kromatografi cair kinerja tinggi 2014
DESCRIPTION
teknik pemisahan dengan metode KCKTTRANSCRIPT
-
2014/4/16
1
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
LO Bahan Kajian
Setelah menyelesaikan topik ini mahasiswa mampu menjelaskan dan menerapkan pemisahan dengan kromatografi cair kinerja tinggi beserta instrumentasi utamanya.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Definisi dan Sejarah 1
Instrumentasi 2
Kromatografi Partisi Kinerja Tinggi 3
Kromatografi Adsorpsi Kinerja Tinggi 4
Kromatografi Penukar Ion 5
Kromatografi Filtrasi 4
Perbandingan KCKT dan KG 5
Buku Acuan
Skoog DA, West DM, Holler FJ, Crouch SR. 2004. Fundamental of Analytical Chemistry. Ed. Ke-8. Belmont: Brook/Cole-Thomson Learning
-
2014/4/16
2
Varian HPLC System
9010 Solvent
Delivery System
9050 Variable UV/Vis Detector
HPLC Solvent
Reservoirs
HPLC Column
Rheodyne
Injector
9060 Polychrom
(Diode Array) Detector
Computer
Workstation
Keep an eye on
these 4 screens!
Varian Solvent Delivery System
Varian 9010 Solvent Delivery System
Rheodyne
Injector
%A %B %C Flow Rate Pressure
{H2O} {MeOH} (mL/min) (atmos.)
Ready
Ternary Pump
A
C
B
from solvent
reservoir
Colu
mn
to
detector
to column
through
pulse
dampener
to injector
through pump
load
inject
Definisi dan Sejarah
Kromatografi: teknik analitik Kromatograf: instrumen
Kromatogram: gambar/hasil Kromatografer: orang
-
2014/4/16
3
Definisi dan Sejarah
Fase gerak
Gas cairan Padatan
Fase
diam
Gas
Cairan
Padatan
Gas
chromatography
Liquid
chromatography
Definisi dan Sejarah
Kromatografi cair: dapat menganalisis berbagai senyawa yang dapat larut dalam fase gerak: analat nonvolatil hingga yang mudah terdekomposisi
Tipe mekanisme pemisahan Partisi: kromatografi cair-cair Adsorpsi: kromatografi cair-padat Penukar ion Size exclusion Afinitas kiral
Definisi dan Sejarah Definisi dan Sejarah
Kolom gelas dengan diameter dalam 10-50 mm dengan panjang 50 500cm, ukuran partikel fase diam 150 - 200m laju alir 1/10 ml/min.
Perlu tekanan untuk meningkatkan tekanan laju alir dengan meningkatkan tinggi pelat dan menurunkan efisiensi kolom.
Perkembangan teori LC: peningkatan tinggi pelat dapat diturunkan dengan menurunkan ukuran partikel 1960: ukuran partikel makin kecil memer- lukan pompa untuk menambah tekanan
-
2014/4/16
4
H
P igh
erformance
L iquid
C hromatography
H
P igh
ressure
L iquid
C hromatography
Definisi dan Sejarah
Kelebihan KCKT
Pemisahan pemisahan tinggi, memungkinkan analisis batch beberapa komponen
Reproduksibilitas tinggi
Sensitivitas tinggi
Kondisi analisis umum (KG perlu diuapkan)
Memerlukan jumlah sampel yang sedikit
Mudah preparasi pemisahan dan pemurnian sampel
Instrumentasi Reservoar fase gerak dan sistem penanganan pelarut
Sistem pompa Sistem injeksi sampel
Kolom untuk KCKT detektor
Pompa
injektor
kolom
oven (thermostatic column
chamber)
Detektor
Eluen
(fase gerak)
buangan
Data processor Degasser
-
2014/4/16
5
Reservoar fase gerak dan sistem penanganan pelarut
Biasanya dilengkapi dengan instrumen penghilang gas terlarut dalam fase gerak spt sistem pompa vakum, penyaringan vakum, distilasi, pemanasan, pengadukan, sonikasi atau pemercikan/sparging (gas didorong oleh gas lembam yang solubilitasnya rendah spt He)
Gas mampu membentuk gelembung pada kolom, menyebabkan pelebaran pita, dan mengganggu kinerja detektor
Perlu dihilangkan debu karena mengganggu deteksi, menyumbat kolom, dan merusak sistem pompa (penyaringan milipore dengan vakum)
Reservoar fase gerak dan sistem penanganan pelarut
Cara menghilangkan gas pada fase gerak
Sonikasi
Memberikan tekanan parsial saat agitasi
Diberi gas helium
In-line degasser
Reservoar fase gerak dan sistem penanganan pelarut
Online degasser
Gas-liquid separation membrane method Helium purge method
Helium
cylinder
To draft
To pump
Eluent container
Regulator
Drain valve
To pump
Eluent container
Polymeric film tube Vacuum chamber
Reservoar fase gerak dan sistem penanganan pelarut
Elusi Isokratik & Elusi gradien
Long analysis time!!
