pengembangan dan validasi metode analisis penetapan kadar ... · secara kromatografi cair kinerja...

PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR VITAMIN A DALAM MINYAK GORENG SAWIT SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

SLAMET SUKARNO

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2011

PERNYATAAN MENGENAI TUGAS AKHIR DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tugas akhir ”Pengembangan dan Validasi Metode Analisis Penetapan Kadar Vitamin A dalam Minyak Goreng Sawit Secara Kromatografi Cair kinerja Tinggi” adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tugas akhir ini.

Bogor, September 2011

Slamet Sukarno F 252070025

ABSTRACT

SLAMET SUKARNO. The Development and Validation of Method Analysis for Vitamin A Determination in Palm Oil by High Performance Liquid Chromatography. Under Direction of FERI KUSNANDAR and HANIFAH NURYANI LIOE.

The fortification of vitamin A in cooking palm oil is being mandatorily regulated in 2013. To control the implementation this standard, the laboratory capacity to analyze vitamin A is required. The vitamin A analysis must be valid, selective, rapid, easy and practical. The objective of this study was to validate a modified standardized method of vitamin A analysis by a High Performance Liquid Chromatography (HPLC).

All validation parameters (liniearity, accuracy, precision, selectivity, robustness, LOD, and LOQ) met the requirement. Vitamin A in palm oil matrix could be analyzed by HPLC method by using a mobile phase of acetonitrile:water (80:20) with flux rate of 1,75 mL/min, and ultraviolet detector at 325 nm. This condition used a C-18 column.

Keywords: method analysis, vitamin A, HPLC, optimal condition, validation

RINGKASAN

SLAMET SUKARNO. Pengembangan dan Validasi Metode Analisis Penetapan Kadar Vitamin A dalam Minyak Goreng Sawit secara Kromatografi Cair kinerja Tinggi. Dibimbing oleh FERI KUSNANDAR dan HANIFAH NURYANI LIOE.

Penyakit akibat kurang vitamin A (KVA) merupakan masalah global yang menimpa sebagian besar penduduk di dunia termasuk juga di Indonesia. KVA disebabkan oleh kurangnya vitamin A di dalam jaringan yang dapat menimbulkan gangguan secara subklinis atau klinis. Salah satu kebijakan pemerintah yang ditempuh untuk menanggulangi masalah KVA adalah fortifikasi vitamin A ke dalam minyak goreng sawit. Tahun 2013 pemerintah akan mengimplementasikan Standar Nasional Indonesia (SNI) wajib minyak goreng sawit yang difortifikasi dengan vitamin A. Menurut Rancangan Standar Nasional Indonesia (RSNI) tentang persyaratan mutu minyak goreng sawit, jumlah vitamin A yang harus ditambahkan ke dalam produk tersebut minimal 45 IU/g. Seiring dengan peraturan dan kondisi diatas maka perlu dilakukan pengawasan atau monitoring terhadap kadar vitamin A dalam minyak goreng sawit, baik pada tingkat industri, distributor dan konsumen. Untuk itu dibutuhkan suatu metode analisis yang valid, selektif, cepat, mudah dan praktis untuk identifikasi dan penetapan kadar vitamin A, khususnya vitamin A dalam minyak goreng sawit.

Metode analisis vitamin A dalam minyak goreng sawit masih sulit didapat, namun metode analisis vitamin A dalam produk pangan dengan menggunakan peralatan moderen, diantaranya dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) sudah banyak yang dikembangkan oleh peneliti terdahulu. Namun kelemahan dari metode yang ada adalah kerumitan dalam penyiapan sampel (saponifikasi, ekstraksi dan pemekatan atau penguapan pelarut organik yang digunakan). Oleh karena itu, perlu dilakukan pengembangan metode analisis penetapan kadar vitamin A minyak goreng sawit yang mudah dan praktis, namun memberikan hasil yang valid. Metode analisis yang dikembangkan oleh peneliti ini berbasis kromatografi, tanpa proses saponifikasi, tanpa ekstrasi dan tanpa penguapan pelarut organik.

Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan kondisi optimum untuk analisis vitamin A dalam minyak goreng sawit, melakukan validasi metode analisis yang sudah dipilih pada optimasi metode dan melakukan uji coba penetapan kadar vitamin A dalam minyak goreng sawit yang beredar di pasaran menggunakan metode yang telah dikembangkan.

Teknik penyiapan sampel dilakukan dengan cara melarutkan sampel meng-gunakan campuran n-pentana dan 2-propanol, ditambahkan larutan butil hidroksi toluena sebagai antioksidan dan tetra-n-butil amonium hidroksida untuk melaku-kan reaksi subsitusi retinil palmitat menjadi retinol, yang selanjutnya dianalisis dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi.

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dilakukan dengan menggunakan teknik isokratik menggunakan kolom C18 (Waters Xbridge®, dengan panjang 250 mm, diameter 4,6 mm ukuran partikel 5,0 µm). Parameter kondisi KCKT yang dioptimasi adalah: komposisi fase gerak metanol 100 % dengan laju alir: 0,6; 0,8;

1,0 mL/menit; metanol dan air (97,5:2,5; 95:5; 90:10; dan 85:15) dengan laju alir 1,5 mL/menit; asetonitril dan metanol (75:25; 50:50; dan 25:75) dengan laju alir 1,0 mL/menit, asetonitril dan air (100:0; 95:5; 90:10; 85:15; 80:20 dan 75:25) dengan laju alir: 1,5 dan 1,75 mL/menit dan detektor yang digunakan detektor ultraviolet dan detektor fluoresens. Kromatogram yang dihasilkan dievaluasi berdasarkan waktu retensi (Rt), resolusi (Rs), jumlah lempeng teoritis (N) dan faktor ikutan (Tf). Hasil pemilihan kondisi optimum yang memberikan skor tertinggi adalah: komposisi fase gerak asetonitril dan air (80:20), laju alir 1,75 mL/menit menggunakan detektor ultraviolet pada panjang gelombang 325 nm.

Metode ini valid yang ditunjukkan dengan kurva kalibrasi dan linieritas pada rentang konsentrasi 0,4443 IU/mL sampai dengan 13,5233 IU/mL dengan koefesien regresi (r) 0,99997 dan standar deviasi relatif regresi linier (Vxo) 2,54 %; presisi dengan 3 tingkat konsentrasi dengan nilai % RSD antara 1,87 sampai 1,97; akurasi dengan 3 tingkat konsentrasi yang memberikan nilai persen pero-lehan kembali antara 96,84 - 102,39 %; selektivitas dan robustness bila diban-dingkan dengan hasil uji presisi yang memberikan nilai yang tidak berbeda bermakna, batas deteksi (LOD) 1,66 IU/g dan batas kuantisasi (LOQ) 5,89 IU/g.

Hasil analisis terhadap 4 merek sampel minyak goreng sawit yang beredar di pasaran menggunakan metode analisis hasil pengembangan diperoleh kadar vitamin A berturut-turut adalah: 16,75; 28,39; 29,07 dan 66,35 IU/g. Matriks sampel yang terkandung dalam berbagai merek minyak goreng sawit yang beredar di pasaran tidak mengganggu dalam analisis penetapan kadar vitamin A. Kata kunci: metode analisis, vitamin A, KCKT, kondisi optimal, validasi.

©Hak Cipta milik IPB, tahun 2011 Hak Cipta dilindungi Undang-undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR VITAMIN A DALAM MINYAK GORENG SAWIT SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

SLAMET SUKARNO

Tugas Akhir sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Profesi

Pada Program Studi Teknologi Pangan

SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tugas Akhir: Dr. Ir. Nuri Andarwulan, MSi.

Judul Tugas Akhir : Pengembangan dan Validasi Metode Analisis Penetapan

Kadar Vitamin A dalam Minyak Goreng Sawit secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Nama Mahasiswa : Slamet Sukarno Nomor Pokok : F252070025 Program Studi : Magister Profesi Teknologi Pangan

Menyetujui, Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Ferif Kusnandar, M.Sc Dr. Ir. Hanifah Nuryani Lioe, MSi (Ketua) (Anggota)

Mengetahui

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pasca Sarjana Magister Profesi Teknologi Pangan Dr. Ir. Lilis Nuraida, M.Sc Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr Tanggal ujian: 13 September 2011 Tanggal lulus: ..........................

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tugas akhir ini disusun sebagai syarat untuk memperoleh gelar Magister Profesi pada Program Magister Profesional Teknologi Pangan. Tema penelitian ini diangkat dari masalah yang dijumpai oleh peneliti dalam pekerjaan sehari-hari. Tugas akhir ini diharapkan dapat memberikan manfaat bagi pembaca, dapat memberikan kontribusi bagi dunia pendidikan di Indonesia mengenai validasi metode analisis untuk pengujian kimia pangan dan bagi pemerintah dalam rangka pengawasan program fortifikasi vitamin A dalam minyak goreng sawit.

Terima kasih yang mendalam penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Feri Kusnandar, MSc. dan Dr. Ir. Hanifah Nuryani Lioe, MSi. selaku komisi pembimbing yang telah membimbing penulis dengan sabar dalam menyusun tugas akhir ini, mulai dari awal hingga akhir. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Ir. Nuri Andarwulan, MSi. selaku penguji luar komisi yang telah banyak memberikan masukan dalam penyusunan tesis ini. Terima kasih juga disampaikan kepada Dr. Lilis Nuraida, MSc selaku Koordinator Program Studi Magister Profesi Teknologi Pangan yang telah membantu, memberikan dorongan dan kesempatan yang begitu banyak kepada penulis.

Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada seluruh dosen pengajar di Program Studi Teknologi Pangan yang telah mencurahkan pengetahuan kepada penulis selama menjalani kuliah di sekolah pascasarjana Magister Profesi Teknologi Pangan. Tidak lupa terima kasih juga kepada ibu Tika dan ibu Mar yang telah banyak membantu dalam masalah administrasi.

Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Drs. Siam Subagyo, Apt., MSi selaku Kepala Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional, yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk melanjutkan pendidikan pascasarjana di kampus tercinta, IPB.

Tak lupa kepada Dra. Niza Nemara, Apt., MSi selaku Kepala Bidang Pangan, penulis ucapkan terimaksih yang sebesar-besarnya atas dukungannya selama ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada sejawat di Bidang Pangan Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional terutama kepada ibu Herni, ibu Yuli dan pak Yanto. Terima kasih juga kepada teman-teman yang telah memberikan motivasi kepada penulis. Juga kepada teman-teman MPTP batch 4, terima kasih semua. Penulis juga mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada istri, anak, orang tua dan keluarga tercinta atas dukungan dan doanya.

Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini belum sempurna, sehingga penulis lain dapat melanjutkan untuk penyempurnaannya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, September 2011

Slamet Sukarno

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 3 Oktober 1965 sebagai anak

kedua dari ayah Musnindar (almarhum) dan Ibu Hartini. Tahun 1985 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Jakarta dan pada tahun yang sama penulis diterima di Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Indonesia Depok dan mendapatkan gelar sarjana Farmasi pada tahun 1991. Penulis melanjutkan ke program profesi apoteker pada perguruan tinggi yang sama dan menamatkannya pada tahun 1993.

Mulai tahun 1993 penulis bekerja sebagai pegawai negeri sipil di Instalasi Farmasi Rumah Sakit Umum Daerah Sintang Kalimantan Barat sampai dengan tahun 1996. Selanjutnya pada tahun 1996 penulis mutasi kerja ke Balai Pengawas Obat dan Makanan di Pontianak hingga tahun 2003. Sejak tahun 2003 hingga sekarang penulis mutasi kerja ke Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional, Badan POM RI di Jakarta dan ditempatkan pada Laboratorium Pangan. Berbagai pelatihan, seminar dan tugas-tugas kantor tentang laboratorium kimia pangan dan keamanan pangan telah diikuti oleh penulis selama bekerja di Badan POM RI.

xi

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR ISI ..................................................................................................... xi DAFTAR TABEL ............................................................................................. xii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiv DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xv I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ...................................................................................... 1 1.2 Perumusan Masalah ............................................................................... 2 1.3 Tujuan .................................................................................................... 3 1.4 Manfaat .................................................................................................. 4 1.5 Ruang Lingkup Penelitian ..................................................................... 4 II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Vitamin A …………….......................................................................... 5 2.2 Minyak Goreng Sawit ……................................................................... 8 2.3 Fortifikasi Pangan .................................................................................. 11 2.4 Metode Analisis Penetapan Kadar Vitamin A ...................................... 13 2.5 Instrumentasi KCKT ............................................................................. 18 2.6 Validasi Metode Analisis ...................................................................... 22 III BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat ............................................................................... 27 3.2 Alat dan Bahan ...................................................................................... 27 3.3 Metode Penelitian .................................................................................. 28 IV HASIL DAN PEMBAHASAN ……………………………………………... 41 V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan ……………........................................................................ 69 5.2 Saran …….............................................................................................. 69 DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………………………. 71 LAMPIRAN : ………………………………………………………………………. 75

xii

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 1 Rumus empiris dan bobot molekul dari vitamin A alkohol (retinol)

dan ester vitamin A (ester retinil) ...........................................................

5 Tabel 2 Sifat-sifat kimia fisika retinol dan retinil palmitat ................................. 6 Tabel 3 Angka kecukupan gizi (AKG) vitamin A …………………………….. 8 Tabel 4 RSNI 3 Persyaratan mutu minyak goreng sawit ……………………… 11 Tabel 5 Keberterimaan akurasi berdasarkan persen rekoveri ............................. 25 Tabel 6 Kondisi parameter KCKT untuk optimasi metode …………………… 31 Tabel 7 Penentuan skor untuk penilaian kromatogram ....................................... 32 Tabel 8 Data hasil uji penetapan aktivitas baku vitamin A ................................. 41 Tabel 9 Data pengamatan kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks

minyak goreng sawit) menggunakan komposisi fase gerak metanol 100 % kecepatan laju alir 1,0 mL/menit, 0,8 mL/menit dan 0,6 mL menit dan detektor UV…………………………………………………

47

Tabel 10 Data pengamatan kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan komposisi fase gerak metanol 100 % kecepatan laju alir 1,0 mL/menit, 0,8 mL/menit dan 0,6 mL/menit dan detektor fluoresens ………………………………….....

47

Tabel 11 Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak methanol:air dengan perbandingan: 85:15; 90:10; 95:5 dan 97,5:2,5 pada kecepatan laju alir 1,5 mL/menit dan detektor UV ……………………………….

47

Tabel 12 Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak methanol:air dengan perbandingan: 85:15; 90:10; 95:5 dan 97,5:2,5 pada kecepatan laju alir 1,5 mL/menit dan detektor fluoresens ………………………..

48

Tabel 13 Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril :metanol dengan perbandingan: 75:25; 50:50 dan 25:75 pada kecepatan laju alir 1,0 mL/menit dan detektor UV ……………………

48

Tabel 14 Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril: metanol dengan perbandingan 75:25; 50:50 dan 25:75 pada kecepatan laju alir 1,0 mL/menit dan detektor fluoresens ………………………..

49

Tabel 15 Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan air dengan perbandingan: 100:0; 95:5; 90:10; 85:15; 80:20 dan 75:25 pada kecepatan laju alir 1,5 mL/menit dan detektor dengan detektor UV ……………………………………………………………

49

Tabel 16 Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan air dengan perbandingan: 100:0; 95:5; 90:10; 85:15; 80:20 dan 75:25 pada kecepatan laju alir 1,5 mL/menit dan detektor dengan

50

xiii

detektor asetonitril dan air dengan detektor fluoresens ……………….. Tabel 17 Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak

goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan air dengan perbandingan: 100:0; 95:5; 90:10; 85:15; 80:20 dan 75:25 pada kecepatan laju alir 1,75 mL/menit dan detektor dengan detektor UV ……………………………………………………………

50

Tabel 18 Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan air dengan perbandingan: 100:0; 95:5; 90:10; 85:15; 80:20 dan 75:25 pada kecepatan laju alir 1,75 mL/menit dan detektor dengan detektor fluoresens …………………………………………………….

51

Tabel 19 Data hasil uji kesesuaian sistem (UKS) baku vitamin A ....................... 52 Tabel 20 Data uji presisi penetapan kadar vitamin A dalam matriks minyak

goreng sawit ........................................................................................... 57

Tabel 21 Data uji akurasi penetapan kadar vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit …………………………………………………………...

58

Tabel 22 Data uji selektivitas (spesifisitas) vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit …………………………………………………………...

61

Tabel 23 Data hasil uji robustness dengan perubahan penambahan jumlah pereaksi menjadi: n-pentana 3 mL, larutan antioksidan butil hidroksi toluena 3 mL dan larutan tetra-n-butil amonium hidroksida 10,5 mL ...

62

Tabel 24 Data hasil uji robustness dengan perubahan pengurangan jumlah pereaksi n-pentana 2 mL, larutan antioksi dan butil hidroksi toluena 2 mL dan larutan tetra-n-butil amonium hidroksida 9,5 mL …………….

62

Tabel 25 Data hasil uji robustness dengan perubahan komposisi fase gerak asetonitril:air (81:19) dan kecepatan laju alir 1,74 mL/menit …….…...

63

Tabel 26 Data hasil uji robustness dengan perubahan komposisi fase gerak asetonitril:air (79:21) dan kecepatan laju alir 1,76 mL/menit ….……...

63

Tabel 27 Data uji robustness vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dengan perubahan metode penggunakan kolom C 18 yang mereknya berbeda (kolom merek Shimadzu Shim-pack, Jepang: panjang 250 mm, diameter dalam 1,46 mm dan ukuran partikel 5 µm) …………….

64

Tabel 28 Data hasil analisis penetapan kadar vitamin A dalam minyak goreng sawit yang beredar di pasaran …………………………………………

67

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1 Struktur molekul vitamin A alkohol (retinol), ester vitamin A (ester

retinil) ………………………………………………………………..

5 Gambar 2 Diagram blok sistem KCKT ................................................................ 19 Gambar 3 Reaksi antara vitamin A palmitat dengan tetra-n-butil ammonium

hidroksida ............................................................................................ 42

Gambar 4 Kromatogram A (blanko minyak goreng sawit yang tidak mengandung vitamin A) dan kromatogram B (baku vitamin A palmitat dalam matriks minyak goreng sawit); yang dianalisis menggunakan KCKT kolom C18 pada kondisi optimum dengan komposisi fase gerak yang terdiri dari campuran asetonitril:air (80:20), laju alir 1,7 mL/menit dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm…………………………………………………...

46

Gambar 5 Kurva kalibrasi baku vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit 53 Gambar 6 Hubungan antara konsentrasi vitamin A dengan faktor respon

detektor ................................................................................................

Gambar 7 Hubungan antara konsentrasi vitamin A terhadap residual …………. 54 Gambar 8 Kromatogram A (campuran senyawa kimia yang sedang dilakukan

uji selektivitasnya: butil hidroksi anisol, butil hidroksi toluena, propil galat, tersier butil hidrokuinon, vitamin D, vitamin E dan beta karoten) dan kromatogram B (baku vitamin A) dalam matriks sampel minyak goreng sawit yang dianalisis menggunakan KCKT kolom C18 pada kondisi optimum dengan komposisi fase gerak yang terdiri dari campuran asetonitril:air (80:20), laju alir 1,75 mL/menit dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm ………………………………………………………………………..

59

Gambar 9 Kurva regresi kadar vitamin A terhadap tinggi noise dengan sinyal (S/N) ....................................................................................................

60

xv

DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1 Contoh menghitung aktivitas baku vitamin A .................................. 76 Lampiran 2 Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng

sawit) menggunakan fase gerak metanol 100 %, laju alir 1,0 mL/menit (memberikan tekanan 78 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm ……………………………………….

77 Lampiran 3 Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng

sawit) menggunakan fase gerak metanol 100 %, laju alir 1,0 mL/menit (memberikan tekanan 78 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ………………………………………….


sawit) menggunakan fase gerak metanol 100 %, laju alir 0,8 mL/menit (memberikan tekanan 64 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm ……………………………………….


sawit) menggunakan fase gerak methanol 100 %, laju alir 0,8 mL/menit (memberikan tekanan 64 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ………………………………………….


sawit) menggunakan fase gerak methanol 100 %, laju alir 0,6 mL/menit (memberikan tekanan 45 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm ……………………………………….


sawit) menggunakan fase gerak metanol 100 %, laju alir 0,6 mL/menit (memberikan tekanan 45 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ………………………………………….


sawit) menggunakan fase gerak metanol:air (85:15) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 200 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm ………………………………….


sawit) menggunakan fase gerak metanol:air (85:15) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 200 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ………………………………………….



