ) = x a. Konsentrasi Sampel Kopiy = 8,8258 x + 4,4261592,66 = 8,8258 x + 4,4261592,66 4,426 = 8,8258 xX = 179,953 ppmkarena sampel diencerkan 5 kali, maka :Konsentrasi (C) = 179,953 ppm x 5 = 899,767 ppm Konsentrasi kafein dalam sampel = 899,767 ppm = 899,767 mg/LJadi, berat kafein dalam kopi (diambil 1 L larutan)mg = ppm x 1L = 899,767 mg/L x 1 L = 899,767 mg = 0,899 gramb. Konsentrasi sampel Tehy = 8,8258 x + 4,426295,602 = 8,8258 x + 4,426295,602 4,426 = 8,8258 xX = 32,99 ppmkarena sampel diencerkan 5 kali, maka :Konsentrasi (C) = 32,99 ppm x 5 = 164,96 ppm Konsentrasi kafein dalam sampel = 164,96 ppm = 164,96 mg/LJadi, berat kafein dalam teh (diambil 1 L larutan)mg = ppm x 1L= 164,96 x 1 = 164,96 mg = 0,165 gramc. Konsentrasi sampel Kratingdaengy = 8,8258 x + 4,426602,953 = 8,8258 x + 4,426602,953 4,426 = 8,8258 xX = 67,81 ppmkarena sampel diencerkan 5 kali, maka :Konsentrasi (C) = 67,81 ppm x 5 = 339,078 ppm Konsentrasi kafein dalam sampel = 339,078 ppm = 339,078 mg/LJadi, berat kafein dalam Kratingdaeng (diambil 1 L larutan)mg = ppm x 1L= 339,078 x 1 = 339,078 mg = 0,339 gram

VI. PembahasanHigh-performance liquid chromatography (HPLC) mengacu pada proses pemurnian dan pengasingan campuran. Pada HPLC RP, senyawa-senyawa dipisahkan berdasarkan karakter hidrofobiknya. Pelarut-pelarut harus dihawa gaskan (dihilangkan komponen gasnya) untuk menghalangi pembentukan gelembung-gelembung.Prinsip kerja HPLC adalah dengan bantuan pompa fasa gerak cair yang dialirkan melalui kolom ke detector. Sampel yang digunakan pada percobaan ialah kafein pada kopi, teh, dan kratingdaeng yang mempunyai struktur molekul

Sampel dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.Instrumentasi HPLC yaitu: Fasa gerakFasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelariut. HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak. Fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan. Dalam percobaan ini yang berfungsi sebagai fasa gerak ialah metanol. Fasa gerak Persyaratan fasa gerak dalam HPLC ialah:1. zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis.2. zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu interpretasi kromatogram3. zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom4. zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.5. zat cair tidak kental6. sesuai dengan detectorJenis fasa gerak untuk kromatografi partisi, adsorpsi, dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa gerak berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Akibatnya, waktu retensi sangat dipengaruhi oleh jenis pelarut. Sebaliknya fasa gerak untuk kromatografi eksklusi bersifat non interaktif. Oleh karena itu, waktu retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung pada komposisi fasa gerak. PompaPompa memberikan tekanan tinggi yang tetap tanpa berpulsasi, dan bisa diprogramkan untuk memvariasikan komposisi pelarut selama berlangsungnya pemisahan. Pompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan, yaitu:1. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi (pons/in2)2. Keluaran bebas pulsa3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit4. Bahan tahan korosi Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian SampelKadang kala, faktor ketidaktepatan pengukuran HPLC terletak pada keterulangan pemasukan cuplikan ke dalam peking kolom. Masalahnya, kebanyakan memasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukkan harus sekecil mungkin, beberapa puluh mikroliter. Selain itu, perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak. Berikut beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam sistem HPLC :1. Injeksi SyringeAlat yang paling dulu dan paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek2. Injeksi stop-flowInjeksi stop-floe adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali3. Kran CuplikanJenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah: (a) sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam loop, (b) kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500L. Dengan sistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukkan cuplikan pada tekanan 7000 psi dengan ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan volume 0,5 hingga 5 L. KolomKolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fas diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya.

DetectorDetektor-detektor bergantung pada perubahan indeks refraktif, serapan UV-tampak, atau fluoresensi setelah eksitasi dengan panjang gelombang yang sesuai.Berbagai detector untuk HPLC telah tersedia, walaupun demikian detector harus memenuhi persyaratan berikut: 1. cukup sensitive; 2. stabilitas dan keterulangan tinggi;3. respon linear terhadap solute; 4. waktu respon pendek sehinggatidak bergantung kecepatan alir ;5. realibilitas tinggi dan mudah digunakan; 6. tidak merusak cuplikan. Detector HPLC dikelompokan ke dalam tiga jenis, yaitu: detector umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanaya solute. Sebaliknya, detector sepesifik memberi respon terhadap beberapa sifat solute yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detectoe yang bersifat umum terhadap solute setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan. Detector berdasarkan absorpsi UV merupakan detector HPLC yang paling banyak di pakai. Detector elektrokimia paling banyak dipakai terutama dalam HPLC penukar ion.Cara Kerja HPLC, mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi berbutar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan pertolongan mikrosiring, sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh detector, yang penampakannya ditunjukan oleh perekam (pencatat = recorder). Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa pemasuk solven pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa milliliter per menit. Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampelKelebihan HPLC Dibandingkan dengan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan. Beberapa kelebihan KCKT diantaranya ialah:1. Percobaan dapat dilaksanakan dalam suhu kamar2. cepat dan mudah melaksanakannya3. peka, detektor HPLC dapat divariasi dan unik.4. pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya.5. ideal untuk molekul besar dan ion.6. mudah memperoleh cuplikan.7. daya pisahnya baik.8. dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang di analisis.9. HPLC juga dapat menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan termolabil.

Dari percobaan terlihat bahwa kopi memiliki kadar kadein yang tinggi yaitu 1,027 gram, disusul oleh Kratingdaeeng yaitu 0,402 gram, dan yang terakhir teh sebanyak 0,172 gram (semua dalam larutan 1 L)VII. KesimpulanKadar kafein dalam Kopi: Dengan kurva kalibrasi luas kromatogram : 1,027 gram Dengan kurva kalibrasi tinggi kromatogram: 0,899 gramKadar kafein dalam Teh: Dengan kurva kalibrasi luas kromatogram : 0,172 gram Dengan kurva kalibrasi tinggi kromatogram: 0,165 gramKadar kafein dalam Kratingdaeng: Dengan kurva kalibrasi luas kromatogram : 0,402 gram Dengan kurva kalibrasi tinggi kromatogram: 0,339 gram

VIII. Daftar Pustaka Harvey, David. Modern Analytical Chemistry. International edition. Mc Graw Hill Publisher. Sydney. 2000. pg 578-588. Braithwaite, A. and Smith, F. J. Chromatographic Methods. 5th ed. Kluwer Academic Publisher. London. 1999. pg 23-26, 258-266, 379-383. Drs. Soebagio dkk, 2002, KIMIA ANALITIK II, Malang: JICA FMIPA UNM Sumar Hendrayana, 2006, KIMIA PEMISAHAN, Bandung : Rosdakarya Hostettmann, K dkk, 1995, Cara Kromatografi Preparatif, Bandung: ITB