Poor
separation!!
CH3OH / H2O = 6 / 4
CH3OH / H2O = 8 / 2
(Column: ODS type)
-
2014/4/16
6
Reservoar fase gerak dan sistem penanganan pelarut
Elusi Isokratik & Elusi gradien
95%
30%
Co
nce
ntr
atio
n o
f m
eth
ano
l in
elu
ent
KCKT
Sistem Pompa
Syarat:
Tekanan yang dihasilkan tinggi, bebas pula
Pengaturan laju alir lebar 0.1-10 mL/min dan tepat
Kontrol laju alir dan keterulangan laju alir baik
Komponen instrumen tahan korosi
Mudah untuk pergantian pelarut
Sistem Pompa
Pompa piston timbal balik
Pompa pergeseran
Pompa pneumatik
Seluruh pompa dikontrol oleh komputer dalam pengoperasiannya
-
2014/4/16
7
Sistem Pompa
Pompa timbal balik Eluen dipompa dengan gerakan timbal balik (maju mundur)
oleh piston Tekanan yang dihasilkan tinggi, dapat digunakan untuk elusi
gradien, laju alir yang dihasilkan konstan dan bebas dari viskositas eluen dan tekanan balik kolom
Menghasilkan tekanan yang memiliki pulsa
Sistem Pompa
Pompa pergeseran Menyerupai syringe
besar yang terdiri atas bejana dan alat penyedot,
menghasilkan aliran yang bebas dari viskositas eluen
Bebas pulsa Terbatas pada
kapasitas fase gerak
Sistem Pompa
Pompa pneumatik Eluen dalam kontainer
didorong oleh tekanan gas/udara
Bebas dari pengaruh viskositas eluen dan tekanan balik kolom
Tidak dapat digunakan untuk elusi gradien dan tekanan yang dihasilkan kurang dari 2000 psi
KCKT
-
2014/4/16
8
Sistem Injeksi
Tempat memasukkan sampel ke kolom
Sistem injeksi dengan menggunakan simpal pencuplikan (sampling loop) lebih banyak digunakan
KCKT
Kolom untuk KCKT
Bentuk: koil, kolom biasa, kolom gabungan (coupling column)
Jenis: kolom kemas (packed column), kapiler, preparatif
Kolom penjaga: kolom untuk menyingkirkan kontaminan dalam eluen dan
matriks sampel yang teikat tidak reversible pada kolom, memperpanjang umur kolom pemisahan
Termostat kolom: menjaga suhu operasi kolom
Kolom untuk KCKT
Terbuat dari baja, stainless stell atau teflon
Panjang: 10-30 cm Diameter dalam 4-40mm atau 1-
4.6mm Partikel fase diam 5-10m
-
2014/4/16
9
Pemanas kolom
Untuk mengoptimumkan pemisahan
Perubahan suhu waktu retensi berubah, selektivitas kolom berubah
Menghitung efisiensi kolom
Lebar puncak pada setengah tinggi digunakan untuk menghitung efisiensi kolom
N = 5.54 (T/W)2; N: pelat teoritis, W: lebar pada setengah tinggi, T: waktu retensi, 5.54: konstanta berdasarkan pada distribusi normal
tr
Faktor lain
Ingat kembali: faktor retensi, resolusi, selektivitas
Tailing factor: Tf: lewar puncak/ 2 (lebar setengah puncak) Tf>1.5 terjadi interaksi yang tidak diinginkan
Front width
Peak width
5% height
Faktor lain
Faktor asimetri (As)
10% height
Back half width
AS = ----------------------
Front half width
-
2014/4/16
10
KCKT
Detektor
Dasar sifat yang digunakan untuk deteksi Sifat limbak (bulk property):
Membandingkan perubahan keseluruhan sifat fisis fase gerak dengan dan tanpa zat yang dielusi
Relatif kurang sensitif Memerlukan kontrol suhu yang baik Contoh