81

xvi

Lampiran 11 Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak metanol:air (90:10) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 176 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ………………………………………….




sawit) menggunakan fase gerak metanol:air (95:5) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 147 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ………………………………………….


sawit) menggunakan fase gerak metanol:air (97,5:2,5) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 132 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm ………………………………….


sawit) menggunakan fase gerak metanol:air (97,5:2,5) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 132 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ………………………………………….


sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:metanol (75:25) laju alir 1,0 mL/menit (memberikan tekanan 49 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm ……………………………..


sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:metanol (75:25) laju alir 1,0 mL/menit (memberikan tekanan 49 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ………………………………………….

84 Lampiran 18 KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit)

menggunakan fase gerak asetonitril:metanol (50:50) laju alir 1,0 mL/menit (memberikan tekanan 54 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm ……………………………………….


sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:metanol (50:50) laju alir 1,0 mL/menit (memberikan tekanan 54 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ………………………………………….


sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:metanol (25:75) laju alir 1,0 mL/menit (memberikan tekanan 63 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm ……………………………..

86

xvii

Lampiran 21 Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:metanol (25:75) laju alir 1,0 mL/menit (memberikan tekanan 63 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ………………………………………….


sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (100:0) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 71 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm ……………………………………….


sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (100:0) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 71 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ………………………………………….








sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (90:10) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 85 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ……………………….............................






sawit) menggunakan fase gerak asetonitril : air (80:20) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 103 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm ………………………………….

91

xviii

Lampiran 31 Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (80:20) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 103 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ……………………….............................


sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (75:25) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 113 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm ………………………………….


sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (75:25) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 113 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ………………………...


sawit) menggunakan fase gerak asetonitril : air (100:0) laju alir 1,75 mL/menit (memberikan tekanan 83 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm ………………………………….












sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (85:15) laju alir 1,75 mL/menit (memberikan tekanan 111 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm …………………………………

96

xix

Lampiran 41 Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (85:15) laju alir 1,75 mL/menit (memberikan tekanan 111 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ……………………….............................




sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air asetonitril:air (80:20) laju alir 1,75 mL/menit (memberikan tekanan 123 kgf) dengan detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm ………………………..


sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (75:25) laju alir 1,75 mL/menit (memberikan tekanan 130 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm ……………………..…………..



98 Lampiran 46 Data kurva kalibrasi baku vitamin A dalam matriks minyak goreng

sawit .................................................................................................

99 Lampiran 47 Contoh menghitung faktor respon detektor ……………………….. 99 Lampiran 48 Data hubungan antara konsentrasi vitamin A dengan faktor respon

detektor …………………………………………………………….

100 Lampiran 49 Data hubungan antara konsentrasi vitamin A dengan residual ......... 101 Lampiran 50 Contoh menghitung kadar vitamin A dalam sampel (pada uji presi-

si) …………………………………………………………………..

102 Lampiran 51 Contoh menghitung RSD Horwitz ………………………………... 103 Lampiran 52 Contoh menghitung akurasi vitamin A ............................................ 104 Lampiran 53 Contoh cara menghitung uji t ……………………………………... 105 Lampiran 54 Data hubungan antara konsentrasi vitamin A terhadap tinggi noise

dengan tinggi sinyal (S/N) dan perhitungan batas deteksi (LOD) dan batas kuantisasi (LOQ) ……………………………………….

106

I. PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Kesehatan masyarakat dunia dewasa ini bukan dihadapkan pada

masalah defisiensi gizi makro, tetapi pada masalah defisiensi gizi mikro.

Masalah defisiensi gizi mikro yang yang utama dihadapi adalah anemia gizi

besi, gangguan akibat kekurangan iodium (GAKI) dan kekurangan vitamin A

(KVA) (Martianto, 2011). Kekurangan zat gizi mikro berpotensi mengganggu

kesehatan masyarakat, sehingga dapat merusak kualitas sumber daya manusia

Indonesia. Subdit Bina Gizi Mikro Direktorat Bina Gizi Masyarakat juga

mengemukakan bahwa masalah kekurangan gizi di kalangan masyarakat

Indonesia terjadi pada setiap siklus kehidupan (World Bank 2006).

Sampai saat ini, penduduk Indonesia, terutama yang berpenghasilan

rendah baik di perkotaan dan pedesaan, masih banyak yang mengalami

masalah kekurangan zat gizi mikro. Data Organisasi Kesehatan Dunia

(WHO) pada 2009 menunjukkan lebih dari sembilan juta anak-anak Indonesia

dan satu juta perempuan menderita kekurangan vitamin A. Tercatat pula 25 -

30 % kematian bayi dan balita di dunia disebabkan oleh kekurangan vitamin

A, sedangkan di Indonesia sekitar 14,6 % anak di atas usia satu tahun

mengalami kekurangan vitamin A. (Krisnamurthi, 2010)

Penyakit akibat kurang vitamin A (KVA) disebabkan oleh kurangnya

vitamin A di dalam jaringan yang dapat menimbulkan gangguan secara

subklinis maupun klinis. Menurut WHO, kurang vitamin A subklinis ditandai

dengan nilai retinol serum 0,35 – 0,70 µmol/L (10 -20 µg/dL), meskipun

pada kadar retinol serum sampai 1,05 µmol/L masih dijumpai gejala sub-

klinis. Gejala KVA subklinis ditandai dengan gangguan diferensiasi sel dan

gangguan pada sistem imunitas. KVA klinis terjadi bila retinol serum kurang

dari 0,35 µmol/L (kurang dari 10 µg/dL) dengan gejala antara lain buta senja,

gangguan pertumbuhan dan xeroptalmia (Smith, 2000).

Program penanggulangan kekurangan vitamin A di Indonesia dilakukan

dengan 3 cara yaitu: diversifikasi konsumsi pangan, suplementasi vitamin A

dosis tinggi dan fortifikasi pangan (Martianto, 2011). Strategi yang digunakan

2

untuk menanggulangi masalah kekurangan vitamin A harus tepat untuk

menjawab kebutuhan dan harus menggunakan sistem dan teknologi yang

tersedia. Kombinasi beberapa intervensi mencakup promosi pemberian air

susu ibu (ASI), modifikasi makanan (misalnya meningkatkan ketersediaan

pangan dan meningkatkan konsumsi pangan), fortifikasi pangan dan suple-

mentasi. Fortifikasi vitamin A ke dalam minyak goreng sawit perlu dilakukan

dengan alasan (1) produk pangan di Indonesia sebagian besar menggunakan

minyak goring, (2) untuk mengurangi penyakit akibat KVA, maka perlu

adanya kebijakan yang tepat untuk menanggulangi masalah KVA, (3) salah

satu kebijakan yang ditempuh adalah fortifikasi vitamin A dalam minyak

goring, dan (4) pemerintah akan menetapkan standar yang mewajibkan kepada

seluruh produsen minyak goreng sawit untuk melakukan fortifikasi vitamin A

ke dalam produknya.

Target pencapaian persiapan program fortifikasi minyak goreng sawit

dengan vitamin A adalah sebagai berikut:

1. Tahun 2004-2011 : dilaksanakan studi konsumsi (intake minyak goreng),

stabilitas, efficacy, effectiveness.

2. Tahun 2011-2012 SNI wajib untuk minyak goreng sudah selesai

disiapkan.

3. Tahun 2011-2013 dilaksanakan pilot project di beberapa wilayah

(dimulai di Jawa Timur dan Jawa Barat).

4. Tahun 2011-2012 selesai dilaksanakan capacity building.

5. Tahun 2013 diimplementasikan SNI Wajib minyak goreng yang

difortifikasi.

6. Tahun 2013-2014 dilaksanakan monitoring dan evaluasi dampak forti-

fikasi wajib.

1.2 PERUMUSAN MASALAH

Seiring dengan peraturan dan kondisi di atas, maka perlu dilakukan

pengawasan atau monitoring terhadap pemenuhan kadar vitamin A dalam

minyak goreng sawit, baik pada tingkat industri, distributor dan konsumen.

Untuk itu dibutuhkan suatu metode analisis yang valid, selektif, cepat, mudah

3

dan praktis untuk mengidentifikasi dan menetapkan kadar vitamin A,

khususnya vitamin A dalam minyak goreng sawit. Namun analisis vitamin A

dalam produk pangan sulit dilakukan dengan metode yang tersedia, karena

matriks pangan yang kompleks dan adanya bahan tambahan yang ditam-

bahkan dalam produk pangan.

Di antara metode resmi atau metode standar pengujian vitamin A yang

ada saat menggunakan metode analisis dengan kromatografi cair kinerja

tinggi (KCKT). Kesulitan yang dihadapi dalam penggunaan metode yang ada

tersebut adalah dalam tahap persiapan sampel yang harus melewati tahapan

saponifikasi, ekstraksi dan pemekatan atau penguapan pelarut organik yang

digunakan untuk ekstraksi. Panjangnya proses persiapan tersebut menyebab-

kan hasil diperoleh kurang baik. Oleh karena itu, perlu dikembangkan metode

analisis untuk penetapan kadar vitamin A dalam minyak goreng sawit dengan

menggunakan KCKT tanpa proses saponifikasi, ekstraksi dan penguapan

pelarut organik.

Suatu metode baru atau metode yang dimodifikasi dapat digunakan bila

telah dilakukan validasi yang kondisinya disesuaikan dengan kondisi labora-

torium dan peralatan yang tersedia, meskipun metode yang akan digunakan

tersebut telah dipublikasikan dalam jurnal, buku teks atau buku resmi (Indra-

yanto, 1994). Validasi metode juga perlu dilakukan bila dilakukan penyeder-

hanaan atau perbaikan metode oleh karena ada perbedaan dan keterbatasan

alat, pereaksi atau kondisi lain yang menyebabkan metode tersebut tidak

dapat diterapkan secara keseluruhan. Apabila dari hasil validasi metode

tersebut sudah memberikan hasil yang baik, maka metode ini dianggap valid,

dapat dipercaya dan dapat digunakan untuk analisis rutin.

1.3 TUJUAN PENELITIAN

1. Melakukan pengembangan metode analisis penetapan kadar vitamin A

dalam minyak goreng sawit menggunakan KCKT menggunakan kolom C

18, yaitu menentukan komposisi fase gerak dan laju alir yang cocok

dalam pemisahan vitamin A dari komponen-komponen yang lain

menggunakan KCKT; dan detektor yang cocok (detektor ultra violet atau

4

detektor fluoresens) pada penetapan kadar vitamin A dalam minyak

goreng sawit.

2. Melakukan validasi metode analisis hasil pengembangan untuk membuk-

tikan bahwa metode yang telah dikembangkan tersebut valid.

3. Melakukan uji coba metode yang telah dikembangkan dan telah divali-

dasi untuk membuktikan bahwa metode tersebut dapat digunakan untuk

penetapan kadar vitamin A dalam minyak goreng sawit yang beredar di

pasaran tanpa adanya gangguan matriks sampel yang ada di dalam

berbagai merek minyak goreng sawit.

1.4 MANFAAT PENELITIAN

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan metode analisis

yang handal (valid, selektif, cepat, mudah dan praktis) untuk analisis

penetapan kadar vitamin A dalam minyak goreng, sehingga dapat dijadikan

kontrol yang lebih baik terhadap industri pangan dalam mensukseskan

fortifikasi vitamin A dalam minyak goreng sawit. Penelitian ini juga

diharapkan dapat menambah pengetahuan baru bagi peneliti dan memberikan

kontribusi bagi dunia pendidikan di Indonesia mengenai validasi metode

analisis pangan.

1.5 RUANG LINGKUP PENELITIAN

Penelitian ini merupakan penelitian laboratorium yang dilakukan

dengan cara: mencari komposisi fase gerak, laju alir, dan detektor yang

digunakan dalam pemisahan vitamin A dengan komponen-komponen lainnya

menggunakan KCKT, sehingga didapatkan suatu metode untuk penetapan

kadar vitamin A dalam minyak goreng sawit. Untuk membuktikan kehan-

dalan metode yang didapat, maka dilakukan validasi terhadap metode tersebut

dengan parameter validasi meliputi: linieritas, presisi, akurasi, selektivitas,

robustness, batas deteksi dan batas kuantisasi; dan uji coba metode tersebut

untuk penetapan kadar vitamin A dalam berbagai merek minyak goreng sawit

yang beredar di pasaran.

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 VITAMIN A

Vitamin A merujuk pada semua senyawa isoprenoid dari produk-

produk hewani yang mempunyai aktivitas all trans-retinol ( Rohman dan Ibnu,

2007). Menurut Almatsier (2009), vitamin A merupakan terminologi nama

generik yang menyatakan semua senyawa retinoid dan karotenoid (prekursor/

pro vitamin A) yang mempunyai aktivitas biologis seperti retinol. Bentuk

kimiawi senyawa retinoid berupa retinol (vitamin A bentuk alkohol), retinal

(aldehida), ester retinil dan asam retinoat. Menurut CE (2007) struktur kimia,

rumus empiris dan bobot molekul dari: retinol, retinil asetat, retinil propionat

dan retinil palmitat dapat dilihat pada Gambar 1 dan Tabel 1. Menurut

Eitenmiller dkk, (2008) sifat-sifat kimia-fisika dari retinol dan retinil palmitat

dapat dilihat pada Tabel 2.

CH3H3CCH3 CH3

OR

CH3

Gambar 1. Struktur molekul vitamin A alkohol (retinol) dan ester vitamin A (ester retinil)

Tabel 1. Rumus empiris dan bobot molekul dari vitamin A alkohol (retinol)

dan ester vitamin A (ester retinil) Nama zat R Rumus empiris Bobot Molekul

Retinol Retinil asetat Retinil propionat Retinil palmitat

H CO-CH3 CO-C2H5

CO-C15H31

C20H30O C22H32O2 C23H34O2 C30H40O2

286,5 328,5 342,5 524,9

Sumber: CE (2007)

6

Tabel 2. Sifat-sifat Kimia Fisika Retinol dan Retinil Palmitat Sifat Kimia Fisika Retinol Retinil Palmitat Bentuk Kristal kuning Kristal, amorf atau cairan

kental berwarna kuning Rumus Kimia Bobot Molekul

C20H30O 286,46

C36H60O2 524,88

Kelarutan Larut dalam: metanol, etanol, propanol, kloroform, eter, hidrokarbon, minyak

Larut dalam: metanol, etanol, propanol, kloroform, eter, hidrokarbon, minyak.

Absorbsi UV: λ maks. (etanol) E (1%, 1cm)

325 nm 1845

325 nm 940

Flourosensi: λ eksitasi λ emisi

325 nm 470 nm

325 nm 470 nm

Sumber: Eitenmiller dkk (2008)

Vitamin A pada umumnya stabil terhadap panas, asam, dan alkali,

namun mempunyai sifat yang mudah teroksidasi oleh udara dan akan rusak

bila dipanaskan pada suhu tinggi bersama udara, sinar, dan lemak yang sudah

tengik (Winarno, 2008). Menurut Favaro dkk, (1991) di dalam Hariyadi

(2011) vitamin A yang difortifikasikan ke dalam minyak goreng stabil selama

6-9 bulan jika disimpan dalam wadah tertutup dan terlindung dari cahaya,

vitamin A relatif stabil setelah proses penggorengan.

Menurut CE (2007), aktifitas vitamin A dinyatakan dalam Retinol

Ekivalen (R.E.), 1 mg R.E. sebanding dengan aktifitas 1 mg All-trans retinol.

Aktifitas ester retinol lain dihitung secara stoikiometris, sehingga didapat 1

mg R.E. vitamin A sebanding dengan: 1,147 mg all-trans-retinyl acetate,

1,195 mg all-trans-retinyl propionate dan 1,832 mg all-trans palmitate. Unit

Internasional atau International Units (IU) juga digunakan untuk menyatakan

aktifitas vitamin A. 1 IU Vitamin A ekivalen dengan aktivitas 0,300 μg All-

trans retinol. Aktifitas retinol ester lain dihitung secara stoikiometris,

sehingga didapat 1 IU vitamin A sebanding dengan aktifitas: 0,334 μg all-

trans-retinyl acetate, 0,359 μg all-trans-retinyl propionate, dan 0,550 μg all-

trans palmitate.1 mg R.E. sebanding dengan 3333 IU.

7

Aktifitas vitamin A ditentukan dengan tujuan untuk menghitung jumlah

yang dibutuhkan pada pembuatan konsentrat. Menurut BP Commision (2009),

aktivitas vitamin A palmitat ditetapkan dengan cara menimbang 25-100 mg

vitamin A dengan akurasi 0,1 %, dilarutkan dengan menggunakan 5 mL

pentana dan diencerkan dengan 2-propanol hingga diperolah konsentrasi 10 -

15 IU/mL. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang yang

menghasilkan serapan maksimum pada 326 nm. Aktivitas vitamin A dihitung

dalam satuan internasional unit (IU) per gram dengan persamaan:

A326 = Absorbansi pada panjang gelombang 326 nm

V = total volume pengenceran untuk mendapatkan kadar 10 – 15 IU/mL

1900 = faktor untuk mengkonversi absorbansi spesifik ester retinol menjadi

IU per gram

m = bobot substansi yang di uji (dalam gram).

Vitamin A merupakan zat gizi yang penting (esensial) bagi manusia,

karena zat gizi ini tidak dapat disintesa oleh tubuh, sehingga harus dipenuhi

dari luar. Vitamin A penting untuk kesehatan mata dan mencegah kebutaan

dan yang lebih penting lagi vitamin A meningkatkan daya tahan tubuh. Anak-

anak yang cukup mendapatkan vitamin A, bila terkena diare, campak atau

penyakit infeksi lainnya maka penyakit-penyakit tersebut tidak mudah men-

jadi parah, sehingga tidak membahayakan jiwa anak. Dengan adanya bukti-

bukti yang menunjukkan peranan vitamin A dalam menurunkan angka

kematian, maka selain untuk mencegah kebutaan, pentingnya vitamin A saat

ini lebih dikaitkan dengan kelangsungan hidup, kesehatan dan pertumbuhan

anak (Depkes, 2009a). Fungsi vitamin A didalam tubuh adalah untuk diferen-

siasi sel penglihatan, spermatogenesis, perkembangan embrio, imunitas,

mempengaruhi indra perasa, pendengaran, nafsu makan, serta pertumbuhan

(Bagriansky dan Ranum, 1998). Fungsi lain dari vitamin A adalah membantu

memelihara penglihatan di dalam gelap dan mencegah rabun senja serta

xeropthalmia, untuk pertumbuhan, dibutuhkan dalam pertumbuhan tulang dan

8

perkembangan gigi, sebagai koenzim dalam sintesis glikoprotein, memiliki

fungsi seperti hormon steroid, diperlukan untuk pembentukan tiroksin dan

pencegahan goiter, sintesis protein dan sintesis kortikosteron dari kolesterol,

serta sintesis normal dari glikogen (Berdarnier dkk, 2002).

Angka kecukupan gizi untuk vitamin A biasanya dinyatakan dalam satuan

retinol ekivalen (RE). Satu RE setara dengan 1 mikrogram retinol atau 6

mikrogram beta karoten atau 12 mikrogram beta karoten campuran. Status

vitamin A dikatakan baik jika konsentrasi vitamin A dalam hati sebesar 20

mikrogram/gram. Penggunaan setiap harinya adalah sekitar 0,5% dari

persediaan tersebut. Konsumsi vitamin A yang baik adalah jika setengahnya

bisa disimpan didalam tubuh (Muhilal, Jalal dan Hardiansyah, 1998). Angka

kecukupan gizi vitamin A rata-rata yang dianjurkan perhari dapat dilihat pada

Tabel 3.

Tabel 3. Angka Kecukupan Gizi Vitamin A

Kelompok Usia (tahun) Angka Kecukupan (RE) Bayi 0-0,5 0,5-1

375 400

Anak-anak 1-2 2-6 6-10

400 450 500

Pria 10-12 12-70

500 600

Wanita 10-70 500 Wanita Hamil 800 Wanita Menyusui 0-6 bulan > 6 bulan

850 850

Sumber: FAO/WHO (2001) dalam Muhilal dan Sulae-man (2004)

2.2 MINYAK GORENG SAWIT

Menurut Badan POM (2006), minyak goreng (frying oil atau frying fat)

adalah: minyak dan lemak yang digunakan untuk menggoreng yang diperoleh

dari proses rafinasi/pemurnian (refining/purifying) minyak nabati dalam

bentuk tunggal atau campuran. Karakteristik dasar minyak goreng meliputi:

9

kadar air tidak lebih dari 0,15 %, kadar asam lemak bebas tidak lebih dari 0,3

%, kadar asam lemak linoleat tidak lebih dari 2 % dan bilangan peroksida

tidak lebih dari 10 mek O2/kg.

Minyak kelapa sawit (Refined Bleached Deodorized Palm Oil/RBDPO)

adalah: minyak yang diperoleh dari hasil proses rafinasi/pemurniaan minyak

kelapa sawit mentah. Karakteristik dasar minyak kelapa sawit meliputi:

bilangan penyabunan 190 mg KOH/g, bilangan iod 50 Wijs hingga 55 Wijs,

titik leleh 33 oC hingga 39 oC dan bilangan peroksida tidak lebih dari 10 mek

O2/kg (Badan POM, 2006).

Minyak olein kelapa sawit (Refined Bleached Deodorized Palm Oilein)

adalah fraksi cair minyak kelapa sawit berwarna kekuningan yang diperoleh

dari hasil proses rafinasi/pemurniaan minyak olein kelapa sawit mentah

(Crude Palm Oil/CPO) atau fraksinasi minyak kelapa sawit yang sudah dirafi-

nasi (RBD palm oil). Karakteristik dasar minyak olein kelapa sawit meliputi

titik leleh/lebur tidak lebih dari 30oC, bilangan iod tidak kurang dari 56 Wijs,

bilangan penyabunan 194 mg KOH/g hingga 202 mg KOH/g dan bilangan

peroksida tidak lebih dari 10 mek O2/kg (Badan POM, 2006).

Minyak stearin kelapa sawit (Refined Bleached Deodorized Palm

Stearin) adalah fraksi padat minyak kelapa sawit yang berwarna kekuningan

yang diperoleh dari hasil proses rafinasi/pemurnian stearin kelapa sawit

mentah (Crude Palm Stearin) atau fraksinasi minyak kelapa sawit yang sudah

dirafinasi (RBD palm oil). Karakteristik dasar minyak olein kelapa sawit

meliputi: titik leleh/lebur tidak kurang dari 44oC dan bilangan iod tidak lebih

dari 48 Wijs (Badan POM, 2006).\

Minyak sawit (palm oil) berbeda dengan minyak inti sawit (palm kernel

oil). Minyak sawit diperoleh dari daging buah kelapa sawit bagian mesokarp,

sedangkan minyak inti sawit diperoleh dari biji buah kelapa sawit. Minyak

kelapa sawit diperoleh melalui proses ekstraksi secara rendering atau penge-

presan dan proses pemurnian yang terdiri atas pengendapan dan pemisahan

gum, netralisasi, pemucatan dan deodorisasi. Secara umum minyak kelapa

sawit mempunyai karakteristik warna kuning pucat sampai jingga tua,

10

memiliki aroma yang sedap dan stabil atau tahan terhadap ketengikan

(Winarno, 2008).

Melalui proses rafinasi, pemucatan dan penghilangan bau atau disingkat

RBD (Refined, Bleached, Deodorized), minyak kelapa sawit dapat diubah

menjadi produk yang bernilai tinggi. Proses rafinasi dan fraksinasi

menghasilkan minyak yang tidak berwarna, jernih dan bersih dari kotoran

yang dikenal dengan RBD oil. Kehilangan beta karoten yang terkandung

dalam minyak kelapa sawit banyak terjadi selama proses-proses tersebut

berlangsung (Muchtadi, 1996).

Menurut Olson (1990), minyak kelapa sawit yang tidak mengalami

proses penjernihan dan bleaching memiliki warna merah karena banyak

mengandung karoten (α dan β karoten) dalam jumlah yang banyak.

Kandungan karotenoid sebanyak 0,5 mg/mL minyak kelapa sawit. Kebutuhan

vitamin A pada anak usia pra-sekolah dapat dicukupi dari konsumsi 7 mL

minyak kelapa sawit merah per hari. Menurut Martianto, Marliyati dan

Komari (2007), walaupun memiliki kandungan karotenoid yang tinggi,

minyak kelapa sawit merah tidak dapat diterima dalam banyak penggunaan

karena warna merah yang kuat dan rasanya yang sangat khas.

Menurut Kemperin (2010), minyak goreng sawit adalah: bahan pangan

dengan komposisi utama trigliserida berasal dari minyak sawit, dengan atau

tanpa pengubahan kimiawi, termasuk hidrogenasi, pendinginan dan telah

melalui proses pemurnian dengan penambahan vitamin A. Komposisi minyak

goreng sawit terdiri atas bahan baku minyak sawit dan bahan tambahan

pangan (BTP) yang penggunaannya disesuaikan dengan ketentuan yang

berlaku untuk diizinkan penggunaannya pada minyak goreng sawit. Adapun

persyaratan mutu minyak goreng sawit sesuai dengan RSNI 3 Minyak goreng

sawit 2010 dapat dilihat pada Tabel 4

11

Tabel 4 RSNI 3 Persyaratan Mutu Minyak Goreng Sawit No. Kriteria Uji Satuan Persyaratan 1 Keadaan 1.1 Bau - Normal 1.2 Rasa - Normal 1.3 Warna (merah/kuning) (Lovibond 5,25

cell) maks. 5,0/50

2 Kadar air dan bahan menguap % (b/b) maks. 0,1 3 Asam lemak bebas (dihitung

sebagai asam palmitat) % maks. 0,3

4 Bilangan peroksida mek O2/kg maks. 10* 5 Vitamin A IU/g min. 45* 6 Minyak pelikan - negatif 7 Cemaran logam 7.1 Kadmium (Cd) mg/kg maks. 0,2 7.2 Timbal (Pb) mg/kg maks. 0,1 7.3 Timah (Sn) mg/kg maks. 40,0/250,0** 7.4 Raksa (Hg) mg/kg maks. 0,05 8 Cemaran arsen (As) mg/kg maks. 0,1 Catatan:

* pengambilan contoh di pabrik ** dalam kemasan kaleng

2.3 FORTIFIKASI PANGAN

Menurut Soekirman (2003), kekurangan zat gizi mikro dapat diatasi

dengan berbagai pendekatan seperti diversifikasi pangan, suplementasi dan

fortifikasi pangan. Fortifikasi adalah penambahan satu atau lebih zat gizi

mikro tertentu ke dalam bahan pangan dengan tujuan utama adalah mening-

katkan mutu gizi makanan. Fortifikasi dapat bersifat sukarela maupun wajib.

Fortifikasi yang dilakukan secara sukarela adalah fortifikasi yang dilakukan

oleh produsen untuk meningkatkan nilai tambah produknya, sedangkan

fortifikasi wajib merupakan fortifikasi yang diharuskan dan terdapat dalam

undang-undang maupun peraturan pemerintah dengan tujuan melindungi

rakyat dari kurang gizi. Target utama dari fortifikasi wajib ini adalah

masyarakat miskin yang umumnya menderita kekurangan gizi mikro seperti

kekurangan yodium, zat besi, dan vitamin A. Bahan pangan yang dapat

dilakukan fortifikasi harus memenuhi beberapa kriteria yaitu:

1. Bahan pangan harus dikonsumsi oleh semua atau sebagian besar populasi

sasaran.

2. Bahan pangan harus dikonsumsi secara rutin dalam jumlah yang tetap.

12

3. Rasa, penampakan dan bau bahan pangan yang difortifikasi tidak boleh

berubah.

4. Zat yang digunakan untuk fortifikasi harus stabil pada kondisi yang

ekstrim seperti pemasakan, pemrosesan, pengangkutan dan penyimpanan

5. Harga bahan pangan hasil fortifikasi tidak naik secara berarti.

Menurut Soekirman (2003) syarat-syarat bahan pangan yang akan

dilakukan fortifikasi adalah produsen yang memproduksi dan mengolah bahan

pangan tersebut terbatas jumlahnya, tersedianya teknologi fortifikasi untuk

bahan pangan yang dipilih dan bahan pangan tersebut tetap aman untuk

dikonsumsi dan dan tidak membahayakan kesehatan.

Menurut Martianto (2011), minyak goreng merupakan bahan pangan

yang diproduksi secara terpusat dan dikonsumsi secara luas oleh masyarakat,

sehingga dapat dipakai sebagai alternatif bahan pangan untuk difortifikasi.

Fortifikasi vitamin A ke dalam minyak goreng sawit perlu dilakukan dengan

alasan: (1) Produk makanan Indonesia sebagian besar menggunakan minyak

goreng; (2) Untuk mengurangi penyakit akibat KVA, maka perlu adanya

kebijakan yang tepat untuk menanggulangi masalah KVA; (3) Salah satu

kebijakan yang ditempuh adalah fortifikasi vitamin A dalam minyak goreng,

dan (4) Pemerintah akan menetapkan standar yang mewajibkan kepada

seluruh produsen minyak goreng sawit untuk melakukan fortifikasi vitamin A

ke dalam produknya.

Menurut Hariyadi (2011), fortifikasi vitamin A pada minyak goreng

dapat dilakukan dengan alasan: (1) Vitamin A dan pro-vitamin A sangat

mudah larut dalam minyak goreng; (2) Vitamin A umumnya lebih stabil

dalam minyak goreng dari pada dalam bahan pangan lainnya; (3) Minyak

goreng (lipida) membantu proses absorbsi dan pemanfaatan vitamin A; (4)

Minyak goreng digunakan oleh masyarakat luas; (5) Teknologinya tersedia

dan sederhana, dan (6) Biaya fortifikasi terjangkau.

13

2.4 METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR VITAMIN A

Secara umum pengujian vitamin A dalam bahan pangan terdiri atas 3

tahap yaitu: tahap saponifikasi, tahap ektraksi, tahap pemekatan atau

penguapan pelarut organik dan tahap pengukuran menggunakan instrumen.

Saponifikasi dilakukan dengan menggunakan kalium hidroksida dengan

pelarut campuran etanol dan air, penambahan zat anti oksidan (asam askorbat,

pirogalol, butil hidroksi toluena) dan pemanasan pada suhu 60–80oC

(Eitenmiller, 2008). Tahap ekstraksi dilakukan menggunakan pelarut organik

seperti petroleum eter (Eitenmiller, 2008); eter, campuran etanol dengan tetra

hidrofuran (USP Convention 2008). Selanjutnya dilakukan pemekatan atau

penguapan terhadap pelarut organik yang digunakan, lalu dilarutkan kembali

dengan pelarut lainnya seperti metanol atau etanol dan selanjutnya siap untuk

ditetapkan kadarnya menggunakan instrumen seperti: spektrofotometri atau

kromatografi cair kinerja tinggi. Metode penetapan kadar vitamin A

menggunakan instrumen akan dijelaskan sebagai berikut:

2.4.1 Metode Spektrofotometri

2.4.1.1 Pengukuran secara langsung.

Spektrum absorbsi ultraviolet vitamin A dan vitamin A asetat

mempunyai absorbsi maksimal pada panjang gelombang antara 325

sampai 328 nm dalam berbagai pelarut. Larutan vitamin A dalam

isopropanol absorbansinya diukur pada panjang gelombang maksimal

(λmaks) dan pada dua titik, yaitu satu disebelah kanan λmaks dan satunya

pada sebelah kiri λmaks. Absorbansi pada λmaks dikoreksi terhadap

senyawa pengganggu dengan menggunakan formula koreksi karena

senyawa-senyawa ini akan ikut menyerap pada daerah UV. Beberapa

pengganggu terutama pada minyak ikan adalah vitamin A2, kitol,

anhidro vitamin A dan asam polien. Pada vitamin A sintetik senyawa

pengganggunya adalah senyawa-senyawa antara (Rohman dan

Sumantri, 2007).

14

2.4.1.2 Pengubahan retinol atau akseroftol menjadi anhidroakseroftol

Akseroftol mudah diubah menjadi anhidroakseroftol dengan

bantuan sejumlah kecil asam mineral atau asam organik kuat. Metode

Budowski dan Bondi, akseroftol diubah menjadi anhidroakseroftol

dalam pelarut benzen dengan katalisator asam toluen-p-sulfonat pada

temperatur kamar. Kenaikan absorbansi pada 399 nm merupakan hasil

dehidrasi yang berbanding langsung dengan jumlah akseroftol yang

terkandung. Reaksi ini dapat dihentikan dengan penambahan alkali.

Pengukuran absorbansi pada 358 nm, 377 nm dan 399 nm dalam

benzen merupakan cara yang baik untuk mengetahui kemurnian

akseroftol yakni dengan melihat bahwa A399 nm/A377 nm sebesar 0,868

dan A358 nm/A377 nm sebesar 0,692 (Rohman dan Sumantri, 2007).

2.4.1.3 Metode Maleat anhidrat untuk isomer vitamin A

Maleat anhidrat bereaksi dengan all-trans dan 9-cis isomer

vitamin A menghasilkan senyawa yang tidak memberikan warna biru

ketika diuji dengan menggunakan antimon (III) klorida. Potensi

kehilangan terhadap all-trans dan 9-cis isomer dapat terjadi, sehingga

perlu dilakukan dua kali pengukuran nilai antimon (III) klorida,

pertama untuk isomer campuran dan setelah penghilangan kedua

isomer tersebut. Dari perbedaan nilai pengukuran ini, maka komposisi

isomer dalam campuran dan potensi biologisnya dapat ditentukan.

2.4.1.4 Penentuan secara simultan retinol (vitamin A1) dan dehidro-

retinol (vitamin A2)

Prinsip dari metode ini adalah perbedaan panjang gelombang

maksimum dan nilai ekstinsi dari masing-masing vitamin A1 dan A2.

Vitamin A1 mempunyai panjang gelombang maksimum pada 326 nm

sedangkan vitamin A2 mempunyai panjang gelombang maksimum

pada 351 nm.

15

2.4.2 Metode kolorimetri

2.4.2.1 Metode Carr-Price

Metode Carr-Pierce mencakup perlakuan vitamin A dengan

antimon (III) klorida; warna biru yang timbul memberikan serapan

maksimum pada panjang gelombang 620 nm dan mematuhi hukum

Lambert-Beer. Antimon (III) klorida yang digunakan sebagai reagen

penghasil warna bersifat korosif, dan membutuhkan penanganan secara

khusus dan kadang-kadang menyebabkan kerusakan terhadap peralatan

spektrofotometer. Dilihat dari formasi antimon (III) klorida, zat ini

sulit untuk untuk dibersihkan dari kuvet dan juga peralatan preparasi.

Warna biru yang timbul sangat tidak stabil dan pengukuran absorbansi

harus dilakukan antara 5-10 detik dari penambahan reagen (Rohman

dan Sumantri, 2007).

2.4.2.2 Pengukuran secara spektrofotometri dengan menggunakan

Asam trifluoro asetat

Asam trifluoro asetat bereaksi dengan vitamin A dan turunannya

sehingga mengasilkan warna biru yang memberikan serapan maksi-

mum pada panjang gelombang 616 nm. Reaksi warna yang terjadi

mematuhi hukum Lambert-Beer pada kisaran konsentrasi vitamin A

sebesar 10-6 dan 10-5 M (Libman, 1966).

2.4.2.3 Pengukuran secara spektrofotometri dengan menggunakan

gliserol diklorohidrin aktif

Gliserol diklorohidrin aktif bereaksi dengan vitamin A dalam

kloroform untuk menghasilkan warna ungu yang stabil dan mem-

punyai serapan maksimum pada panjang gelombang 555 nm. Reaksi

warna yang terjadi mematuhi hukum Lambert-Beer pada kisaran yang

lebar. Intensitas warna yang timbul 1/3 jika dibandingkan dengan

intensitas warna biru dari metode Carr-Pierce yang menggunakan

antimon (III) klorida. Reaksi bergantung pada suhu pengujian dan

disarankan pembuatan kurva kalibrasi dan analisis sampel dilakukan

pada suhu yang sama (Libman, 1966).

16

2.4.2.4 Pengukuran dengan menggunakan Asam fosfotungstat

Vitamin A dalam kloroform bereaksi dengan asam fosfotungstat

dalam etil asetat dengan adanya asetat anhidrat maka menghasilkan

warna biru dan memberikan serapan maksimum pada panjang gelom-

bang 620 nm. Reaksinya mematuhi hukum Lambert-Beer. Pada pema-

nasan dengan suhu 50°C menggunakan penangas air, warna biru yang

ada akan berubah menjadi biru keunguan, ungu, dan akhirnya menjadi

merah dan mempunyai serapan maksimum pada 530 nm. Warna merah

yang timbul juga mematuhi hukum Lambert-Beer dan cocok untuk

pengujian vitamin A, akan tetapi metode ini kurang sensitif untuk

bahan dengan kadar vitamin A rendah (Libman, 1966).

2.4.2.5 Pengukuran secara kolorimetri dengan aluminium klorida

Metode ini mencakup reaksi larutan jenuh aluminium klorida

dalam kloroform anhidrat dengan vitamin A. Warna yang timbul

mempunyai serapan maksimum pada panjang gelombang 618 nm dan

mematuhi hukum Lambert-Beer (Libman, 1966).

2.4.2.6 Pengukuran menggunakan asam fosfomolibdat

Metode ini melibatkan reaksi vitamin A dengan asam fosfo-

molibdat; warna biru yang timbul memberikan serapan maksimum

pada panjang gelombang 700 serta mematuhi hukum Lambert-Beer

(Libman, 1966).

2.4.3 Metode Spektrofluorometri

Berdasarkan sifat vitamin A yang dapat memberikan flourosensi,

maka vitamin A dalam bahan pangan yang telah diekstrasi dapat diu-

kur menggunakan spektrofluorometer pada panjang gelombang eksi-

tasi 330 nm dan emisi 480 nm. Pengukuran dengan metode spektro-

fluorometri lebih spesifik dibandingkan cara spektrofotometri, karena

banyak senyawa yang memberikan serapan pada daerah UV, namun

tidak memberikan sifat flourosensi (Angustin dkk 1985).

17

2.4.4 Metode Kromatografi

2.4.4.1 Pengukuran dengan kromatografi lapis tipis

Vitamin A dapat dipisahkan dengan komponen lainnya secara

kromatografi lapis tipis menggunakan fase diam silika gel F254 dan fase

gerak campuran siklo heksana dan eter dengan perbandingan 4:1, noda

yang telah terpisah dideteksi menggunakan asam fosfomolibdat dan

bercak biru hijau yang terjadi menunjukkan adanya vitamin A.

Perkiraan harga Rf vitamin A dalam bentuk alkohol, asetat dan

palmitat berturut-turut adalah 0,1; 0,45 dan 0,7 (Depkes 1995). Untuk

mendeteksi noda vitamin A dapat juga digunakan larutan antimon (III)

klorida yang akan memberikan warna biru (Depkes 1979) atau

menggunakan UV pada pada panjang gelombang 254 nm (CE 2007).

Sebagai fase gerak selain menggunakan campuran siklo heksana dan

eter, juga dapat digunakan campuran siklo heksana dan etil asetat

dengan perbandingan 9:1 (Libman 1966).

2.4.4.2 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Vitamin A dapat ditetapkan kadarnya menggunakan KCKT

menggunakan kolom fase normal atau kolom fase terbalik. Dengan

menggunakan kolom fase normal, vitamin A ditetapkan kadarnya

menggunakan fase diam kolom silika, fase gerak n-heksana dan

dideteksi menggunakan UV 325-nm (USP Convention 2008). Sebagai

fase gerak dapat juga digunakan campuran heptana dan diisopropil

eter, 95:5; heksana dan dietil eter 98:2; 1-5 % 2-propanol dalam

heptana; heksana dan metil etil keton, 90:10 (Nollet 2000). Dengan

kolom fase terbalk, vitamin A ditetapkan kadarnya menggunakan fase

diam kolom C18, fase gerak campuran metanol dan air dengan

perbandingan 860:140 dan dideteksi menggunakan UV 328-nm atau

313-nm (AOAC International, 2005). Sebagai fase gerak dapat juga

digunakan campuran asetonitril dengan air 90:10 (Eitenmiller, 2008);

campuran asetonitril dengan air, 90:10 atau campuran metanol dengan

air, 80:20 (Augustin dkk 1985). Persiapan sampelnya terdiri atas

18

proses saponifikasi, ekstraksi, pemekatan dan melarutkan kembali

menggunakan pelarut yang sesuai.

2.5 INTRUMENTASI KCKT

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut

dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan teknik

pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa

tertentu dalam suatu sampel. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan

senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis. KCKT merupakan

metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kuali-

tatif maupun kuantitatif (Rohman 2007).

Kromatografi adalah suatu prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu

proses migrasi difrensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau

lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah

tertentu dan di dalam zat tersebut menunjukkan perbedaan morbilitas disebab-

kan adanya perbedaan dalam adsorbsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran

molekul atau kerapatan muatan ion (Depkes 2009b)

Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas komponen pokok yaitu

wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukkan

sampel kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung peng-

hubung dan suatu komputer atau integrator atau perekam (Johnson, 1991).

Diagram blok untuk sistem kromatografi cair kinerja tinggi ditunjukkan pada

Gambar 2.

19

Gambar 2. Diagram Blok Sistem KCKT

2.5.1 Wadah Fase Gerak pada KCKT

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini

biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilang

gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul

dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan

mengacaukan analisis.

2.5.2 Fase Gerak Pada KCKT

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut

yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya

elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas

keseluruhan pelarut, polaritas fase diam dan sifat komponen-kompo-

nen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase

20

gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas

pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar dari-

pada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya

polaritas pelarut.