Detektor indeks refraksi (refractive index detector, RID)
Sifat solut (solute property) Berdasar sifat fisik yang terlarut yang tidak ditunjukkan oleh fase
gerak 1000 kali lebih sensitif dari pada detektor sifat limbak Mendeteksi dalam jumlah ng Contoh
Detektor UV-Vis
Detektor
Detektor
Detektor fluoresens Radiasi datang fluoresens lurus/90o
Untuk analisis senyawa polinuklir, steroid, pigmen tumbuhan, vitamin, alkaloid, dsb
Detektor elektrokimia Karakteristik voltametri molekul dalam fase gerak polar pada
permukaan elektroda Untuk analisis senyawa amino aromatik, asam askorbat, asam
urat, sistein, dsb
Detektor fotometri Absorpsi UV-Vis: UV 254/280nm, sensitivitas tinggi (ng), tidak
sensitif terhadap perubahan suhu, laju alir, komposisi fase gerak Untuk analisis senyawa kimia/biologis yang aromatik, senyawa
mengandung karbonil, tiokarbonil, nitroso, dan azo
-
2014/4/16
11
Detektor
Detektor UV
Paling umum digunakan
Sistem sederhana
Baik untuk elusi gradien
Tingkat derat 1% dari skala penuh
Detektor
Detektor
Detektor indeks refraktif
Merespon hampir semua pelarut
Memerlukan peredaman pulsa pada sistem pompa: pulse dampers untuk sistem elusi gradien
Limit deteksi 1000x lebih rendah dari UV
Sensitif terhadap perubahan suhu
Tidak berguna untuk analisis renik
Kisaran linear rendah
Detektor
Diode array detektor
Merekam spektrum tiap solut yang melewatinya
-
2014/4/16
12
Kromatografi Partisi Kinerja Tinggi
Pengemasan fase pengikat Pengemasan fase normal dan fase terbalik
Pemilihan fase diam dan fase gerak Aplikasi
Kromatografi Partisi
Berdasarkan permukaan silika yang telah dimodifikasi
Fase terikat C18 lebih melarutkan dibandingkan mengadsorpsi spesies analat, sehingga partisi terjadi antara 2 fase cairan
Fase diam: cairan (disangga dengan pengisi kolom)
Fase gerak: cairan Sistem: Fase normal dan fase
terbalik
Kromatografi Partisi
Terdiri atas
Kromatografi cair-cair: cairan pada fase diam terikat secara adsorpsi fisik
Kromatografi cair-fase terikat: cairan pada fase diam terikat dengan ikatan kimia
Pengemasan Fase Pengikat
Sebagian besar pengikatan fase terikat dilakukan dengan reaksi organoklorosilan dengan gugus OH pada permukaan silika oleh hidrolisis dalam panas
R: rantai lurus oktil atau oktildesil Gugus fungsi lain yang telah diikat pada
permukaan silika termasuk amina alifatik, ester, nitril dan hidrokarbon aromatik perbedaan kepolaran fase diam
-
2014/4/16
13
Chromatography Stationary Phases
relatively polar surface
O O O
| | |
OSiOSiOSiOH | | |
O O O
| | |
OSiOSiOSiOH | | |
O O O
bulk (SiO2)x surface
relatively nonpolar surface
Silica Gel
O O O
| | |
OSiOSiOSiOR | | |
O O O
| | |
OSiOSiOSiOR | | |
O O O
bulk (SiO2)x surface
Derivatized Silica Gel
Where R = C18H37 hydrocarbon chain
(octadecylsilyl deriv.
silica or C18)
normal phase reversed phase
Proteksi dari hidrolisis
Fase terikat lebih stabil dibandingkan ikatan fisik pada fase diam.