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan

dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol

atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase

normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran

pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau

menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.

2.5.3 Pompa pada KCKT

Pompa yang digunakan untuk KCKT adalah pompa yang

mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa

harus inert terhadap fase gerak. Pompa yang digunakan sebaiknya

mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan

fase gerak dengan kecepatan alir 1-3 mL/menit. Untuk tujuan prepa-

ratif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak

dengan kecepatan 20 mL/menit.

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak

adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung

secara tepat, reproduksibel, konstan dan bebas dari gangguan.

2.5.4 Injektor/Penyuntikan Sampel Pada KCKT

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke

dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom

menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan

katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sampel loop)

internal atau eksternal.

Pada saat pengisian sampel digelontor melewati keluk sampel

dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan,

katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan

21

menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikan dengan keluk

sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1%.

2.5.5 Kolom Pada KCKT

Kolom KCKT pada umumnya terbuat dari pipa baja tahan karat.

Panjang kolom antara 10-30 cm dengan diameter dalam 4,5-5,0 mm.

Kolom diisi dengan yang sesuai untuk pemisahan sampel tertentu.

Kolom untuk pemisahan analitik umumnya mempunyai diameter

dalam 2-4 mm. Kolom dapat dipanaskan sampai 60oC agar dihasilkan

pemisahan yang lebih efisien. Jika tidak dinyatakan lain, kolom

dipertahankan pada suhu kamar.

Fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara

kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren

dan divinil benzene. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam

karena adanya residu gugus silanol (Si-OH), Oktadesil silan (ODS atau

C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena

mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah,

sedang, maupun tinggi. Fase diam eksklusi dan penukar ion dapat

menggunakan silika atau polimer.

2.5.6 Detektor KCKT

Detektor pada KCKT ada 2 yaitu (1) Detektor universal (yang

mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik dan tidak

bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri

massa, dan (2) Detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi

analit secara spesifik dan selektif, seperti detector UV-VIS, detektor

fluoresensi dan elektro kimia.

2.5.7 Komputer, Integrator atau Rekorder.

Alat pengumpul data seperti komputer, integrator atau rekorder,

dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektro-

nik yang dihasilkan oleh detektor lalu memplotkannya sebagai suatu

kromatogram.

22

2.6 VALIDASI METODE ANALISIS

Suatu metode analisis terdiri atas serangkaian langkah yang harus

diikuti untuk tujuan analisis kualitatif dan kuantitatif dengan menggunakan

teknik tertentu. Faktor-faktor yang harus diperhatikan dalam melakukan

pemilihan metode analisis adalah: tujuan analisis, biaya yang dibutuhkan,

serta waktu yang diperlukan; level analit yang diharapkan dan batas deteksi

yang diperlukan; macam sampel yang akan dianalisis serta pra-perlakuan

sampel yang dibutuhkan; jumlah sampel yang dianalisis; ketepatan dan

ketelitian yang diinginkan untuk analisis kuantitatif; ketersediaan bahan

rujukan, senyawa baku, bahan-bahan kimia, dan pelarut yang dibutuhkan;

peralatan yang tersedia; kemungkinan adanya gangguan pada saat deteksi

atau pada saat pengukuran sampel. Menurut Rohman dan Ibnu (2007),

kriteria yang harus dipenuhi suatu metode analisis yang baik adalah:

1. Peka (sensitive) artinya metode harus dapat digunakan untuk mene-

tapkan kadar senyawa dalam konsentrasi yang kecil.

2. Selektif, artinya untuk penetapan kadar senyawa tertentu, metode

tersebut tidak banyak terpengaruh oleh adanya senyawa lain.

3. Tepat (precise) artinya metode tersebut menghasilkan suatu hasil

analisis yang sama atau hampir sama dalam satu seri pengukuran

(penetapan).

4. Teliti (accurate) artinya metode dapat menghasilkan nilai rata-rata

(mean) yang sangat dekat dengan nilai sebenarnya (true value).

5. Kasar (rugged) artinya ada perubahan komposisi pelarut atau variasi

lingkungan tidak menyebabkan perubahan hasil analisis.

6. Praktis artinya metode tersebut mudah dikerjakan serta tidak banyak

memerlukan waktu dan biaya.

Pengembangan metode analisis biasanya didasarkan pada metode yang

sudah ada menggunakan instrumen yang sama atau hampir sama. Pengem-

bangan metode analisis biasanya membutuhkan syarat-syarat metode

tertentu dan memutuskan jenis alat yang akan digunakan. Pada tahap

pengembangan metode, keputusan yang terkait dengan pemilihan kolom,

23

fase gerak, detektor dan metode kuantisasi harus diperhatikan. Ada beberapa

alasan tertentu untuk pengembangan metode analisis yang baru, yaitu:

1. Belum ada metode yang sesuai untuk analit tertentu dalam suatu matriks

sampel tertentu.

2. Metode yang sudah ada terlalu rumit, terlalu banyak tahap perlakuan

yang dapat menimbulkan kesalahan atau metode yang sudah ada tidak

reliabel (presisi dan akurasinya rendah).

3. Metode yang sudah ada terlalu mahal, membutuhkan waktu dan energi

yang besar atau tidak dapat diotomatisasikan.

4. Metode yang sudah ada tidak memberikan sensitivitas atau spesifisitas

yang mencukupi pada sampel yang dituju.

5. Adanya kebutuhan untuk pengembangan metode alternatif, baik untuk

alasan legal atau alasan saintifik.

Suatu metode perlu divalidasi terlebih dahulu sebelum metode

tersebut digunakan untuk penggunaan lebih lanjut, sehingga metode tersebut

dapat menjamin bahwa analisis yang dilakukan dapat dipercaya dan sesuai

dengan tujuan penggunaanya serta dapat diandalkan untuk mengambil

keputusan. Metode analisis yang akan digunakan harus disesuaikan dengan

kondisi laboratorium, peralatan dan pereaksi yang tersedia. Walaupun

metode analisis vitamin A dalam minyak goreng sawit masih sulit didapat,

namun metode analisis vitamin A dalam produk pangan dengan meng-

gunakan peralatan moderen, diantaranya dengan menggunakan KCKT sudah

banyak yang dikembangkan oleh peneliti terdahulu. Namun kelemahanya

dari metode yang ada adalah kerumitan dalam penyiapan sampel (saponi-

fikasi, ekstraksi dan pemekatan atau penguapan pelarut organik yang

digunakan). Metode analisis yang dikembangkan oleh peneliti ini dipilih

karena memiliki banyak kelebihan, yaitu metodenya tanpa proses saponi-

fikasi, ekstraksi dan penguapan pelarut organik yang digunakan sehingga

waktu analisinya relatif lebih cepat.

Menurut Gunzler (1996), validasi metode adalah menetapkan dengan

percobaan laboratorium yang sistimatik, pemenuhan karakteristik unjuk

kerja metode terhadap spesifikasi yang dikaitkan dengan penggunaan hasil

24

pengujian yang dimaksudkan. Karakreristik unjuk kerja (parameter) yang

ditetapkan mencakup: presisi, akurasi, selektivitas dan spesifisitas, batas

deteksi, batas kuantisasi, rentang, linieritas, sensitivitas dan kekasaran

(ruggedness). Menurut Harmita (2004), beberapa parameter analisis yang

harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis yaitu kecermatan

(akurasi), keseksamaan (presisi), selektivitas (spesifisitas), linearitas dan

rentang, batas deteksi dan batas kuantitasi, ketangguhan metode

(ruggedness) dan kekuatan metode (robustness).

Validasi metode adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan

bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu tujuan khusus

dipenuhi. Proses validasi suatu metode biasanya sangat dekat dengan proses

pengembangan suatu metode. Sebuah metode harus divalidasi bila kinerja

parameter metode uji tersebut belum valid atau belum dibuktikan valid

untuk penggunaan analisis khusus (BSN 2005).

Tujuan memvalidasi metode adalah untuk mengetahui sejauh mana

penyimpangan suatu metode tidak dapat dihindari pada kondisi normal,

dimana seluruh elemen terkait telah dilaksanakan dengan baik dan benar.

Dengan memvalidasi metode, tingkat kepercayaan yang dihasilkan oleh

suatu metode pengujian dapat diperkirakan dengan pasti ( Hadi, 2007)

Menurut USP Convention (2009), presisi adalah derajat kesesuaian

diantara hasil uji individu (berdiri sendiri) jika metode uji dilakukan

berulang-ulang terhadap multi sampling dari suatu sampel yang homogen.

Presisi biasanya dinyatakan sebagai simpangan baku atau simpangan baku

relatif (koefisien variasi) dari serangkaian pengukuran. Presisi hendaknya

dilakukan pada tiga tingkat berbeda yaitu: ripitabilitas, presisi intermediat

dan reprodusibilitas. Ripitabilitas adalah penggunaan metode pengujian di

dalam satu laboratorium dalam satu periode waktu yang singkat menggu-

nakan personel penguji yang sama, dengan peralatan yang sama di bawah

kondisi sekonstan mungkin. Presisi intermediat dilakukan dengan berbagai

variasi di dalam laboratorium, seperti pada hari yang berbeda atau personil

penguji yang berbeda atau alat yang berbeda dalam laboratorium yang sama.

Reprodusibilitas atau disebut juga ruggedness adalah penggunaan metode

25

pengujian dalam berbagai laboratorium yang berbeda seperti dalam uji

kolaborasi.

Akurasi adalah ukuran ketepatan dari suatu metode pengujian, atau

kedekatan antara nilai hasil uji yang diukur dengan nilai benar, atau nilai

nilai konvensional atau nilai acuan yang dapat diterima (USP Convention

2009). Akurasi dari suatu metode dapat dilakukan dengan cara: mengguna-

kan bahan acuan bersertifikat, membandingkan hasil yang benar-benar telah

dikarakterisasi dan akurasinya telah ditetapkan atau dengan cara menghitung

persen perolehan kembali terhadap sampel yang sudah dispike (Wood R

1998). Kriteria kecermatan dalam persen perolehan kembali sangat tergan-

tung kepada konsentrasi analit dalam matriks sampel dan pada keseksamaan

metode (RSD) (Oktavia, 2006). Persen rekoveri rata-rata untuk tiap level

konsentrasi dinilai terhadap rentang % rekoveri pada Tabel 5.

Selektivitas menunjukkan kemampuan suatu metode membedakan

antara analit yang dituju dan komponen lain / bentuk-bentuk analit lain yang

mungkin ada dalam matrik untuk mengukur secara akurat dan spesifik analit

dalam matriks sampel dengan adanya zat pengganggu. Selektivitas sering-

kali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode

yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan

berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan

dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan

lain yang ditambahkan (Oktavia, 2006).

Tabel 5. Keberterimaan akurasi berdasarkan % rekoveri

No

% Analit

Rasio Analit Satuan Rentang

keberterimaan (% Rekoveri)

1 100 1 100 % 98 – 102 2 10 10 -1 10 % 98 – 102 3 1 10 -2 1 % 97 – 103 4 0,1 10 -3 1000 ppm 95 – 105 5 0,01 10 -4 100 ppm 90 – 107 6 0,001 10 -5 10 ppm 80 – 110 7 0,0001 10 -6 1 ppm 80 – 110 8 0,00001 10 -7 100 ppb 80 – 110 9 0,000001 10 -8 10 ppb 60 – 115

10 0,0000001 10 -9 1 ppb 40 – 120

26

Linieritas adalah kemampuan untuk menghasilkan hasil uji yang

sebanding/berbanding lurus terhadap konsentrasi analit dalam sampel pada

kisaran konsentrasi tertentu. Menentukan kemampuan suatu metode untuk

mendapatkan respon yang proporsional terhadap konsentrasi analit (Oktavia,

2006).

Rentang yaitu kemampuan untuk memperoleh hasil uji yang kadar

analitnya masih linier dengan presisi dan akurasi yang masih dapat diterima.

Ditetapkan bersamaan dengan penetapan linieritas dengan melakukan peng-

ujian terhadap sampel yang kadarnya dibawah dan diatas normal. Rentang

metoda menjelaskan rentang konsentrasi dimana metode uji diaplikasikan

yang dinyatakan dalam presisi, akurasi (trueness) dan linieritas (Oktavia,

2006).

Batas Deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat

dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingan dengan

blanko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi

merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas

terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan

seksama. Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung

pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis

yang tidak menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan

mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Pada analisis

instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blanko

beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blanko. Batas deteksi

dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari

kurva kalibrasi (Oktavia, 2006).

III. BAHAN DAN METODE

3.1 WAKTU DAN TEMPAT

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April sampai dengan Juli

2011, bertempat di Laboratorium Pangan Pusat Pengujian Obat dan

Makanan Nasional Badan POM RI, Jalan Percetakan Negara No. 23

Jakarta.

3.2 ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat

KCKT yang terdiri dari pompa (Shimadzu, Jepang), detektor ultraviolet

(Shimadzu, Jepang), detektor fluoresens (Shimadzu, Jepang), auto sampler

(Shimadzu, Jepang), kolom C18 dengan panjang 250 mm, diameter 4,6 mm

ukuran partikel 5,0 µm (Waters Xbridge, USA dan Shimadzu Shim-pack,

Jepang), penyaring 0,2 µm (Millipore), penyaring 0,45 µm (Millipore),

ultrasonik (Branson, USA), seperangkat alat spektrofotometer UV-Vis

(Shimadzu, Jepang), timbangan analitik (Precisa, Switzerland) dan peralatan

gelas.

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah pelarut (fase

gerak) berderajat KCKT yaitu metanol (Merck, Jerman), asetonitril (JT

Beaker, USA) dan air demineral. Pereaksi dan pelarut organik berkualitas

pro analis: butil hidroksi toluena (Merck, Jerman), n-pentana (Merck,

Jerman), 2-propanol (Merck, Jerman), tetra-n-butil ammonium hidroksida

0,1 M dalam 2-propanol (Merck, Jerman). Bahan baku pembanding yaitu:

vitamin A palmitat 1700000 IU/g (BASF, Jerman), butil hidroksi anisol

(BPFI, Indonesia), butil hidroksi toluena (BPFI, Indonesia), propil galat

(BPFI, Indonesia), tersier butil hidro kinon (BPFI, Indonesia), vitamin D

(BASF, Jerman), vitamin E (BASF, Jerman), beta karoten (BASF, Jerman),

sampel minyak goreng sawit yang tidak mengandung vitamin A dan

beberapa merek minyak goreng sawit yang mengandung vitamin A.

28

3.3 METODE PENELITIAN

Penelitian ini merupakan percobaan laboratorium yang terdiri dari (3)

tiga tahap. Penelitian tahap I merupakan penelitian pemilihan kondisi

optimum (komposisi fase gerak, laju alir dan detektor) yang akan digunakan

dalam penetapan kadar vitamin A menggunakan KCKT. Parameter yang

dievaluasi meliputi: bentuk kromatogram, waktu retensi (Rt), resolusi (Rs),

jumlah lempeng teoritis (N) dan tailing faktor (Tf).

Penelitian tahap II merupakan validasi metode analisis penetapan

kadar vitamin A menggunakan KCKT. Parameter validasi yang akan

dilakukan adalah: kurva baku dan linieritas, presisi, akurasi, selektivitas,

robustness, batas deteksi dan batas kuantisasi metode.

Penelitian tahap III merupakan uji coba metode analisis yang telah

dikembangkan dan telah divalidasi untuk analisis vitamin A dalam minyak

goreng sawit yang beredar di pasaran. Parameter yang diuji adalah penga-

matan kromatogram dan penetapan kadar vitamin A.

3.3.1 Penetapan Aktivitas Baku Vitamin A

Aktivitas baku vitamin A ditetapkan sesuai metode Farmakope

Inggris (2009), yaitu dengan cara menimbang dengan saksama sejum-

lah baku vitamin A palmitat, dilarutkan dengan n-pentana dan diencer-

kan dengan 2-propanol hingga konsentrasinya 10 -15 IU/mL. Pengu-

kuran absorbansi dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis

pada panjang gelombang maksimum (326 nm), aktivitas baku vitamin

A dalam satuan unit internasional (IU) per gram dihitung dengan

rumus:

A26 = absorbansi pada panjang gelombang 326 nm V = total volume pengenceran untuk mendapatkan kadar 10-15

IU/mL 1900 = faktor untuk mengkonversi absorbansi spesifik ester retinol

menjadi menjadi IU per gram m = bobot substansi yang di uji (dalam gram).

29

3.3.2 Penetapan kondisi optimum KCKT

Larutan baku vitamin A yang akan disuntikkan ke dalam

sistem KCKT disiapkan sesuai metode Farmakope Inggris (2009).

Metode ini digunakan untuk penetapan kadar vitamin A dalam bentuk

baku atau konsentrat vitamin A, sehingga untuk penetapan kadar

vitamin A dalam minyak goreng sawit oleh peneliti dilakukan modifi-

asi, yaitu penambahan matriks minyak goreng sawit, perubahan

konsentrasi baku yang digunakan dan pada proses penyiapan sampel

tanpa pemanasan larutan uji.

Larutan dianalisis menggunakan KCKT dengan berbagai

kondisi percobaan seperti pada Tabel 6 dan analisis untuk setiap

kondisi percobaan dilakukan masing-masing dengan 3 kali pengu-

angan. Kromatogram yang dihasilkan dievaluasi dengan cara mencatat

atau menghitung: waktu retensi (Rt), resolusi (Rs), jumlah lempeng

teoritis (N) dan faktor ikutan atau tailing faktor (Tf) untuk masing-

masing hasil pada berbagai kondisi percobaan. Kondisi percobaan

memenuhi kriteria apabila: waktu retensi (Rt) < 15 menit; resolusi (Rs)

> 1,5; jumlah lempeng teoritis (N) > 3000 dan faktor ikutan atau

tailing faktor (Tf) mendekati 1. Untuk mempermudah dalam mengam-

bil keputusan pada pemilihan kondisi optimum, maka setiap parameter

kromatogram diberi nilai skor antara 1 - 3. Penentuan nilai skor untuk

penilaian kromatogram dapat dilihat pada Tabel 7.

Dari hasil tersebut kemudian ditentukan jumlah skor tertinggi

yang merupakan kondisi optimum dan selanjutnya digunakan pada

penelitian selanjutnya.

31

Tabel 6. Kondisi parameter KCKT untuk optimasi metode Kondisi Parameter Tetap Parameter Berubah

1 Kolom C 18; fase gerak metanol; detektor UV 325 nm Laju alir: 0,6; 0,8 dan 1,0 mL/menit 2 Kolom C 18; fase gerak metanol; detektor fluoresens panjang

gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.

Laju alir: 0,6; 0,8 dan 1,0 mL/menit

3 Kolom C 18; fase gerak metanol dan air; laju alir 1,5 mL/menit; detektor UV 325 nm

Perbanding komposisi fase gerak metanol dan air (97,5:2,5; 95:5; 90:10; dan 85:15)

4 Kolom C 18; fase gerak metanol dan air; laju alir 1,5 mL/menit; detektor fluoresens panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.

Perbanding komposisi fase gerak metanol dan air (97,5:2,5; 95:5; 90:10; dan 85:15)

5 Kolom C 18; fase gerak asetonitril dan metanol; laju alir 1,0 mL/menit; detektor UV 325nm

Perbanding komposisi fase gerak metanol dan air (75:25; 50:50; dan 25:75)

6 Kolom C 18; fase gerak asetonitril dan metanol; laju alir 1,0 mL/menit; detektor fluoresens panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.

Perbanding komposisi fase gerak metanol dan air (75:25; 50:50; dan 25:75)

7 Kolom C 18; fase gerak asetonitril dan air; laju alir 1,5mL/menit; detektor UV 325 nm

Perbanding komposisi fase gerak asetonitril dan air (100:0; 95:5; 90:10; 85:15; 80:20 dan 75:25).

8 Kolom C 18; fase gerak asetonitril dan air; laju alir 1,5mL/menit; detektor fluoresens panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang ge-lombang emisi 470 nm.

Perbanding komposisi fase gerak asetonitril dan air (100:0; 95:5; 90:10; 85:15; 80:20 dan 75:25)

9 Kolom C 18; fase gerak asetonitril dan air; laju alir 1,75mL/menit; detektor UV 325 nm


10 Kolom C 18; fase gerak asetonitril dan air; laju alir 1,75mL/menit; detektor fluoresens panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.


32

Tabel 7. Penentuan skor untuk penilaian kromatogram

Skor Pengamatan Rt Rs N Tf

1 ≥ 15 ≤ 1,5 ≥ 3000 dan < 6000 ≤ 0,75 atau ≥ 1,25 2 > 10 dan < 15 > 1,5 dan < 2,5 ≥ 6000 dan < 9000 > 0,75 atau < 1,25 3 ≤ 10 ≥ 2,5 ≥ 9000

33

3.3.3 Uji kesesuaian sistem (UKS)

Uji kesesuaian sistem dilakukan sesuai metode Farmakope

Indonesia (1995) dengan cara menyuntikkan salah satu larutan baku seri

ke dalam sistem KCKT minimal 5 kali pengulangan. Kondisi KCKT

sesuai prosedur yang telah dipilih pada uji optimasi, kemudian dihitung %

RSD dari waktu retensi dan luas area dari vitamin A. SD dan RSD

dihitung dengan menggunakan rumus:

UKS diterima bila memenuhi kriteria apabila % RSD dari waktu retensi

dan luas area dari vitamin A kurang atau sama dengan 1.

3.3.4 Pembuatan kurva baku dan uji linieritas

Untuk pembuatan kurva baku dan uji linieritas, sebelumnya dibuat

larutan baku seri vitamin A dengan konsentrasi 0,5– 4 IU/mL. Larutan

baku dibuat dengan cara menimbang dan memasukkan 2,5 g minyak

goreng sawit yang tidak mengandung vitamin A dan 2,5 mL n-pentana ke

dalam labu takar berwarna coklat 25 mL lalu dikocok sehingga minyak

goreng sawit larut, kemudian ditambahkan baku vitamin A dengan cara

memipet 0,5–7,0 mL larutan baku vitamin A 50 IU/mL dan dimasukkan

ke dalamnya. Selanjutnya dilakukan perlakuan yang sama seperti pada

pembuatan larutan larutan uji pada penetapan kondisi optimum KCKT.

Larutan baku seri disuntikan ke dalam sistem KCKT sesuai prosedur yang

telah dipilih pada uji optimasi dan masing-masing larutan baku seri

disuntikan dengan 3 kali pengulangan, kemudian dibuat kurva antara

konsentrasi analit yang berbeda-beda (x) terhadap respon instrumen atau

luas area (y) dan dikaji secara visual, apakah linier atau tidak. Selanjutnya

ditetapkan kurva linier: y = bx + a, dimana a adalah intersept (perpotongan

dengan garis dengan sumbu y) dan b adalah slope (kemiringan garis

regresi), kelinieran kurva ditentukan dengan cara menghitung koefesien

korelasi (r) dan standar deviasi relatif regresi linier (Vxo). Linieritas

34

diterima apabila nilai r > 0,995 dan Vxo ≤ 5. Untuk menentukan nilai a,

b, r dan Vxo digunakan rumus sebagai berikut:

Selanjutnya dibuat kurva konsentrasi versus faktor respon detektor

dan kurva konsentrasi versus residual. Faktor respon detektor dihitung

dengan menggunakan rumus:

Residual dihitung menggunakan rumus:

Residual = (Y^ - Y)

Y^ = Luas area vitamin A secara teoritis (dari persamaan garis regresi).

Y = Luas area vitamin A yang diamati.

Masing-masing kurva tersebut diamati secara visual, jika terjadi

penyebaran titik-titik secara random antara konsentrasi vitamin A dengan

faktor respon detektor dan konsentrasi vitamin A dengan residual yang

mendekati garis tengah menunjukkan linieritas yang baik.

35

3.4.5 Uji presisi

Untuk pembuatan larutan uji presisi, sebelumnya disiapkan terlebih

dahulu sampel minyak goreng sawit yang mengandung vitamin A dengan

3 tingkat konsentrasi yang berbeda yaitu: kadar rendah 22,5 IU/g, kadar

menengah 45 IU/g dan kadar tinggi 67,5 IU/g. Masing-masing sampel

tersebut ditimbang dengan saksama sejumlah 2,5 gram, dimasukkan ke

dalam labu takar berwarna coklat 25 mL, kemudian ditambahkan 2,5 mL

n-pentana, lalu dikocok sehingga minyak goreng sawit larut. Selanjutnya

dilakukan perlakuan yang sama seperti pada pembuatan larutan larutan uji

pada penetapan kondisi optimum KCKT. Uji presisi dilakukan dengan

cara menyuntikkan larutan uji ke dalam sistem KCKT menggunakan

prosedur yang telah dipilih pada uji optimasi. Masing-masing sampel

dengan 3 tingkat konsentrasi yang berbeda dianalisis sebanyak 6 kali

pengulangan. Perhitungan kadar sampel dilakukan menggunakan

persamaan kurva kalibrasi dengan menggunakan rumus:

Kemudian kadar dari masing-masing uji presisi dihitung dan

ditentukan nilai rata-ratanya, standar deviasi (SD) dan standar deviasi

relatif (RSD). Presisi diterima bila memenuhi kriteria: untuk satu penguji

(repeatabilitas): % RSD sampel ≤ ⅔ x % RSD Horwitz dan untuk intralab

(intra reprodubilitas): % RSD sampel ≤ % RSD Horwitz. RS D Horwitz

dihitung menggunakan rumus:

3.4.6 Uji akurasi

Untuk pembuatan larutan uji akurasi, digunakan sampel minyak

goreng sawit yang sama pada uji presisi. Masing-masing sampel minyak

goreng tersebut ditimbang dengan saksama sejumlah 1,25 gram,

dimasukkan ke dalam labu takar coklat 25 mL, kemudian ditambahkan 2,5

mL n-pentana, lalu dikocok sehingga minyak goreng sawit larut. Untuk

akurasi pada tingkat kadar rendah ditambahkan baku vitamin A 50 IU/mL

36

sebanyak 0,6 mL, untuk tingkat kadar menengah 1,2 mL dan untuk akurasi

tingkat kadar tinggi ditambahkan 1,8 mL. Selanjutnya dilakukan perlakuan

yang sama seperti pada pembuatan larutan larutan uji pada penetapan

kondisi optimum KCKT. Uji akurasi dilakukan dengan cara menyuntikkan

larutan uji ke dalam sistem KCKT sesuai prosedur penetapan kadar yang

telah ditentukan dari hasil uji optimasi. Masing-masing sampel dengan 3

tingkat konsentrasi yang berbeda dianalisis sebanyak 6 kali pengulangan.

Berdasarkan luas area yang didapat, dengan menggunakan kurva kalibrasi

baku selanjutnya dihitung jumlah total vitamin A, vitamin A dari sampel

dan rekoveri vitamin A. Akurasi metode dinyatakan sebagai % rekoveri

yang dihitung dengan menggunakan rumus:

Akurasi diterima bila memenuhi kriteria: rekoveri yang diperoleh pada

rentang 80–110 %

3.4.7 Uji selektivitas (spesifisitas)

Larutan untuk uji selektivitas dibuat dengan cara menimbang dengan

saksama sejumlah 2,5 gram sampel minyak goreng sawit yang sama pada

uji presisi (mengandung vitamin A dengan konsentrasi 45 IU/g), kemudian

dimasukkan ke dalam labu takar coklat 25 mL, ditambahkan 2,5 mL n-

pentana lalu dikocok sehingga minyak goreng sawit larut, ditambahkan 2,5

mL larutan butil hidroksi toluena 0,25 % dalam 2-propanol, 1 mL

campuran larutan butil hidroksi anisol (BHA), butil hidroksi toluena

(BHT), propil galat, tersier butil hidrokuinon (TBHQ), vitamin D dan

vitamin E masing-masing 1000 ppm serta beta karoten 100 ppm dalam 2-

propanol dan 10 mL larutan tetra-n-butil amonium hidroksisida 0,1 M

dalam 2-propanol, kemudian larutan diencerkan dengan 2-propanol hingga

tanda tera, lalu dikocok hingga homogen. Kemudian larutan disaring

menggunakan membran filter 0,2 µm dan dilakukan sonifikasi selama 10

menit. Uji selektivitas (spesifisitas) dilakukan dengan cara menyuntikkan

larutan ke dalam sistem KCKT sesuai prosedur yang telah dipilih pada uji

37

optimasi. Uji selektivitas (spesifisitas) dilakukan sebanyak 6 kali

pengulangan. Perhitungan kadar dilakukan menggunakan kurva kalibrasi,

kadar rata-rata dan SD dari masing-masing uji selektivitas (spesifisitas)

dihitung. Dengan menggunakan uji t, dibandingkan kadar rata-rata dan SD

yang diperoleh dari uji selektivitas (spesifisitas) dengan kadar rata-rata dan

SD yang diperoleh dari perhitungan presisi. Selektivitas (spesifisitas)

diterima apabila nilai yang diperoleh dari perhitungan uji t seperti di atas

memberikan hasil yang tidak berbeda bermakna.

3.4.8 Uji robustness

Larutan untuk uji selektivitas dibuat dengan cara menimbang dengan

saksama sejumlah 2,5 gram sampel minyak goreng sawit yang sama pada

uji presisi (mengandung vitamin A dengan konsentrasi 45 IU/g).

Selanjutnya dilakukan perlakuan yang sama seperti pada pembuatan

larutan uji pada presisi. Uji robustness dilakukan dengan cara

menyuntikkan larutan uji ke dalam sistem KCKT sesuai prosedur yang

telah dipilih pada uji optimasi, namun pada metode tersebut dilakukan

sedikit perubahan kecil seperti: perubahan penambahan atau pengurangan

jumlah pereaksi yang digunakan, perubahan komposisi fase gerak,

perubahan laju alir, dan perubahan merek kolom. Pada penelitian ini, uji

dilakukan dengan cara melakukan sedikit perubahan pada:

1. Pengurangan jumlah pereaksi n-pentana 2 mL, larutan antioksidan

butil hidroksi toluena 2 mL dan larutan tetra-n-butil amonium

hidroksida 9,5 mL

2. Penambahan jumlah pereaksi n-pentana 3 mL, larutan antioksidan butil

hidroksi toluena 3 mL dan larutan tetra-n-butil amonium hidroksida

10,5 mL

3. Perubahan komposisi fase gerak menjadi asetonitril : air (81:19) dan

laju alir 1,74 mL/menit.

4. Perubahan komposisi fase gerak menjadi asetonitri : air (79:21) dan

laju alir 1,76 mL/menit.

38

5. Perubahan penggunakan merek kolom yang berbeda: kolom C 18

panjang 250 mm, diameter dalam 4,6 mm dan ukuran partikel 5 µm

(Shimadzu Shim-pack, Jepang).

Masing-masing perubahan kondisi pada uji robutsness dilakukan

sebanyak 6 kali pengulangan. Perhitungan kadar dilakukan menggunakan

kurva kalibrasi, kadar rata-rata dan SD dari masing-masing uji dihitung.

Dengan menggunakan uji t, dibandingkan kadar rata-rata dan SD yang

diperoleh dari uji robustness dengan kadar rata-rata dan SD yang diperoleh

dari perhitungan presisi. Uji robustness diterima apabila nilai yang

diperoleh dari perhitungan uji t seperti di atas memberikan hasil yang tidak

berbeda bermakna.

3.4.9 Uji batas deteksi dan batas kuantisasi

Untuk pembuatan larutan untuk penentuan uji batas deteksi dan batas

kuantisasi, sebelumnya disiapkan terlebih dahulu sampel minyak goreng

sawit yang mengandung vitamin A dengan 7 tingkat konsentrasi yang

berbeda yaitu: kadar 0,5 IU/g, 0,625 IU/g, 1 IU/g, 1,25 IU/g, 2,5 IU/g, 5

IU/g dan 10 IU/g. Penyiapan larutan uji dilakukan dengan cara dilakukan

perlakuan yang sama seperti pada pembuatan larutan uji pada presisi. Uji

penentuan batas deteksi (LOD) dan batas kuantisasi (LOQ) dilakukan

dengan cara menyuntikkan larutan uji ke dalam sistem KCKT sesuai

prosedur yang telah dipilih pada uji optimasi. Kromatogram yang

diperoleh dianalisis dengan membuat data kadar spike yang berbeda-beda

(X), tinggi noise (N), tinggi sinyal atau puncak (S) dan perbandingkan

sinyal dengan noise (S/N). Kemudian dibuat kurva hubungan antara

konsentrasi spike (X) terhadap respon S/N (Y) dan dibuat persamaan garis

regresi kurva linier: y = bx + a. Berdasarkan kurva linier tersebut,

kemudian dihitung nilai LOD dan LOQ dengan menggunakan rumus:

LOD = harga nilai X pada S/N = 3, sedangkan nilai LOQ = harga nilai X

pada S/N = 10

39

3.4.10 Penetapan kadar vitamin A pada minyak goreng sawit yang beredar

di pasaran

Untuk penetapan kadar vitamin A pada minyak goreng sawit yang

beredar di pasaran, sebelumnya dilakukan pembelian sampel beberapa

merek minyak goreng sawit yang pada labelnya mengklaim akan

kandungan vitamin A. Penyiapan larutan uji dilakukan dengan cara

dilakukan perlakuan yang sama seperti pada pembuatan larutan uji pada

presisi. Masing-masing sampel dilakukan pengulangan pengujian minimal

2 kali. Masing-masing larutan uji tersebut kemudian disuntikkan ke dalam

sistem KCKT sesuai prosedur yang telah dipilih pada uji optimasi.

Kromatogram yang dihasilkan diamati dan perhitungan kadar vitamin A

dilakukan menggunakan kurva kalibrasi.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian ini telah dilakukan pengembangan dan validasi metode

analisis untuk penetapan kadar vitamin A dalam minyak goreng sawit secara

KCKT menggunakan kolom C 18 dengan alasan karena kolom ini sudah umum

digunakan dan sudah dimiliki oleh sebagian besar laboratorium pangan.

Komposisi fase gerak yang digunakan terdiri dari pelarut organik dan air, tanpa

penambahan larutan buffer dan pasangan ion, sehingga setelah penggunan selesai,

alat KCKT dapat segera dimatikan tanpa pencucian kolom terlebih dahulu

menggunakan air. Penelitian hasil pengembangan, validasi dan uji coba metode

analisis yang telah dilakukan oleh peneliti sebagai berikut:

4.1 Penetapan aktivitas baku vitamin A

Sebelum penelitian ini dimulai, perlu dilakukan penetapan aktivitas baku

vitamin A menggunakan spektrofotometer UV-Vis yang sudah dikalibrasi.

Penetapan ini perlu dilakukan karena sifat dari vitamin A yang mudah rusak oleh

pengaruh udara dan cahaya. Bila tidak dilakukan penetapan aktivitas baku vitamin

A, maka kadar baku vitamin A tidak sesuai dengan kadar yang sebenarnya dan

akibatnya hasil pengujian tidak akurat. Data uji penetapan aktivitas baku vitamin

A dapat dilihat pada Tabel 8.

Tabel 8. Data hasil uji penetapan aktivitas baku vitamin A

No. Bobot Baku (g)

Faktor Absorban

Kadar Baku Pengenceran Vit. A (IU/g)

1 0,0733 10.000 0,6557 1.699.632 2 0,0699 10.000 0,6240 1.696.137 3 0,0720 10.000 0,6330 1.670.417 Rata-rata (IU/g) 1.688.729 SD (IU/g) 15954,51 RSD (%) 0,94

Data yang dipereleh menunjukan kadar baku vitamin A adalah 1688729

IU/g dengan RSD 0,94 %. Dari data diperoleh dapat disimpulkan bahwa baku

vitamin A tersebut dapat digunakan untuk penelitian tahap selanjutnya.

42

4.2 Pemilihan kondisi analisis optimum

Sebelum disuntikkan ke dalam sistem KCKT, larutan baku dan larutan

sampel disiapkan dengan cara menimbang, lalu melarutkannya menggunakan n-

pentana dan 2-propanol, ditambahkan larutan butil hidroksi toluena dan tetra-n-

butil ammonium hidroksida. Adapunun maksud dari penambahan perekaksi-

pereaksi tersebut adalah sebagai berikut: penambahan pereaksi n-pentana untuk

membantu kelarutan minyak goreng sawit dalam pelarut 2-propanol. Minyak

goreng sawit merupakan senyawa yang sangat non polar, sedangkan 2-propanol

bersifat semi polar. Agar minyak goreng sawit mudah bercampur dengan 2-

propanol, maka minyak goreng sawit tersebut dilarutkan terlebih dahulu dengan

pelarut lain (n-pentana) yang lebih mudah bercampur dengan minyak goreng

sawit, lalu diencerkan dengan 2-propanol. Pereaksi butil hidroksi toluena

berfungsi untuk mencegah oksidasi vitamin A. Oksidasi terjadi akibat pengaruh

udara dan cahaya, yang akan membentuk yang selanjutnya radikal bebas tersebut

dapat mengoksidasi vitamin A. Butil hidroksi toluena akan beraksi dengan radikal

bebas tersebut, sehingga mencegah terjadinya reaksi oksidasi vitamin A. Pereaksi

tetra-n-butil ammonium hidroksida berfungsi untuk mengubah vitamin A palmitat

atau retinil palmitat menjadi retinol. Tanpa adanya reaksi tersebut, retinil palmitat

sangat sulit untuk dianalisis dengan KCKT karena sifat dari retinil palmitat yang

sangat non polar, sehingga terjadi inter aksi yang kuat dengan fase diam dan

akibatnya retinil palmitat tidak dapat dielusi oleh fase gerak yang digunakan.

Reaksi yang terjadi antara vitamin A palmitat dengan tetra-n-butil ammonium

hidroksida dapat dilihat pada Gambar 3.

+

Retinil palmitat Tetra-n-butil ammonium hidroksida

Retinol

Gambar 3. Reaksi antara retinil palmitat dengan tetra-n-butil ammonium hidroksida menghasilkan retinol.

43

Untuk mendapatkan kondisi analisis optimum vitamin A dalam minyak

goreng sawit, beberapa parameter kondisi KCKT perlu dioptimasi antara lain:

komposisi fase gerak, laju alir fase gerak dan detektor yang digunakan. Komposisi

fase gerak dan laju alir yang optimum memberikan jumlah lempeng teoritis (N)

yang besar, resolusi (Rs) yang lebih besar dari 1,5, faktor ikutan (Tf) yang

mendekati satu, serta waktu retensi yang relatif singkat, sedangkan optimasi

detektor yang digunakan untuk menentukan spesifisitas dan selektivitas yang

tinggi dalam analisis tanpa adanya gangguan dari matriks sampel. Dalam

penelitian ini digunakan kolom C18 yang bersifat non polar, sehingga sistem

kromotagrafi ini merupakan sistem kromatografi fase balik. Daya elusi dalam

sistem kromatografi ini berbanding terbalik dengan polaritas fase gerak. Semakin

kecil polaritas fase gerak, maka daya elusinya semakin besar. Fase gerak yang

digunakan dalam penelitian ini terdiri dari fase gerak berupa pelarut murni

(asetonitril atau metanol) dan campuran pelarut organik (asetonitril atau metanol)

dengan air. Dalam hal ini, air merupakan senyawa yang paling polar bila

dibandingkan dengan asetonitril dan metanol. Apabila jumlah air dalam komposisi

fase gerak tersebut ditambah, maka daya elusinya semakin rendah dan akibatnya

waktu retensi analit semakin besar. Namun dengan berkurangnya daya elusi dapat

memperbaiki bentuk kromatogram tersebut (resolusi, jumlah lempeng teoritis

ataupun tailing faktor) hingga diperoleh kondisi yang optimum.

Pada pencarian kondisi analisis optimum, laju alir juga divariasikan mulai

dari 0,6 mL/menit sampai dengan 1,75 mL/menit. Laju alir berbanding lurus

dengan waktu retensi. Pada optimasi laju alir dipilih yang mempunyai waktu

terpendek tetapi tidak mengabaikan kapasitasnya. Waktu retensi dikendalikan oleh

koefesien distribusi (k), jika harga k besar maka komponen dalam fase diam lebih

besar dari pada dalam fase gerak, sehingga komponen akan tinggal lebih lama

dalam fase diam. Kecepatan migrasi ditentukan oleh jumlah komponen yang

terdapat dalam fase gerak, karena komponen hanya bergerak dibawa oleh fase

gerak, sedangkan laju alir mempengaruhi migrasi suatu komponen. Untuk fase

gerak yang viskositasnya besar akan menyebabkan peningkatan tekanan pada

kolam, sehingga bila menggunakan fase gerak dengan menggunakan pelarut yang

mempunyai viskositas yang besar, maka laju alirnya tidak boleh besar. Dalam hal

44

ini, asetonitril merupakan pelarut yang mempunyai viskositas paling kecil bila

dibandingkan denga air dan metanol. Dalam hal ini, bila komposisi fase gerak

terdiri dari asetonitril dengan jumlah yang besar maka dalam analisis bila

menggunakan laju alir yang besar tekanan kolom tetap rendah.