Pengikatan secara fisik secara bertahap akan larut oleh fase gerak
Elusi gradien tdk cocok untuk kromatografi cair-cair karena akan kehilangan kelarutannya oleh fase gerak
Fase diam terikat terbatas pada kapasitas sampel
Pengemasan Fase Normal dan Fase Terbalik
Fase normal: fase diam: polar; fase gerak: nonpolar
Sblmnya KCKT menggunakan silika yang belum dimodifikasi (sangat polar) sehingga menuntut fase gerak yang nonpolar untuk pemisahan
Fase terbaik: fase diam: nonpolar; fase gerak: polar
KCKT saat ini menggunakan silika C18 yang dimodifikasi permukaannya sehingga dapat menggunakan fase gerak yang polar
-
2014/4/16
14
Fase normal dan fase terbalik
Fase diam - NON POLAR
Fase gerak - POLAR
-
+
-
- + +
Fase diam - POLAR
Fase gerak -NON POLAR
+ - + - + - + - + - + - + - +
- + - + - + - + - + - + - + - +
Fase normal dan fase terbalik
Kromatografi pasangan ion bagian dari fase terbalik (spesies yang mudah terionisasi
dipisahkan pada kolom fase terbalik) Garam organik seperti amonium kuarterner atau alkil sulfonat
ditambahkan pada fase diam sebagai reagen pasangan ion. Postulat 1: ion counter membentuk pasangan ion tak
bermuatan dengan ion zat terlarut pada muatan berlawanan di fase gerak, pasangan ion terpartisi ke fase diam nonpolar memberikan retensi yang berbeda
Postulat 2: ion counter tertahan dengan kuat pada fase diam yang netral dan menyebabkan muatan pada fase diam. Pemisahan karena muatan berlawanan yang terbentuk oleh pembentukan kompleks pasangan ion yang reversible, paling kuat tertahan membentuk kompleks yang kuat dengan fase diam
Kromatografi Partisi
1. niasinamida, 2. piridoksine, 3. riboflavin, 4. thiamin
Pemilihan Fase Diam dan Fase Gerak
Keseimbangan gaya intermolekular antara sampel, fase gerak, dan fase diam sangat diperlukan
Polaritas gugus fungsi senyawa organik secara umum: hidrokarbon alifatik < olefin < hidrokarbon aromatik < halida < sulfida < eter < senyawa nitro < ester aldehida keton < alkohol amina < sulfone < sulfoksida < amida < asam karboksilat < air
Umum: mencocokkan polaritas analat ke fase diam, fase gerak ditentukan berdasarkan perbedaan polaritas yang digunakan
Jika sebaliknya: waktu retensi terlalu pendek secara praktek
-
2014/4/16
15
Pemilihan Fase Diam dan Fase Gerak
Aplikasi kromatografi fase terikat
Aplikasi
Bidang Analat yang dipisahkan
Farmaseutika Antibiotik, sedatif, steroid, analgesik
Biokimia Asam amino, protein, karbohidrat, lipid
Produk makanan Pemanis buatan, antioksidan, aflatoksin, bahan tambahan makanan
Industri kimia Aromatik terkondensasi, surfaktan, pewarna
Polutan Pestisida, herbisida, fenol, PCB
Kimia forensik Obat, racun, alkohol dalam darah, narkotik
Kimia medisinal Asam empedu, obat metabolisme, ekstrak urin, estrogen
Aplikasi
Aplikasi
-
2014/4/16
16
Aplikasi
Kromatografi adsorpsi kinerja tinggi
Fase gerak dan fase diam
Aplikasi
KCKT Adsorpsi
Berdasarkan permukaan silika yang belum dimodifikasi yang bersifat sangat polar
Zat terlarut akan teradsorbsi di permukaan ini Analat teradsorpsi pada fase diam padat,
bersaing dengan molekul fase gerak Fase diam: silika dan alumina (tidak selalu) Fase gerak: komposisi beragam Kemampuan yang khas: memisahkan campuran
isomer misalnya turunan benzena tersubstitusi meta dan para
Fase Gerak dan Fase Diam
Silika lebih sering digunakan sebagai fase diam karena kapasitas sampel yang tinggi dan kisaran penggunaan yang lebar
Waktu retensi akan lebih besar jika polaritas sampel meningkat
Yang mempengaruhi koefisien distribusi analat adalah komposisi fase gerak
-
2014/4/16
17
Aplikasi
KCKT cair-padatan banyak digunakan untuk pemisahan senyawa nonpolar, senyawa organik tak larut air dengan Mr kurang dari 5000.