Pada pencarian kondisi analisis optimum, detektor yang digunakan juga

divariasikan. Detektor yang digunakan pada penelitian ini adalah detektor

ultraviolet dan detektor fluoresens. Detektor ultraviolet digunakan untuk

mendeteksi komponen zat yang dapat menyerap cahaya di daerah ultraviolet (190

– 400 nm). Keuntungan dari detektor ini adalah pemilihan panjang gelombang

yang luas dan sensitivitas terhadap alat yang baik. Detektor fluoresens digunakan

untuk mendeteksi komponen zat yang dapat menyerap cahaya dan kemudian

memancarkan cahaya pada panjang gelombang yang lebih tinggi. Dibandingkan

dengan detektor ultra violet, detektor flouresen lebih peka dan lebih selektif,

karena hanya komponen zat yang berfluoresensi saja yang dapat dideteksi.

Vitamin A dapat dideteksi baik dengan menggunakan detektor ultraviolet maupun

menggunakan detektor fluoresens.

Pada penelitian ini digunakan kolom C 18 (Waters Xbridge, dengan panjang

250 mm, diameter 4,6 mm ukuran partikel 5,0 µm). Pemilihan kondisi optimum

dilakukan dengan memvariasikn komposisi fase gerak, laju alir dan detektor yang

digunakan (detektor ultraviolet dan fluoresens). Data pengamatan kromatogram

vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan komposisi fase

gerak metanol dengan detektor UV dapat dilihat pada Tabel 9, sedangkan data

pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit

menggunakan variasi komposisi fase gerak metanol dengan detektor fluoresens

dapat dilihat pada Tabel 10. Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam

matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak metanol

dan air dengan detektor UV dapat dilihat pada Tabel 11, sedangkan data

pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit

menggunakan variasi komposisi fase gerak metanol dan air dengan detektor

fluoresens dapat dilihat pada Tabel 12. Data pengamatan kromatogram vitamin A

dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak

asetonitril dan metanol dengan detektor UV dapat dilihat pada Tabel 13,

45

sedangkan data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak

goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan metanol

dengan detektor fluoresens dapat dilihat pada Tabel 14. Data pengamatan

kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi

komposisi fase gerak asetonitril dan air dengan detektor UV dapat dilihat pada

Tabel 15 dan Tabel 17, sedangkan data pengamatan kromatogram vitamin A

dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak

asetonitril dan air dengan detektor fluoresens dapat dilihat pada Tabel 16 dan

Tabel 18.

Berdasarkan kromatogram yang dihasilkan dari berbagai kondisi optimasi

percobaan dan dengan nilai skor yang diperoleh, diperoleh 1 kondisi analisis yang

paling optimum untuk analisis vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit

yaitu: komposisi fase gerak yang terdiri dari campuran asetonitril dan air (80:20),

laju alir 1,75 mL/menit dengan detektor ultraviolet pada panjang gelombang 325

nm. Kromatogram blanko (minyak goreng sawit yang tidak mengandung

vitamin A) dan kromatogram baku vitamin A palmitat (dalam matriks minyak

goreng sawit) yang dianalisis menggunakan KCKT kolom C18 pada kondisi

optimum komposisi fase gerak yang terdiri dari campuran asetonitril dan air

(80:20), laju alir 1,75 mL/menit dengan detektor UV pada panjang gelombang 325

nm dapat dilihat pada Gambar 4. Dari gambar 4 menunjukkan bahwa walaupun

kromatogram matriks minyak goreng sawit memberikan banyak puncak, namun

pada saat vitamin A keluar dari kolom dan dideteksi oleh detektor, di sekitar

puncak/kurva vitamin A tidak ada matriks atau perekasi yang mengganggu dan

memberikan waktu retensi yang sama dengan vitamin A, sehingga dengan

kondisi KCKT tersebut matriks minyak goreng sawit dan pereaksi yang

digunakan tidak mengganggu dalam analisis vitamin A dalam kondisi KCKT

yang digunakan.

46

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50mV(x10)

Detector A:325nm

A

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50mV(x10)Detector A:325nm

Vita

min

A/7

.84

1/1

49

05

6

B

Gambar 4. Kromatogram A (blanko minyak goreng sawit yang tidak mengandung vitamin A) dan kromatogram B (baku vitamin A palmitat dalam matriks minyak goreng sawit); yang dianalisis menggunakan KCKT kolom C18 pada kondisi optimum dengan komposisi fase gerak yang terdiri dari campuran asetonitril dan air (80:20), laju alir 1,7 mL/menit dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm.

4.3 Uji kesesuaian sistem (UKS)

Uji kesesuaian sistem perlu dilakukan sebelum instrumen KCKT

digunakan. Secara normal terdapat variasi dalam peralatan dan teknik

analisis, maka uji kesesuaian sistem dilakukan untuk memastikan bahwa

sistem operasional sudah sesuai dan memberikan hasil yang diharapkan

sesuai dengan tujuan analisis. Data uji kesesuaian sistem dapat dilihat

pada Tabel 19. Dari tabel tersebut dapat dilihat bahwa pada penyuntikan

ulang larutan baku vitamin A dengan 6 kali pengulangan, diperoleh

waktu retensi (Rt) 7,900 menit dengan standar deviasi relatif (RSD)

0,223 %, luas area 169352 dengan RSD 0,726 %. Nilai RSD kurang dari

1,0 %, maka data ini menunjukkan tidak terjadi perubahan yang

signifikan dari waktu retensi dan luas area baku vitamin A dan sistem

operasional yang digunakan teruji efektif untuk analisis dan dapat

disimpulkan bahwa UKS sudah memberikan hasil yang baik dan sistem

KCKT tersebut dapat digunakan untuk analisis vitamin A.

47

Tabel 9. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan, fase gerak metanol 100% dengan berbagai variasi laju alir, detektor UV pada panjang gelombang 325 nm

No, Laju Alir (mL/menit) Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs)

Jumlah Lempeng Teoritis (N) Tailing Faktor (Tf) Total

Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 1,0 4,481 3 2,392 2 3673 1 1,205 2 8 2 0,8 5,285 3 2,276 2 3759 1 1,223 2 8 3 0,6 7,021 3 2,380 2 4038 1 1,224 2 8

Tabel 10. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan: fase gerak

metanol 100% dengan berbagai variasi laju alir detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm

No, Laju Alir (mL/menit) Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs)


Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 1,0 4,624 3 1,701 2 3239 1 1,172 2 8 2 0,8 5,613 3 1,887 2 3336 1 1,177 2 8 3 0,6 7,452 3 2,006 2 3579 1 1,185 2 8

Tabel 11. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi

komposisi fase gerak metanol dan air; laju alir: 1,50 mL/menit, detektor UV pada panjang gelombang 325 nm

No, Komposis Fase Gerak Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs)


Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 85:15 14,106 2 8,273 3 8619 2 1,036 2 9 2 90:10 7,641 3 4,112 3 6382 2 1,030 2 10 3 95:5 4,515 3 3,146 3 4931 1 1,078 2 9 4 97,5:2,5 3,576 3 1,559 2 3878 1 1,120 2 8

48


komposisi fase gerak metanol dan air; laju alir: 1,50 mL/menit, detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm

No, Komposis Fase Gerak Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs)


Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 85:15 14,293 2 Baik 3 8380 2 1,041 2 9 2 90:10 7,835 3 Baik 3 6138 2 1,075 2 10 3 95:5 4,678 3 2,150 2 4020 1 1,108 2 8 4 97,5:2,5 3,777 3 1,514 2 3267 1 1,130 2 8


komposisi fase gerak asetonitril dan metanol; laju alir: 1,0 mL/menit, detektor UV pada panjang gelombang 325 nm

No, Komposisi Fase Gerak Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs)


Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 75:25 5,035 3 3,801 3 5203 1 1,164 2 9 2 50:50 4,814 3 2,192 2 4413 1 1,213 2 8 3 25:75 4,623 3 1,605 2 4063 1 1,187 2 8

49


komposisi fase gerak asetonitril dan metanol; laju alir: 1,0 mL/menit, detektor fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm



Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 75:25 5,158 3 1,391 1 15301 1 1,622 1 6 2 50:50 4,969 3 2,220 2 3733 1 1,140 2 8 3 25:75 4,747 3 2,107 2 3515 1 1,182 2 8

Tabel 15. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan air; laju alir: 1,5 mL/menit, detektor UV panjang 325 nm



Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 100:0 3,572 3 3,487 3 4174 1 1,196 2 9 2 95:5 4,412 3 2,549 3 5589 1 1,102 2 9 3 90:10 5,634 3 2,777 3 7125 2 1,034 2 10 4 85:15 7,206 3 2,485 2 9317 3 1,047 2 10 5 80:20 9,537 3 2,046 2 8525 2 1,059 2 9 6 75:25 13,163 2 Baik 3 10869 3 1,024 2 10

50


komposisi fase gerak asetonitril dan air; laju alir: 1,5 mL/menit, dengan detector fluoresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm



Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 100:0 3,799 3 1,700 2 3486 1 1,123 2 8 2 95:5 4,607 3 1,251 1 4540 1 1,170 2 7 3 90:10 5,828 3 1,834 2 4534 1 1,077 2 8 4 85:15 7,397 3 2,879 3 7837 2 1,031 2 10 5 80:20 9,703 3 1,699 2 9536 3 1,377 2 10 6 75:25 13,352 2 Baik 3 10254 3 1,040 2 10

Tabel 17. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan air; laju alir: 1,75 mL/menit, detektor UV pada panjang gelombang 325 nm



Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 100:0 3,258 3 1,533 2 3916 1 1,239 1 7 2 95:5 3,789 3 Baik 3 5167 1 1,096 2 9 3 90:10 4,778 3 Baik 3 6956 2 1,025 2 10 4 85:15 6,250 3 Baik 3 8556 2 1,026 2 10 5 80:20 8,456 3 Baik 3 9830 3 1,028 2 11 6 75:25 11,259 2 Baik 3 9096 3 1,037 2 10

51

Tabel 18. Data pengamatan dan evaluasi kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan

variasi komposisi fase gerak asetonitril dan air; laju alir: 1,5 mL/menit, detektor fluoresens panjang gelombang eksitasi 325 nm

dan panjang gelombang emisi 470 nm

No. Komposisi Fase Gerak Waktu Retensi (Rt) Resolusi (Rs)


Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor Rata-rata Skor 1 100:0 3,355 3 1,446 1 3337 1 1,148 2 7 2 95:5 3,921 3 1,302 1 4230 1 1,120 2 7 3 90:10 4,943 3 1,219 1 5868 1 0,995 2 7 4 85:15 6,305 3 3,560 3 7132 2 0,959 2 10 5 80:20 8,624 3 5,171 3 8150 2 1,509 1 9 6 75:25 11,428 2 2,023 2 9004 3 1,036 2 9

52

Tabel 19. Data hasil uji kesesuaian sistem (UKS) baku vitamin A No Kode Waktu Retensi (Rt) Luas Area 1 UKS 1 7,931 169736 2 UKS 2 7,881 170247 3 UKS 3 7,906 168218 4 UKS 4 7,899 169386 5 UKS 5 7,895 170891 6 UKS 6 7,887 167634 Rata-rata 7,900 169352 SD 0,018 1229,279 RSD 0,223 0,726 Syarat RSD (%) ≤ 1,0 ≤ 1,0

4.4 Validasi metode analisis penetapan kadar vitamin A 4.4.1 Kurva kalibrasi dan uji linieritas.

Setelah diperoleh kondisi optimum untuk analisis dan uji kese-

suaian sistem telah memenuhi sesuai dengan yang diinginkan, selanjut-

nya dilakukan validasi terhadap metode analisis tersebut. Validasi ini

diawali dengan pembuatan kurva kalibrasi dan linieritas dengan rentang

konsentrasi 0,4443 IU/mL sampai dengan 13,5233 IU/mL. Pemilihan

rentang konsentrasi ini berdasarkan konsentrasi vitamin A yang

ditambahkan ke dalam minyak goreng sawit yang beredar di pasaran

dan mencakup konsentrasi batas kuantisasi yaitu 5,73 IU/g. Untuk

analisis vitamin A dalam minyak goreng sawit, baku untuk pembuatan

kurva kalibrasi diperlakukan sama terhadap larutan uji, yaitu ditam-

bahkan minyak goreng sawit yang tidak mengandung vitamin A. Hal ini

dimaksudkan untuk menyamakan adanya gangguan matriks dari

minyak goreng sawit antara larutan uji dan larutan baku. Kurva kali-

brasi vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dapat dilihat pada

gambar 5.

Dari hasil perhitungan statistik kurva kalibrasi memberikan nilai r

0,99997 dan Vxo 2,54 dimana kriteria linieritas yang dapat diterima

adalah r minimal 0,995 dan Vxo maksimal 5 % sehingga dapat disim-

pulkan bahwa linieritas baku vitamin A memenuhi uji linieritas. Selan-

jutnya dibuat kurva konsentrasi versus faktor respon detektor dan kurva

konsentrasi versus residual. Kurva hubungan antara konsentrasi vitamin

53

A terhadap faktor respon detektor dapat dilihat pada Gambar 6 dan

kurva hubungan antara konsentrasi vitamin A terhadap residual dapat

dilihat pada Gambar 7.

Dari kedua kurva tersebut dapat dilihat adanya penyebaran secara

random antara konsentrasi vitamin A dengan faktor respon detektor dan

konsentrasi vitamin A dengan residual yang mendekati garis tengah

menunjukkan linieritas yang baik. Dengan demikian dapat disimpulkan

bahwa linieritas baku vitamin A dengan rentang konsentrasi 0,4443

IU/mL sampai dengan 13,5233 IU/mL memenuhi kritria uji linieritas

dan dapat diterima untuk perhitungan analisis selanjutnya.

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Konsentrasi Vitamin A (IU/mL)

Luas

Area

Gambar 5. Kurva kalibrasi baku vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit

54

32897

33897

34897

35897

36897

37897

38897

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Konsentrasi Vit. A (IU/mL)

Fakt

or R

espo

n D

etek

tor

-8000

-6000

-4000

-2000

0

2000

4000

6000

8000

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Konsentrasi Vitamin A (IU/mL)

Resi

dual

Gambar 6. Hubungan antara konse- trasi vitamin A dengan faktor respon detektor.

Gambar 7. Hubungan antara konsen sentrasi vitamin A terha- residual.

4.3.2 Uji presisi

Presisi pengukuran kuantitatif dapat ditentukan dengan mengana-

lisis sampel yang sama secara berulang-ulang (minimal 6 x pengu-

langan), kemudian dihitung nilai standar deviasinya (SD) dan dari nilai

standar deviasi tersebut dihitung nilai standar deviasi baku relatif (RSD)

atau koefesien variasi (KV). Dari nilai % RSD yang diperoleh diban-

dingkan dengan % RSD Horwitz yaitu suatu kurva berbentuk terompet

yang menghubungkan reprodusibilitas (presisi yang dinyatakan sebagai

% RSD dengan konsentrasi analit). Presisi metode analisis diekspresikan

sebagai fungsi dari konsentrasi melalui persamaan:

Presisi suatu metode akan memenuhi syarat apabila %RSD yang diper-

oleh dari percobaan lebih kecil dari 2/3 % RSD Horwitz dan berdasarkan

persamaan Horwitz dapat dipastikan bahwa, semakin kecil konsentrasi

suatu analit, maka nilai presisi yang dapat diterima akan semakin besar.

Pada penelitian ini, uji presisi dilakukan analisis terhadap tiga

konsentrasi, yaitu konsentrasi rendah ( 23,48 IU/g), konsentrasi sedang

(46,74 IU/g) dan konsentrasi tinggi (71,28 IU/g), dari masing-masing

55

konsentrasi tersebut selanjutnya dilakukan uji presisi sebanyak 6 kali

pengulangan dan pengujian dilakukan oleh analis yang sama dan waktu

yang hampir bersamaan (ripitabilitas). Presisi suatu metode dinyatakan

memenuhi syarat keberterimaan jika % RDS lebih kecil dari 2/3 CV

Horwitz. Data hasil uji presisi dapat dilihat pada Tabel 20.

Data yang diperoleh menunjukkan bahwa nilai RSD untuk

ripitabilitas yang dihasilkan tidak melebihi 2/3 dari nilai RSD berdasar-

kan rumus Horwizt. Hal ini menunjukkan bahwa sistem operasional alat

dan analis memiliki nilai presisi yang baik terhadap metode dengan

respon yang relatif konstan, sehingga hasil pengukuran memiliki nilai

presisi yang memenuhi persyaratan.

4.3.3 Uji akurasi

Berbeda halnya dengan presisi yang merujuk pada pengertian

ketelitian, akurasi merujuk pada pengertian ketepatan (kecermatan).

Penentuan akurasi metode untuk membuktikan kedekatan hasil analisis

dengan nilai benar. Akurasi dapat ditetapkan dengan 3 cara yaitu; pene-

tapan dengan menggunakan bahan acuan bersertifikat atau standard

reference material (SRM), membandingkan menggunakan metode yang

telah valid (metode resmi atau metode standar) dan menghitung uji

perolehan kembali dengan menggunakan penambahan standar (standar

adisi). Pada penelitian ini digunakan metode penambahan standar adisi

dan menghitung persen perolehan kembali. Uji perolehan kembali

dilakukan dengan cara menambahkan sejumlah baku pembanding vita-

min A ke dalam sampel yang sebelumnya telah ditentukan kadar vitamin

A-nya (sampel yang telah ditentukan nilai presisinya). Selanjutnya sam-

pel dianalisis hingga diperoleh nilai persen perolehan kembalinya. Nilai

persen perolehan kembali yang mendekati 100 % menunjukkan

bahwa metode tersebut memiliki ketepatan yang baik dalam menunjuk-

kan tingkat kesesuaian dari rata-rata suatu pengukuran yang sebanding

dengan nilai sebenarnya (true value).

56

Pada penelitian ini, uji akurasi dilakukan analisis terhadap tiga

konsentrasi yang berbeda, yaitu konsentrasi rendah ( 23,48 IU/g), kon-

sentrasi sedang (46,74 IU/g) dan konsentrasi tinggi (71,28 IU/g), dari

masing-masing konsentrasi tersebut selanjutnya dilakukan uji akurasi

sebanyak 6 kali pengulangan dan pengujian dilakukan pada waktu yang

hampir bersamaan. Pengujian akurasi dilakukan dengan cara penam-

bahan standar adisi dan akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan

kembali. Data hasil uji akurasi dapat dilihat pada Tabel 21.

Dari tabel hasil uji akurasi dapat dilihat, secara keseluruhan nilai

persen perolehan kembali berada dalam rentang 96,84–102,39 %,

dimana kriteria persen perolehan kembali yang dapat diterima adalah 80-

110 %. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa metode analisis yang

digunakan memenuhi kriteria untuk uji akurasi dan dengan kata lain

metode yang telah dikembangkan ini memberikan hasil akurasi yang

tidak berbeda dengan metode standar atau metode resmi.

4.3.4 Uji selektivitas (spesifisitas)

Pada uji selektivitas (spesifisitas), dilakukan analisis terhadap

sampel minyak goreng sawit yang sama pada uji presisi, namun pada saat

penyiapan larutan uji ditambahkan senyawa-senyawa kimia lainnya yang

mungkin terdapat atau sengaja ditambahkan ke dalam minyak goreng

sawit. Senyawa kimia tersebut dapat berupa: senyawa anti oksidan (butil

hidroksi anisol, butil hidroksi toluena, propil galat, tersier butil

hidrokinon), vitamin yang larut dalam minyak (vitamin D dan vitamin E)

dan senyawa kimia alami yang terdapat dalam minyak goreng sawit (beta

karoten). Kromatogram campuran senyawa kimia yang sedang dilakukan

uji selektivitasnya (tanpa penambahan vitamin A) dan baku vitamin A

dengan matriks sampel minyak goreng sawit dapat dilihat pada Gambar 8.

Data hasil uji selektivitas (spesifisitas) dapat dilihat pada Tabel 22.

57

Tabel 20. Data uji presisi penetapan kadar vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit No.

Bobot Sampel Pengenceran Luas Area

Kadar Vit. A Kadar Vit. A SD (IU/g) RSD (%) RSD 2/3 RSD

(g) (IU/g) Rata-rata (IU/g) Horwitz (%) Horwitz (%) 1 2,5147 25 84957 23,56 2 2,4991 25 85404 23,83 3 2,5593 25 85028 23,17 23,48 0,46 1,97 7,26 4,84 4 2,5138 25 86478 23,99 5 2,5942 25 84535 22,73 6 2,5343 25 85764 23,60 7 2,4914 25 167239 46,83 8 2,5104 25 167814 46,63 9 2,5336 25 167056 46,00 46,74 0,90 1,93 6,54 4,36

10 2,5004 25 170554 47,58 11 2,5777 25 168170 45,51 12 2,4902 25 170849 47,86 13 2,5045 25 258306 71,96 14 2,4904 25 261964 73,39 15 2,5092 25 252020 70,07 71,28 1,33 1,87 6,14 4,09 16 2,5055 25 257386 71,67 17 2,4901 25 252416 70,72 18 2,5202 25 252344 69,86

Kurva Kalibrasi yang digunakan untuk perhitungan presisi vitamin A

n a (Intersep) b (Slope) r 12 51,9937563 35825,84683 0,999973

58

Tabel 21. Data uji akurasi penetapan kadar vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit No Bobot

Sampel (g) Vit. A yang

ditambahkan (IU) Pengenceran Luas Area

Vit. A total (IU)

Vit. A dari sampel (IU)

Rekoveri Vit. A (%)

Rata-Rata Rekoveri (%) SD (%) RSD (%)

1 1,2647 28,98 25 84610 59,0063 29,6952 101,15

98,40 1,87 1,90

2 1,2317 28,98 25 81711 56,9833 28,9203 96,84 3 1,2402 28,98 25 82138 57,2813 29,1199 97,18 4 1,2507 28,98 25 82822 57,7586 29,3664 97,98 5 1,2413 28,98 25 82067 57,2317 29,1457 96,92 6 1,2504 28,98 25 83783 58,4292 29,3594 100,31 7 1,2307 57,96 25 163743 114,2269 57,5229 97,94

98,76 1,81 1,83

8 1,2439 57,96 25 164669 114,8731 58,1399 97,89 9 1,2503 57,96 25 165772 115,6428 58,4390 98,70 10 1,2468 57,96 25 164814 114,9743 58,2754 97,83 11 1,2416 57,96 25 164546 114,7872 58,0324 97,93 12 1,2592 57,96 25 169434 118,1982 58,8550 102,39 13 1,2577 86,94 25 254429 117,5094 89,6489 101,06

98,29 1,50 1,52

14 1,2425 86,94 25 249940 174,3769 88,5654 98,71 15 1,2404 86,94 25 247577 172,7280 88,4157 96,98 16 1,2506 86,94 25 249957 174,3888 89,1428 98,06 17 1,2503 86,94 25 249607 174,1445 89,1214 97,80 18 1,2407 86,94 25 247784 172,8724 88,4371 97,12

Kurva Kalibrasi yang digunakan untuk perhitungan akurasi vitamin A


59

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25


A

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25


Vita

min

A/7

.87

9/1

69

49

0

B

Gambar 8. Kromatogram A (campuran senyawa kimia yang sedang dilakukan uji selektivitasnya: butil hidroksi anisol, butil hidroksi toluena, propil galat, tersier butil hidrokuinon, vitamin D, vitamin E dan beta karoten) dan kromatogram B (baku vitamin A) dalam matriks sampel minyak goreng sawit yang dianalisis menggunakan KCKT kolom C18 pada kondisi optimum dengan komposisi fase gerak yang yang terdiri dari campuran asetonitril dan air (80:20) laju alir 1,75 mL/menit dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm.

Data yang diperoleh menunjukkan bahwa kromatogram yang dihasilkan

tidak diganggu oleh adanya senyawa-senyawa yang sengaja ditambahkan

ke dalam minyak goreng sawit dan pada uji t diperoleh hasil yang tidak

berbeda bermakna bila dibandingkan dengan hasil dari presisi yang telah

dilakukan, sehingga dapat disimpulkan bahwa metode analisis yang

digunakan memenuhi syarat uji selektivitas (spesifitas) terhadap analit:

senyawa anti oksidan (butil hidroksi anisol, butil hidroksi toluena, propil

galat, tersier butil hidrokinon), vitamin yang larut dalam minyak (vitamin

D dan vitamin E) dan senyawa kimia alami yang terdapat dalam minyak

goreng sawit (beta karoten).

4.3.5 Uji robustness.

Pada uji robustness, dilakukan analisis terhadap sampel minyak

goreng sawit yang sama pada uji presisi, namun pada metode tersebut

dilakukan sedikit perubahan kecil seperti: perubahan penambahan atau

pengurangan jumlah pereaksi yang digunakan, perubahan komposisi fase

gerak, perubahan laju alir, dan perubahan merek kolom. Data hasil uji

robustness dengan perubahan penambahan jumlah pereaksi menjadi: n-

60

pentana 3 mL, larutan antioksidan butil hidroksi toluena 3 mL dan larutan

tetra-n-butil amonium hidroksida 10,5 mL dapat dilihat pada Tabel 23.

Data hasil uji robustness dengan perubahan pengurangan jumlah pereaksi

n-pentana 2 mL, larutan antioksidan butil hidroksi toluena 2 mL dan

larutan tetra-n-butil amonium hidroksida 9,5 mL dapat dilihat pada Tabel

24. Data hasil uji robustness dengan perubahan komposisi fase gerak

asetonitril:air (81:19) dan laju alir 1,74 mL/menit dapat dilihat pada Tabel

25. Data hasil uji robustness dengan perubahan komposisi fase gerak

asetonitril:air (79:21) dan laju alir 1,76 mL/menit dapat dilihat pada Tabel

26. Data hasil uji robustness dengan perubahan menggunakan merek

kolom yang berbeda dapat dilihat pada Tabel 27. Dari Tabel 23–27

menunjukkan dalam uji t diperolah nilai t hitung lebih kecil dari t tabel,

sehingga dapat disimpulkan hasil pengujian kondisi normal dengan hasil

pengujian pada kondisi yang sedang diuji robutsnessnya memberikan

hasil uji yang tidak berbeda bermakna.

4.3.6 Uji batas deteksi dan batas kuantisasi

Pada penentuan uji batas deteksi dan batas kuantisasi dibuat

larutan vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dengan

konsentrasi 0,4988 IU/g sampai dengan 9,9970 IU/g. Kurva regresi

kadar vitamin A terhadap tinggi noise dengan sinyal pada penentuan

uji batas deteksi dan batas kuantisasi dapat dilihat pada Gambar 9.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 2 4 6 8 10 12

Kadar Vit. A (IU/g)

Perband

ingan tin

ggi nois

e terhad

ap tingg

i sinyal

(S/N)

Gambar 9. Kurva regresi kadar vitamin A terhadap tinggi noise dengan sinyal (S/N).

61

Tabel 22. Data uji selektivitas (spesifisitas) vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit

No Bobot Sampel Pengenceran Luas Area Kadar Vit. A Kadar Vit. A SD Uji t (g) (IU/g) Rata-Rata (IU/g) (IU/g) t Hitung t Tabel 1 2,5087 25 169742 47,20 2 2,5419 25 173729 47,68 3 2,5703 25 168767 45,81 47,36 0,99 1,609 2,228 4 2,5007 25 172544 48,13 5 2,5098 25 168382 46,80 6 2,4949 25 173673 48,56

Kurva Kalibrasi yang digunakan untuk perhitungan uji selektivitas (spesifisitas)


62

Tabel 23. Data uji robustness vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dengan perubahan metode pengurangan jumlah pereaksi menjadi: n-pentana 2 mL, larutan antioksidan butil toluena 2 mL dan larutan tetra-n-butil amonium hidroksida 9,5 mL



n a (Intersep) b (Slope) R 12 51,9937563 35825,84683 0,999973

Tabel 24. Data uji robustness vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dengan perubahan metode pengurangan jumlah pereaksi menjadi:

n-pentana 3 mL, larutan antioksidan butil toluena 3 mL dan larutan tetra-n-butil amonium hidroksida 10,5 mL No Bobot Sampel Pengenceran Luas Area Kadar Vit. A Kadar Vit. A SD Uji t (g) (IU/g) Rata-Rata (IU/g) (IU/g) t Hitung t Tabel 1 2,5047 25 169864 47,31 2 2,5995 25 173708 46,62 3 2,5989 25 170548 45,78 46,90 0,99 0,415 2,228 4 2,5491 25 173648 47,52 5 2,5994 25 170851 45,85 6 2,4902 25 172393 48,29



63

Tabel 25. Data uji robustness vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dengan perubahan metode perubahan komposisi fase gerak menjadi asetonitri: air (81:19) dan laju alir 1,74 mL/menit




Tabel 26. Data uji robustness vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dengan perubahan metode perubahan komposisi fase gerak

asetonitri menjadi: air (79:21) dan laju alir 1,76 mL/menit No Bobot Sampel Pengenceran Luas Area Kadar Vit. A Kadar Vit. A SD Uji t (g) (IU/g) Rata-Rata (IU/g) (IU/g) t Hitung t Tabel 1 2,5989 25 174788 46,92 2 2,5993 25 173576 46,59 3 2,5972 25 173804 46,68 47,37 0,87 1,744 2,228 4 2,5908 25 175049 47,13 5 2,4902 25 173647 48,65 6 2,4907 25 172261 48,25



64

Tabel 27. Data uji robustness vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dengan perubahan metode penggunakan merek kolom C 18 yang berbeda (kolom merek Shimadzu Shim-pack, Jepang: panjang 250 mm, diameter dalam 1,46 mm dan ukuran partikel 5 µm)




65

Setelah dianalisis dan dibuat persamaan regresi linier, diperoleh

nilai batas deteksi vitamin A dalam minyak goreng sawit adalah 1,66

IU/g dan nilai batas kuantisasi vitamin A dalam minyak goreng sawit

adalah 5,89 IU/g. Batas deteksi dan batas kuantisasi yang diperoleh

sudah dapat diterima, karena untuk mengetahui apakah minyak goreng

sawit yang diuji memenuhi syarat atau tidak dalam hal kandungan

vitamin A adalah minimal 45 IU/g, sedangkan batas deteksi dan batas

kuantitasi yang diperolah jauh di bawah 45 IU/g.

4.4 Uji coba penetapan kadar vitamin A dalam minyak goreng sawit

yang beredar di pasaran.

Hasil analisis terhadap minyak goreng sawit yang beredar di pasaran

dan pada labelnya mengklaim akan kandungan vitamin A menunjukkan

bahwa pada ke-empat sampel mengandung vitamin A berturut-turut sebesar

16,75 IU/g, 28,39 IU/g, 29,07 IU/g dan 66,65 IU/g (75 % sampel tidak

memenuhi persyaratan kadar vitamin A yang akan ditetapkan pemerintah).

Data hasil analisis terhadap sampel minyak goreng sawit yang beredar di

pasaran dapat dilihat pada tabel 28. Dari tabel tesebut dapat disimpulkan

bahwa kandungan vitamin A dalam sampel yang diuji masih banyak yang

belum memenuhi persyaratan kadar vitamin A yang akan ditetapkan oleh

pemerintah. Hasil evaluasi kromatogram dan SD yang diperoleh dari

penetapan kadar vitamin A dapat disimpulkan bahwa matriks sampel yang

terkandung dalam berbagai merek minyak goreng sawit yang beredar di

pasaran tidak mengganggu dalam analisis penetapan kadar vitamin A,

sehingga metode yang telah dikembangkan dan telah divalidasi oleh peneliti

dapat digunakan sebagai metode alternatif untuk penetapan kadar vitamin A

dalam berbagai merek minyak goreng sawit.

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan terhadap metode analisis yang

telah dikembangkan dan telah divalidasi oleh peneliti, dapat dibuat ringkasan hasil

penelitian sebagai berikut:

66

1. Hasil optimasi metode analisis penetapan kadar vitamin A dalam minyak

goreng sawit secara KCKT menggunakan kolom C 18 diperoleh hasil yang

optimal menggunakan komposis fase gerak asetonitril:air (80:20) dengan

laju alir 1,75 mL/menit menggunakan detektor ultraviolet pada panjang

gelombang 325 nm, dibuktikan dengan perolehan skor yang tinggi dalam

penilaian kromatogram KCKT.

2. Metode yang telah dikembangkan peneliti hasilnya sudah valid yang

dibuktikan dengan hasil validasi dari metode tersebut yang sudah

memenuhi persyaratan yang ditentukan.

3. Metodenya selektif, dibuktikan dari hasil selektivitas pada bagian uji

validasi yang telah dilakukan dan hasilnya sudah memenuhi persyaratan

yang ditentukan.

4. Metodenya cepat, dibuktikan dengan persiapan sampel pada metode yang

telah dikembangkan peneliti tanpa proses saponifikasi, tanpa proses

ektraksi dan tanpa proses pemekatan atau penguapan pelarut, sehingga

untuk sekali pengujian sampel menggunakan metode tersebut diperlukan

waktu sekitar 2 jam, sedangkan bila menggunakan metode resmi yang

sudah ada (dengan proses saponifikasi, ekstraksi dan proses pemekatan

atau penguapan pelarut) dari pengalaman yang pernah diperoleh peneliti

diperlukan waktu sekitar 6 jam.

5. Metodenya mudah dan praktis, karena metode yang telah dikembangkan

peneliti persiapan sampelnya tanpa proses saponifikasi, tanpa proses

ekstraksi dan tanpa proses pemekatan atau penguapan pelarut, sehingga

metode ini lebih mudah dan praktis; tanpa diperlukan keahlian dan

peralatan khusus untuk proses persiapan sampel.

6. Metode yang sudah dikembangkan dan divalidasi oleh peneliti memiliki

keunggulan-keunggulan seperti telah diuraikan di atas, namun

kelemahannya metode ini hanya dapat digunanakan untuk penetapan kadar

vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit dan tidak dapat digunakan

untuk penetapan kadar vitamin A dalam produk pangan yang lain,

misalnya: susu, daging dan telur.

67

Tabel 28. Data hasil analisis penetapan kadar vitamin A dalam minyak goreng sawit yang beredar di pasaran No Kode Bobot Sampel Pengenceran Luas Area Kadar Vit. A Kadar Vit. A SD RSD (g) (IU/g) Rata-Rata (IU/g) (IU/g) (%) 1 Avn A 2,4907 25 58070 16,25 2 Avn B 2,5928 25 64114 17,24 16,75 0,70 4,17 3 Fvt 2,4917 25 99450 27,84 4 Fvt 2,5892 25 107451 28,95 28,39 0,78 2,76 5 Sva A 2,4974 25 104545 29,20 6 Sva B 2,4989 25 103703 28,94 29,07 0,18 0,61 7 Snc A 2,4916 25 232286 65,04 8 Snc B 2,5015 25 242568 67,65 66,35 1,85 2,78

Kurva Kalibrasi yang digunakan untuk perhitungan kadar vitamin A


V. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 KESIMPULAN

Kondisi optimum untuk analisis penetapan kadar vitamin A dalam minyak

goreng sawit menggunakan KCKT dengan kolom C-18 (Waters Xbridge, panjang

250 mm, diameter 4,6 mm ukuran partikel 5,0 µm) adalah menggunakan fase

gerak asetonitril-air (80:20), kecepatan alir 1,75 mL/menit dan menggunakan

detektor ultraviolet pada panjang gelombang 325 nm.

Hasil validasi metode analisis yang telah dilakukan menunjukkan bahwa

parameter validasi linieritas, presisi, akurasi, selektivitas, robustness, penetapan

batas deteksi dan batas kuantisasi memenuhi kriteria yang telah ditetapkan

sehingga metode analisis ini valid, selanjutnya dapat digunakan sebagai metode

alternatif untuk penetapan kadar vitamin A dalam minyak goreng sawit.

Parameter yang digunakan pada pencarian kondisi analisis optimum pada

penetapan kadar vitamin A dengan menggunakan KCKT kolom C 18 dengan

variasi komposisi fase gerak, laju alir dan detektor ultraviolet dan atau detektor

fluoresens yang memberikan nilai resolusi (Rs) dan nilai lempeng teoritis (N)

yang baik, dapat digunakan sebagai konfirmasi identitas vitamin A dalam minyak

goreng sawit.

Hasil analisis terhadap 4 merek sampel minyak goreng sawit yang beredar

di pasaran yang pada labelnya mengklaim kandungan vitamin A diperoleh 75 %

mengandung vitamin A dibawah standar yang akan ditetapkan. Matriks sampel

yang terkandung dalam berbagai merek minyak goreng sawit yang beredar di

pasaran tidak mengganggu dalam analisis penetapan kadar vitamin A, sehingga

metode yang telah dikembangkan dan telah divalidasi oleh peneliti dapat

digunakan sebagai metode alternatif untuk penetapan kadar vitamin A dalam

berbagai merek minyak goreng sawit.

5.2 SARAN

Terhadap metode ini agar dilakukan validasi lebih lanjut seperti: uji

selektivitas menggunakan matriks minyak goreng sawit yang sudah mengalami

penurunan mutu (bilangan asam dan bilangan peroksidanya tinggi), uji presisi

70

antara (intermediate reproducibility) dan ketangguhan metode (ruggednes/

reproducibility) dengan cara melakuan uji kolaborasi yang melibatkan

laboratorium lain, sehingga kehandalan metode ini benar-benar diyakini dan untuk

selanjutnya dapat diusulkan sebagai metode resmi dalam Standar Nasional

Indonesia (SNI).

Untuk penelitian selanjutnya agar dilakukan perhitungan estimasi

ketidakpastian pengukuran dalam penetapan kadar vitamin A dalam minyak

goreng sawit agar dapat mengetahui sumber-sumber kesalahan dalam pengukuran,

yang selanjutnya dapat menghindari terjadinya kesalahan yang besar dalam suatu

analisis.

DAFTAR PUSTAKA

Almatsier S. 2009. Prinsif Dasar Ilmu Gizi. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama.

[AOAC International] Association of Official Analytical Chemist International. 2005. Official Methods of Analysis of AOAC International. Ed ke-18. Gaithersburg.

Augustin J, Barbara PK, Deborah B, Paul BV. 1985. Methods of Vitamin Assay. New York: A Wiley-Interscience.

[Badan POM] Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia. 2006. Kategori Pangan. Jakarta.

Bagriansky J dan P Ranum. 1998. Vitamin A Fortification of P. L. 480 Vegetables Oil [terhubung berkala]. http://pdf.usaid.gov/pdf_docs/PNACK055.pdf [1 Mar 2011]

Berdanier et. all. 2002. Hanbook of Nutrion and Food. Washington DC: CRC Press.

[BP Commision] British Pharmacopoeia Commision. 2009. British Pharmaco-poeia. London.

[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2005. Persyaratan Umum Kompetensi Laboratorium Pengujian dan Laboratorium Kalibrasi. ISO/IEC 17025: 2005. Jakarta.

[CE] Council of Europe. 2007. European Pharmacopoia. Strasbourg: European Directorate for the Quality of Medicine and Health Care.

[Depkes] Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1979. Kodeks Makanan Indonesia. Jakarta.

[Depkes] Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Farmakope Indo-nesia. Ed ke-4. Jakarta.

[Depkes] Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2009a. Profil Kesehatan Indonesia 2008. Jakarta.

[Depkes] Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2009b. Suplemen I Farma-kope Indonesia. Ed ke-4. Jakarta.

Eitenmiller RR, Lin Ye, WO Landen Jr. 2008. Vitamin Analysis for the Health and Food Sciences. Ed ke-2. Boca Raton: CRC Press.

Favaro, R., J. Ferreira, I. Desai, and J. Dutra de Oliveira. 1991. Studies on Fortification of Refined Soybean Oil with All-trans Retinyl Palmitate in Brazil: Stability During Cooking and Storage. J. Food Comp. Anal. 4: 237-244. Di dalam: Hariyadi P. 2011. Teknologi Fortifikasi Vitamin A pada Minyak Sawit. Di dalam: Workshop Fortifikasi Vitamin A pada Minyak Goreng Sawit; Jakarta, 16 Mar 2011. Jakarta:

72

Direktorat Industri Makanan, Hasil Laut dan Perikanan-Kementrian Perindustrian RI

Gunzler H. 1996. Accreditation and Quality Assurance in Analytical Chemistry. Springer. Di dalam: Siregar CJP, Tomi H. 2007. Praktik Sistem Manaje-men Laboratorium-Pengujian yang Baik (Good Testing-Laboratory Mana-gement System Practice). Jakarta: EGC.

Hadi A. 2007. Pemahaman dan Penerapan ISO/IEC 17025-2005: Persyaratan Umum Kompetensi Laboratorium Pengujian dan Laboratorium Kalibrasi. Jakarta: PT Granedia Pustaka Utama.

Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungan-nya. Majalah Ilmu Kefarmasian. Vol. 1 No. 3. 117-135

Hariyadi P. 2011. Teknologi Fortifikasi Vitamin A pada Minyak Sawit. Di dalam: Workshop Fortifikasi Vitamin A pada Minyak Goreng Sawit; Jakarta, 16 Mar 2011. Jakarta: Direktorat Industri Makanan, Hasil Laut dan Peri-kanan-Kementrian Perindustrian RI

Johnson EL, Robert S., 1991. Dasar Kromatografi Cair. Bandung: Penerbit ITB. Terjemahan dari: Basic Liquid Chromatography.

[Kemperin] Kementrian Perindustrian Republik Indonesia. 2010. RSNI 3 Minyak Goreng Sawit. Jakarta.