Mampu memisahkan isomer seperti substittusi meta dan para pada turunan benzena
Aplikasi
Aplikasi
Kromatografi penukar ion
Kromatografi ion dengan suppersor
Kromatografi ion kolom tunggal
-
2014/4/16
18
KCKT Penukar Ion
Fase diam: penukar ion (polimer gugus fungsi counter ion)
Sampel: ion/dapat diionkan/ligan
Fase gerak: Variasi pH (bufer)
Variasi kekuatan ion C garam
Pengompleks (sitrat, EDTA) untuk kation logam
Mn+ + Xy-1 MX(n-m)
(kation/anion/netral) pH; Kf
KCKT Penukar Ion
Penukar Kuat SO3
-H+ penukar kation kuat CH2N
+(CH3)Cl- penukar anion kuat
Mengion sempurna kekuatan pertukaran pH kapasitas pertukaran pH
Penukar lemah COO-H+ penukar kation lemah CH2N(CH3)2 penukar anion lemah Pengionan tidak sempurna kapasitas pertukaran pH COO-H+ pH tinggi CH2N(CH3)2 pH rendah
Kapasitas pertukaran Jumlah gugus fungsi tersedia untuk pertukaran per satuan
massa atau volume penukar ion
Cation exchangers
Anion exchangers
SO3 COOH
N(R3) N(RR) NHR NH2
Weakly basic
Weakly acidic
Kromatografi Penukar Ion Sejak 1949
N(R3)
E- S-
eluent sample
Strongly acidic
Strongly basic
e.g., anions are retained by attraction force
Kromatografi Ion dengan Suppresor
E- S-
E- E-
E-
E-
E-
E-
E-
E- E-
E-
S-
E- E-
E- E-
E- E-
E-
E-
E-
E-
E-
Bagaimana menentukan sampel ion?
Konduktivitas merupakan sinyal umum untuk ion, tetapi eluen pada kromatografi ion juga merupakan ion.
Penghilangan konduktivitas eluen kunci untuk menentukan konduktivitas sampel
-
2014/4/16
19
Cation Anion
H+ 350 OH- 198
Li+ 39 F- 55
Na+ 50 Cl- 76
NH4+ 74 NO3
- 71
K+ 74 SO42- 80
Cs+ 77 I- 77
Ag+ 62 CH3COO- 41
Cu2+ 54
Konduktivitas ekuivalen () 25C
S cm2 mol-1 S cm2 mol-1
Pompa
Injektor
Kolom penukar ion
Suppressor
Detektor konduktivitas
Buangan
Eluen
Kromatografi Ion 1975 H. Small
Dionex
H+ Na2CO3 (Eluen)
NaNO3 (Analat)
H2CO3 (kecil)
HNO3 (besar)
Suppressor Packed column, ion-exchange hollow tube,
ion-exchange micromembrane, electrolytic
Kromatografi Anion
OH- HNO3 (Eluen)
NaNO3 (Analat)
H2O (kecil)
NaOH (besar)
Cation chromatography
TOSOH
Conditions Column: TSKgel SuperIC-AZ (4.6mmI.D.15cm Eluent: 1.9 mM NaHCO3 + 3.2 mM Na2CO3 Flow rate: 0.8mL/min Temp.40 Inj. volume30L Detection: CM
F-
Cl-
NO2-
NO3-
Br- PO4
3-
SO42-
-
2014/4/16
20
Kromatografi Ion dengan Kolom Tunggal
Instrumentasi kromatografi ion komersial tanpa suppressor telah tersedia.