Krisnamurthi B. 2010. Menambahkan Vitamin A pada Minyak Goreng [terhubung berkala]. http://www.koran-jakarta.com/berita-detail.php? id=49585 [ 27 Feb 2011]

Libman DD. 1966. Vitamin Assay Tested Methods. Verlagsnummer: Omnitypie Geseeschaft Nachf.

Martianto D, SA Marliyati, Komari. 2007. Vitamin A Fortification of Cooking Oil at Distribution Site Gudeline. Koalisi Fortifikasi Indonesia for Japan Fund for Poverty Reduction Project. Direktorat Gizi Masyarakat Departemen Kesehatan RI. Jakarta.

Martianto D. 2011. Penanggulangan Kurang Vitamin A (KVA) di Indonesia Melalui Fortifikasi Minyak Goreng Sawit. Di dalam: Workshop Fortifikasi Vitamin A pada Minyak Goreng Sawit; Jakarta, 16 Mar 2011. Jakarta: Direktorat Industri Makanan, Hasil Laut dan Perikanan-Kementrian Perindustrian RI.

Muchtadi TR. 1996. Peranan Teknologi Pangan dalam Meningkatkan Nilai Tambah Produk Minyak Sawit Indonesia. Orasi Ilmiah Guru Besar Tetap Ilmu dan Teknologi Pertanian. IPB Bogor.

Muhilal F, Jalal, Hardiansyah. 1998. Angka Kecukupan Gizi yang Dianjurkan. Di dalam: Widyakarya Nasional Pangan dan Gizi VI. Jakarta: Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia.

73

Neil MJO, et. All. 2006 The Merck Indeks. Ed ke-14. Whitehouse Station: Merck Research Labratories.

Nielsen S. 2003. Food Analysis. Ed ke-2. New York: Springer Science.

Nollet LML. 2000. Food Analysis by HPLC. New York: Marcel Dekker.

Nollet LML. 2004. Handbook of Food Analysis. Ed ke-2. New York: Marcel Dekker.

Oktavia E. 2006. Teknik Validasi Metode Analisis Kadar Ketopropen Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Buletin Teknik Pertanian Vol.11No.1. 23-28

Olson JA. 1990. Vitamin A LJ. Machilin (Ed). Di dalam: Handbook of Vitamins. Ed ke-2. New York: Marcel Dekker.

Rohman A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:Pustaka Pelajar.

Rohman A, Ibnu GG. 2007. Metode Kromatografi untuk Analisi Makanan. Yogyakarta: Pustaka Pelajar

Rohman A, Sumantri. 2007. Analisis Makanan. Yogyakarta: Gadjah Mada Uni-versity Press.

Smith J, Stelnemann TL. Vitamin A deficiency and The Eye. In: Friedlaender MH.Eds. International Opthalmology Clinics. Nutrition, Philadelphia. Lippincott Willimns. 2000. Di dalam: Sekarsari N. 2004. Efek Suplemen-tasi Vitamin A terhadap Sensitivitas Kontras Penderita Defisiensi Vitamin A [tesis]. Jakarta: Fakultas Kedokteran Departemen Ilmu Penyakit Mata, Universitas Indonesia.

Soekirman. 2003. Fortifikasi dalam Program Gizi, Apa dan Mengapa. Jakarta: Koalisi Fortifikasi Indonesia.

Soendegaard C. 2011. Semi-quantitative Analysis of Vitamin A in Cooking Oil. Di dalam: Technical Seminar Quality Control of Vitamin A in Fortified Oil; Surabaya, 26 Jan 2011. Jakarta: BASF, Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, Koalisi Fortifikasi Indonesia.

[USP Convention] United States Pharmacopeial Convention. 2008. Food Chemi-cal Codex. Twinbrook Parkway: United States Pharmacopeial Convention.

[USP Convention] United States Pharmacopeial Convention. 2009. United States Pharmacopoeia National Formulary, USP 32/NF 27. Twinbrook Parkway: United States Pharmacopeial Convention.

Winarno FG. 2008. Kimia Pangan dan Gizi. Bogor: M-Brio Press.

Winarno FG, Felicia K. 2007. Pangan Fungsional dan Minuman Energi. Bogor: M-Brio Press.

Wood R, et all. 1998. Quality in the Food Analysis Laboratory. The Royal Soci-ety of Chemistery. Di dalam: Siregar CJP, Tomi H. 2007. Praktik Sistem Manajemen

74

Laboratorium-Pengujian yang Baik (Good Testing-Labora-tory Management System Practice). Jakarta: EGC.

World Bank. 2006. Reposition Nutrition as Central to Development, dikutip oleh Subdit Bina Gizi Mikro Direktorat Bina Gizi Masyarakat, pada “Workshop Nasional tentang Standar Fortifikasi Pangan” Hotel Bumi Karsa Jakarta, 31 Jul 2008.

Lampiran

76

Lampiran 1. Contoh menghitung aktivitas baku vitamin A

Penimbangan baku (m) vitamin A : 0,0733 g

Faktor pengenceran (V) : 10.000

Absoban pada 326 nm (A326) : 0,6557

Maka aktivitas baku vitamin A dapat dihitung dengan menggunakan rumus:

77

Lampiran 2. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak metanol 100 %, laju alir 1,0 mL/ menit (memberikan tekanan 78 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00

3.25

3.50

mV(x10)Detector A:325nm

/3.7

84/2

3988

Vita

min

A/4

.356

/344

490

/4.7

24/1

311

Lampiran 3. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak metanol 100 %, laju alir 1,0 mL/menit (memberikan tekanan 78 kgf) dengan detektor flouresens pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

mV(x100)Detector B:Ex:325nm,Em:470nm

RT4.0

39/4.

071/1

0436

2

Vitam

in A/

4.646

/1895

027

/5.35

9/142

65

78

Lampiran 4. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak metanol 100 %, laju alir 0,8 mL/menit (memberikan tekanan 64 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00

3.25

3.50

3.75mV(x10)

Detector A:325nm

/4.63

9/28

995

Vitam

in A/

5.28

2/42

8019

.

Lampiran 5. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak metanol 100 %, laju alir 0,8 mL/menit (memberikan tekanan 64 kgf) dengan detektor pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75


RT4.9

81/4.

983/6

7496

Vitam

in A/5

.610/2

3859

48

RT6.4

38/6.

422/1

2395

.

79

Lampiran 6. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak metanol 100 %, laju alir 0,6 mL/menit (memberikan tekanan 45 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00

3.25

3.50

3.75mV(x10)

Detector A:325nm

/6.1

64/4

5068

Vita

min

A/7

.020

/568

224

Lampiran 7. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak metanol 100 %, laju alir 0,6 mL/menit (memberikan tekanan 45 kgf) dengan detektor pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75mV(x100)

Detector B:Ex:325nm,Em:470nm

RT6.5

96/6.

609/

9528

5

Vitam

in A/

7.45

3/30

9068

6

RT8.4

86/8.

503/

3076

0

80

Lampiran 8. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak metanol:air (85:15) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 200 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 min

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0


/9.6

12/2

878

Vita

min

A/1

4.12

8/21

9687

Lampiran 9. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng

sawit) menggunakan fase gerak metanol:air (85:15) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 200 kgf) dengan detektor pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00

3.25

3.50


RT14

.318

/14.

259/

7884

93

81


0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75


/5.7

13/6

741

Vita

min

A/7

.642

/237

597

Lampiran 11. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak metanol:air (90:10) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 176 kgf) dengan detektor pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5


Vitam

in A/

7.830

/9285

22

82


0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50mV(x10)

Detector A:325nm

/3.4

69/1

1021

Vita

min

A/4

.462

/224

343

/5.0

17/2

164

Lampiran 13. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak metanol:air (95:5) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 147 kgf) dengan detektor pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1mV(x100)


RT3.6

26/3.

813/1

1278

Vitam

in A/4

.696/1

0946

45

RT5.4

47/5.

479/9

841

83

Lampiran 14. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak metanol:air (97,5:2,5) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 132 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00mV(x10)

Detector A:325nm

/2.7

99/1

5221

Vita

min

A/3

.608

/230

923

/4.1

64/1

620

Lampiran 15. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak metanol:air (97,5:2,5) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 132 kgf) dengan detektor pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3


/0.05

0/151

0

RT3.3

19/3.

319/6

153

Vitam

in A/

3.796

/1144

504

RT4.1

21/4.

121/1

6814

84

Lampiran 16. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:metanol (75:25) laju alir 1,0 mL/menit (memberikan tekanan 49 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00

3.25

3.50mV(x10)

Detector A:325nm

/4.0

15/1

7054

Vita

min

A/5

.032

/328

196

Lampiran 17. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:metanol (75:25) laju alir 1,0 mL/menit (memberikan tekanan 49 kgf) dengan detektor pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0


/4.38

6/727

24

Vitam

in A/

5.327

/9511

12

/6.49

6/406

64

85


0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00

3.25

3.50mV(x10)

Detector A:325nm

/4.01

4/411

3

Vitam

in A/

4.700

/3405

61

/5.36

5/865

2


sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:metanol (50:50) laju alir 1,0 mL/menit (memberikan tekanan 54 kgf) dengan detektor pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0mV(x10)


RT4.2

65/4.

270/6

1254

Vitam

in A/4

.969/9

7857

2

RT5.6

47/5.

763/2

6631

86


0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00

3.25

3.50


/3.7

77/2

1233

Vita

min

A/4

.479

/338

198

/4.9

28/3

569


sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:metanol (25:75) laju alir 1,0 mL/menit (memberikan tekanan 63 kgf) dengan detektor pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1


RT4.1

63/4.

163/4

7424

Vitam

in A/

4.742

/1207

183

RT5.4

60/5.

460/1

9711

87

Lampiran 22. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (100:0) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 71 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75


/2.8

22/2

3825

Vita

min

A/3

.575

/228

693

/4.2

63/2

512


sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (100:0) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 71 kgf) dengan detektor pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 min

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0


RT3.0

41/3.

074/2

4498

8

Vitam

in A/3

.769/6

1468

2

RT4.3

60/4.

187/6

5198

88


0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75mV(x10)

Detector A:325nm

Vita

min

A/4

.407

/219

738

/5.2

38/7

938



0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5mV(x10)


RT3.9

90/3.

988/2

9121

Vitam

in A/4

.601/5

0472

9

RT5.0

59/5.

071/2

3644

89


0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25


/4.8

58/1

763

Vita

min

A/5

.618

/223

005

/6.6

18/1

017


sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (90:10) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 85 kgf) dengan detektor pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0


RT5.2

83/5.

283/3

208

Vitam

in A/5

.817/5

9422

1

90


0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00


/6.0

58/1

430

Vita

min

A/7

.202

/215

390

/7.7

98/2

513

Lampiran 29. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (85:15) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 94 kgf) dengan detektor pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00

3.25

3.50mV(x10)


RT5.5

90/5.

590/1

9097

Vitam

in A/

7.350

/4002

21

RT7.8

50/7.

850/4

203

91


0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6


Vita

min

A/9

.477

/210

769

/10.

306/

2467


sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (80:20) laju alir 1,5 mL/menit (memberikan tekanan 103 kgf) dengan detektor pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50


/9.16

0/425

1

Vitam

in A/9

.688/3

4049

0

/10.59

8/283

2

.

92


0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2mV(x10)

Detector A:325nm

Vita

min

A/1

3.19

8/21

0780



0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25


Vitam

in A/1

3.347

/3379

12

93

Lampiran 34. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (100:0) laju alir 1,75 mL/menit (memberikan tekanan 83 kgf) dengan detektor UV pada panjang gelombang 325 nm

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 min-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75


/3.1

05/7

321

Vita

min

A/3

.342

/208

224

/4.0

32/2

842

. Lampiran 35. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng


0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 min

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2mV(x100)Detector B:Ex:325nm,Em:470nm

RT3.1

01/3.

101/7

5197

Vitam

in A/3

.496/5

7808

7

RT4.0

68/4.

068/2

2770

94


0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50


Vita

min

A/3

.760

/186

241

/4.4

64/4

896



0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5


RT3.3

58/3.

357/6

3474

Vitam

in A/3

.928/4

6189

0

RT4.3

28/4.

338/2

9191

95


0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25


/4.1

23/1

381

Vita

min

A/4

.780

/184

194

/5.1

92/2

024

.

Lampiran 39. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak asetonitril:air (90:10) laju alir 1,75 mL/menit (memberikan tekanan 100 kgf) dengan detektor pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5mV(x10)


/4.48

0/326

6

Vitam

in A/4

.946/3

8641

9

RT5.2

69/5.

363/1

4686

.

96


0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75


/5.4

13/2

765

Vita

min

A/6

.255

/183

645

/7.0

70/1

646



0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00

3.25

3.50mV(x10)


Vitam

in A/

6.420

/3728

50

RT8.0

33/8.

089/1

3890

7

97


0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5


Vita

min

A/8

.455

/181

518

. Lampiran 43. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng


0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00mV(x10)


RT5.6

78/5.

843/

1184

8

RT8.5

87/8.

623/

4259

37

98


0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0min

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1mV(x10)

Detector A:325nm

Vita

min

A/1

1.26

4/18

0871

.

Lampiran 45. Kromatogram KCKT vitamin A (dalam matriks minyak goreng sawit) menggunakan fase gerak asetonitril: (75:25) laju alir 1,75 mL/menit (memberikan tekanan 130 kgf) dengan detektor pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50


RT10

.403/1

0.403

/3675

Vitam

in A/1

1.408

/2874

27

RT12

.830/1

2.830

/6480

99

Lampiran 46. Data kurva kalibrasi baku vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit

No. Konsentrasi Vitamin A (IU/mL) Luas Area Rata-Rata 1 0,4443 16237 2 0,9660 34951 3 1,9319 68853 4 2,8979 103539 5 3,8638 137995 6 4,8684 175886 7 5,7957 206279 8 6,7617 240872 9 7,7276 279377

10 9,6595 346368 11 11,5914 414637 12 13,5233 484571

r (koefesien regresi) 0,99997 a (intersep) 51,99376 b (slope) 35825,84683

Lampiran 47. Contoh menghitung faktor respon detektor

Konsentrasi vitamin A : 0,4443 IU/mL

Luas area : 16244

= 36520

100

Lampiran 48. Data hubungan antara konsentrasi vitamin A dengan faktor respon detektor

No. Konsentrasi Vitamin A (IU/mL) Luas Area Faktor Respon 1 0,4443 16244 36520 2 0,4443 16305 36695 3 0,4443 16161 36371 4 0,9660 34668 35890 5 0,9660 34958 36190 6 0,9660 35227 36469 7 1,9319 68818 35622 8 1,9319 69031 35732 9 1,9319 68710 35566

10 2,8979 104322 36000 11 2,8979 102741 35454 12 2,8979 103554 35735 13 3,8638 136811 35408 14 3,8638 137852 35678 15 3,8638 139322 36058 16 4,8684 175203 35988 17 4,8684 176795 36315 18 4,8684 175659 36081 19 5,7957 204310 35252 20 5,7957 206575 35643 21 5,7957 207952 35880 22 6,7617 238851 35324 23 6,7617 239429 35410 24 6,7617 244336 36135 25 7,7276 278054 35982 26 7,7276 279671 36191 27 7,7276 280405 36286 28 9,6595 350039 36238 29 9,6595 346370 35858 30 9,6595 342696 35478 31 11,5914 414102 35725 32 11,5914 415082 35809 33 11,5914 414728 35779 34 13,5233 481595 35612 35 13,5233 484637 35837 36 13,5233 487482 36047

Rata-rata 35897

101

Lampiran 49. Data hubungan antara konsentrasi vitamin A dengan residual No. Konsentrasi

= xi (IU/mL) Luas Area

Pengamatan = yi Luas Area

Teoritis (y^) Residual (y^ - y) (y^ - y)²

1 0,4443 16244 15589 -655 429304 2 0,4443 16305 15589 -716 512961 3 0,4443 16161 15589 -572 327427 4 0,9660 34668 33641 -1027 1054783 5 0,9660 34958 33641 -1317 1734559 6 0,9660 35227 33641 -1586 2515480 7 1,9319 68818 67071 -1747 3052191 8 1,9319 69031 67071 -1960 3841804 9 1,9319 68710 67071 -1639 2686491

10 2,8979 104322 100501 -3821 14600633 11 2,8979 102741 100501 -2240 5017947 12 2,8979 103554 100501 -3053 9321282 13 3,8638 136811 133931 -2880 8294994 14 3,8638 137852 133931 -3921 15375049 15 3,8638 139322 133931 -5391 29063992 16 4,8684 175203 168698 -6505 42314109 17 4,8684 176795 168698 -8097 65560269 18 4,8684 175659 168698 -6961 48454541 19 5,7957 204310 200791 -3519 12384446 20 5,7957 206575 200791 -5784 33456439 21 5,7957 207952 200791 -7161 51282128 22 6,7617 238851 234221 -4630 21438564 23 6,7617 239429 234221 -5208 27125135 24 6,7617 244336 234221 -10115 102316859 25 7,7276 278054 267651 -10403 108226678 26 7,7276 279671 267651 -12020 144485333 27 7,7276 280405 267651 -12754 162669750 28 9,6595 350039 334511 -15528 241126742 29 9,6595 346370 334511 -11859 140641959 30 9,6595 342696 334511 -8185 66998420 31 11,5914 414102 401371 -12731 162086186 32 11,5914 415082 401371 -13711 187999948 33 11,5914 414728 401371 -13357 178417659 34 13,5233 481595 468231 -13364 178606075 35 13,5233 484637 468231 -16406 269168595 36 13,5233 487482 468231 -19251 370614799

Jumlah 210,0948 7528695 7278615 -250080 2713203532 Rata-rata 5,8360 209130 202184 -6947 75366765

r 0,9999 a 51,9938 b 35825,8468

Vxo 2,54

102

Lampiran 50. Contoh menghitung kadar vitamin A dalam sampel (pada uji presisi)

Bobot saepel : 2,5147 g

Faktor pengenceran : 25

Luas area : 84957

Persamaan kurva kalibrasi yang digunakan :

- Intersept (a) : 51,9937563

- Slope (b) : 35825,84683

103

Lampiran 51. Contoh menghitung RSD Horwitz

Kadar vitamin A palmitat rata-rata 23,48 IU/g

1 IU setara dengan 0,550 µg vitamin A palmitat

Maka kadar vitamin A palmitat dalam minyak goreng sawit

= 23,48 x 0,550 = 12,914 µg/g

= 0,0000012914 g/g (fraksi konsentrasi = C), maka:

104

Lampiran 52. Contoh menghitung akurasi vitamin A

Bobot sampel : 1,2647 g

Kadar vitamin A dalam sampel : 23,48 IU/g (data dari hasil presisi)

Vitamin A yang ditambahkan : 28,98 IU

Faktor pengenceran : 25

Luas area : 84610

Persamaan kurva kalibrasi yang digunakan :

- Intersept (a) : 51,9937563

- Slope (b) : 35825,84683

Vitamin A yang diperoleh kembali = Vitamin A total – Vitamin A dari sampel

= 59,0063 IU – 29,6952 IU

= 29,3111 IU

= 101,14 %

105

Lampiran 53. Contoh cara menghitung uji t

Hasil pengujian Metode 1:

Kadar rata-rata hasil pengujian ( ) : 46,74 IU/g

Standar deviasi (S1) : 0,90 IU/g

Jumlah data (N1) : 6

Hasil pengujian Metode 2 (dari hasil presisi):

Kadar rata-rata hasil pengujian ( ): 47,36 IU/g

Standar deviasi (S2) : 0,99 IU/g

Jumlah data (N2) : 6

Nilai kritis dari tabel dengan derajat bebas = 10 (N1 + N2 -2), maka diperoleh

t10 = 2,228 (P=0,05)

Karena nilai t-hitung lebih kecil dari t-tabel, maka kedua metode tidak berbeda

bermakna.

106

Tabel 54. Data hubungan antara konsentrasi vitamin A terhadap tinggi noise dengan tinggi sinyal (S/N) dan perhitungan batas deteksi (LOD) dan batas kuantisasi (LOQ)

No. Kadar spike Vitamin A IU/g ( X )

Perbandingan tinggi sinyal terhadap noise (S / N) ( Y )

1 0,4998 1,03 2 0,6248 1,38 3 0,9372 1,59 4 1,2496 2,32 5 2,4993 4,41 6 4,9985 8,78 7 9,9970 16,67 r (koefesien regresi) 0,9997 a (intersep) 0,2515 b (slope) 1,6543

Batas deteksi (LOD) : Batas kuantisasi (LOQ) : Untuk S / N = 3, maka x adalah: Untuk S / N = 10, maka x adalah: = y – a =

y - a

B b = 3 - 0,2515 =

10 - 0,2515 16,543 16,543

= 1,66 IU/g = 5,89 IU/g

pengembangan dan validasi metode analisis penetapan kadar ... · secara kromatografi cair kinerja...

Documents