Penukar ion dengan kapasitas rendah digunakan sebagai eluen dengan konsentrasi elektrolit rendah konduktivitas rendah
Keuntungan tidak memerlukan suppressor khusus
Sensitivitas rendah untuk menentukan anion
Aplikasi
Aplikasi
Aplikasi
-
2014/4/16
21
Kromatografi filtrasi
Kolom
aplikasi
Kolom
Terdiri atas silika yang kecil atau polimer yang tersusun secara seragam dan memungkinkan analat dan pelarut dapat berdifusi
Dalam pori fase diam, molekul secara efektif terjebak dan bergerak oleh aliran fase gerak
Molekul yang lebih besar dari ukuran pori2 tidak terjerap dan tidak memiliki retensi
Pemilihan metode pemisahan
-
2014/4/16
22
Pelebaran Pita pada KC
Efek kinetik pada transfer massa dari dan ke fase gerak ke dan dari fase diam
Transfer massa pada fase gerak:
Makin kecil diameter packing partikel, meningkatkan rasio luas permukaan/volume sehingga meningkatkan efek transfer massa pada fase gerak
Pelebaran Pita pada KC
Persamaan van Deemter
H= A + B/u + Cu
Dari 3 komponen tsb manakah yang paling berhubungan dengan H?
B/u: difusi biasanya pada cairan 100x lebih kecil daripada fase gas
Cu: dapat dieliminasi oleh proses dengan mengasumsikan bahwa efek transport massa adalah paling besar pada LC untuk efek H
Aplikasi Aplikasi
-
2014/4/16
23
Aplikasi Perbandingan KCKT dan KG
Sifat kedua metode Efisien, selektivitas tinggi, banyak aplikasinya Memerlukan jumlah sampel yang sedikit Mungkin nondestruktif Mudah diadaptasikan menjadi analisis kuantitatif
Keuntungan KCKT Dapat digunakan untuk senyawa non-volatil dan tidak tahan
terhadap panas Secara umum cocok untuk ion anorganik
Keuntungan KG Mudah dan peralatannya tidak terlalu mahal Cepat Resolus tidak unparaleled (dengan kolom kapiler) Mudah digabungkan dengan spektrometri massa
Latihan
Jelaskan senyawa seperti apa yang baik dipisahkan dengan metode kromatografi berikut Gas-cair Partisi cairan Pertukaran ion Adsorpsi cairan Permeasi gel Filtrasi gel Gas-padat
Apa yang dimaksud dengan Elusi isokratik Elusi gradien Pengemasan fase terbalik Pengemasan fase normal Kromatografi pasangan ion
Kromatografi ion Eluen kolom suppressor Filtrasi gel Permeasi gel
Tentukan urutan keluarnya senyawa berikut pada KCKT fase terbalik Benzena, dietil eter, n-heksana Aseton, diklorometana,
asetamida
Tentukan urutan keluarnya senyawa berikut pada KCKT fase normal Etil asetat, asam asetat,
dimetilamina Propilena, heksana, benzena,
diklorobenzena
Latihan
Jelaskan perbedaan mendasar antara kromatografi adsorpsi dan
partisi Kromatografi penukar ion
dan size-exclusion Filtrasi gel dan permeasi gel Kolom tunggal dan kolom
suppressor dalam kromatografi ion
Jelas senyawa apa yang dapat dipisahkan oleh KCKT tapi tidak dapat dipisahkan oleh KG
Jelaskan berbagai tipe
pompa pada KCKT, serta jelaskan kelemahan dan kelebihannya
Jelaskan detektor KG yang cocok untuk KCKT. Mengapa beberapa detektor tidak cocok digunakan pada KCKT
Detektor yang ideal untuk KG telah Anda ketahui, dari 8 ciri detektor KG yang ideal, ciri apakah yang diperlukan juga untuk KCKT? Apakah syarat tambahan detektor KCKT yang ideal
-
2014/4/16
24
Latihan
Meskipun suhu tidak terlalu penting dalam pemisahan dalam KCKT dibandingkan dalam KG, jelaskan bagaimana dan mengapa suhu dapat mempengaruhi pemisahan berikut: Kromatografi fase terbalik
pada pemisahan campuran steroid
Pemisahan isomer dalam kromatografi adsorpsi
Dua senyawa dalam pemisahan KCKT memiliki perbedaan waktu retensi sebesar 15 detik. Puncak
pertama keluar pada 9.0 menit, dan lebar puncak keduanya identik. Waktu mati sebesar 65 detik. Tentukan jumlah pelat teoritis yang diperlukan untuk mendapatkan nilai resolusi sebesar 0.5, 075, 0.9, 1.0, 1.1, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, dan 2.5. Bagaimana hasilnya perubah jika puncak kedua melebar dua kali dibandingkan puncak pertama
Hal 994 soal no 32-16 Hal 995 soal no 32-17 dan 18